<ul><li>La Trascrizione genica nei procarioti </li></ul>
OPERONE <ul><li>Gruppi di geni vicini trascritti e tradotti insieme; </li></ul><ul><li>La trascrizione è regolata da un pr...
Controllo della Funzione Genica Uso selettivo dell’informazione del genoma <ul><li>Perchè I batteri consumano gli zuccheri...
<ul><li>Un gene o un operone può essere  controllato  sia   positivamente   che   negativamente  in relazione ai diversi s...
Controllo della Funzione Genica Uso selettivo dell’informazione del genoma <ul><li>La struttura del DNA,  </li></ul><ul><l...
Genetic Switch <ul><li>Un gene viene  attivato  o  represso  semplicemente rimuovendo un repressore dal gene o legandolo a...
Il problema della complessità  in organismi multicellulari Metazoi e Piante <ul><li>Uomo  = >300 diversi tipi di cellule, ...
OPERONI L’ operone  Lac  di  E. coli
R. NEGATIVA
Regolazione cis/trans <ul><li>AD AZIONE   CIS   una   sequenza nucleotidica   regolatoria del DNA che può controllare un g...
Regolazione in  trans
Regolazione in  trans
Evidenza sperimentale dell’ esistenza di sequenze di DNA  cis-acting Isopropyl- β -thiogalactoside inducer X-gal + lac Blu...
Evidenza sperimentale dell’ esistenza  di sequenze di DNA/proteine  che agiscono in  trans
R. POSITIVA CAP = catabolite  activator protein
LacZ non viene trascritto  in presenza del repressore
LacZ viene trascritto  in presenza di di glucosio e di lattosio
LacZ viene trascritto ad alta efficienza  in presenza di lattosio in assenza di glucosio
Il   controllo positivo   dell’operone di  lac  operon è determinato dal   cAMP-CAP CAP = catabolite  activator protein
Inizio Trascrizione <ul><li>L’inizio della trascrizione della maggior parte dei geni da parte della  RNA polimerasi   avvi...
L’ RNA Polimerasi (3,000 mol) si lega a specifiche sequenze di promotori per iniziare la trascrizione <ul><li>Le subunita ...
cAMP
Un modello   space-filling   dell’ cAMP-CAP  legato al DNA del promotore di  lac
Il legame cooperativo tra l’ cAMP-CAP e  l’ RNA polimerasi alla regione di controllo di  lac  attiva la trascrizione
L’ RNA polimerasi si lega a sequenze specifiche del promotore per iniziare la transcrizione Ogni subunità ha una funzione ...
La regione di controllo di  lac  contiene 3 siti critici che agiscono in  cis
La maggior parte delle sequerze di operatore sono brevi  inverted repeats <ul><li>L’ Operatore di lac </li></ul>
Differenze nel promotore di  E. coli   influenzano la  frequenza di inizio della trascrizione
Regolazione negativa  dell’operone trp
La maggior parte dei repressori batterici sono dimeri  che contengono regioni α helices che si inseriscono  nel major groo...
La modifica conformazionale indotta dal ligando altera  l’affinità per il DNA di molti repressori <ul><li>Il  binding  del...
La transcrizione da alcuni promoteri inizia tramite fattori alternativi sigma
Attivazione del fattore sigma 54 -contente l’ RNA polimerasi al promotore  glnA  daparte di NtrC kinasi Glutamino sintetas...
Visualizzazione di  DNA looping  ed interazione di NtrC legato e sigma 54 - polimerasi
Molti risposte di batteri vengono controllate da sistemi a due componenti The PhoR/PhoB two-component regulatory system in...
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  • L’operone si ritrova solo nelle cellule procariotiche.
  • Esistono numerosi meccanismi che interferiscono con la capacità dell’RNA polimerasi di trascrivere un dato gene o operone, il più comune comporta l’azione di una proteina regolatrice chiamata repressore. Es. operone lac: E. coli può utilizzare sia glucosio che lattosio come fonte di carbonio… La regolazione negativa è esercitata da una proteina repressore prodotta dal gene lacI: In assenza di lattosio, nessuno dei tre geni necessari per il suo catabolismo viene trascritto
  • Il complesso cAMP-CAP si lega ad una sequenza adiacente al promotoree, se il repressore non occupa l’operatore, la trascrizione dell’operone viene attivata a livelli molto più alti di quelli dovuti al solo induttore.
