Đặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAY

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC
VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
-----------------------------
NGUYỄN THANH VIỆT
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHÁNG SINH VÀ
GEN LIÊN QUAN Ở CÁC CHỦNG Salmonella ĐA KHÁNG
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
HÀ NỘI – 2020

VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM
HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
……..….***…………
NGUYỄN THANH VIỆT
LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC
NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM KHÁNG KHÁNG SINH VÀ
GEN LIÊN QUAN Ở CÁC CHỦNG Salmonella ĐA KHÁNG
Chuyên ngành: Vi sinh vật học
Mã sỗ: 9 42 01 07
Người hướng dẫn khoa học:
1. GS. TS. Nghiêm Ngọc Minh
2. PGS. TS. Võ Thị Bích Thủy
Hà Nội – 2020

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu sử dụng phân tích trong luận án có
nguồn gốc rõ ràng, đã công bố theo đúng quy định. Các kết quả nghiên
cứu trong luận án do tôi tự tìm hiểu, phân tích một cách trung thực, khách
quan. Các kết quả nghiên cứu này đã được công bố trên các tạp chí quốc
tế và tạp chí chuyên ngành trong nước với sự đồng ý của các đồng tác giả.
Các kết quả này chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào của
tác giả khác.
Tác giả luận án
Nguyễn Thanh Việt

Lời cảm ơn
Để hoàn thành luận án này, trước tiên tôi xin cảm ơn GS. TS. Nghiêm
Ngọc Minh, Phó Viện trưởng Viện Nghiên cứu Hệ gen và PGS. TS. Võ Thị
Bích Thủy, Phó Trưởng phòng Hệ gen học Vi sinh, Viện Nghiên cứu Hệ gen,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã trực tiếp hướng dẫn, truyền
đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu trong quá trình học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Quân y, Ban Giám
đốc Viện Nghiên cứu Y dược học Quân sự, Học viện Quân y, Bộ Quốc phòng
đã tạo điều kiện cho tôi được học tập tại Học viện Khoa học và Công nghệ,
Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo viện Nghiên cứu hệ gen đã tạo
điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu tại viện. Cảm ơn TS. Nguyễn Thị
Thanh Ngân, chuyên viên đào tạo Viện Nghiên cứu hệ gen đã giúp đỡ tôi hoàn
thành những thủ tục cần thiết trong quá trình học tập.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Khoa học và Công
nghệ, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Phòng Đào tạo, Học
viện Khoa học và Công nghệ đã tạo điều kiện để tôi hoàn thành khóa học.
Tôi xin cảm ơn Khoa xét nghiệm, Viện Bỏng Quốc gia Lê Hữu Trác,
Học viện Quân y đã giúp tôi thực hiện một số thí nghiệm trong quá trình thực
hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn TS. Moreland Gibbs, Trung tâm hỗ trợ phần mềm
Genenious, New Zealand, đã giúp đỡ tôi trong quá trình phân tích số liệu. Cảm
ơn các đồng nghiệp đã đóng góp, giúp đỡ tôi hoàn thiện luận án của mình.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn sâu sắc đến gia đình, những người bạn thân
thiết đã luôn bên cạnh, động viên và giúp đỡ tôi trong quá trình học tập.
Nghiên cứu sinh
Nguyễn Thanh Việt

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
Viết tắt Viết đầy đủ Tên tiếng việt
AM Ampicillin
BHI Brain Heart Infusion Broth Canh thang BHI
C Chloramphenicol
CAZ Ceftazidime
CIP Ciprofloxacin
DNA Deoxyribonucleic Acid Axit đêôxiribônuclêic
RNA Ribonucleic Acid Axit ribônuclêic
GN Gentamycin
GI Genomic Island
KSĐ Kháng sinh đồ
LCS Longest Contig Size Độ dài contig dài nhất
LPS Lipopolysaccharide
MDR Multidrug Resistance Đa kháng kháng sinh
MSS Mean Sequence Size Kích thước trung bình của trình tự
NC Number of Contigs Số lượng các contig
NGS Next Generation Sequencing Giải trình tự thế hệ mới
OMP Outer Membrane Protein Protein màng ngoài
R Resistant Đề kháng
S Sensitive Nhạy cảm
STR Streptomycin
SCS Shortest Contig Size Độ dài contig ngắn nhất
SXT Sulfamethoxazol/Trimetoprim
TE Tetracycline

