Genetica microbica: ricombinazione e plasmidi
Coniugazione batterica
Sesso … …  nei batteri !
Coniugazione batterica Scoperta della sessualità <ul><li>1946 J.  Lederberg  e E.  Tatum </li></ul><ul><li>Un ceppo di  E....
 
 
I batteri donatori:  plasmidi trasmissibili ,  ”elementi coniugativi”;  I batteri riceventi li ricevono.  ” elementi coniu...
I batteri hanno sessi separati
I Plasmidi <ul><li>I  Plasmidi  sono piccoli segmenti di  DNA circolare  contenenti alcuni geni. </li></ul><ul><ul><li>Una...
 
Batteri Gm(-)  contengono molti plasmidi trasmissibili ( Tra + );  molto comuni in batteri Enterici ( E. coli, Shigella, S...
<ul><li>Il  fattore F  è stato il primo plasmide coniugativo identificato ed è stato trovato in  E. coli  K12  (molti altr...
 
Meccanismo di Coniugazione (F + ) <ul><li>Contatto: </li></ul><ul><ul><li>1. Il  pilo F  sintetizzato dal donatore (F + )....
<ul><li>Trasferimento del DNA:   </li></ul><ul><ul><li>Un  nick   è introdotto in un sito specifico del filamento di DNA d...
Coniugazione F +
Selezione di trasconiugati Il  Donatore  trasporta  kan R  su un plasmide mobile Il  Ricevente  presenta una mutazione cro...
Ceppi Hfr  Hfr=High frequency of recombination <ul><li>Le Cellule Hfr  derivano da cellule che contengono il plasmide F ( ...
 
 
Cellule Hfr <ul><li>Poichè i  siti di inserzione   per il plaside F sono dispersi nel genoma di  E. coli , sii possono for...
Cellule Hfr <ul><li>1. Nei ceppi Hfr, F è parte del cromosoma il  DNA viene trasferito nel momento in cui si trasferisce F...
Cellule Hfr <ul><ul><li>5. Le cellule riceventi ricevono lunghi segmenti di  ssDNA cromosomale  dal donatore che  può rico...
 
Come si fa a sapere che un determinato gene è stato trasferito? <ul><li>Non è possibile misurare l’ingresso del DNA. </li>...
Come si fa a sapere che un determinato gene è stato trasferito?
Coniugazione  Hfr
Hfr  sono stati adoperati  per mappare i geni di  E. coli   MAPPE FISICHE <ul><li>Sono state adoperate per mappare e  loca...
continua
Hfr: Interrupted mating Il  tempo  e  l’ordine  di  trasferimento   genico  nella cellula ricevente riflette direttamente ...
segue
 
 
Nel 1958, F. Jacob e E. Wollman  per dimostrare che  il genoma di  E. coli  è circolare
Fattore F´ <ul><li>1.  Plasmidi F autonomi trasportanti segmenti (piccoli o grandi) di  DNA cromosomale. </li></ul><ul><li...
 
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5.plasm comjugation

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  • I microbiologi hanno tentato occasionalmente di osservare al microscipio la riproduzione sessuata nei batteri, ma senza successo.
  • La scoperta della trasformazione (1928-1944) rinnovò l’interesse per questa curiosità. Lederberg riuscì a dimostrare la formazione di ricombinanti prototrofi in una coltura mista di due doppi mutanti auxotrofi. L’uso dei doppi auxotrofi fu essenziale perché la frequenza di ricombinazione di auxotrofi singoli (circa 10-6 per cellula) è simile alla frequenza di formazione dei prototrofi mediante retromutazione.
  • I batteri donatori contengono plasmidi trasmissibili, i batteri riceventi li ricevono.
  • La presenza di streptomicina blocca la ricombinazione tra un ceppo sensibile ed uno resistente, ma non tra la stessa coppia con gli alleli per la sensibilità e per la resistenza invertiti. Nell’accoppiamento ci sono quindi due tipi di batteri che si comportano in maniera asimmetrica. La Str ucccide le cellule bloccando la sintesi proteica e permette invece la sintesi del DNA e la produzione di energia, le cellule possono servire da donoatori genetici (maschi) fornendo DNA per l’incrocio anche dopo essere state uccise; le cellule riceventi (femminili) devono rimanere vive.
  • I plasmidi sono molecole circolari di DNA extracrosomale. Codificano molti geni responsabili per la loro replicazione e mantenimento all’interno della cellula batterica. Inoltre, molti geni servono alla promozione del trasferimento di questi plasmidi mediante la coniugazine, tra cui i geni codificanti le proteine del pilo e quelli coinvolti nella regolazione della sua espressione e formazione. Il pilo si forma sulla superficie della cellula donatrice ed è in grado di riconoscere il ricevente e staibilire il contatto iniziale tra le due cellule. Cellule diverse possono codificare pili differenti.
  • Oltre al pilo, che stabilisce il primo contatto, sono necessri molti altri fattori per stabilizzare il legame, creando un complesso stabile tra le due cellule e per formare un canale nella parete batterica.
  • Sull’asse delle ordinate è riportata la frequenza di caratteri genetici dell’Hfr tra i ricombinanti. Sull’asse delle ascisse il tempo.
  • Fig 15.13 Perry
  • 5.plasm comjugation

