Nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy nấm men rhodotorula sp trên môi trường bán rắn để thu nhận beta carotene 3485865

1. TỔNG LIÊN ĐOÀN LAO ĐỘNG VIỆT NAM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÔN ĐỨC THẮNG
KHOA KHOA HỌC ỨNG DỤNG

NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG NUÔI CẤY NẤM MEN
RHODOTORULA SP TRÊN MÔI TRƯỜNG BÁN RẮN ĐỂ THU
NHẬN BETA CAROTENE
Giảng viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện:
ThS.NGUYỄN MINH KHANG TRẦN NGỌC VÂN KHANH
Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 01/2009

2. ii
TÓM TẮT LUẬN VĂN
TRẦN NGỌC VÂN KHANH, Đại học Tôn Đức Thắng Tp. Hồ Chí Minh.
Tháng 8/2009 “Nghiên cứu ứng dụng nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp trên môi
trường bán rắn để thu nhận beta -carotene”
Giáo viên hướng dẫn: Th.S. Nguyễn Minh Khang
Quá trình lên men bán rắn từ nấm men Rhodotorula sp đã tạo được hướng đi
mới trong việc tận dụng các nguồn phụ phẩm rẻ tiền trong sản xuất nông nghiệp và
ngành công nghiệp thực phẩm thành các chế phẩm giàu dinh dưỡng và hàm lượng
beta- carotene đạt 50mg/kg.
Với mục tiêu nghiên cứu: tìm hiểu các điều kiện nuôi cấy nấm men
Rhodotorula sp trên môi trường bán rắn để thu nhận beta carotene, bước đầu chúng tôi
đã thành công khi mật độ tế bào đạt được 7,40.108
CFU/g sau 7 ngày nuôi cấy với các
điều kiện sau:
 Gạo tấm phụ phẩm ngâm 24 giờ, pH 2,0 trước khi hồ hóa
 Thành phần môi trường nuôi cấy gồm cơm tấm : lõi bắp : khoáng K2HPO4 87%:
5% : 2,8%
 Điều kiện nuôi cấy tối ưu với các thông số ban đầu pH = 5,5, độ ẩm = 60% và
lượng giống cấy là 10%
Sau quá trình nghiên cứu, bước đầu tạo sản phẩm bột màu đỏ nâu từ canh
trường nuôi cấy. Thu được chế phẩm bột canh trường nấm men Rhodotorula sp có độ
ẩm <10% với các thành phần như sau :
+ Cơm tấm : 87%
+ Lõi bắp : 5%
+ Bột đậu nành : 10%
+ Dầu ăn : 1%
+ Khoáng (K2HPO4, MgSO4.7H2O) : 1%
+ K2HPO4: 2,8%
+ Hàm lượng beta-caroten : 50mg/kg

3. iii
MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ...................................................................................................................i
Tóm tắt luận văn..........................................................................................................ii
Mục lục ..................................................................................................................... iii
Danh sách các chữ viết tắt...........................................................................................vi
Danh sách các bảng ...................................................................................................vii
Danh sách các hình....................................................................................................vii
Danh sách các sơ đồ....................................................................................................ix
Danh sách các biểu đồ .................................................................................................x
Chương 1: MỞ ĐẦU..................................................................................................1
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ...................................................................................................1
1.2 MỤC ĐÍCH VÀ PHẠM VI ĐỀ TÀI..................................................................2
1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI .......................................................2
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................3
2.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM MEN..........................................................................3
2.1.1 Tổng quan về nấm men...............................................................................3
2.1.2 Hình dạng và kích thước của tế bào nấm men.............................................3
2.2 NẤM MEN RHODOTORULA SP .....................................................................8
2.2.1 Phân loại.....................................................................................................8
2.2.2 Hình dạng và kích thước............................................................................9
2.2.3 Cấu tạo và sinh sản của nấm men Rhodotorula sp.....................................11
2.2.4 Đặc điểm sinh hóa ...................................................................................13
2.2.5 Đặc điểm sinh lý:......................................................................................14
2.3 BETA-CAROTENE (β-Carotene) ...................................................................15
2.3.1 Giới thiệu về Carotenoids.........................................................................15
2.3.2 Giới thiệu về Beta-Carotene.....................................................................20
2.4 Lên men bán rắn ..............................................................................................24
2.4.1 Khái quát về lên men bán rắn (SSF)..........................................................24
2.4.2 Các ứng dụng và yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi bán rắn với nấm men
Rhodotorula sp..................................................................................................26

4. iv
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................32
3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU..................................................32
3.2 DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT .........................................................32
3.2.1 Dụng cụ....................................................................................................32
3.2.2 Thiết bị.....................................................................................................33
3.2.3 Hóa chất ..................................................................................................33
3.3 NGUYÊN LIỆU VÀ GIỐNG VI SINH VẬT ..................................................33
3.3.1 Nguyên liệu ..............................................................................................33
3.3.2 Giống vi sinh vật ......................................................................................34
3.4 CÁC MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG (Phụ lục 1)..................................................34
3.4.1 Môi trường phân lập nấm men..................................................................34
3.4.2 Môi trường giữ giống nấm men ................................................................34
3.4.3 Môi trường hoạt hóa nấm men..................................................................35
3.4.4 Môi trường nuôi cấy bán rắn.....................................................................35
3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....................................................................36
3.5.1 Các phương pháp phân tích, thu nhận các chỉ tiêu dùng trong nghiên cứu.36
3.5.2 Phương pháp phân lập và chọn giống .......................................................36
3.5.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm..................................................................37
3.6 TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ....................................................44
3.6.1 Tối ưu tỉ lệ cơm tấm bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn
..........................................................................................................................44
3.6.2 Tối ưu tỉ lệ lõi bắp bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn45
3.6.3 Tối ưu tỉ lệ khoáng K2HPO4 bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy
bán rắn..............................................................................................................46
3.7. PHƯƠNG PHÁP QUY HOẠCH THỰC NGHIỆM........................................47
3.7.1. Mục đích .................................................................................................47
3.7.2. Phương pháp xử lý số liệu .......................................................................47
3.8 THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ......................................................49
3.9 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU ................................................................49
Chương 4: K ẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................50
4.1 KHẢO SÁT CÁC ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI CỦA NẤM MEN
RHODOTORULA..................................................................................................50

5. v
4.2. KHẢO SÁT THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUÔI BÁN RẮN ...................52
4.3 XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG SINH TRƯỞNG CỦA NẤM MEN
RHODOTORULA TRÊN MÔI TRƯỜNG LÊN MEN BÁN RẮN.........................56
4.4. KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA pH VÀ THỜI GIAN NGÂM GẠO...........58
4.5. TỐI ƯU HÓA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY ...................................................60
4.5.1 Tối ưu tỉ lệ cơm tấm bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn...60
4.5.2 Tối ưu tỉ lệ lõi bắp bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn......61
4.5.3 Tối ưu tỉ lệ khoáng K2HPO4 bổ sung vào thành phần môi trường nuôi cấy bán
rắn .........................................................................................................................63
4.6 TỐI ƯU HÓA THÀNH PHẦN MÔI TRƯỜNG NUỐI CẤY NẤM MEN
RHODOTORULA BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM..............................64
4.7 THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM ......................................................66
4.8 KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG CHẾ PHẨM.......................................................67
4.9 TÍNH GIÁ THÀNH SẢN PHẨM....................................................................67
Chương 5: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................69
5.1 KẾT LUẬN.....................................................................................................69
5.2 KIẾN NGHỊ ....................................................................................................69
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................70
PHỤ LỤC 1..............................................................................................................72
PHỤ LỤC 2..............................................................................................................74
PHỤ LỤC 3..............................................................................................................81
PHỤ LỤC 4..............................................................................................................86

6. vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
SSF Solid State Fermentation (Lên men bán rắn)
LDL Low-Density Lipoprotein (lipoprotein có tỷ trọng thấp)
LSD Sai số nhỏ nhất
Rh Rhodotorula
Sp loài
MT Môi trường
TG Thời gian
CSS Corn steep solid ( Bột ngô ngâm)
VSV Vi sinh vật

7. vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Thành phần hóa học của tế bào nấm men......................................................4
Bảng 2.2 Hình thái tế bào của một số loài Rhodotorula sp nuôi cấy tên môi trường
thạch malt từ các nguồn phân lập khác nhau ..............................................................10
Bảng 2.3 Đặc điểm sinh lý.........................................................................................14
Bảng 3.1: Danh sách dụng cụ sử dụng .......................................................................32
Bảng 3.2: Danh sách các thiết bị sử dụng...................................................................33
Bảng 3.3 Bảng phân phối nghiệm thức ......................................................................42
Bảng 3.4 Các yếu tố thí nghiệm .................................................................................48
Bảng 3.5 Bố trí thí nghiệm.........................................................................................49
Bảng 4.1: Kết quả phân tích một số chỉ tiêu của nguyên liệu ban đầu ........................53
Bảng 4.2: Kết quả khảo sát môi trường lên men bán rắn ............................................53
Bàng 4.3: Kết quả theo dõi sự phát triển của nấm men theo ngày...............................55
Bảng 4.4: Kết quả theo dõi sự phát triển của nấm men theo ngày trên môi trường 2 ..56
Bảng 4.5: Kết quả ảnh hưởng của pH ngâm gạo đến mật độ nấm men phát triển trong
quá trình nuôi cấy ......................................................................................................58
Bảng 4.6: Kết quả ảnh hưởng của thời gian ngâm gạo đến mật độ tế bào nấm men phát
triển trong quá trình nuôi cấy.....................................................................................59
Bảng 4.7: Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa thành phần cơm.........................................60
Bảng 4.8 : Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa tỉ lệ lõi bắp ................................................61
Bảng 4.9 : Kết quả thí nghiệm tối ưu hóa thành phần khoáng K2HPO4 ......................63
Bảng 4.10 : Mức biến thiên của các nhân tố sinh trưởng............................................64
Bảng 4.11 : Kết quả thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm ................................65
Bảng 4.12 : Chi phí trong 1 lít môi trường nhấn giống nấm men Rhodotorula ...........67
Bảng 4.13 : Chi phí trong 1 kg môi trường lên men bán rắn.......................................68

8. viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Nấm men Rhodotorula sp.............................................................................8
Hình 2.2: Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis..........................................................8
Hình 2.3: Các sắc tố carotenoid chủ yếu của nấm men Rhodotorula sp......................14
Hình 2.4: Công thức cấu tạo của các carotenoids quan trọng......................................16
Hình 2.5: Phân loại carotenoids .................................................................................17
Hình 2.6:Con đường tổng hợp carotenoid ở vi sinh vật do Simpson đề nghị ..............19
Hình 2.7: Cấu trúc phân tử Betacaroten .....................................................................20
Hình 2.8: Cấu trúc phân tử Betacaroten trong không gian 3D ...................................20
Hình 2.9: Cấu trúc Vitamin A....................................................................................21
Hình 2.10: Sinh tổng hợp vitamin A từ Beta-Carotene...............................................22
Hình 4.1: Nấm men đỏ trên môi trường thạch Hensen ...............................................50
Hình 4.2: Cấy trang quan sát khuẩn lạc trên môi trường thạch Hensen.......................50
Hình 4.3: Nấm men đỏ quan sát dưới vật kính x 40....................................................51
Hình 4.4: Nấm men đỏ quan sát dưới vật kính x100...................................................51

9. ix
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nuôi cấy bán rắn nấm men Rodotorula............................................37
Sơ đồ 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1...........................................................................40
Sơ đồ 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2...........................................................................43

10. x
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 4.1: Khảo sát môi trường lên men bán rắn.....................................................54
Biểu đồ 4.2: Sự phát triển của nấm men trên môi trường bán rắn...............................55
Biểu đồ 4.3: Đường cong sinh trưởng của nấm men Rhodotorula trên môi trường 2 ......57
Biểu đồ 4.4: Khảo sát ảnh hưởng của pH nước ngâm gạo ..........................................58
Biểu đồ 4.5: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian ngâm gạo..........................................59
Biểu đồ 4.6 : Kết quả tối ưu hóa thành phần cơm.......................................................60
Biểu đồ 4.7 : Kết quả tối ưu hóa tỉ lệ lõi bắp ..............................................................62
Biểu đồ 4.8 : Tối ưu hóa tỉ lệ khoáng K2HPO4 ...........................................................63
Biểu đồ 4.9 : Biểu đồ thí nghiệm theo phương pháp thực nghiệm ..............................66

