1. IFOM per la Scuola Lo Studente Ricercatore 2010 Luca De Cristofaro Liceo Scientifico “Gian Battista Vico” - Corsico (MI) Gruppo di lavoro: DNA Sequencing Unit Tutor: Sara Volorio Sequenziare il DNA: come leggere i geni
2. Il primo metodo di sequenziamento efficiente fu elaborato da Frederick Sanger nel 1975. Sequenziare il DNA significa “scoprire” la successione delle basi azotate di uno specifico tratto di DNA. Il sequenziamento Tratta da: The Molecular Biology Of The Cell di Alberts et al. Scheletro desossiribosio - fosfato Basi azotate legate con legami a idrogeno
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9. Si è osservato che mutazioni congenite in BRCA1 e BRCA2 innalzano sensibilmente la probabilità di contrarre tumore alla/e mammella/e e/o all’ovaia. Ottenere una preventiva informazione sulla presenza di queste variazioni nucleotidiche in famiglie a rischio permette un tempestivo intervento, Le mutazioni in BRCA1 e BRCA2 se necessario, o una più accurata sorveglianza dell’individuo nel tempo, limitando il rischio dello sviluppo del tumore. Dall’introduzione alla tesi di laurea specialistica in Genetica medica dal titolo “Caratterizzazione degli spettri mutazionali dei geni BRCA1 e BRCA2 in famiglie italiane con suscettibilità genetica ai carcinomi della mammella e dell’ovaia”.
10. Il flusso di lavoro Purificazione delle sequenze Elettroforesi nel sequenziatore Analisi delle sequenze tramite software Refertazione Purificazione della PCR Allestimento delle reazioni di sequenza Allestimento delle reazioni di PCR Estrazione del DNA dal sangue e archiviazione Arrivo del campione di sangue Controllo delle PCR su gel Compilazione della request Counseling genetico In azzurro i passaggi svolti dai centri che richiedono le analisi e in giallo i passaggi svolti nel laboratorio di sequenziamento del DNA.
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15. Fase 5: l’analisi dei dati I dati vengono poi elaborati grazie a un software che mette a confronto la sequenza analizzata con una wild-type ottenuta da un database online (come Ensembl) o da una precedente analisi, segnalando le mutazioni. Il software è in grado di evidenziare le mutazioni e di stabilire le sequenze aminoacidiche codificate dalle due sequenze nucleotidiche.
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Editor's Notes
I geni di interesse sono, nel nostro caso, BRCA1 e BRCA2 (BReast CAncer), due geni oncosopressori coinvolti in molti meccanismi della cellula quali i sistemi di controllo del ciclo cellulare, i sistemi di riparo del DNA, la demolizione delle proteine (tramite marcatura con ubiquitina), l’inattivazione del cromosoma X (nelle donne, per compensare la dose di geni in eccesso rispetto al sesso maschile) e la differenziazione delle cellule staminali dell’epitelio mammario. Si è osservato che mutazioni congenite in questi geni innalzano sensibilmente la probabilità di contrarre tumore alla/e mammella/e e/o all’ovaia rispetto al resto della popolazione. Perciò ottenere una preventiva informazione sulla presenza di queste variazioni nucleotidiche in famiglie a rischio permette un tempestivo intervento, se necessario, o una più accurata sorveglianza dell’individuo nel tempo, limitando il rischio dello svilupo del tumore. Descrizione dettagliata dell’attività svolta 3.1 Premessa: Il gene BRCA1 ha 24 esoni di cui 22 codificanti, mentre il gene BRCA2 ne ha 27, di cui 26 codificanti. In entrambi i geni lo start codon si trova nell’esone 2 e in BRCA1 l’esone 4 non viene normalmente tradotto. Gli mRNA trascritti sono rispettivamente di 7.8 kb e 10.4 kb. Per i geni BRCA1 e BRCA2 e’ stato sviluppato in questo laboratorio un “kit” costituito da 69 ampliconi di circa 500 paia di basi l’uno, indicando con amplicone il prodotto di un’ amplificazione tramite PCR. Gli esoni più lunghi vengono amplificati in più ampliconi parzialmente sovrapposti alle estremità; quelli più piccoli, se consecutivi, vengono amplificati in un unico amplicone; quelli che presentano regioni in cui si ripete consecutivamente un solo nucleotide (omopolimeriche) vengono analizzati su ampliconi ottenuti con un primer che si lega al gDNA (per “gDNA”, in seguito nominato anche “genomico”, si intende il DNA costituente l’intero genoma di un individuo) a valle della sequenza ripetuta. In questo modo si possono evitare errori della Taq polimerasi (fenomeno dello “scivolamento” della Taq) che, durante la PCR, tenderebbe ad inserire nell’amplificato altri nucleotidi dello stesso tipo di quelli ripetuti, causando uno frameshift. Questo “kit” è in grado di aumentare l’efficienza e la tempestività della diagnosi poiché consente di amplificare tutti gli ampliconi alla stessa temperatura e di utilizzare solo due primers per la reazione di sequenza. Le analisi sono leggermente diverse a seconda della tipologia del paziente. Si analizzano tutti gli ampliconi nel caso dei probandi, i pazienti da cui si comincia l’analisi del patrimonio genetico di una famiglia. I familiari dei probandi vengono detti collaterali e dei loro campioni vengono amplificati e sequenziati solamente gli esoni mutati nel campione di DNA del probando di riferimento, seguendo il normale flusso di lavoro del servizio.
