Regolazione espressione 01.02.2010

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Regolazione espressione 01.02.2010

  1. 1. REGOLAZIONE ESPRESSIONE GENICA <ul><li>Con ESPRESSIONE GENICA si intende quella </li></ul><ul><li>serie di eventi che dall'attivazione della </li></ul><ul><li>trascrizione di un gene, conducono alla </li></ul><ul><li>produzione della proteina corrispondente. </li></ul><ul><li>La regolazione di questi processi è molto fine </li></ul><ul><li>e la sua complessità aumenta salendo la scala </li></ul><ul><li>evolutiva. </li></ul><ul><li>Studiare la regolazione dell'espressione di un </li></ul><ul><li>gene significa accertare in quali tessuti viene </li></ul><ul><li>espresso, in quali condizioni e qual è l'effetto </li></ul><ul><li>di tale espressione. </li></ul>
  2. 2. La regolazione dell’espressione genica <ul><li>Nei procarioti: </li></ul><ul><ul><li>un’espressione genica selettiva permette alle cellule di risparmiare energia </li></ul></ul><ul><ul><li>La regolazione avviene prevalentemente a livello trascrizionale </li></ul></ul><ul><li>Negli eucarioti: </li></ul><ul><ul><li>l’espressione genica selettiva permette alle cellule di svolgere ruoli specializzati </li></ul></ul><ul><ul><li>La regolazione avviene a vari livelli </li></ul></ul>
  3. 3. Regolazione genica nei procarioti <ul><li>Geni costitutivi: sono costantemente attivi (es. geni che codificano per gli enzimi della glicolisi) </li></ul><ul><li>Geni regolati: la loro espressione è regolata in modo tale che la quantità del corrispondente prodotto (proteina o RNA) è controllata in relazione al fabbisogno cellulare (es. sintesi adattativa di enzimi) </li></ul>
  4. 4. I batteri utilizzano strategie diverse per regolare la sintesi degli enzimi <ul><li>Vie cataboliche : induzione da substrato </li></ul><ul><li>Vie anaboliche : repressione da prodotto finale </li></ul><ul><li>Gli enzimi che catalizzano queste vie sono spesso regolati in modo coordinato: la sintesi di tutti gli enzimi coinvolti in una particolare via viene attivata o repressa simultaneamente </li></ul>
  5. 5. Vie cataboliche e induzione da substrato
  6. 6. Vie anaboliche : repressione da prodotto finale La sintesi del triptofano
  7. 7. Caratteristiche comuni ai due processi <ul><li>Il controllo è effettuato a livello genomico </li></ul><ul><li>Il controllo viene indotto da piccole molecole (effettori) che modificano la conformazione di molecole che controllano l’espressione genica </li></ul><ul><li>Per le vie cataboliche i substrati (lattosio) </li></ul><ul><li>Per le vie anaboliche i prodotti finali (triptofano) </li></ul>
  8. 8. I geni coinvolti nel catabolismo del lattosio sono organizzati in un operone inducibile La delezione del gene lac I origina cellule che producono sempre le tre proteine indipendentemente dalla presenza dell’induttore Lac I codifica per un repressore
  9. 9. Regolazione dell’operone lac
  10. 10. I repressori e gli attivatori sono molecole proteiche che legano il DNA
  11. 11. Regolazione della sintesi del triptofano: operone reprimibile
  12. 12. Gli operoni lac e trp spiegano il controllo negativo della trascrizione <ul><li>Per le vie cataboliche la forma attiva del repressore (che si lega al DNA) è rappresentata dalla proteina repressore libera dall’effettore </li></ul><ul><li>Per le vie anaboliche la forma attiva è quella della proteina repressore legata all’effettore che in questo caso può definirsi corepressore </li></ul><ul><li>In entrambi i casi il risultato è lo stesso: il repressore attivo previene la trascrizione dell’operone bloccando il legame della RNA polimerasi al DNA </li></ul>