11. 1
Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Việt Nam là nước nông nghiệp đang phát triển kéo theo sự phát triển của các
ngành khoa học kỹ thuật. Công nghệ sinh học đã và đang trở thành một trong những
ngành được quan tâm hàng đầu trên thế giới nói chung và ở Việt Nam nói riêng. Công
nghệ sinh học phát triển nhanh chóng đang tạo ra một cuộc cách mạng sinh học trong
các ngành nông nghiệp và công nghiệp thực phẩm, làm thay đổi phương thức sản xuất
trong các ngành y dược, năng lượng khai khoáng và bảo vệ môi trường.
Khi đất nước ngày càng phát triển, cùng với quá trình công nghiệp hóa hiện đại
hóa. Các ngành nông nghiệp, công nghiệp nâng cao năng suất và các sản phẩm ngày
càng tăng, đa dạng hơn về mặt số lượng cũng như chất lượng. Việc ứng dụng phế liệu
trong ngành nông nghiệp để tạo ra một sản phẩm sinh học có giá trị là một vấn đề đang
được hầu hết các nhà khoa học quan tâm.
Các kết quả nghiên cứu cho thấy tại Việt Nam rất phổ biến giống nấm men
Rhodotorula. Một số chủng đã được nghiên cứu về khả năng tạo sinh khối, tích lũy
carotenoid, chất béo đặc biệt là các acid béo không no có giá trị sinh học cao trên các
phế phụ phẩm chế biến nông sản thực phẩm.
Nấm men Rhodotorula là một trong rất ít giống nấm men có khả năng tổng hợp
một lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là beta-carotene, một hợp chất có
hoạt tính sinh học, có vai trò quan trọng trên người, gia súc, gia cầm…
Ngoài việc được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực y học, beta-caroten còn
được quan tâm hơn khi bổ sung vào các loại thực phẩm cho người và thức ăn gia súc
nhằm nâng cao giá trị dinh dưỡng, cũng như cải thiện và giảm thiểu một số bệnh do
thiếu vitamin A. Tại các nước có nền sinh học phát triển nấm men Rhodotorula đã
được nghiên cứu và được sử dụng như một nguồn cung cấp chất màu thực phẩm an
toàn, sinh khối nấm men có giá trị dinh dưỡng cao được dùng trong chăn nuôi....

12. 2
Đứng trước nhu cầu đó, bước đầu chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu ứng
dụng nuôi cấy nấm men Rhodotorula sp trên môi trường bán rắn để thu nhận
beta -carotene”
1.2 MỤC ĐÍCH VÀ PHẠM VI ĐỀ TÀI
Khảo sát những điều kiện tối ưu nhất cho sự phát triển của nấm men đỏ
Rhodotorula sp trên môi trường bán rắn thông qua việc tận dụng các nguồn nguyên vật
liệu phụ phẩm rẻ tiền từ các ngành nông nghiệp, công nghiệp, công nghiệp thực
phẩm,… để thu được lượng sinh khối cao nhất.
1.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
- Xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng Rhodotorula sp trên môi trường bán
rắn.
- Quan sát vi thể và đại thể của chủg nấm men đỏ Rhodotorula sp
- Lựa chọn ra môi trường bán rắn thích hợp nhất cho việc nuôi cấy nấm men đỏ
Rhodotorula sp.
- Tối ưu hóa các thành phần môi trường nuôi cấy.
- Sản xuất chế phẩm beta-carotene từ nấm men đỏ Rhodotorula sp trên môi trường
tối ưu.
- Kiểm tra hàm lượng beta-carotene trong chế phẩm sản xuất.

13. 3
Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. ĐẠI CƯƠNG VỀ NẤM MEN
2.1.1 Tổng quan về nấm men [2], [6], [7], [12]
Nấm men là tên chung để chỉ nhóm nấm thường có cấu tạo đơn bào và thường
sinh sản vô tính theo lối nảy chồi. Nấm men không thuộc về một nhóm phân loại nào
nhất định, chúng có thể thuộc ngành Nấm túi (Ascomycota) hoặc ngành Nấm đảm
(Basidiomycota).
Nấm men phân bố hết sức rộng rải trong tự nhiên: đất, nước, lương thực thực
phẩm, rau quả,… Đặc biệt chúng hiện diện nhiều ở các môi trường chứa đường, pH
thấp như đất trồng nho và cây ăn quả.
Nấm men có khả năng sinh sản nhanh chóng, sinh khối giàu protein, vitamin và
lipid. Vì vậy chúng được sử dụng rộng rãi trong công nghệ chế biến rượu trắng, rượu
vang, bia, cồn, thức ăn bổ sung cho người và gia súc, làm nở bột mì, gây hương nước
chấm, làm dược phẩm, sản xuất enzym, sản xuất acid citric từ khí thiên nhiên, sản xuất
riboflavin (vitamin B2), .... Bên cạnh rất nhiều nấm men có ích còn có những loại nấm
men có thể gây bệnh (Candida, Mycoderma).
2.1.2 Hình dạng và kích thước của tế bào nấm men [3], [7]
2.1.2.1 Hình dạng nấm men [7]
Nấm men thường có cấu tạo đơn bào. Hình dạng tế bào nấm men thường thay đổi
tùy theo loài, ngoài ra một phần còn phụ thuộc vào tuổi giống và điều kiện ngoại cảnh,
điều kiện nuôi cấy. Nói chung nấm men thường có hình trứng, bầu dục
(Saccharomyces serevisiae), hình cầu (Candida utilis), hình oval hoặc elip, hình ống
(Pychia), hình trụ, hình quả chanh, hình tam giác,…và một số hình dạng đặc biệt. Hình
dạng của nấm men hầu như không ổn định, nó phụ thuộc vào tuổi của nấm men và
điều kiện nuôi cấy.
Ngoài ra một số loài nấm men có tế bào hình que nối với nhau thành những sợi
gọi là khuẩn ty hoặc khuẩn ty giả, thường gặp ở các giống Endomycopsis, Candida,
Trichosporon.

14. 4
2.1.2.2 Kích thước tế bào nấm men [7]
Kích thước tế bào nấm men thay đổi rất nhiều, theo từng giống, từng loài, hay
tuổi sinh lý. Nói chung thường to hơn tế bào vi khuẩn từ 5 ÷ 10 lần. Kích thước trung
bình của tế bào nấm men.
 Chiều dài: 9 ÷ 10 µm.
 Chiều rộng: 2 ÷ 7 µm.
Các loài nấm men đơn bào trong công nghiệp thường có kích thước 3 – 5 µm. x
5- 10 µm.
2.1.3 Dinh dưỡng nấm men
2.1.3.1 Thành phần hóa học của tế bào nấm men [12]
Thành phần cơ bản và chủ yếu là nước (nước liên kết và nước tự do) - khoảng
75% khối lượng chung. Thành phần sinh khối khô của nấm men như sau (%)
Bảng 2.1 Thành phần hóa học của tế bào nấm men
Chất khô của tế bào nấm men gồm có 23 – 28 % là chất hữu cơ và 5 – 7 % chất tro.
Chất hữu cơ gồm có : Protein 13 -14 %, glucogen 6 – 8 %, xenluloza 1,8 -2 %, chất
béo 0,5 – 2 %.
2.1.3.2 Dinh dưỡng nấm men [12]
Dinh dưỡng nấm men thường chia làm hai nguồn dinh dưỡng. Đó là dinh dưỡng
ngoại bào và dinh dưỡng nội bào. Chất dinh dưỡng ngoại bào được thấm qua màng
vào tế bào từ các chất của môi trường nuôi cấy bên ngoài. Khi tế bào ở trạng thái đối
với môi trường bên ngoài nghèo hoặc cạn các chất dinh dưỡng thì những chất dự trữ
nội bào như glycogen, tregeloza, lipit, các hợp chất chứa N sẽ được nấm men sử dụng
– dinh dưỡng nội bào.
Các chất dinh dưỡng khi được sử dụng sẽ hoặc là đi vào thành phần tế bào phục
vụ cho sinh trưởng hoặc là cung cấp năng lượng cần thiết cho đời sống tế bào.
Chất hữu cơ 5-10 %
Cacbon 25-50 %
Nitơ 4,8-12 %
Protein 30-75 %
Lipid 2-5 %

15. 5
 Dinh dưỡng cacbon [12],[4]
Nguồn dinh dưỡng carbon của nấm men bao gồm các loại hợp chất hữu cơ khác
nhau như đường, rượu, acid hữu cơ, acid amin,…. Hầu hết các loài nấm men đều
không có enzyme polyhydrolase trong đó có amylase và cellulase. Vì vậy, nấm men
không sử dụng trực tiếp được tinh bột cũng như cellulose và hemicellulose.
Đường là một trong những nguồn carbon quan trọng cho nấm men sử dụng đặc
biệt là đường glucose thuộc loại đường 6 (hexose) là thông dụng nhất cho tất cả các
loài nấm men. Glucose được coi như nguồn carbon vạn năng đối với vi sinh vật.
Tỷ số đường sử dụng là đặc điểm riêng của từng loài nấm men. Đối với các
nguồn carbon khác như rượu và acid hữu cơ thì đặc điểm này là giống nhau ở tất cả
các loài nấm men. Các loài Saccharomyces lên men rượu vang sử dụng glucose,
fructose, maltose, saccharose và galactose, với rafinose chỉ sử dụng được một phần.
Với lactose, melibiose, dextrin, pentose và tinh bột lại hoàn toàn không sử dụng được.
Trong môi trường có một hỗn hợp các nguồn carbon dinh dưỡng thì nguồn nào
cung cấp cho nấm men sinh trưởng tốt sẽ được ưu tiên sử dụng trước, tính sử dụng kế
tiếp các nguồn carbon trong canh trường được gọi là tính đa dưỡng của nấm men.
Trong quá trình nuôi cấy glucose và fructose sẽ được sử dụng trước hết.
Những loài nấm men cùng một giống không phải bao giờ cùng đồng hóa vật chất
như nhau. Các loài khác nhau (dù là một giống) sẽ đồng hóa các nguồn dinh dưỡng
khác nhau.
Những disaccharide (maltose và saccharose) trước khi được nấm men sử dụng
phải qua thủy phân sơ bộ thành đường đơn nhờ enzyme tương ứng của nấm men. Các
acid hữu cơ cũng chiếm một vị trí quan trọng trong trao đổi chất của nấm men. Chúng
có thể kích thích hoặc ức chế sinh trưởng của nấm men. Chúng cũng có thể là nguồn
dinh dưỡng carbon và năng lượng duy nhất.
Các acid béo có mạch carbon tương đối dài (từ 6 ÷ 10) nấm men chỉ sử dụng ở
nồng độ trong môi trường rất thấp (0,02 ÷ 0,05 %). Ở nồng độ cao sẽ ức chế nấm men
phát triển. Acid béo có từ C12 ÷ C17 carbon trong phân tử được sử dụng tùy thuộc vào
từng chủng loại nấm men.
 Dinh dưỡng nitơ [12], [4]
Nguồn nitơ cần thiết cho tế bào nấm men thường là các hợp chất hữu cơ hoặc vô
cơ có sẵn trong môi trường.