  • Regolazione negativa leggermente diversa.
  • 6.operon

    1. 1. <ul><li>La Trascrizione genica nei procarioti </li></ul>
    2. 2. OPERONE <ul><li>Gruppi di geni vicini trascritti e tradotti insieme; </li></ul><ul><li>La trascrizione è regolata da un promotore posto a monte del primo gene; </li></ul><ul><li>Termina a valle dell’ultimo gene del complesso; </li></ul><ul><li>Si formano mRNA policistronici </li></ul>
    3. 3. Controllo della Funzione Genica Uso selettivo dell’informazione del genoma <ul><li>Perchè I batteri consumano gli zuccheri SEQUENZIALMENTE anzicchè simultaneamente ? </li></ul><ul><li>Scoprirono che la β-gal non è presente in una forma inattiva ma viene sintetizzata de novo ( enzyme induction ) </li></ul><ul><li>Ipotizzarono che la sintesi di una proteina inducible era INIBITA da uno specifico repressore , sintetizzato continuamente dalla cellula </li></ul><ul><li>Mutanti nel gene codificante per il repressore sintetizzano costantemente β-gal. </li></ul>Esperimenti di Jacob e Monod in E. coli 1961-1965 β-gal
    4. 4. <ul><li>Un gene o un operone può essere controllato sia positivamente che negativamente in relazione ai diversi stimoli ambientali presenti in quel momento. </li></ul>
    5. 5. Controllo della Funzione Genica Uso selettivo dell’informazione del genoma <ul><li>La struttura del DNA, </li></ul><ul><li>l’universalità del codice genetico, </li></ul><ul><li>il metabolismo condiviso da tutte le cellule, </li></ul><ul><li>fecero comprendere a J & M che avevano scoperto un CORE PROCESS con illimitate applicazioni: </li></ul><ul><ul><li>La regolazione </li></ul></ul><ul><ul><li>dell’espressione genica </li></ul></ul>β-gal
    6. 6. Genetic Switch <ul><li>Un gene viene attivato o represso semplicemente rimuovendo un repressore dal gene o legandolo ad esso </li></ul><ul><li>La molecola fondamentale nel lac operon è il LATTOSIO , che però non si lega direttamente al DNA ma ad una proteina specifica regolatrice </li></ul><ul><li>Questa modalità indiretta tra il lattosio e la sintesi di mRNA permette al sistema ( core process ) un’infinità di modifiche per regolare virtualmente qualsiasi gene. </li></ul>
    7. 7. Il problema della complessità in organismi multicellulari Metazoi e Piante <ul><li>Uomo = >300 diversi tipi di cellule, per un totale di 10 14 cellule … </li></ul><ul><ul><li>Anche se l’ </li></ul></ul><ul><ul><li>Uomo ( ca. 22.500 geni ) ha solo 6 volte il genoma di E. coli ( ca. 4.000 geni ) </li></ul></ul>
    8. 8. OPERONI L’ operone Lac di E. coli
    9. 9. R. NEGATIVA
    10. 10. Regolazione cis/trans <ul><li>AD AZIONE CIS una sequenza nucleotidica regolatoria del DNA che può controllare un gene solo sullo stesso cromosoma. </li></ul><ul><ul><li>Nei batteri , elementi ad azione cis sono adiacenti o vicini al gene che essi controllano, </li></ul></ul><ul><ul><li>mentre negli eucarioti possono essere anche molto lontani. </li></ul></ul><ul><li>AD AZIONE TRANS sequenze di DNA che codificano per proteine diffusibili (attivatori, repressori) che controllano i geni sullo stesso cromosoma o su cromosomi differenti. </li></ul>
    11. 11. Regolazione in trans
    12. 12. Regolazione in trans
    13. 13. Evidenza sperimentale dell’ esistenza di sequenze di DNA cis-acting Isopropyl- β -thiogalactoside inducer X-gal + lac Blue color 5-bromo-4 cloro-3-indolil- β -galatto-piranoside
    14. 14. Evidenza sperimentale dell’ esistenza di sequenze di DNA/proteine che agiscono in trans
    15. 15. R. POSITIVA CAP = catabolite activator protein
    16. 16. LacZ non viene trascritto in presenza del repressore
    17. 17. LacZ viene trascritto in presenza di di glucosio e di lattosio