  13. 13. Controllo positivo della trascrizione La forma attiva della proteina regolativa “accende” l’espressione dell’operone Esempio: repressione da catabolita Il glucosio ha la capacità di inibire la sintesi degli enzimi catabolici prodotti dagli operoni batterici inducibili Il glucosio agisce inibendo indirettamente l’adenilato ciclasi l’enzima che catalizza la sintesi di cAMP da ATP. Quindi più è alta la concentrazione di glucosio meno cAMP è prodotto. Il cAMP agisce legando la proteina recettore del cAMP (CRP) che è un attivatore della trascrizione
  14. 14. Il Fenomeno dell’attenuazione permette la regolazione della trascrizione dopo la fase di inizio Yanofsky: l’operone trp possiede un nuovo sito di regolazione negativa chiamato sequenza leader (o L) che viene trascritta per produrre un segmento di mRNA leader di 162 nucleotidi, localizzato al 5’ dell’mRNA poligenico trp. La sequenza leader dell’mRNA del triptofano
  15. 15. L’attenuazione nell’operone trp
  16. 16. Differenze della regolazione genica fra procarioti ed eucarioti <ul><li>Dimensione e complessità del genoma </li></ul><ul><li>Compartimentazione del genoma </li></ul><ul><li>Organizzazione strutturale del genoma </li></ul><ul><li>Stabilità dell’mRNA </li></ul><ul><li>Modificazione post-traduzionale delle proteine </li></ul><ul><li>Turnover delle proteine </li></ul>
  17. 17. Come è fatto un gene? Eucarioti
  18. 18. Come è fatto un gene? Procarioti
  19. 19. I geni degli eucarioti sono organizzati diversamente da quelli dei procarioti: nel DNA degli eucarioti sono presenti regioni molto estese che non vengono rappresentate negli mRNA maturi che si trovano nel citoplasma I geni degli eucarioti sono discontinui, presentano cioè regioni codificanti (esoni) alternate a regioni non codificanti (introni) Il prodotto intermedio della trascrizione negli eucarioti (trascritto primario) contiene sia gli esoni che gli introni Il trascritto primario subisce una serie di modificazioni prima di essere esportato nel citoplasma, dove verrà tradotto.
  20. 20. Cellula umana contiene circa 30000 geni RNA genes Geni per proteine Ogni cellula in un determinato momento esprime solo una piccola parte di questo potenziale ( ˜ 5000 geni) Geni housekeeping Geni tessutospecifici metabolismo biosintesi membrana istoni ribosomali DIFFERENZIAMENTO CELLULARE A QUESTA ESPRESSIONE SELETTIVA NON CORRISPONDE (IN GENERE) UNA VARIAZIONE DEL CONTENUTO DI DNA
  21. 21. <ul><li>La regolazione genica negli eucarioti </li></ul><ul><li>La regolazione dell’espressione genica negli eucarioti, è un meccanismo </li></ul><ul><li>molto complesso che si avvale della presenza: </li></ul><ul><li>di siti di regolazione presenti sul DNA e </li></ul><ul><li>di numerose molecole che svolgono </li></ul><ul><li>una funzione di controllo in termini di attivazione e repressione. </li></ul><ul><li>L’integrazione dei vari segnali richiede una enorme flessibilità per far fronte alla complessità degli eucarioti, in particolare quelli multicellulari. </li></ul>
  22. 22. <ul><li>Le maggiori differenze fra regolazione negli eucarioti e procarioti riguardano: </li></ul><ul><li>La presenza dei nucleosomi: le loro modificazioni influenzano l’accesso ai geni da parte dei fattori di regolazione; </li></ul><ul><li>vi sono molti più siti di regolazione (cui corrispondono più proteine regolatorie) anche molto distanti dal sito di inizio della trascrizione sia a monte che a valle. </li></ul><ul><li>3) la struttura interrotta dei geni consente un ulteriore livello di regolazione a livello dello splicing; </li></ul>