MỤC LỤC
Trang
Trang phụ bìa
Lời cam đoan
Lời cảm ơn
Danh mục các từ viết tắt
Mục lục
Danh mục các bảng
Danh mục các hình vẽ, đồ thị
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN ............................................................................... 3
1.1. Đặc điểm sinh học của Salmonella....................................................... 3
1.1.1. Hình thái .......................................................................................... 3
1.1.2. Tính chất nuôi cấy ........................................................................... 3
1.1.3. Tính chất hóa sinh........................................................................... 4
1.1.4. Sức đề kháng.................................................................................... 4
1.1.5. Kháng nguyên.................................................................................. 4
1.1.5.1. Kháng nguyên O ......................................................................... 5
1.1.5.2. Kháng nguyên H ......................................................................... 5
1.1.5.3. Kháng nguyên Vi......................................................................... 6
1.1.6. Phân loại .......................................................................................... 6
1.2. Đặc điểm hệ gen của Salmonella.......................................................... 8
1.2.1. Cấu trúc hệ gen................................................................................ 8
1.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh ở Salmonella.......................................10
1.2.2.1. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm aminoglycoside .....................11
1.2.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm β-lactam ................................12
1.2.2.3. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm phenicol.................................13
1.2.2.4. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm quinolone...............................13
1.2.2.5. Cơ chế kháng kháng sinh tetracycline......................................13
1.2.2.6. Cơ chế kháng sulfonamide và trimethoprim ............................14

1.2.3. Liên quan giữa đột biến gen và kiểu hình kháng kháng sinh ở vi
khuẩn........................................................................................................15
1.2.4. Các gen liên quan đến kênh bơm thải thuốc................................15
1.2.4.1. Phân loại các loại kênh bơm thải thuốc...................................16
1.2.4.2. Liên quan giữa kênh bơm thải thuốc và kháng kháng sinh ở
Salmonella .............................................................................................18
1.3. Tình hình nhiễm và đề kháng kháng sinh của Salmonella trong
thực phẩm ...................................................................................................19
1.3.1. Trên thế giới...................................................................................19
1.3.2. Tại Việt Nam ..................................................................................22
1.4. Một số kỹ thuật hay được sử dụng trong nghiên cứu biểu hiện gen
......................................................................................................................23
1.4.1. Reverse transcription PCR (RT-PCR) ..........................................24
1.4.2. Real-time PCR (qPCR) ..................................................................24
1.4.3. Microarray......................................................................................24
1.4.4. Giải trình tự thế hệ mới.................................................................26
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................. 28
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU................................................................28
2.1.1. Nguyên liệu ....................................................................................28
2.1.2. Môi trường, hóa chất, kháng sinh, các bộ kit ..............................29
2.1.2.1. Môi trường, hóa chất phân lập Salmonella theo tiêu chuẩn ISO
6579:2002..............................................................................................29
2.1.2.2. Môi trường dùng để làm kháng sinh đồ ...................................33
2.1.2.3. Kháng sinh................................................................................34
2.1.2.4. Các bộ kít..................................................................................34
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu........................................................................35
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................................37
2.2.1. Phương pháp lấy mẫu.................................................................37
2.2.2. Định danh Salmonella...................................................................37
2.2.2.1. Tăng sinh sơ bộ không chọn lọc...............................................37