16. 6
Thông thường, nitơ của tế bào nấm men thường vào khoảng 7 ÷ 10 %, đôi khi lên
tới 12% vật chất khô. Để tạo thành 10 tỷ tế bào nấm men chi phí nitơ trong điều kiện
kị khí là 66 ÷ 67 mgN, trong điều kiện hiếu khí là 37 ÷ 53 mgN. Tuy nhiên hàm lượng
nitơ trong nấm men phụ thuộc vào thành phần môi trường, điều kiện hiếu khí và số
lượng các chất dinh dưỡng bổ sung vào môi trường đối với từng chủng nấm men.
Các hợp chất hữu cơ chứa nitơ của tế bào là các acid amin, các nucleotic purin và
pyrimidin, protein và một số vitamin.
Nguồn nitơ vô cơ được nấm men sử dụng tốt là các muối amoni của acid vô cơ
cũng như hữu cơ. Đó là các muối amoni sunfat, amoni phosphat rồi đến các muối
amoni acetat, amoni lactat, amoni maltat và amoni sucxinat. Trong môi trường có
muối amoni đặc biệt là sunfat thì nấm men sẽ sử dụng gốc amoni trước, gốc acid còn
lại sẽ sử dụng sau hoặc ít sử dụng do vậy có thể làm môi trường acid hóa, giảm pH.
Các nguồn nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các acid amin, các peptid, các
nucleic,.... Trong thực tế người ta hay dùng cao ngô, cao nấm men, dịch thủy phân
protein tự nhiên (đậu tương, khô lạc,...) làm nguồn nitơ hữu cơ.
Xếp theo thứ tự nấm men tiêu hóa tốt nhất là các muối amon, tiếp theo là các
acid amin, sử dụng pepton kém và hoàn toàn không sử dụng được protein. Trong quá
trình nuôi cấy nấm men các acid amin vừa là nguồn nitơ vừa là nguồn carbon dinh
dưỡng. Chúng đồng thời tham gia vào phản ứng cetoacid để tạo thành các acid amin
mới như là chất cho nhóm amin (NH2
-
).
 Dinh dưỡng các nguyên tố vô cơ [12], [4]
Các nguyên tố vô cơ trong nuôi cấy vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men
thì phospho được quan tâm trước hết, sau đó là kali, magiê và lưu huỳnh,….
Phospho: tham gia vào các thành phần quan trọng của tế bào, như các
nucleoproteic, acid nucleic, polyphosphate, phospholipid,…. Các hợp chất phospho
đóng vai trò xác định trong các biến đổi hóa sinh khác nhau, đặc biệt là trong trao đổi
chất hydrocacbon và trong vận chuyển năng lượng. Nấm men sử dụng rất tốt nguồn
phospho vô cơ là orthophosphate. Hợp chất này sẽ chuyển thành polyphosphate và sau
khi được hoạt hóa sẽ dùng vào các quá trình tổng hợp.
Khi không đủ phospho trong môi trường sự trao đổi chất ở nấm men bị thay đổi
đáng kể liên quan tới sự phá vỡ nhu cầu sử dụng hydratcacbon và nitơ. Nhu cầu sinh lý
về phospho đối với 10 tỷ tế bào nấm men vào khoảng 10 ÷ 13 mgP.

17. 7
Người ta thường dùng KH2PO4, K2HPO4 hoặc dung dịch chiết từ supephosphat
làm nguồn P và K. Trong dịch đường hóa từ tinh bột thường đủ P đáp ứng nhu cầu của
nấm men, rỉ đường củ cải cũng như rỉ đường mía thường thiếu P, vì vậy cần phải bổ
sung vào môi trường acid orthophosphoric hoặc supephosphat.
Lưu huỳnh là thành phần của một số acid amin trong phân tử protein và là nhóm
phụ (-SH) của một số enzyme CoA. Bởi vậy, khi không có mặt lưu huỳnh trong môi
trường sự trao đổi chất có thể không tổng hợp được protein. Những chất chứa lưu
huỳnh như acid amin (cystine, cysteine, metionine), vitamin (tiamin, biotin) và một số
hợp chất khác đóng vai trò quan trọng trong hoạt động sống của nấm men. Trong môi
trường nuôi cấy nấm men thường có (NH4)2SO4 làm nguồn amon và nguồn lưu huỳnh.
Trong môi trường với hàm lượng lưu huỳnh nhỏ làm tăng sự nảy chồi của nấm men.
Nhưng ở nồng độ 1mg/l lưu huỳnh đã kìm hãm quá trình này. Do vậy, khi sử dụng các
nguồn lưu huỳnh dinh dưỡng cho vi sinh vật nói chung, trong đó có nấm men, cần phải
thận trọng.
Các ion K+
, Ca2+,
Mg2+
cũng cần có trong môi trường nuôi cấy hoặc lên men.
Thông thường ion K+
được bổ sung cùng với các muối phosphat hoặc sunfat, ion Ca2+,
Mg2+
thường có mặt trong nước sinh hoạt, tuy nhiên khi hàm lượng ion Ca2+,
Mg2+
quá
cao (nước cứng), cần phải loại bớt hai ion này (làm mềm nước). Giúp cho quá trình
nuôi cấy vi sinh vật hiệu quả hơn.
 Dinh dưỡng các chất sinh trưởng [12], [4]
Những chất kích thích sinh trưởng là các vitamin, các base purin và pyrimidin.
Những nhân tố sinh trưởng cơ bản đối với nấm men không có sắc tố là 6 vitamin nhóm
B: inozit (B8), biotin (B7 hay H), acid pantotenic (B3), tiamin (B1), pyridoxine (B6),
acid nicotinic (B5 hay PP). Đối với nấm men có sắc tố đỏ cần các chất sinh trưởng là
tiamin, ngoài ra còn có acid paraaminobenzic.
Trong công nghiệp thường dùng các nguồn vitamin là cao ngô, cao nấm men (có
thể dùng dịch men tự phân hay nước chiết nấm men), nước chiết cám (cám gạo hoặc
cám mì), dịch thủy phân đậu tương bằng enzyme và đặc biệt là rỉ đường (cung cấp
bionin). Trong các thí nghiệm nuôi cấy ở phòng thí nghiệm vi sinh vật hoặc ở quy mô
nhỏ có thể dùng các dịch chiết từ giá đậu, từ rau cải, bắp cải, cà chua, cà rốt, khoai
tây,…làm nguồn vitamin bổ sung vào môi trường.

18. 8
2.2 NẤM MEN RHODOTORULA SP
2.2.1 Phân loại [20]
Theo phân loại Harison (1927) nấm men Rhodotorula sp thuộc:
 Giới: Nấm (fungi)
 Ngành: Basidiomycota
 Lớp: Urediniomycetes
 Bộ: Sporidiales
 Họ: Sporidiobolaceae
 Giống: Rhodotorula
Hình 2.1: Nấm men Rhodotorula sp [20],[21]
Hình 2.2: Tế bào nấm men Rhodotorula glutinis [19]
Nấm men Rhodotorula sp còn được gọi là nấm men sinh sắc tố carotenoid
(carotengensis), là một trong rất ít các chi nấm men có khả năng tổng hợp tích luỹ một
lượng lớn các sắc tố carotenoid trong đó chủ yếu là β-carotene, torulene, torularhodin.
Năm 1921, A. Harden là người đầu tiên phân lập được loài Rhodotorula
mucilaginose, tiếp sau đó năm 1928 Harison và nhiều nhà khoa học khác đã phân lập
được 34 loài, trong đó phổ biến nhất là 3 loài Rhodotorula glutinus, Rh. Mucilaginosa

19. 9
và Rhodotorula gracilis. Năm 2000, Krutzman và Fell cho rằng giống nấm men
Rhodotorula sp gồm 45 loài, theo mô tả của tác giả cho rằng loài Rh. mucilaginosa
trước đó có tên gọi là Rh. rubra, loài này tạo ra enzyme urease, không đồng hoá
nitrate, không phát triển trên cycloheximide hoặc nhiệt độ 40o
C và loài Rh. rubra thực
ra chỉ là một dạng riêng của loài Rh. glutinis, tên gọi Rh. ruba ở một số tài liệu hiện
nay không còn nữa và được thay thế bằng tên mới là Rh. Mucilaginosa [10],[11].
Riêng tác giả người Nhật Hasegawa lại dựa vào quang phổ hấp thụ sắc tố
carotenoide để chia giống nấm men Rhodotorula sp thành hai giống phụ là:
Rhodotorula (hấp thụ tối đa ở bước sóng 610nm) và Flavotorrula (hấp thụ tối đa ở
bước sóng 450nm).
Theo Lodder (1971), Koneman E.W. và Robert (1983), thì Rhodotorula sp thuộc
cơ thể đơn bào, nhóm nấm men không sinh bào tử, không có sợi khuẩn ty hay sợi
khuẩn ty giả và là nhóm vi sinh vật ưa ấm, khoảng nhiệt độ hoạt động từ 20 -
400
C.Chúng phân bố rộng rãi ở khắp nơi: trong đất, không khí, trên các vỏ lá cây: táo,
dưa hấu, dâu tây, dâm bụt,…
Khi quan sát dưới kính hiển vi tế bào nấm men Rhodotorula sp có dạng hình
tròn, oval, elip đến dạng thon dài hoặc gậy. Kích thước tế bào dao động trong khoảng
2 ÷ 5 µm chiều rộng, 2,5 – 10 µm chiều dài tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy và độ
tuổi.
Khuẩn lạc phát triển nhanh, bề mặt trơn nhẵn, bóng sáng hoặc mờ đục, đôi khi
ghồ ghề, mịn và nhớt. Mép khuẩn lạc không có răng cưa. Khuẩn lạc có màu từ kem,
hồng đến đỏ san hô cũng có khi có màu vàng và đỏ cam. Kích thước khuẩn lạc tuỳ môi
trường, có thể đạt từ 1 – 10 mm. Quan sát dưới kính hiển vi không hình thành sợi nấm,
một số có sinh sợi nấm giả nhưng rất kém phát triển, không hình thành bào tử túi [4].
2.2.2 Hình dạng và kích thước [3], [4], [12]
Rhodotorula sp có nhiều hình dạng khác nhau tùy thuộc vào điều kiện nuôi cấy
và loài khác nhau. Gồm hình trứng, hình dài, hình elip, hình cầu, tròn và hình gậy.
Rhodotorula sp có khuẩn lạc trơn, không nhăn, có màu từ kem đến vàng hoặc đỏ.
Sinh trưởng sinh dưỡng: khuẩn lạc màu cam đến màu đỏ, vàng, dạng bơ hoặc
nhầy.
Tế bào hình cầu, gần cầu, elip, trứng hoặc trứng kéo dài, thường nảy chồi ở đỉnh.
Có thể xuất hiện sợi giả và sợi thật.

20. 10
Bảng 2.2 Hình thái tế bào của một số loài Rhodotorula sp nuôi cấy tên môi
trường thạch malt từ các nguồn phân lập khác nhau [4]
STT Loài Màu khuẩn lạc Hình
dạng
Nguồn phân lập
1 Rh. Acheniorum Hồng Dài Quả dâu, lá lê
2 Rh. Araucariae Hồng Tròn cầu Gỗ cây bách tán
3 Rh. Aurantiaca Hồng hoặc đỏ Dài Không khí, bia,
đất
4 Rh. Bogoriensis Kem hoặc hồng Gậy
5 Rh. Diffluens Kem Tròn cầu,
elip
6 Rh. Fujisanense Kem hoặc hồng Gậy Cây nho dại
7 Rh. Glutinis Hồng hoặc đỏ Tròn cầu
8 Rh. Graminis Hồng Tròn cầu
9 Rh. Ingeniosa Kem Tròn cầu
10 Rh. Javanica Kem Dài
11 Rh. Lactosa Vàng, hồng
hoặc đỏ
Tròn cầu Không khí
12 Rh. Marina Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Con tôm
13 Rh. Minuta Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Không khí, biển
14 Rh.
Mucilaginosa
(rubra)
Kem, hồng hoặc
đỏ
Dài Nước, không khí,
…
15 Rh. Muscorum Kem hoặc nâu
nhạt
Gậy
16 Rh. Pallida Kem hoặc hồng Tròn cầu Nước biển, dưa
leo ngâm
17 Rh. Pilatii Kem Tròn cầu Cây tùng bách
18 Rh. Pilimanae Hồng hoặc đỏ Tròn cầu Nước, đất

21. 11
2.2.3 Cấu tạo và sinh sản của nấm men Rhodotorula sp [11]
2.2.3.1 Thành phần cấu tạo nấm men
Các nghiên cứu cho thấy, nấm men Rhodotorula sp có hình thái và cấu tạo tế bào
giống như các loài nấm men khác, được cấu tạo từ các thành phần.
a. Thành tế bào
Được cấu tạo từ các thành phần khác nhau, trong đó đáng kể nhất là: glucan,
manan, protein, lipit và một số thành phần nhỏ như kitin.
 Glucan: là hợp chất cao phân tử của D-glucoza. Đó là một polysacharit phân
nhánh có liên kết β-1,3 và β-1,6. Cả hai thành phần này phân bố đều trên thành
tế bào.
 Manan: là hợp chất cao phân tử của D-manoza, mỗi phân tử thường chứa 200 -
400 thành phần manoza. Thường manan liên kết với protit theo tỷ lệ 2:1. Manan
thường có mối liên kết α-1,6; α-1,3; β-1,3. Phân tử lượng của chúng khoảng
5.104
dalton.
 Protein: thường protein liên kết với các thành phần khác như là manan. Trong
thành phần của chúng chứa nhiều axit amin. Phân bố ở màng tế bào, gần sát bào
tương.
 Kitin: nằm ở phần nẩy chồi. Chúng chiếm số lượng rất nhỏ khoảng 3%. Đầu là
chất bền vững không bị enzym phá hủy, vì thế chúng có tác dụng bảo vệ chồi
còn non.
 Ngoài ra còn thấy trong thành tế bào có lipit ở dạng phospholipit, khoảng 1%-
10 %.
b. Màng nguyên chất
Màng nguyên sinh gồm các hợp chất phức tạp như protein, phospholipit, enzym
permerase.
Trong thời kì còn non màng nguyên sinh chất bám sát lấy thành tế bào làm cho
khả năng trao đổi chất của nấm men gặp khó khăn. Ngược lại ở thời kì tế bào già màng
nguyên sinh chất co lại, tạo thành khoảng trống giữa tế bào và chất nguyên sinh vì thế
mà khả năng trao đổi chất của nấm men gặp khó khăn. Hai hiện tượng này được gọi là
co nguyên sinh và trương nguyên sinh chất.
c. Nguyên sinh chất