    1. 1. Genetica microbica: ricombinazione e plasmidi
    2. 2. Coniugazione batterica
    3. 3. Sesso … … nei batteri !
    4. 4. Coniugazione batterica Scoperta della sessualità <ul><li>1946 J. Lederberg e E. Tatum </li></ul><ul><li>Un ceppo di E. coli thr - leu - mischiato con uno a met - bio - produce cellule prototrofiche ad una frequenza abbastanza alta (10 - 7 ). </li></ul><ul><li>La trasmissione di un singolo filamento di DNA richiede il contatto fisico tra cellule ( DNase resistant ). </li></ul>
    5. 7. I batteri donatori: plasmidi trasmissibili , ”elementi coniugativi”; I batteri riceventi li ricevono. ” elementi coniugativi” incluso geni che permettono il contatto intercellulare ed al DNA di essere trasportato da una cellula all’altra. Coniugazione batterica
    6. 8. I batteri hanno sessi separati
    7. 9. I Plasmidi <ul><li>I Plasmidi sono piccoli segmenti di DNA circolare contenenti alcuni geni. </li></ul><ul><ul><li>Una origine di replicazione è necessaria per permettere la loro replicazione. </li></ul></ul><ul><li>I tipi di plasmidi includono: </li></ul><ul><ul><li>F-plasmids : relativamente grandi (~95 kb), tali plasmidi sono traseriti tra batteri per coniugazione. </li></ul></ul><ul><ul><li>Col-plasmids : plasmidi più piccoli che codificano per tossine chiamate colicine </li></ul></ul><ul><ul><li>R-plasmids : plasmidi di dimensioni variabili che conferiscono resistenza ad antibiotici. </li></ul></ul><ul><ul><li>Plasmidi Specializzati : plasmidi di dimensioni variabili che codificano per funzioni quali interazioni ospite/parassita tra simbionte o patogeno </li></ul></ul><ul><li>I Plasmidi possono avere host ranges sia molto largo che ristretto. </li></ul>
    8. 11. Batteri Gm(-) contengono molti plasmidi trasmissibili ( Tra + ); molto comuni in batteri Enterici ( E. coli, Shigella, Salmonella , etc.) e Pseudomonas . Tutti esprimono pili coniugativi (tipi diversi) che permettono di stabilire il contatto cellulare. Batteri Gm(+) stabiliscono il contatto cellulare diversamente ( no pili ). Plasmidi coniugativi sono stati descritti per Enterococcus, Bacillus, Staphylococcus, Streptococcus , ed altri. In alcuni casi ( Streptococcus; Enterococcus; Staphylococcus ), è stato trovato un sistema di “trasposoni coniugativi”. Coniugazione batterica
    9. 12. <ul><li>Il fattore F è stato il primo plasmide coniugativo identificato ed è stato trovato in E. coli K12 (molti altri plasmidi F-like sono stati identificati). </li></ul><ul><li>F è un 100 kb dsDNA circolare , basso numero di copie (1-2/cell). </li></ul><ul><li>Il sistema di trasferimento F è codificato da una regione di 34 kb. </li></ul>L’esser MASCHIO dipende da un plasmide
    10. 14. Meccanismo di Coniugazione (F + ) <ul><li>Contatto: </li></ul><ul><ul><li>1. Il pilo F sintetizzato dal donatore (F + ). </li></ul></ul><ul><ul><li>2. F-pilus tocca la superfice di una cellula F - . </li></ul></ul>Le cellule reagiscono al pilo formando un mating channel
    11. 15. <ul><li>Trasferimento del DNA: </li></ul><ul><ul><li>Un nick è introdotto in un sito specifico del filamento di DNA di F: l’origine di trasferimento ( oriT ). </li></ul></ul><ul><ul><li>A partire dal 5', il singolo filamento tagliato è trasportato nella cellula ricevente e ricircolarizzato . </li></ul></ul><ul><ul><li>Il DNA non passa attraverso il pilo F. </li></ul></ul><ul><ul><li>La replicazione del DNA nel donatore rimpiazza il filamento esportato; nel ricevente si forma il filamento complementare . Il ricevente diventa F + &quot; transconjugants&quot; . </li></ul></ul>Meccanismo di Coniugazione (F + )
    12. 16. Coniugazione F +
    13. 17. Selezione di trasconiugati Il Donatore trasporta kan R su un plasmide mobile Il Ricevente presenta una mutazione cromosomale che conferisce una rif R Si ha l’accoppiamento; transconiugati dovrebbero essere kan R e rif R Solo le cellule riceventi contengono il plasmide mobile e cresceranno su piastra