  23. 23. REGOLAZIONE ESPRESSIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI Stato di condensazione- decondensazione CROMATINA Trascrizione Post trascrizione Traduzione Post Traduzione Attività delle proteine
  24. 24. NUCLEO controllo trascrizionale : legame di fattori trascrizionali tessuto specifici, legame diretto di ormoni, fattori di crescita o elementi intermedi a elementi risponsivi di geni inducibili controllo post-trascrizionale : splicing alternativo, polyA alternativo, RNA editing tessuto-specifico controllo del trasporto mRNA controllo della stabilità degradazione traduzione PROTEINA controllo post-traduzionale PROTEINA attiva o inattiva DNA Meccanismi epigenetici : controllo a lungo raggio mediante rimodellamento della struttura della cromatina Trascritto primario (precursore) mRNA controllo traduzionale CITOPLASMA Esistono molteplici livelli di regolazione dell’espressione genica negli eucarioti
  25. 25. Livelli multipli di regolazione dell’espressione genica degli eucarioti
  26. 26. La Il primo livello di regolazione dell’espressione genica riguarda lo stato di condensazione della cromatina ATTIVAZIONE DELLA CROMATINA:
  27. 27. Puffing cromosomici in ghiandole salivari di Drosophila. Lo svolgimento localizzato della struttura cromosomica indica trascrizione in quella regione
  28. 28. In cosa consistono, a livello molecolare le modificazioni dello stato di condensazione della cromatina associate alla attivazione trascrizionale? La decondensazione locale della cromatina è una dissociazione temporanea degli istoni che “scopre” il DNA e lo rende accessibile al macchinario della trascrizio ne
  29. 29. Meccanismi epigenetici <ul><li>Fattori che vengono trasmessi alla progenie, ma che non sono direttamente attribuibili alla sequenza del DNA. </li></ul><ul><li>Modificazioni degli istoni </li></ul><ul><li>Acetilazioni, fosforilazioni e metilazioni, responsabili di cambiamenti conformazionali della cromatina. </li></ul><ul><li>Metilazione del DNA </li></ul><ul><li>Nelle cellule eucariotiche la metilazione è a carico della C. Solo il 3% delle C sono metilate ed in genere è bersaglio della metilazione la C della doppietta CpG. </li></ul>
  30. 30. I residui amminoacidici all’N-terminale di ciascun istone (20-60 residui) si estendono al di fuori della superficie del nucleosoma. Queste regioni sono particolarmente ricche in lisina (K) che può essere reversibilmente modificata mediante acetilazione, fosforilazione e metilazione . Meccanismi epigenetici: Modificazioni degli Istoni
  31. 31. Modificazioni degli istoni H3 e H4 La lisina 9 di H3 può essere sia acetilata che metilata. L’acetilazione è associata alla cromatina trascrizionalmente attiva, ma se la regione cromatinica viene metilata a livello del DNA (CpG), le proteine che si legano al DNA metilato richiamano le deacetilasi istoniche, che rimuovono i gruppi acetile e le metil transferasi istoniche, legate alle CpG binding protein, metilano gli istoni. Il risultato è la condensazione della cromatina.
  32. 32. Dissociazione temporanea degli istoni Ipermetilazione del promotore
  33. 33. Repressori e attivatori possono dirigere la deacetilazione/acetilazione degli istoni a livello di specifici geni Importanza della struttura modulare e delle interazioni proteina-proteina
  34. 34. Meccanismi epigenetici: Metilazione del DNA La metilazione del DNA è un processo post-replicativo. L’estensione delle modificazioni riguardanti la metilazione del DNA è fondamentalmente decisa durante lo sviluppo . La metilazione del DNA è quindi uno dei meccanismi correlati con il differenziamento cellulare, tramite l’inibizione dell’espressione genica a livello trascrizionale.