22. 12
Tế bào còn non thì nguyên sinh chất càng đồng nhất, càng về già càng mất tính
đồng nhất do xuất hiện nhiều không bào và hạt voluten. Thành phần bao gồm: nước,
protit, lipit, gluxit, muối khoáng và enzym. Tế bào chất luôn luôn chuyển động,
thường chuyển động một chiều xung quanh thành tế bào.
d. Nhân
Ở Rhodotorula sp đã có nhân thật, nhân hình bầu dục hay hình cầu. Nó được bao
bọc bởi lớp màng bên trong là lớp dịch nhân. Nhân thường có hình bầu dục và hình
cầu. Giống như các vi sinh vật khác, nhân nấm men có chứa protein và acid nucleic. Ở
trạng thái lên men nhân tăng 20 - 30 lần so với ở trạng thái hô hấp.
e. Các thành phần khác
- Không bào: là nơi chứa đựng protease.
- Hạt không bào: thường nằm trong không bào, là chất dinh dưỡng của tế bào,
nguồn năng lượng cho tế bào, tham gia điều hoà các quá trình sinh trưởng và phát triển
của tế bào.
- Ty thể: cung cấp năng lượng hoạt động cho tế bào.
- Riboxom: tham gia vào nhiều quá trình sinh tổng hợp của nấm men.
- Volutin: không phải là thành phần cấu trúc tế bào, chúng xuất hiện ở những
điều kiện đặc biệt như khi nuôi cấy trên môi trường giàu hydratcacbon và phoshat vô
cơ. Số lượng volutin còn phụ thuộc vào tỷ lệ C : N và sự có mặt của S cũng như của
vitamin. Volutin đóng vai trò quan trọng sau:
+ Là chất dự trữ dinh dưỡng cho tế bào.
+ Tham gia điều hòa quá trình sinh trưởng, phát triển của tế bào.
+ Làm nguồn năng lượng cho tế bào.
2.2.3.2 Sinh sản nấm men [3], [4], [11]
Đa số loài của nấm men Rhodotorula sp sinh sản bằng cách nẩy chồi như: Rh.
pilimanae, Rh. pilatii, Rh. javaniti, Rh. ingniosa, Rh. diffluens và Rh. bogoriensis.
Ngoài ra, Rhodotorula sp còn sinh sản theo kiểu phân đôi nhưng giống Rhodotorula sp
không có kiểu sinh sản theo hữu tính.
a. Sinh sản bằng hình thức nẩy chồi
Đầu tiên hạch nấm men bắt đầu dài ra và sau đó hạch bắt đầu thắt lại ở chính
giữa. Tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con. Hạch một phần chuyển vào chồi và
một phần ở tế bào mẹ, nguyên sinh chất cũng chuyển sang chồi con. Khi chồi con gần

23. 13
bằng chồi mẹ nó sẽ được tách ra và sống độc lập. Đây là phương pháp sinh sản vô tính
chủ yếu nhất ở nấm men.
b. Sinh sản bằng hình thức phân đôi
Lúc đầu tế bào dài ra, sau đó từ từ thắt lại ở chính giữa, nơi thắt này nhỏ dần, nhỏ
dần tới khi đứt hẳn và tạo thành hai tế bào con độc lập. Hai tế bào con này giống hệt
nhau và đều mang một nửa vật chất di truyền của tế bào mẹ.
Tốc độ sinh sản của Rhodotorula sp nhanh, thời gian để số tế bào tăng gấp đôi
thường từ 2 ÷ 6 giờ.
Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men gồm bốn giai đoạn: Giai đoạn
thích nghi, giai đoạn phát triển, giai đoạn ổn định và giai đoạn diệt vong.
Thời gian sinh trưởng tốt nhất của Rhodotorula sp trong khoảng 24 - 48 giờ nếu
môi trường cung cấp đủ các chất cần thiết.
2.2.4 Đặc điểm sinh hóa [19], [22]
Nấm men Rhodotorula sp có một số đặc tính sinh hoá sau:
 Không lên men các loại đường như: D-glucose, D-galactose, maltose, me- α -D
glucoide, saccharose và nhiều loại đường khác nhưng chúng lại sử dụng các loại
đường này để cung cấp nguồn carbon cho việc xây dựng tế bào.
 Tạo ra ezyme urease.
 Đồng hoá DBB (Diazonium Blue B).
 Có chứa sắc tố carotenoid.
 Không tạo thành hợp chất loại tinh bột.
 Không tạo ra acid acetic.
 Không đồng hoá được inositol, đây là nét đặc trưng cơ bản nhất của
Rhodotorula sp khác với các giống nấm men Cryptococus, Candida.
 Khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid.

24. 14
2.2.5 Đặc điểm sinh lý:
Bảng 2.3 Đặc điểm sinh lý
Lên men -
D-Glucuronate +/-
Myo-inositol -
Đồng hoá nitrat +/-
Cơ chất giống tinh bột -
Phản ứng DBB +
Hoạt hoá Ureaza +
Coenzym Q9 hoặc Q10
Xylose -
Ghi chú :
+ : Lên men
- : Không lên men
Hình 2.3: Các sắc tố carotenoid chủ yếu của nấm men Rhodotorula sp [19]
Đã có nhiều công trình nghiên cứu về khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid
trên nhiều các nguồn cơ chất khác nhau, với các phương pháp nuôi cấy khác nhau: như
nuôi cấy gián đoạn, bán liên tục, lên men dịch thể, lên men bán rắn,… chỉ từ giống

25. 15
Rhodotorula sp hay nuôi cấy kết hợp với một chủng vi sinh vật khác như: nấm men,
nấm mốc, vi khuẩn.
2.3 BETA-CAROTENE (β-Carotene)
2.3.1 Giới thiệu về Carotenoids
2.3.1.1 Tổng quan về Carotenoids
a. Định nghĩa [22]
Carotenoids là các sắc tố hữu cơ tự nhiên được tìm thấy trong thực vật và một số
cơ thể sinh vật quang hợp, thực vật, tảo, nấm mốc, nấm men và vi khuẩn.
b. Lịch sử của carotenoids [17], [18], [19], [20]
Nghiên cứu sớm nhất về carotenoids là những ngày đầu của thế kỷ 19. Và
Carotenoid đã được phân lập lần đầu tiên trong lịch sử bởi Wackenroder vào năm 1831
(thu lập trên cà rốt) và nhiều phát hiện khác về carotenoids đã được đặt tên trong suốt
những năm 1800 dù cấu trúc của chúng vẫn chưa được biết.
Đến tận năm 1907 nhờ kinh nghiệm mà Willstatter và Mieg đã thiết lập được
công thức của beta-caroten C10H56 và cấu trúc này đã được giải thích bởi Karrer trong
năm 1930 -1931. Và trong năm 1919, Steenbock đã đưa ra giả thiết là có thể có mối
quan hệ giữa beta-caroten và vitamin A.
Năm 1837 Berzelius đã gọi sắc tố có màu vàng trong là cây là xanthophylls. Và
thập niên 1950, carotenoids đã được sinh tổng hợp để sử dụng như là một chất màu
thực phẩm.
Trong năm 1954 Roche đã bắt đầu sản xuất thương mại carotenoids. Có rất nhiều
nghiên cứu đã được thực hiện trong những năm 1970 – 1980 để xác định sự phù hợp
của beta-caroten để sử dụng trong thực phẩm và hoạt động của nó trong cơ thể người.
Và trong những năm đầu thập niên 80 beta-caroten được đề nghị có thể hữu ích trong
việc phòng chống ung thư và nó là một chất chống oxy hoá.
Ngày nay số lượng các carotenoids tìm thấy trong tự nhiên lên đấn 700 hợp chất
với các màu sắc khác nhau. Các carotenoids chủ yếu được tách từ các nguồn nguyên
liệu tự nhiên như thực vật và vi sinh vật.
c. Danh pháp và cấu tạo [4]
Có hai cách gọi tên carotenoids:
+ Tên truyền thống: tên theo nguồn gốc mà loại carotenoid đó được trích chiết
đầu tiên.

26. 16
+ Tên hệ thống: tên theo công thức hóa học. Carotenoid được gọi tên theo dẫn
xuất carotene với hai nhóm cuối được ký hiệu bằng các ký tự Hy Lạp (theo trình tự
alphabe).
Các tiếp đầu ngữ, tiếp vị ngữ được sử dụng để chỉ mức độ hydro hóa và sự hiện
diện của các nhóm chức thay thế.
Hình 2.4: Công thức cấu tạo của các carotenoids quan trọng [4]

27. 17
Tất cả các carotenoid có thể được xem như là dẫn xuất của acrylic C40H56 có
trung tâm là chuỗi gồm nhiều nối đôi liên hợp, do kết hợp với hydro (hydrogenation),
khử hydro (dehydrogenation), hình thành vòng (cyclization), thực hiện quá trình oxy
hóa (oxidation) tạo nên.
Carotenoid được tổng hợp đầu tiên là các tiền chất C5-terpenoid; isopentyl
diphosphat (IPP), hợp chất này sau đó chuyển thành geranyl diphosphat (C20). Hai
phân tử này kết hợp với nhau tạo thành phytoene sau đó tiếp tục khử hydro tạo thành
phytofluene, zeta-carotene và neurosporence để cho ra lycopene. Tiếp theo đó là sự tạo
vòng, sự khử hydro và sự oxi hóa, để tạo ra các carotenoid riêng biệt thường gặp trong
tự nhiên, tuy nhiên có một số ít các hợp chất được biết có sự chuyển hóa cấu trúc cuối
cùng dẫn đến hình thành hàng trăm các carotenoid khác nhau.
d. Phân loại
Carotenoids được chia làm 2 nhóm sắc tố chính:
+ Carotenes: gồm các hợp chất hydrocacbon carotenoid.
+ Xanthophylls: gồm các dẫn xuất carotene với nhóm chức có chứa oxy
(hydroxy, keto, epoxy, methoxy, các nhóm acid carboxylic).
Hình 2.5: Phân loại carotenoids [4]

28. 18
Theo Bong và cộng sự (2004) các carotenoid chính có giống men nghiên cứu
Rhodotorula sp hiện điện đủ hai nhóm, trong đó torulene (I), beta-carotene (III) thuộc
nhóm carotenes; torularhodin (II) thuộc xanthophylls.
e. Tính chất [4], [18], [19]
Carotenoid thường kết tinh ở dạng tinh thể. Tinh thể carotenoid có nhiều dạng
khác nhau và kích thước của chúng cũng rất khác nhau như dạng hình kim dài
(lycopen, δ-carotene), hình khối lăng trụ đa diện (α-carotene), dạng hình thoi (β-
carotene), kết tinh vô định hình (γ-carotene).
Nhiệt độ nóng chảy cao, khoảng 130 – 2200
C.
Độ hòa tan thay đổi tùy loại dung môi. Tinh thể carotenoid không tan trong
nước, tan tốt trong các dung môi như chloroform, dichloromethane. Hầu như tất cả
carotenoid đều tan trong chất béo và các dung môi không phân cực.
Các carotenoid tự do tạo màu kem, vàng, cam, hồng, đỏ tùy theo loại hợp chất,
nguồn nguyên liệu, điều kiện nuôi trồng, thời tiết,… dạng caroteneoprotein tạo dãy
màu từ xanh lá, tím, xanh dương và đen. Khi đun sôi sẽ chuyển sang màu đỏ cam do
protein bị biến tính, phức hợp với carotenoid bị phá huỷ, màu carotenoid trở lại bình
thường.
Do hệ thống nối đôi liên hợp nên carotenoid dễ bị oxy hóa mất màu, hoặc đồng
phân hoá, hydro hóa tạo màu khác. Các tác nhân ảnh hưởng đến độ bền màu là nhiệt
độ, phản ứng oxy hóa trực tiếp hoặc gián tiếp, ion kim loại, ánh sáng, tác dụng của
enzyme (peroxidase, lipxidase, lipperoxidase)…
2.3.1.2 Cơ chế sinh tổng hợp Carotenoids trong sinh vật [4],[17],[20]
Toàn bộ quá trình sinh tổng hợp sắc tố carotenoid của nấm men có thể chia thành
3 giai đoạn:
 Giai đoạn cảm ứng ánh sáng (tối thiểu 12 giờ).
 Giai đoạn tổng hợp các enzyme - giai đoạn này xảy ra trong tối.
 Giai đoạn tổng hợp carotenoid phụ thuộc vào ánh sáng.
Giai đoạn đầu tiên hình thành các tiền terpenoids gồm 5 carbon ban đầu. Giai đoạn
hai là hình thành các hợp chất C40. Giai đoạn cuối cùng là thay đổi chuỗi C40 trong hệ
thống các carotenoid. Có nhiều hệ enzyme khác nhau được sử dụng vào giai đoạn cuối
của quá trình tổng hợp các sterol và carotenoid, chúng có chung con đường là thông
qua farnesyl pyrophosphate. Giống Rhodotorula sp thông qua tổng hợp acid mevalonic