    14. 18. Ceppi Hfr Hfr=High frequency of recombination <ul><li>Le Cellule Hfr derivano da cellule che contengono il plasmide F ( F + cells ). </li></ul><ul><li>Il plasmide F presenta sequenze IS e Tn che gli permettono di integrarsi per ricombinazione omologa in diversi siti nel cromosoma. Ceppi che contengono integrazioni stabili di F sono chiamati Hfr. </li></ul>
    15. 21. Cellule Hfr <ul><li>Poichè i siti di inserzione per il plaside F sono dispersi nel genoma di E. coli , sii possono formare differenti ceppi Hfr . </li></ul>
    16. 22. Cellule Hfr <ul><li>1. Nei ceppi Hfr, F è parte del cromosoma il DNA viene trasferito nel momento in cui si trasferisce F ; un singolo filamento di DNA è trasportato linearmente con il 5’ del sito dell’ oriT tagliato. </li></ul><ul><li>2. La posizione e l’orientamento di F nel cromosoma, specialmente dell’ oriT , determina dove e in che direzione si ha il trasferimento. </li></ul><ul><li>3. Il numero di geni cromosomali trasferiti dipende dalla durata dell’accoppiamento . </li></ul><ul><li>4. Generalmente non avviene il trasferimento dell’intero cromosoma; siccome il DNA di F non viene trasferito interamente le cellule riceventi non diventano F + o Hfr. </li></ul>
    17. 23. Cellule Hfr <ul><ul><li>5. Le cellule riceventi ricevono lunghi segmenti di ssDNA cromosomale dal donatore che può ricombinare con il cromosoma del ricevente (da qui Hfr= H igh f requency r ecombinant donor). </li></ul></ul><ul><ul><li>6. Il trasferimento è costante, quindi il “ tempo di entrata ” di un dato marker riflette la distanza dall’ oriT di F nel ceppo Hfr. </li></ul></ul><ul><ul><li>7. Nella mappa genica di E. coli le distanze sono espresse in “ minuti ” di trasferimento. </li></ul></ul>
    18. 25. Come si fa a sapere che un determinato gene è stato trasferito? <ul><li>Non è possibile misurare l’ingresso del DNA. </li></ul><ul><li>Si adoperano ceppi batterici con mutazioni in geni che codificano per enzimi di vie metaboliche e si incrociano con ceppi wt per quel gene (marcatore). </li></ul><ul><li>Dopo l’incrocio si piastrano i batteri in un mezzo solido senza la presenza di quel determinato metabolita (es. amminoacido). </li></ul>
    19. 26. Come si fa a sapere che un determinato gene è stato trasferito?
    20. 27. Coniugazione Hfr
    21. 28. Hfr sono stati adoperati per mappare i geni di E. coli MAPPE FISICHE <ul><li>Sono state adoperate per mappare e localizzare fisicamente i geni , bloccando il trasferimento a Tempi Precisi . </li></ul><ul><li>Questa procedura è chiamata INTERRUPTED MATING </li></ul><ul><li>Cellule Hfr vengono mescolate con altre cellule F - e il mating viene interrotto meccanicamente. </li></ul><ul><li>Il trasferiento di un gene viene determinando piastrando le cellule su terreni specifici </li></ul>
    22. 29. continua
    23. 30. Hfr: Interrupted mating Il tempo e l’ordine di trasferimento genico nella cellula ricevente riflette direttamente l’ordine dei geni sul cromosoma delle Hfr (donatore) in relazione all’orientamento dell’ oriT . L’Estrapolazione sull’asse delle ascisse indica quando i geni iniziano ad entrare nel ricevente.
    24. 31. segue
    25. 34. Nel 1958, F. Jacob e E. Wollman per dimostrare che il genoma di E. coli è circolare
    26. 35. Fattore F´ <ul><li>1. Plasmidi F autonomi trasportanti segmenti (piccoli o grandi) di DNA cromosomale. </li></ul><ul><li>2. Generati dalla excissione sbagliata di F dal cromosoma di un ceppo Hfr. </li></ul><ul><li>3. Un dato F´ trasporta geni che erano vicini al sito di integrazione nel ceppo Hfr parentale. </li></ul><ul><li>4. Donatori F´ trasferiscono in poco tempo l’intero plasmide con lo stesso meccanismo delle F+; così il ricevente diviene donatore F' . </li></ul><ul><li>5. Plasmidi F´ possono essere usati per costruire ceppi diploidi per regioni di cromosoma trasportati dall F’ “Merodiploid formation”. </li></ul>

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