2.2.2.2. Tăng sinh chọn lọc....................................................................37
2.2.2.3. Quy trình khẳng định................................................................38
2.2.3. Kháng sinh đồ ................................................................................41
2.2.4. Giải trình tự thế hệ mới.................................................................42
2.2.4.1. Tách chiết, tinh sạch RNA tổng số và thiết lập thư viện cDNA 42
2.2.4.2. Giải trình tự thế hệ mới bằng công nghệ Illumina...................42
2.2.5. Nhóm phương pháp tin sinh học ..................................................43
2.2.5.1. Kiểm tra chất lượng trình tự.....................................................43
2.2.5.2. Lọc trình tự chất lượng cao bằng phần mềm Trimmomatic [57]
................................................................................................................43
2.2.5.3. Lắp ráp de novo........................................................................43
2.2.5.4. Chú thích hệ gen biểu hiện .......................................................44
2.2.5.5. Xác định các gen kháng kháng sinh .........................................44
2.2.5.6. Xác định đột biến gen kháng kháng sinh..................................44
2.2.6. Xác nhận kết quả đột biến gen kháng kháng sinh bằng phương
pháp giải trình tự gen Sanger .................................................................45
2.2.7. Xử lý thống kê ................................................................................45
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN....................................................... 46
3.1. Phân lập và định danh type các chủng Salmonella nghiên cứu...46
3.1.1. Kết quả phân lập Salmonella ........................................................46
3.1.2. Kết quả định danh type các chủng Salmonella phân lập được 56
3.2. Đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập
được .............................................................................................................59
3.2.1. Mức độ đề kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập
được ..........................................................................................................61
3.2.2. Số lượng từng Salmonella đề kháng kháng sinh theo nguồn phân
lập..............................................................................................................63
3.2.3. Salmonella đề kháng từng loại kháng sinh theo nguồn phân lập
...................................................................................................................65
3.2.4. Kiểu hình kháng kháng sinh.........................................................66

3.3. Kết quả phân tích các nhóm gen ở một số chủng Salmonella đa
kháng kháng sinh .......................................................................................69
3.3.1. Số lượng trình tự đọc (read)..........................................................71
3.3.2. Lắp ráp de novo..............................................................................72
3.3.3. Chú thích chức năng các gen........................................................73
3.3.4. Phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella nghiên cứu...74
3.3.4.1. Nhóm gen kháng kháng sinh.....................................................74
3.3.4.2. Đột biến gen kháng kháng sinh nhóm Quinolone ....................87
3.3.4.3. Nhóm gen liên quan đến hệ thống kênh bơm thải thuốc (efflux
pump) .....................................................................................................90
3.3.4.4. Nhóm gen độc lực.....................................................................97
3.3.4.5. Nhóm gen liên quan đến tổng hợp flagellar.............................99
3.3.4.6. Nhóm gen liên quan đến quá trình tổng hợp Lipopolysaccharide
(LPS) và thành tế bào ..........................................................................101
3.3.4.7. Nhóm gen đáp ứng với các chất gây độc................................102
3.3.4.8. Nhóm gen di truyền vận động, phage và prophage................105
3.3.4.9. Nhóm gen liên quan đến kênh vận chuyển ABC.....................107
3.4. Xác nhận kết quả đột biến gen kháng kháng sinh bằng phương
pháp giải trình tự gen Sanger .................................................................110
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................................... 114
Kết luận........................................................................................................ 114
Kiến nghị...................................................................................................... 114
NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN .......................................... 115
NHỮNG CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN ........................................................................................... 116
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 117
PHỤ LỤC................................................................................................... 1
Phụ lục 1. Kết quả kiểm tra chất lượng thư viện cDNA bằng máy
Bioanalyzer. ................................................................................................ 1
Phụ lục 2. Gen độc lực biểu hiện ở các mẫu nghiên cứu........................... 4

Phụ lục 3. Biểu hiện của các gen liên quan đến flagellar ........................14
Phụ lục 4. Các gen tổng hợp LPS và thành tế bào...................................16
Phụ lục 5. Các gen liên quan đến các yếu tố di truyền vận động, phage, và
prophage....................................................................................................18
Phụ lục 6. Các gen liên quan đến tác động bất lợi của môi trường biểu
hiện ở cả 6 mẫu nghiên cứu......................................................................20