29. 19
tương tự với con đường tổng hợp carotene của các vi sinh vật sinh sắc tố carotenoid
khác (Scharf và Simpson, 1968).
Hình 2.6:Con đường tổng hợp carotenoid ở vi sinh vật do Simpson đề nghị [4]
Theo Hornero-Mendez D. và Britton G. (2002 ) có ít nhất 700 loại carotenoid đã
được mô tả theo 2 con đường sinh tổng hợp đã được biết. Phần lớn là các carotenoid
do các loài thực vật và vi sinh tổng hợp theo con đường C40. Như vậy có nhiều chứng
cứ chắc chắn rằng sự hình thành carotenoid trong nấm men theo kiểu chuỗi từ nhiều
tiền chất bão hòa. Tuy nhiên kết quả về sự hình thành vòng chưa rõ Nhưng nhìn

30. 20
chung, quá trình sinh tổng hợp carotenoids trong sinh vật được thực hiện qua hai giai
đoạn
 Sinh tổng hợp tiền chất isoprenoid (IPP)
 Sinh tổng hợp carotenoids từ tiền chất IPP.
2.3.2 Giới thiệu về Beta-Carotene
2.3.2.1 Giới thiệu về Beta-Carotene [19]
Beta-carotene là một phân tử cân đối được cấu tạo do 1 chuỗi prolene và 2 vòng
β -ionone ở 2 đầu, khi thuỷ phân cho 2 phân tử vitamin A. Chuỗi liên kết dài sẽ tạo ra
màu cam cho beta-carotene.
Hình 2.7: Cấu trúc phân tử Betacaroten [18]
Hình 2.8: Cấu trúc phân tử Betacaroten trong không gian 3D [21]
2.3.2.2 Tính chất [4],[18]
Beta-carotene là đồng phân quan trọng của hydrocacbon carotene. Tên gọi khác:
Natural Extracts (carotenes), Natural β-carotene, carotenesnatural; CI Food Orange 5,
mixed carotenes, INS No. 160a(ii); CI (1975) No. 75130; CI (1975) No. 40800 (β-
Carotene), : b,b-Carotene,...
Phân nhóm: thuộc nhóm Carotenoid.
Công thức phân tử: C40H56 (β-Carotene).
Khối lượng phân tử: M = 536,88 (β-Carotene).
Nhiệt độ nóng chảy: 1830
C
Độ hoà tan: beta-carotene có độ hòa tan rất khác nhau như sau:

31. 21
+ Tan tốt trong chloroform, benzen, CS2.
+ Tan trung bình trong ether, petroleum ether, dầu thực vật.
+ Tan hạn chế trong methanol, ethanol.
+ Không tan trong nước, acid, hợp chất alkane.
Tinh thể beta-carotene có dạng hình lăng trụ 6 mặt màu tím đậm nếu kết tinh từ
dung môi benzen-methanol, nếu kết tinh từ dung môi petroleum ether có dạng lá hình
thoi gần như vuông, màu đỏ. Dung dịch beta-carotene loãng có màu vàng. Beta-
carotene có độ hấp thu cực đại trong chloroform tại bước sóng 497nm và 466nm. Vì
có 2 vòng β- ionone ở 2 đầu nên beta-carotene có hoạt tính provitamin A mạnh nhất.
Beta-caroten là một chất chống oxi hoá vì vậy mà nó có thể được dùng để chống
lại một số bệnh ung thư và căn bệnh khác. Beta-caroten là một chất tự nhiên hiện diện
trong những trái cây và rau quả màu vàng xanh. Trong cơ thể, beta-carotene nằm trong
vitamin A và nó được sử dụng như là một chất bổ sung của vitamin A để ngăn chăn
hoặc điều trị những chứng thiếu hụt vitamin A.
Beta-carotene tự nhiên gồm hai dạng đồng phân. Một đồng phân quan trọng là 9
– cis beta – carotene, đồng phân còn lại là all – trans beta – carotene. Các đồng phân
này đều có công thức phân tử giống nhau nhưng cách sắp xếp của chúng trong không
gian ba chiều lại khác nhau. Các đồng phân như vậy thường có những đặc tính sinh
hóa học rất khác biệt. Hợp chất 9 – cis beta – carotene là thành phần chống oxi hóa
chủ yếu của beta-carotene. Trong khi đó, loại beta-carotene tổng hợp chỉ chứa loại
đồng phân all – trans beta – carotene có khả năng chống oxi hóa rất thấp.
2.3.2.3 Sinh tổng hợp Vitamin A
Beta-caroten còn được gọi là tiền vitamin A, bởi vì nó là một trong những tiền
thân quan trọng nhất của vitamin A trong chế độ ăn uống của con người. Nếu ta so
sánh 2 phân tử sẽ thấy rằng vitamin A (retinol) là ½ phân tử beta-caroten.
Hình 2.9: Cấu trúc Vitamin A [19]

32. 22
Sự sinh tổng hợp vitamin A từ β-Carotene:
Hình 2.10: Sinh tổng hợp vitamin A từ Beta-Carotene [4]
Khi vào cơ thể beta-carotene chuyển hóa thành vitamin A. Beta-carotene bị phân
cắt ở giữa mạch carbon trung tâm thành 2 phân tử retinal bằng enzyme 15,15’-
dioxygenase. Retinal tiếp tục được chuyển hóa bởi enzym thành retinol. Retinol tạo
thành có thể được hấp thu trực tiếp từ thức ăn vào thành ruột hay sẽ được vận chuyển
nhờ liên kết với protein đến các cơ quan cần thiết hoặc đến gan là nơi tích luỹ vitamin.
Ngoài ra beta-carotene cũng có thể được chuyển hóa thành những chất khác.
2.3.2.4 Sinh tổng hợp Carotenoid ở nấm men
Hiện nay, nấm men đang được tập trung nghiên cứu khả năng sinh tổng
carotenoids của chúng. Một phần là do nấm men ít gây độc và có thể là thức ăn bổ
sung cho con người và động vật.
Một vài chủng nấm men đã được phân loại dựa trên khả năng và đặc tính sinh
carotenoids của chúng. Có rất nhiều loại carotenoid được tổng hợp từ nấm men, trong
đó chủ yếu: carotene, torulene, lycopene, astaxanthin, torularhodin, … Quá trình sinh
tổng hợp carotenoid của nấm men cũng trải qua hai giai đoạn để tạo ra các sản phẩm
carotenoid khác nhau là:
 Sinh tổng hợp IPP

33. 23
 Sinh tổng hợp carotenoids từ IPP
2.3.2.5 Tầm quan trọng của Beta-Carotene đối với sức khoẻ con người
Beta-carotene còn được biết đến là tiền vitamin A. Khi hấp thụ vào cơ thể nó
được chuyển thành vitamin A với tỷ lệ 1mcg beta-caroten thì được 0,167mcg vitamin.
Nhưng ngoài những tác dụng như vitamin A, nó còn là một nguồn cung cấp vitamin A
an toàn, không hề gây độc tính quá liều như vitamin A và điều đặc biệt là betacaroten
khử các gốc tự do tốt hơn vitamin A rất nhiều.
Các chế phẩm beta-caroten có hàng loạt tác dụng có lợi cho sức khoẻ. Phải kể
đến những tác dụng như: khả năng hoạt hóa một số tế bào miễn dịch của cơ thể, beta-
caroten có thể giảm tổn thương DNA, bảo vệ da tránh tác hại của ánh nắng mặt trời, hạ
thấp nguy cơ mắc một số bệnh ung thư, góp phần làm giảm nồng độ cholesterol trong
máu cũng như một số bệnh tim mạch liên quan.
Tia cực tím (Ultraviolet: UV) trong ánh nắng mặt trời tạo ra rất nhiều gốc tự do
gây tổn thương tê bào da. Các vitamin và các dưỡng chất có khả năng chống oxy hóa
thường tập trung rất nhiều ở da, như beta-caroten.
Phân tử vitamin A khi oxy hóa gốc aldehyt của nó sẽ hình thành nên một chất
mới có tên là opsin, là chất tham gia vào cấu tạo của mắt. Do đó, beta-carotene có ảnh
hưởng tốt đến thị lực của con người.
Ngoàii ra, beta- caroten còn tham gia quá trình sinh tổng hợp glycoprotein, chất
mà nếu thiếu hụt trong cơ thể sẽ dẫn đến sự phát triển không bình thường của xương.
Beta-carotene còn được tìm thấy trong huyết tương người. Các nghiên cứu về sức
khỏe y học đã cho thấy những người có lượng beta-carotene đưa vào cơ thể cao và có
một lượng lớn beta-carotene trong huyết tương thì có khả năng giảm thiểu các mối
nguy hiểm của bệnh ung thư phổi.
Beta-carotene còn có khả năng ngăn ngừa bệnh tim, dựa trên khả năng của beta-
carotene là có thể kìm chế các chất LDL (Low Density Lipoprotein ) cholesterol gây
hại. Theo một nghiên cứu được công bố trên tờ AmericanJournal of Clinical Nutrition,
các chuyên gia đã tính toán rằng phụ nữ sử dụng ít nhất 5.37mg (8.950IU) beta-
carotene mỗi ngày có thể chống lại sự oxy hóa LDL.
Có khả năng ngăn ngừa ung thư là một trong những đặc tính quan trọng nhất của
beta-carotene. Khả năng ngăn ngừa bệnh ung thư của beta-carotene còn phải dựa trên

34. 24
sự kết hợp của beta-carotene với các carotenoids khác như lycopene và các chất chống
oxy hóa như vitamin C, vitamin E.
Ngoài ra trên thế giới còn có những công trình đang nghiên cứu về beta-caroten
như các phát hiện cho thấy beta-caroten có thể là một vũ khí quan trọng trong việc né
tránh được các vấn đề về trí nhớ mà có thể là điềm báo của căn bệnh Alzheimer’s và
các chứng bệnh mất trí nhớ khác.
2.4 Lên men bán rắn [10],[14]
2.4.1 Khái quát về lên men bán rắn (SSF)
Lên men trên môi trường bán rắn hay lên men trên cơ chất rắn (SSF) là một quá
trình trong đó sự sinh trưởng của vi sinh vật và sự hình thành sản phẩm diễn ra trên bề
mặt của nguyên liệu hầu như không có mặt nước tự do, cơ chất chứa ẩm dưới dạng hấp
phụ trong mạng chất rắn.
Lên men trên môi trường bán rắn đã được sử dụng từ rất lâu trước khi các quá
trình sinh hóa và vi sinh có liên quan được tìm hiểu. Năm 2600 trước công nguyên
người Ai Cập đã sớm sử dụng SSF để làm ra bánh mì, sự chuẩn bị Koji cho nước
tương đậu nành và sản xuất miso cách đây 1000 năm ở Nhật Bản và Đông Nam Á đã
chứng minh sự ứng dụng SSF trong đời sống từ rất lâu. Ngày nay SSF đang được quan
tâm trở lại một cách mạnh mẽ trên toàn thế giới và được sử dụng rộng rãi nhằm gia
tăng giá trị cho các sản phẩm từ các nguồn nguyên liệu rẻ tiền, các phế liệu nông
nghiệp và các chất thải công nghiệp.
Các quá trình và sản phẩm lên men SSF được nghiên cứu từ 1920-1940 bao gồm
sản xuất acid Gluconic, acid citric, và các loại enzyme. Giữa năm 1940-1950 công
nghệ lên men đã phát triển một cách nhanh chóng và cho ra đời những sản phẩm đầu
tiên của cả phương pháp lên men trong lòng dung dịch và lên men trên môi trường bán
rắn như kháng sinh, penicillin, …Từ năm 1980, lên men SSF đã phát triển trên nhiều
khía cạnh mở rộng việc sử dụng trên nhiều loại vi sinh vật khác nhau, sử dụng phế liệu
như một loại cơ chất rẻ tiền, dễ kiếm và phần nào giảm chất gây ô nhiễm môi trường,
khám phá các sản phẩm mới.
2.4.1.1 Các loại vi sinh vật sử dụng trong lên men bán rắn
Vi khuẩn, nấm men, nấm mốc đếu sinh trưởng và phát triển được trên cơ chất
rắn. Nấm men được dùng trong sản xuất cồn công nghiệp, cồn thực phẩm, thức ăn gia