  35. 35. I geni trascrizionalmente attivi hanno promotori ipometilati
  36. 36. La metilazione regola l’espressione I geni trascrizionalmente attivi hanno promotori ipometilati Livello di metilazione dei geni del globina durante lo sviluppo Hb EMBRIONE Hb FETO Hb ADULTO        2 Hb A (97%)    2 Hb A2(2%)     1 Hb A3 (fetale) (1%)    
  37. 37. Organizzazione dei geni delle globine
  38. 40. CARATTERISTICHE DELLA CROMATINA
  39. 41. REGOLAZIONE ESPRESSIONE GENICA NEGLI EUCARIOTI Stato di condensazione- decondensazione CROMATINA Trascrizione Post trascrizione Traduzione Post Traduzione Attività delle proteine
  40. 42. IL SECONDO LIVELLO DI REGOLAZIONE E’ RAPPRESENTATO DALLA REGOLAZIONE DELLA TRASCRIZIONE Come viene regolata la trascrizione trascrizione?
  41. 43. Il meccanismo è altamente complesso che si avvale della presenza di : Sequenze di regolazione sul DNA Attive solo in cis: Promotori , enhancer, silencer Proteine di regolazione che si legano a queste sequenze operano in trans: sono molecole diffusibili: Attivatori, repressori
  42. 44. <ul><ul><li>Regioni regolatorie sul DNA </li></ul></ul><ul><ul><li>Proteine di regolazione che si legano a queste sequenze </li></ul></ul>
  43. 45. Le regioni regolatorie comprendono: Il core del promoter altri elementi anche molto distanti dal sito di inizio: ehnacers (o silencers) che a attivano o reprimono la trascrizione Insulators che deliminato le regioni di controllo da parte degli enhancers (o silencers). LE REGIONI REGOLATORIE SUL DNA
  44. 46. PROMOTORI: CONTENGONO DIVERSE REGIONI: TATA box, CAAT box, GC box ed altri elementi cis agenti. Tali elementi sono reclutati dai fattori di trascrizione
  45. 48. Alcuni set di geni, come quelli del locus della beta-globina o dei geni Hox, devono essere espressi secondo una sequenza ordinata. Questo è reso possibile da una regione regolatoria denominata locus control region (LCR) o global control region (GCR), che attraverso un meccanismo ancora sconosciuto, controlla l’espressione sequenziale dei geni.
  46. 49. Le regioni insulator scoperte finora nei vertebrati legano una proteina zinc-finger denominata CTCF (&quot;CCCTC binding factor”)
  47. 50. PROTEINE DI REGOLAZIONE Appartengono a famiglie e presentano MOTIVI STRUTTURALI COMUNI molto conservati.
  48. 51. Zinc-finger Leucine zipper helix-turn-helix Alcune proteine che si legano al DNA
  49. 52. Zinc-finger: struttura (C 2 H 2 ) Ci sono zinc-fingers con struttura C 4 (4 cisteine) e C 6 (6 cisteine)
  50. 53. Zinc-finger: Il recettore dell’estrogeno, ER Un dimero di ER si inserisce nel solco maggiore del DNA, provocando l’apertura della doppia elica
  51. 54. Leucine-zipper Due eliche (Jun e Fos), tenute insieme da legami idrofobici fra leucine
  52. 59. Ruolo dei fattori di trascrizione nella regolazione dell’espressione genica Il controllo trascrizionale è regolato dall’azione di molte proteine, chiamate FATTORI DI TRASCRIZIONE FATTORI DI TRASCRIZIONE GENERALI (GTF): si legano al promotore in associazione con la RNA polimerasi FATTORI DI TRASCRIZIONE SPECIFICI: si legano a vari siti regolatori di diversi geni. Agiscono come ATTIVATORI TRASCRIZIONALI REPRESSORI TRASCRIZIONALI
  53. 60. FATTORI GENERALI DI TRASCRIZIONE (Sono chiamati generali perchè intervengono nella trascrizione di differenti tipi di geni in una ampia varietà di organismi diversi) Svolgono un ruolo in tutti gli aspetti della trascrizione: legame della polimerasi inizio allungamento terminazione
  54. 61. Formazione del complesso di preinizio: 1) Legame di una proteina che riconosce il TATA box (TBP) e che fa parte di un complesso molto più grande : TFIID determina una profonda distorsione nella conformazione del DNA