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng Trang
Bảng 1.1. Các gen kháng tetracycline [17].....................................................14
Bảng 1.2. Hệ thống kênh bơm thải thuốc và cơ chất ở Salmonella................17
Bảng 2.1. Địa điểm lấy mẫu, số mẫu và ký hiệu mẫu.....................................28
Bảng 2.2. Thành phần các môi trường và hóa chất sử dụng để định danh
Salmonella.......................................................................................................29
Bảng 2.3. Thành phần môi trường BHI ..........................................................33
Bảng 2.4. Thành phần môi trường Muller Hinton ..........................................34
Bảng 2.5. Kháng sinh sử dụng làm kháng sinh đồ..........................................34
Bảng 2.6. Giải thích kết quả các phép thử khẳng định. ..................................41
Bảng 2.7. Điểm phred và độ chính xác của trình tự [56]................................43
Bảng 3.1. Kết quả tăng sinh sơ bộ không chọn lọc và tăng sinh chọn lọc 90
mẫu nghiên cứu...............................................................................................47
Bảng 3.2. Kết quả giám định một số đặc tính sinh hoá của 25 chủng vi khuẩn
mọc được trên các môi trường tăng sinh chọn lọc..........................................49
Bảng 3.3. Kết quả phân lập các chủng Salmonella ở các mẫu nghiên cứu ....53
Bảng 3.4. Danh sách các mẫu dương tính với Salmonella .............................54
Bảng 3.5. Kết quả định danh type của các chủng Salmonella ở các mẫu
nghiên cứu.......................................................................................................57
Bảng 3.6. Mức độ đề kháng kháng sinh của Salmonella phân lập được........61
Bảng 3.7. Số lượng từng Salmonella đề kháng kháng sinh theo nguồn phân
lập....................................................................................................................64
Bảng 3.8. Salmonella đề kháng từng loại kháng sinh theo nguồn phân lập...65
Bảng 3.9. Kiểu hình kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập
được.................................................................................................................66
Bảng 3.10. Danh sách Salmonella đa kháng kháng sinh ................................68
Bảng 3.11. Nồng độ RNA tổng số của các mẫu nghiên cứu. .........................70
Bảng 3.12. Tóm tắt số lượng trình tự RNA của Salmonella...........................71
Bảng 3.13. Kết quả lắp ráp de novo hệ gen biểu hiện của các Salmonella.....72

Bảng 3.14. Trình tự mã hóa ở 6 mẫu nghiên cứu ...........................................74
Bảng 3.15. Kết quả tóm tắt các gen kháng kháng sinh và kiểu hình kháng
kháng sinh ở các mẫu nghiên cứu...................................................................75
Bảng 3.16. Kết quả chi tiết các gen kháng kháng sinh biểu hiện ở các mẫu
nghiên cứu.......................................................................................................79
Bảng 3.17. Kết quả xác định đột biến gen kháng kháng sinh nhóm quinolone
.........................................................................................................................87
Bảng 3.18. Kết quả xác định biểu hiển các gen liên quan đến kênh bơm thải
thuốc ở các mẫu nghiên cứu............................................................................91
Bảng 3.19. Các gen liên quan đến kênh vận chuyển ABC. ..........................108