35. 25
súc,… Vi khuẩn được dùng trong sản xuất phân trộn (composting), và các quá trình
công nghệ thực phẩm khác.
2.4.1.2 Các cơ chất thường dùng trong lên men bán rắn
Cơ chất chính trong SSF là các nguyên liệu thô, phụ phẩm rẻ tiền của ngành
nông nghiệp và những phế liệu của các ngành công nghiệp khác, thường có cấu trúc đa
phân tử (cung cấp nguồn hidrocacbon và năng lượng) như các nguyên liệu chứa tinh
bột: gạo, lúa mì, gạc ngô, xenluloza,.... các phế liệu ngành công nghiệp thực phẩm:
cám, cám mì, sắn, tấm, củ cải đường, bã mía, cùi bắp, vỏ cam, trấu, mạc cưa, bã sắn,
….và các nguyên liệu như lignoxenluloza, các chất thải giàu pectin cũng được dùng
trong SSF để sản xuất ra nhiều sản phẩm có giá trị cao.
2.4.1.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy bề mặt [15]
Nhìn chung khi lên men bán rắn, cũng như các quá trình lên men khác các thông
số chính cần được kiểm soát bao gồm: các dưỡng chất cần cung cấp, hàm ẩm, nhiệt độ,
pH và độ thoáng khí.
 Các dưỡng chất cần phải cung cấp
Trong SSF do tốc độ khuếch tán cơ chất hạn chế nên cũng hạn chế sự tiếp xúc
giữa vi sinh vật và cơ chất. Một chỉ số quan trọng trong dinh dưỡng quyết định sự sinh
trưởng của SSF là tỷ số C/N. Tùy từng loài vi sinh vật mà có chỉ số C/N thích hợp
khác nhau, chính vì vậy khi thay đổi chỉ số C/N cũng sẽ làm ảnh hưởng đáng kể đến
thành phần dinh dưỡng cũng như khả năng sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật
nuôi cấy trên môi trường SSF. Trong hầu hết các hệ thống SSF, Cacbon có nguồn gốc
từ các nguyên liệu tinh bột và xenluloza tự nhiên, trong khi nguồn nitơ thường được bổ
sung vào. Nguồn nitơ vô cơ thường được bổ sung nhất là NH4Cl, (NH4)2SO4,
NH4NO3, D.A.P, urê, …. Trong khi nguồn nitơ hữu cơ là bánh dầu đậu nành, bã đậu
nành, dịch chiết nấm men, pepton.
 Hàm ẩm
Hàm ẩm của cơ chất là một thông số rất quan trọng quyết định đến sự thành công
của quá trình lên men, có thể được theo dõi qua chỉ số hoạt tính của nước (aw). Đa số
các vi khuẩn sinh trưởng ở mức aw cao trong khi nấm sợi và một số các nấm men sinh
trưởng ở mức aw thấp và một số sinh trưởng ở mức độ aw trung bình. Tuy nhiên khi
mức độ aw quá cao làm giảm độ xâm nhập vào khoảng không nội bào, khả năng
khuếch tán oxy thấp, giảm sự trao đổi khí, giảm bề mặt cơ chất và tăng nguy cơ nhiễm

36. 26
tạp khuẩn. Ngược lại khi aw thấp dẫn đến giảm sự trương nở cơ chất và giảm sự sinh
trưởng của vi sinh vật.
 Nhiệt độ
Nhiệt độ là một trong những thông số có ảnh hưởng đến các quá trình SSF, do
mỗi tế bào có một nhiệt độ tối ưu riêng để sinh trưởng và phát triển. Trong SSF một
lượng lớn nhiệt được trao đổi và điều này có liên quan chặt chẽ đến hoạt tính trao đổi
chất của vi sinh vật. Kiểm soát nhiệt độ đối với SSF còn nhiều khó khăn đặc biệt là khi
SSF quy mô lớn, khi nồng độ cơ chất cao sự tăng nhiệt trên một đơn vị thể tích là lớn
hơn nhiều so với lên men trên môi trường lỏng.
 pH ban đầu
Mặc dù pH là một yếu tố cần quan tâm, nhưng việc điều khiển và kiểm soát pH
trong SSF là không đơn giản. Việc tạo ra các điện cực để đo pH của chất rắn ẩm khi
không có sự hiện diện của nước tự do rất khó khăn. Tuy nhiên dung dịch đệm tốt sẽ
giúp ổn định pH trong suốt quá trình lên men. Điểm thuận lợi này được khai thác trong
việc điều chỉnh pH của chất rắn thông qua việc sử dụng nước ở mức pH mong muốn
làm chất tạo độ ẩm cho môi trường.
 Nhu cầu oxy
Năm 1992, Han và Mudgett nhận thấy rằng mức cân bằng của oxy và CO2 trong
không khí có ý nghĩa rất lớn đến sự tạo thành sắc tố và cũng ít nhiều ảnh hưởng đến sự
tăng trưởng của nấm khi nuôi trên môi trường bán rắn. Trong điều kiện thiếu oxy, có
sự tạo thành nhiều ethanol, CO2 và lượng sắc tố được tạo ra ít hơn.
Cơ chế truyền oxy không khí cho các vi sinh vật hiếu khí vẫn chưa rõ ràng,
nhưng chúng thường có khả năng tồn tại do hòa tan trong màng nước xung quanh bề
mặt hạt cơ chất. Sự thông khí không chỉ cung cấp oxy mà còn tăng cường việc loại trừ
CO2 và tăng cường việc trao đổi nhiệt trong quá trình lên men.
2.4.2 Các ứng dụng và yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi bán rắn với nấm
men Rhodotorula sp
Các công bố về khả năng lên men bán rắn của giống nấm men Rhodotorula
không nhiều. Tuy nhiên theo các tài liệu thu được bước đầu cho thấy giống nấm men
này có khả năng lên men bán rắn. Nghiên cứu gần nhất là của Jacob (1991) đã thành
công khi lên men bán rắn nấm men Rhodotorula gracilis trên môi trường cơ chất là
cám mì có bổ sung dinh dưỡng. Theo Jacob nấm men dầu Rh. gracilis có khả năng

37. 27
hình thành lượng sinh khối cao hơn (13,7g/l) và chất béo (20,3%) trên môi trường
nghèo nitrogen, rẻ tiền và mang lại hiệu quả kinh tế cao đó là rỉ đường không chứa
dịch chiết nấm men bằng phương pháp lên men chìm. Tuy nhiên khi tiến hành lên men
bán rắn trên cơ chất cám mì có bổ sung các nguồn dinh dưỡng khác nhau có ảnh
hưởng đến lượng sinh khối, protein tạo thành, sự hình thành dầu, sự hiện diện của các
acid béo và tỷ lệ giữa acid béo bão hòa và không bão hòa. Hàm lượng lipid ban đầu
trong môi trường điều khiển là 3,5% trong khi với môi trường cám mì, mật rỉ có bổ
sung khoáng chất tăng lên đến 69,8%. Sản phẩm sau lên men bán rắn chứa sắc tố đỏ
carotenoide, tiền vitamin B12 và một số acid béo bão hòa.
Quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men Rhodotorula sp chịu ảnh hưởng
của nhiều yếu tố thuộc môi trường dinh dưỡng (nguồn carbon, nguồn nitrogen, nguồn
khoáng đa và vi lượng) và điều kiện nuôi cấy (nhiệt độ, pH, ánh sáng, hàm lượng oxy
hòa tan,...)
2.4.2.1 Ảnh hưởng của nguồn nitrogen [11]
Nguồn cung cấp nitrogen rất cần cho hoạt động trao đổi chất của nấm men Rh.
glutinis. Nitrogen sử dụng dưới dạng NH4.
+ Có tác dụng kích thích quá trình tích luỹ sinh khối lớn nhất. Hàm lượng chất
béo trong tế bào và quá trình chuyển hóa đường đạt cực đại khi sử dụng nguồn
nitrogen là (NH4)2SO4.
Theo nghiên cứu của nhiều tác giả thì ảnh hưởng của nguồn nitrogen đến sự tổng
hợp carotenoide của nấm men Rhodotorula sp có quan hệ đặc biệt với khả năng sử
dụng các nguồn nitrogen.
Nakagawa và Tatsumi (1960) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitrogen
khác nhau và nhận thấy nấm men Rh-100 cho sản lượng carotenoide cao nhất với
nguồn nitrogen là valine, leucine và asparagine, tỷ lệ nguồn C/N tốt nhất là 50. Vecher
và cộng sự khi dùng nguồn nitrogen là lysine và glutamic acid cho thấy loài Rh.
gracilis phát triển và hình thành carotene tốt.
Khaled M.Ghanem và cộng sự (1990) hàm lượng nitrogen trong môi trường nuôi
cấy ảnh hưởng lớn đến lượng chất béo tạo thành và chất béo đạt cực đại khi nồng độ
(NH4)2SO4 là 5g/l, tuy nhiên lượng chất béo tạo thành bị giảm đi khi tăng nitrogen.
Điều này tương tự với quá trình trao đổi chất được ghi nhận ở nhiều loài nấm men và
nấm mốc khác nhau. Nhiều nấm men lại có khả năng tích luỹ lượng lớn chất béo khi

38. 28
phát triển trên môi trường có dư carbon và thiếu nitrogen. Hàm lượng nitrogen trong
môi trường nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến lượng lipid tạo thành và lipid đạt cực đại khi
nồng độ (NH4)2SO4 là 5g/l. Tuy nhiên lượng lipid tạo thành bị giảm đi khi tăng lượng
nitrogen. Điều này tương tự với quá trình trao đổi chất được ghi nhận ở nhiều loài nấm
men và nấm mốc khác nhau. Nhiều nấm men lại có khả năng tích luỹ lượng lớn lipid
khi phát triển trên môi trường có dư carbon và thiếu nitrogen.
2.4.2.2 Ảnh hưởng của nguồn carbon [4],[11]
Nguồn carbon ảnh hưởng rất lớn đến sự phát triển của khuẩn lạc, khả năng tổng
hợp và thành phần các sắc tố carotenoids cũng như sự tích luỹ sinh khối, các acid béo
của giống nấm men Rhodotorula sp. Theo Wittmann (1957) nấm men Rh. rubra cho
hiệu suất tổng hợp torularhodin trên môi trường có nguồn nitrogen là asparagine và
nguồn carbon là glycerol, nhưng với nguồn carbon là sucrose cho hiệu suất cao nhất là
torulene, β-carotene, γ-carotene và sản lượng carotene cao nhất phụ thuộc vào điều
kiện nuôi cấy. Nấm men Rh. rubra có khả năng cho hàm lượng sinh khối tế bào cao
nhất trên nguồn carbon là glucose nhưng khi sử dụng đường fructose, glycerol và
sucrose thu được hàm lượng torularhodin và β-carotene cao hơn so với khi dùng
glucose, ngược lại glycerol lại kém hơn glucose ở khả năng hình thành torulene.
2.4.2.3 Vai trò của các muối
Theo Zalashko và cộng sự (1984) cho rằng trong môi trường, muối làm gia tăng
hàm lượng acid béo, sterol và triglyceride. Các tác giả Bhosale P., Grade R.V cũng kết
luận rằng chủng đột biến Rh. glutinis mutant 32 cần phải được cung cấp thêm các
khoáng chất là K2HPO4, KH2PO4 và MgSO4.7H2O vào môi trường nhân giống lẫn môi
trường nuôi cấy khi tiến hành lên men nuôi cấy thu nhận sắc tố carotenoide. Khi môi
trường không có NaH2PO4 nấm men phát triển yếu và hàm lượng lipid thấp. Ở nồng
độ NaH2PO4 0,5g/l hiệu suất lên men cao nhất. Mặt khác thay đổi hàm lượng các muối
K2SO4, ZnSO4.7H2O và FeCl3 (cùng một thời điểm).
Trong môi trường nuôi cấy hầu hết các thí nghiệm cho thấy các muối này không
ảnh hưởng đến hoạt lực lên men.
Một số loài nấm men thuộc giống Rhodotorula sp bị ức chế ở nồng độ muối trên
5%, hiện tượng này đã giải thích thích vì sao khả năng lên men của các nấm men càng
thấp khi ở nồng độ muối càng cao. Các tài liệu cho thấy nhiều loài nấm men thuộc