    18. 18. LacZ viene trascritto ad alta efficienza in presenza di lattosio in assenza di glucosio
    19. 19. Il controllo positivo dell’operone di lac operon è determinato dal cAMP-CAP CAP = catabolite activator protein
    20. 20. Inizio Trascrizione <ul><li>L’inizio della trascrizione della maggior parte dei geni da parte della RNA polimerasi avviene in posizioni particolari che si trovano upstream della sequenza codificante </li></ul><ul><li>La coppia di basi dove la trascrizione inizia viene chiamata transcription-initiation site o start site </li></ul><ul><li>Per convenzione, il transcription-initiation site sulla sequenza di DNA viene denominto +1 , e alle coppie di basi che si estendono in direzione della trascrizione ( downstream ) viene assegnato un numero positivo, mentre a quelle che si estendono nella direzione opposta ( upstream ) vengono assegnati numeri negativi </li></ul><ul><li>Diverse proteine (RNA polimerasi, attivatori, repressori) interagiscono con il DNA sul o vicino al promoter per regolare l’inizio della trascrizione </li></ul>
    21. 21. L’ RNA Polimerasi (3,000 mol) si lega a specifiche sequenze di promotori per iniziare la trascrizione <ul><li>Le subunita Beta e Beta’ polimerizzano RIBO nucleotidi trifosfati </li></ul><ul><li>Le subunità alfa e alfa interagiscono con proteine regolatrici </li></ul><ul><li>La subunita sigma indica dove iniziare la trascrizione </li></ul><ul><li>Dopo la polimerizzazione di circa 10 nt, la sub sigma è rilasciata </li></ul><ul><ul><ul><li>Sigma serve quindi per l’inizio della trascrizione </li></ul></ul></ul><ul><ul><li>(fattore di iniziazione) e non per l’elongazione </li></ul></ul><ul><ul><ul><li>2 alfa e le due Beta sono il core enzyme </li></ul></ul></ul><ul><ul><ul><li>Con la sub SIGMA si chiama HALOENZYME </li></ul></ul></ul>
    22. 22. cAMP
    23. 23. Un modello space-filling dell’ cAMP-CAP legato al DNA del promotore di lac
    24. 24. Il legame cooperativo tra l’ cAMP-CAP e l’ RNA polimerasi alla regione di controllo di lac attiva la trascrizione
    25. 25. L’ RNA polimerasi si lega a sequenze specifiche del promotore per iniziare la transcrizione Ogni subunità ha una funzione specifica 5 subunità
    26. 26. La regione di controllo di lac contiene 3 siti critici che agiscono in cis
    27. 27. La maggior parte delle sequerze di operatore sono brevi inverted repeats <ul><li>L’ Operatore di lac </li></ul>
    28. 28. Differenze nel promotore di E. coli influenzano la frequenza di inizio della trascrizione
    29. 29. Regolazione negativa dell’operone trp
    30. 30. La maggior parte dei repressori batterici sono dimeri che contengono regioni α helices che si inseriscono nel major groove adiacente all’ operatore Repressore del batteriofago 434 Gln, Ser, Thr K d =10 -8 -10 -11
    31. 31. La modifica conformazionale indotta dal ligando altera l’affinità per il DNA di molti repressori <ul><li>Il binding del triptofano induce un cambiamento conformazionale nell’ aporepressore trp </li></ul>
    32. 32. La transcrizione da alcuni promoteri inizia tramite fattori alternativi sigma
    33. 33. Attivazione del fattore sigma 54 -contente l’ RNA polimerasi al promotore glnA daparte di NtrC kinasi Glutamino sintetasi glnA Separazione dei filamenti di DNA enhancer
    34. 34. Visualizzazione di DNA looping ed interazione di NtrC legato e sigma 54 - polimerasi
    35. 35. Molti risposte di batteri vengono controllate da sistemi a due componenti The PhoR/PhoB two-component regulatory system in E. coli PhoR è regolato Dal P nel mezzo Asp* 2 domini Sensore ( trasmittente ) Ricevente ( funzionale ) Attivazione

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