  55. 65. Formazione del complesso di inizio della trascrizione TFIID è formatoda 10 subunità diverse TFIIH è il solo GTF con attività enzimatica: una subunità funziona come chinasi per fosforilare l’RNA polimerasi, le altre come enzimi che srotolano l’RNA (elicasi). Dopo l’inizio della trascrizione alcuni GTF sono lasciati indietro. Fino a che TFIID è attaccato al promotore altre polimerasi si possono attaccare
  56. 66. LA FOSFORILAZIONE DELLA POLIMERASI Al momento dell’attacco l’enzima non è fosforilato, la sua fosforilazione avviene a livello del dominio C terminale (CTD) ed è catalizzata da almenno 4 differenti chinasi fra cui TFIIH La fosforilazione permette il distcco dell’enzima dal complesso di pre-inizio per muoversi lungo la stampo del DNA
  57. 67. La RNA polimerasi ed i suoi GTF sono in grado di promuovere la trascrizione basale della maggior parte dei promotori in vivo. Una grossa varietà di FATTORI SPECIFICI DI TRASCRIZIONE è in grado di legarsi a numerosi siti regolatori del DNA, DETERMINANDO: se un complesso di pre-inizio si assembla al promotore oppure no la velocità della polimerasi Mentre il TATA box determina il sito di inizio della trascrizione il CAAT ed il GC box (definiti anche elementi prossimali del promotore) regolano la frequenza con cui la polimerasi trascrive il gene.
  58. 68. GLI ATTIVATORI sono grossi complessi molecolari che possono Interagire con l’apparato di base della trascrizione (GTF e polimarasi) Agire sulla cromatina
  59. 70. Elementi distali Elementi prossimali Promotore basale <ul><li>Una serie di fattori trascrizionali deve legarsi al promotore prima che possa farlo la RNA polimerasi. Quindi se la RNA polimerasi potrà iniziare la trascrizione dipenderà anche dal legame di proteine regolatorie, attivatori e repressori . </li></ul>
  60. 73. GLI ATTIVATORI DELLA TRASCRIZIONE Al contrario dei siti di legame al DNA, le regioni di attivazione mancano di una struttura ben definita, anche per il fatto che devono riconoscere superfici proteiche di natura molto differente. Al contrario degli attivatori procariotici che interagiscono direttamente con la polmerasi posizionandola sul promotore, gli attivatori eucariotici reclutano indirettamente la polimerasi interagendo con componenti del complesso trascrizionale come TFIID o il complesso mediatore.
  61. 74. Il complesso Mediatore Recentemente è stato scoperto nel lievito, grazie alla selezione di mutanti condizionali e in seguito, in Drosophila e nei mammiferi, un complesso multimerico che funge da intermediario essenziale per l’interazione tra i fattori trascrizionali specifici (a controllo positivo e negativo) e quelli generici nel controllo dell’inizio della trascrizione da parte della RNA
  62. 82. Diversi fattori trascrizionali specifici devono essere presenti per “accendere” completamente un gene
  63. 83. I vantaggi del Controllo Combinatorio Negli eucarioti i geni non sono organizzati in operoni Con pochi fattori trascrizionali ( alcune centinaia ) in combinazioni diverse si può controllare espressione di tutti i geni centinaia) l’espressione Geni che devono essere accesi insieme condividono elementi di regolazione e proteine di regolazione “accesi” Possibilit di regolazione fine del livello di trascrizione Possibilità Combinatorio: ••••
  64. 84. L’attivazione della trascrizione è risultato dell’ integrazione di molteplici segnali provenienti da complessi di proteine regolatrici posizionate su molteplici siti di regolazione
  65. 92. CHI REGOLA I REGOLATORI?
  66. 95. REGOLAZIONE POST-TRASCRIZIONALE

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