39. 29
giống Rhodotorula sp khá thích hợp với môi trường nước biển, môi trường muối kim
loại kiềm.
2.4.2.4 Ảnh hưởng của các chất tự nhiên và dầu bổ sung vào
Các thí nghiệm cho thấy nấm men Rh. glutinis cần bổ sung thêm một số các chất
có nguồn gốc tự nhiên. Bột ngô ngâm (CSS – corn steep solid) làm tăng đáng kể khả
năng tổng hợp chất béo của nấm men (đạt 62,4% trọng lượng sinh khối) so với khi
không bổ sung thêm (37%). Hàm lượng CSS tối ưu cho hàm lượng chất béo và hệ số
chuyển hóa chất béo cực đại là 5g/l môi trường. Nấm men khi được bổ sung thêm dầu
hạt bông với hàm lượng 10g/l cũng làm tăng đáng kể khả năng chất béo có trong sinh
khối tế bào nấm men. Điều này phù hợp với các tài liệu được công bố trước đây là
nhiều loại nấm cần bổ sung thêm các vật liệu chứa chất béo (gồm các loại dầu và các
acid béo).
2.4.2.5 Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến quá trình lên men bán rắn
(Solid State Fermentation: SSF) [10], [11], [13]
Quá trình lên men bán rắn liên quan đến sự phát triển vi sinh vật xảy ra trong các
phần tử rắn nhỏ ẩm của lớp cơ chất, trong đó có một phần hay nhiều phân tử nước tự
do trên bề mặt của các phần tử cơ chất rắn. Cơ chất rắn sử dụng trong lên men bán rắn
là những vật liệu hỗn hợp không đồng nhất, thường là các phế phụ phẩm của ngành
công nghệ thực phẩm. Nuôi cấy bán rắn thường tiến hành trên các khay, các túi nhựa
plastic hay các ống hình trụ và không nhất thiết phải thanh trùng môi trường. Quá trình
SSF cho đến nay vẫn chưa được hiểu thấu đáo về các quy luật của kỹ thuật sinh học,
hóa sinh, vi sinh và sinh học phân tử.
 Độ ẩm
Hoạt độ nước sử dụng trong SSF có ý nghĩa thực tiễn cao trong công nghiệp do
giảm được lượng nước thải rất nhiều so với lên men dịch thể. Trong phương pháp SSF
có thể xem sự tăng trưởng và phát triển của vi sinh vật trên cơ chất rắn không có sự
hiện diện của nước tự do. Nước trong hệ thống tồn tại dưới dạng phức trong cơ chất
hoặc chỉ là một lớp mỏng được hấp phụ trên bề mặt của phân tử hoặc được liên kết
nhẹ trong vùng mao mạch của cơ chất. Khi nước trong cơ chất quá cao sẽ hình thành
nước tự do. Hàm ẩm trong SSF ảnh hưởng đáng kể đến sự tăng trưởng của vi sinh vật,
không có mức độ ẩm tối ưu cho toàn bộ cơ chất và vi sinh vật, thường độ ẩm thay đổi
khoảng 60 -75 %. Do đó đòi hỏi hàm lượng nước của vi sinh vật thể hiện ở dạng hoạt

40. 30
độ (aw). Việc giảm aw sẽ ảnh hưởng đến tăng trưởng của vi sinh vật, pha loãng kéo dài,
giảm tỷ lệ tăng trưởng và kết quả dẫn đến lượng sinh khối bị thấp (Oriol et al., 1988).
 pH ban đầu
Theo các tài liệu nghiên cứu cho thấy nấm men Rhodotorula sp thích hợp ở pH
hơi acid từ 4 – 6 tùy theo điều kiện nuôi cấy khác nhau có thể điều chỉnh pH sao cho
phù hợp.
 Nhiệt độ và sự truyền nhiệt
Do cơ chất rắn có khả năng truyền nhiệt kém nên khi vi sinh vật phát triển sẽ tạo
ra một gradient về nhiệt gây tích tụ nhiệt và làm tăng hàm lượng ẩm của môi trường
trong SSF gây ra những khó khăn trong quá trình truyền nhiệt. Chính vì vậy biện pháp
giảm nhiệt chủ yếu của SSF theo quy mô công nghiệp thường dùng phương pháp làm
lạnh bằng bốc hơi có khả năng làm giảm nhiệt độ của môi trường hiệu quả nhất. Chức
năng chính của phương pháp này là làm thông khí, cung cấp oxy cho vi sinh vật tăng
trưởng và loại bỏ CO2 hoặc cũng có thể hạ nhiệt độ phòng nuôi cấy giúp việc giải nhiệt
giữa các lớp cơ chất và không khí. Việc duy trì nhiệt và hàm lượng ẩm ổn định trong
phương pháp SSF ở quy mô lớn là rất khó, tuy nhiên cũng có thể thực hiện được với
các thiết bị phù hợp riêng.
 Ảnh hưởng của môi trường không khí [15]
Sự thông khí trong SSF thực hiện 4 chức năng sau: duy trì điều kiện hiếu khí;
đuổi CO2 ra khỏi môi trường; duy trì nhiệt độ cho cơ chất; điều hòa mức độ ẩm. Năm
1992, Han và Mudgett nhận thấy rằng mức cân bằng của O2 và CO2 trong không khí
có ý nghĩa rất lớn đến sự tạo thành sắc tố và cũng ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của
nấm men khi nuôi trên môi trường bán rắn. Nấm men này không thể sống trong điều
kiện kỵ khí khi sử dụng glucose như cơ chất. Nhưng có thể sống trong điều kiện O2
thấp. Trong điều kiện thiếu oxy, có sự tạo thành nhiều ethalnol, CO2 và lượng sắc tố
được tạo ra ít hơn.
 Ảnh hưởng của ánh sáng
Các sắc tố trong tế bào nấm men Rhodotorula sp được tạo thành bắt đầu vào cuối
giai đoạn phát triển cấp số và phụ thuộc vào ánh sáng. Ở nhiệt độ thấp khoảng 200
C
hàm lựơng beta-carotene khi được chiếu sáng tăng không đáng kể so với khi không
được chiếu sáng. Theo Tada Mikiro và cộng sự (1982) nấm men Rhodotorula minuta
là loài ít có khả năng sinh tổng hợp sắc tố carotenoid trong tối, khi tế bào được chiếu

41. 31
sáng sự hình thành carotenoide và sinh khối tế bào tăng gần như tuyến tính sau 70 giờ
nuôi cấy và sau đó hàm lượng carotenoide sẽ không đổi nhưng lượng tế bào vẫn tiếp
tục tăng.
2.4.2.6 So sánh SSF với quá trình lên men trên môi trường lỏng
SSF có những điểm vượt trội so với lên men trên môi trường lỏng ở quy mô
phòng thí nghiệm với quy mô sản xuất công nghiệp ở môi trường nuôi cấy SSF đơn
giản, tận dụng các phế phụ phẩm của các ngành sản xuất nông nghiệp. Ví dụ như ngủ
cốc, các sản phẩm động thực vật và các phế liệu khác, ... tất cả đều là những cơ chất
tiềm năng của SSF. Ngoài ra khi lên men bằng SSF nồng độ cơ chất cao hơn, giảm
năng lượng và lượng nước sản xuất cũng như nước thải, vốn đầu tư thấp. Mặc dù lên
men SSF có nhiều ưu điểm, lợi ích về mặt kinh tế và môi trường nhưng việc ứng dụng
chúng trong thực phẩm và sinh học vẫn còn nhiều hạn chế so với lên men lỏng: sự
phối trộn đồng nhất về sinh khối vi sinh vật, và sự phân bố nhiệt, ... Nhưng nhìn
chung, khi xét toàn diện SSF có lẽ là một công cụ hữu ích duy nhất để tạo ra những
sản phẩm giới hạn như một số enzyme, các hợp chất sinh học chức năng,... Hơn nữa
SSF được xác định là một quá trình biến đổi sinh học các phế liệu nông nghiệp và
công nghiệp nhằm gia tăng giá trị cho các sản phẩm phụ phẩm này.

42. 32
Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Thời gian thực hiện từ tháng 08/2009 đến tháng 12/2009. Tại phòng thí nghiệm
vi sinh và thực phẩm_Trường Cao đẳng kinh tế công nghệ thành phố Hồ Chí Minh.
3.2 DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT
3.2.1 Dụng cụ
Bảng 3.1: Danh sách dụng cụ sử dụng
Dụng cụ Xuất xứ
Ống nghiệm, giá đỡ ống nghiệm Việt Nam
Ống đong Đức
Đầu type Đức
Becher Trung Quốc
Đũa khuấy thủy tinh Đức
Eppendorf Đức
Lame, lamell Trung Quốc, Đức
Đĩa petri Đức
Pipet, micropipette Trung Quốc, Nhật
Erlen Trung Quốc
Que cấy trang, que cấy vòng Việt Nam
Hộp nhựa Việt Nam
Lọ thủy tinh Việt Nam

43. 33
3.2.2 Thiết bị
Bảng 3.2: Danh sách các thiết bị sử dụng
Thiết bị Xuất xứ
Bếp điện Trung Quốc
Cân phân tích 2 số lẻ, cân phân
tích 4 số lẻ
Nhật
Kính hiển vi điện tử Canada
Lò Microwae Trung Quốc – Việt Nam
Buồng đếm hồng cầu Đức
Nồi hấp tiệt trùng Nhật
Nồi Autoclave Trung Quốc
Máy xay sinh tố Nhật Bản
Tủ cấy vi sinh vật Việt Nam
Tủ sấy, tủ ấm Đức
Tủ lạnh Nhật Bản
Máy đo Ph Italy
Máy chụp hình Nhật Bản
3.2.3 Hóa chất
NaNO3, MgSO4.7H2O, KH2PO4, K2HPO4, NaCl, HCl, NaOH, Glucose,
Saccarose, Peptone, Agar, Cao nấm men, cao thịt, Tween 80, (NH4)3C6H5O7,
CH3COOH, MgSO4, MnSO4, L-cysterin.
3.3 NGUYÊN LIỆU VÀ GIỐNG VI SINH VẬT
3.3.1 Nguyên liệu
 Gạo tấm
Gạo tấm được sử dụng trong quá trình thí nghiệm nuôi bán rắn nấm men
Rhodotorula là loại gạo tấm được mua ở chợ.

44. 34
 Bã cơm dừa
Bã cơm dừa là phụ phẩm của cơm dừa sau khi vắt lấy nước cốt phục vụ cho các
ngành sản xuất khác như sản xuất bánh tráng, bánh kẹo, kẹo dừa… Bã cơm dừa sử
dụng là bã sạch, không bị ôi thiu.
 Cám gạo
Cám gạo là phụ phẩm trong quá trình xay xát hạt lúa thành gạo. Cám gạo mềm,
mịn, có dạng bột. Cám gạo sử dụng trong thí nghiệm có màu vàng nhạt, mùi thơm đặc
trưng và không bị mốc, được mua tại nhà máy xay lúa.
 Lõi bắp
Lõi bắp là phụ phẩm của bắp sau khi được sử dụng để sản xuất thức ăn gia súc,
… Lõi bắp sử dụng phải là lõi sạch, không có nấm mốc, nấm men phát triển. Lõi bắp
sua khi mua về sẽ được nghiền nhỏ, xay nhuyễn và được sấy khô ở 700
C trong 24 giờ
để loại hàm ẩm và bảo quản nơi khô thoáng.
 Bã đậu nành
Đậu nành sau khi được xay nhuyễn nấu và vắt lấy nước cốt sử dụng cho sản xuất sẽ
được sấy khô và bảo quản để sử dụng bã. Bã đậu nành có dạng bột khô, màu vàng rơm
có mùi thơm đặc trưng của đậu nành.
 Dầu ăn Cooking Oil
Sử dụng dầu thực vật của công ty dầu thực vật Tường An.
3.3.2 Giống vi sinh vật
Chủng nấm men Rhodotorula sp do Phòng thí nghiệm vi sinh Trường Cao đẳng
Kinh tế – Công nghệ Tp. Hồ Chí Minh cung cấp.
Địa chỉ : 847/M8, đường Thành Thái, Phường 14, Quận 10, Tp. Hồ Chí Minh.
3.4 CÁC MÔI TRƯỜNG SỬ DỤNG (Phụ lục 1)
3.4.1 Môi trường phân lập nấm men
Dùng môi trường nước malt, làm môi trường lỏng (dịch thể), môi trường đặc trên
ống nghiệm thạch nghiêng, trên hộp petri, thanh trùng 121o
C trong 30 phút.
3.4.2 Môi trường giữ giống nấm men
Môi trường thạch MRS (Man, Rogosa, Sharpe) và môi trường thạch Hensen.

45. 35
 Môi trường thạch MRS
Cách chuẩn bị môi trường
Cân các hóa chất theo tỉ lệ môi trường sau đó dùng nước cất định mức đến 1 lít.
Sau đó chỉnh pH của môi trường về 6,2 bằng máy đo pH, đem môi trường đi quay
trong máy microwae. Sau đó phân phối vào các ống nghiệm, đậy nút bông lại và đem
đi hấp tiệt trùng ở 1210
C trong 20 phút.
Môi trường sau khi hấp tiệt trùng để nghiêng ống nghiệm thành môi trường thạch
nghiêng, giống sẽ được cấy chuyền vào các ống nghiệm chứa môi trường MRS để giữ
giống. Những ngày đầu thì nuôi ở nhiệt độ phòng (27 – 300
C). Sau 4 – 5 ngày thì giữ ở
nhiệt độ 80
C.
3.4.3 Môi trường hoạt hóa nấm men
Cách hoạt hóa nấm men
Cân hóa chất theo tỉ lệ môi trường như trên sau đó phân phối vào các lọ, mỗi lọ
50ml môi trường, đậy nút bông, bọc giấy báo và đem hấp tiệt trùng ở 1210
C trong 20
phút.
Môi trường sau khi hấp tiệt trùng, để nguội, dùng pipetman hút 0,5ml môi trường
cho vào ống nghiệm rồi dùng que cấy lấy nấm men hòa đều vào 0,5 ml môi trường sau
đó cho tất cả vào lọ môi trường. Để yên ở nhiệt độ từ 28 – 300
C trong 48 giờ cho nấm
men phát triển.
3.4.4 Môi trường nuôi cấy bán rắn
a. Thành phần môi trường cơm
 Cơ chất chính: Cơm tấm (Độ ẩm khoảng 60%)
 Dầu ăn: 1% (v/w) thể tích /g khối lượng cơm tấm.
 Bã đậu nành, bã cơm dừa, cám.
 Khoáng: 1% (v/w) thể tích/g khối lượng cơm tấm.
b. Thành phần môi trường dinh dưỡng khoáng bổ sung nuôi cấy bán rắn
 NaNO3 4,55g
 MgSO4.7H2O 1,154g
 KH2PO4 0,878g
 Saccarose 7,5g
 Nước cất vừa đủ 250ml
 Hiệu chỉnh pH 5,5 bằng HCl 0,1N

46. 36
3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.1 Các phương pháp phân tích, thu nhận các chỉ tiêu dùng trong nghiên cứu
Xác định mật độ tế bào nấm men bằng phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng
đếm hồng cầu.
a. Phương pháp đếm trực tiếp bằng buồng đếm hồng cầu (Phụ lục 2)
Có thể sử dụng buồng đếm hồng cầu để xác định số lượng vi sinh vật có kích thước
tế bào lớn như nấm men, bào tử nấm mốc, các loại tảo có trong mẫu dưới kính hiển vi
với hệ số phóng đại từ x100 đến x400. Đối với tế bào vi khuẩn, do kích thước tế bào
nhỏ hơn nên cần phải sử dụng buồng đếm Petroff-hauser. Phương pháp đếm trực tiếp
còn giúp quan sát được hình thái tế bào. Hình thái tế bào không bình thường giúp nhận
biết tế bào không phát triển trong điều kiện tối ưu, hoặc tế bào đã bị thay đổi về kiểu
gen hay kiểu hình.
Cấu tạo buồng đếm hồng cầu thường là một phiến kính dày 2 - 3 mm có một vùng
đĩa đếm nằm giữa phiến kính và được bao quanh bởi một rãnh. Đĩa đếm thấp hơn bề
mặt của phiến kính khoảng 1/10 mm, có hình tròn vì thế khi được phủ lên bằng một lá
kính thì độ sâu của đĩa đếm sẽ đồng đều nhau. Vùng đĩa đếm có diện tích 1mm2
và
được chia thành 25 ô vuông lớn có diện tích mỗi ô là 1/25 mm2
; mỗi ô vuông lớn này
có 16 ô vuông nhỏ. Vì thế có tất cả 400 ô vuông nhỏ , mỗi ô có diện tích 1/400 mm2
.
b. Phương pháp trãi đĩa ( Phụ lục 2)
Chuẩn bị đĩa petri vô trùng
 Môi trường được chuẩn bị - hấp khử trùng và được bảo quản mát ở 45o
C
trong bể điều nhiệt
 Hút 1ml mẫu vào đĩa trống (chọn nồng độ thích hợp)
 Đổ vào đĩa đã cấy 10 – 15ml môi trường, lắc đều
 Để nguội môi trường
 Đem ủ
3.5.2 Phương pháp phân lập và chọn giống
 Nguyên tắc
Phân lập là quá trình tách riêng một vi sinh vật từ mẫu vật hoặc từ một quần thể
vi sinh vật ban đầu dựa trên các kỹ thuật pha loãng và tiến hành nuôi cấy trên môi
trường thạch dinh dưỡng chọn lọc. Sau đó tùy từng loại vi sinh vật mà tiến hành nuôi ủ

47. 37
ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau để tạo điều kiện phù hợp cho vi sinh vật phân lập
phát triển tạo thành một quần thể riêng biệt khác gọi là khuẩn lạc. Sau đó lấy một ít
khuẩn lạc cho vào môi trường thạch sâu hoặc thạch nghiêng để giữ giống cùng với một
điều kiện nuôi ủ như trên để chúng phát triển thành chủng thuần.
3.5.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm
A. Sơ đồ nuôi cấy bán rắn nấm men Rhodotorula
Sơ đồ 3.1: Sơ đồ nuôi cấy bán rắn nấm men Rodotorula
Gạo tấm
Ngâm
Hồ hóa
Phối trộn
Tiệt trùng
Nuôi bán rắn
Sấy khô
bằng nhiệt
Sản phẩm
Cấy giống
Hoạt hóa
Giống nấm men
Rhodotorula
Sinh khối
Bã đậu nành
Khoáng
Dầu ăn
Lõi bắp

48. 38
B. Thuyết minh quy trình nuôi cấy
 Ngâm gạo
Nguyên liệu gạo tấm sẽ được ngâm trong thời gian 24 giờ với nước có pH 4,0
(hiệu chỉnh pH bằng dung dịch HCl 0,1N), giúp cho quá trình thủy phân một phần tinh
bột và giúp gạo hút nước, trương nở tạo điều kiện cho quá trình hồ hóa được diễn ra dễ
dàng hơn.
 Hồ hóa
Sau khi ngâm 24 giờ, gạo tấm được đem đi hồ hóa với nước có pH 5,8, theo tỉ lệ
gạo: nước là 1 : 1,2 tương đương 0,5kg gạo tấm với 600ml nước. Quá trình này sẽ giúp
quá trình lên men bán rắn của nấm men tốt hơn, do hệ cơ chất dễ sử dụng.
 Phân phối
Gạo tấm nấu xong theo các tỷ lệ trên, sẽ được cơm tấm (với pH khoảng 5,5; độ
ẩm khoảng 60%), tiến hành phân phối vào các hộp nhựa lớn với dung tích 1 lít chịu
được nhiệt độ thanh trùng. Ngoài các thành phần môi trường chính, bổ sung dầu ăn và
các tỉ lệ khoáng thành phần như ở mục (3.4). Cuối cùng trộn thật đều các thành phần
môi trường với nhau trước khi tiến hành quá trình tiệt trùng.
 Tiệt trùng
Các hộp canh trường đã được phân phối các thành phần môi trường nuôi cấy
thích hợp được đem tiệt trùng ở nhiệt độ 1210
C trong thời gian 30 phút.
 Cấy vi sinh vật
Giống nấm men Rhodotorula được hoạt hóa trong môi trường MRS broth trong
24 – 48 giờ. Giống sản xuất được đếm trực tiếp trên buồng đếm hồng cầu để tính tỷ lệ
cấy giống vào môi trường sau khi thanh trùng để nguội, với tỷ lệ giống cấy nấm men
Rhodotorula đã hoạt hóa vào khoảng 3.107
CFU/g canh trường.
 Nuôi bán rắn
Nuôi nấm men ở điều kiện nhiệt độ phòng (28 -300
C), trong thời gian từ 5 – 7
ngày. Thu toàn bộ canh trường và đem đi sấy khô bằng nhiệt.
3.5.3.1 Khảo sát các đặc điểm hình thái của chủng nấm men
 Cách thực hiện
Làm tiêu bản giọt ép để quan sát hình thái của nấm men
- Lau phiến kính bằng cồn 700
- Đốt đèn cồn lên
Tải bản FULL (105 trang): https://bit.ly/3fQM1u2
Dự phòng: fb.com/KhoTaiLieuAZ

49. 39
- Nhỏ một giọt nước cất lên chính giữa phiến kính
- Tay trái giữ ống giống vi sinh vật nghiêng trên ngọn lửa đèn cồn
- Tay phải hơ nóng đỏ que cấy, sau đó mở nút bông bằng ngón út và lòng bàn tay
phải
- Tay trái hơ miệng ống giống trên ngọn lửa
- Nhanh chóng và khéo léo dùng que cấy vòng lấy nấm men (chạm đầu que cấy
vào môi trường, không lấy thạch ra) rồi rút que cấy ra
- Lại hơ miệng ống giống trên ngọn lửa và đậy nút bông, để ống giống vào vị trí
cũ.
- Dàn đều giống vừa lấy ra với giọt nước cất trên phiến kính
Đặt lamen vào mép phiến kính 1 góc 450
và hạ xuống phiến kính, sao cho không
tạo bọt khí bên trong.
Quan sát dưới kính hiển vi ở vật kính 40, vật kính 100.
3.5.3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát thành phần môi trường nuôi cấy bán rắn
 Mục đích
Khảo sát và chọn ra môi trường nuôi cấy bán rắn thích hợp nhất đối với chủng
nấm men Rhodotorula sp dựa trên các nguồn nguyên liệu là các phụ phẩm nông
nghiệp và công nghiệp thực phẩm.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 1 nhân tố. Nhân tố môi trường
(MT): nguồn nguyên liệu môi trường nuôi cấy với MT1, MT2, MT3 tương ứng với các
hỗn hợp môi trường được khảo sát là môi trường 1, môi trường 2, và môi trường 3.
 Thành phần môi trường 1
Cơm: 70% (70g)
Lõi bắp: 10% (10g)
Bã dừa: 25% ( 25g)
Khoáng: 1% (v/w) thể tích/ 1g canh trường (1ml)
 Thành phần môi trường 2
Cơm: 89% (89g)
Lõi bắp: 10% (10g)
Bã đậu nành: 1% (2g)
Dầu ăn: 1% (v/w) thể tích/ 1g canh trường (1ml)
Khoáng: 1% (v/w) thể tích / 1g canh trường (1ml)
Tải bản FULL (105 trang): https://bit.ly/3fQM1u2
Dự phòng: fb.com/KhoTaiLieuAZ

50. 40
 Thành phần môi trường 3
Cơm: 68% (68g)
Lõi bắp: 10% (10g)
Bã dừa: 25% (25g)
Cám gạo: 2% (2g)
Khoáng: 1% (v/w) thể tích/ 1g canh trường (1ml)
 Phương pháp thực hiện
Sơ đồ 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1
Gạo tấm
Ngâm
Hồ hóa
Phối trộn
MT1 MT2 MT3
Tiệt trùng
Nuôi bán rắn
Sấy khô
bằng nhiệt
Sản phẩm
Cấy giống
Hoạt hóa
Giống nấm men
Rhodotorula
Sinh khối
3485865