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình Trang
Hình 1.1. Kháng nguyên của Salmonella [4].................................................... 4
Hình 1.2. Phân loại Salmonella [6]................................................................... 7
Hình 1.3. Số lượng các gen chung và gen riêng ở một số loài Salmonella [8].9
Hình 1.4. Cấu trúc hệ gen của S. Gallinarum [9].............................................. 9
Hình 1.5. Các kênh bơm thải thuốc ở Salmonella [23]...................................17
Hình 3.1. Vi khuẩn từ mẫu TB-1 trên môi trường MSRV..............................47
Hình 3.2. Vi khuẩn từ các mẫu TL-1, 2, và TG-1 trên môi trường thạch XLD
.........................................................................................................................48
Hình 3.3. Vi khuẩn từ các mẫu TB-1 và TL-1 trong thạch Kligler ................50
Hình 3.4. Vi khuẩn phân lập được từ mẫu TB-1 trong môi trường ure..........51
Hình 3.5. Vi khuẩn lập được từ mẫu TB-1, TL-1, 2 trong môi trường LDC .52
Hình 3.6. Vi khuẩn phân lập được từ mẫu TL-2 trong môi trường VP..........52
Hình 3.7. Vi khuẩn phân lập được từ mẫu TL-1 trong môi trường Indol.......53
Hình 3.8. Hình ảnh kháng sinh đồ của một số chủng Salmonella nghiên cứu.
.........................................................................................................................60
Hình 3.9. Hình ảnh điện di các mẫu RNA tổng số trên gel agarose 0,8%......71
Hình 3.10. Heatmap của các gen độc tố biểu hiện ở 6 mẫu nghiên cứu.........97
Hình 3.11. Cấu trúc flagellar của vi khuẩn [129]. ........................................100
Hình 3.12. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR gen parC .................................111
Hình 3.13. Kết quả phân tích sự sai khác nucleotide ở gen parC.................112
Hình 3.14. Kết quả thay đổi amino acid ở các mẫu nghiên cứu...................112

DANH MỤC BIỂU ĐỒ
Biểu đồ Trang
Biểu đồ 3.1. Số lượng các serovar phân lập được từ 3 nguồn thịt..................58

1
MỞ ĐẦU
Theo tổ chức Y tế Thế giới (WHO), gánh nặng gây ra do các bệnh từ
thực phẩm là rất lớn. Theo đó, mỗi năm cứ khoảng 10 người thì có 1 người bị
bệnh. Bệnh từ thực phẩm có thể tiến triển nghiêm trọng, đặc biệt là đối với trẻ
nhỏ, người già và người bị suy giảm miễn dịch. Trong số các bệnh do thực
phẩm gây ra thì tiêu chảy là phổ biến nhất do sử dụng thực phẩm không an toàn,
khoảng 550 triệu người bị bệnh này mỗi năm, trong đó có 220 triệu trẻ em dưới
5 tuổi. Salmonella là một trong 4 nguyên nhân chính gây ra bệnh tiêu chảy trên
toàn cầu. Salmonella có khoảng hơn 2500 serovar khác nhau và có mặt ở khắp
mọi nơi. Tất cả các type huyết thanh của Salmonella đều có khả năng gây bệnh
cho người.
Khả năng kháng kháng sinh của Salmonella đang tăng lên nhanh chóng
và trở thành mối đe dọa lớn tới sức khỏe loài người. Salmonella kháng kháng
sinh gây khó khăn cho việc kiểm soát nhiễm khuẩn, dự phòng và điều trị bệnh.
Do vậy, việc phân lập và xác định đặc điểm kháng kháng sinh của Salmonella
từ thực phẩm là việc làm cần thiết. Việc nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh
của Salmonella sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc dự phòng, kiểm soát
bệnh tật cũng như kiểm soát ô nhiễm thực phẩm và quy định sử dụng kháng
sinh trong điều trị và chăn nuôi nhằm hạn chế khả năng kháng kháng sinh của
vi khuẩn.
Hiện nay ở Việt Nam, hầu hết các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào dịch
tễ học kháng kháng sinh của các chủng Salmonella. Nghiên cứu chuyên sâu ở
mức độ phân tử về Salmonella ở Việt Nam còn chưa nhiều. Nghiên cứu các
nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh giúp hiểu biết sâu về
dịch tễ học phân tử các gen kháng kháng sinh. Quan trọng hơn là có thể phát
hiện được các đột biến mới ở gen kháng kháng sinh gây ra tính kháng kháng
sinh ở Salmonella. Ngoài ra còn có thể tìm ra các nhóm gen mới có khả năng
gây nên tính kháng kháng sinh ở loài vi khuẩn này.
Ở Việt Nam cho đến thời điểm hiện tại chưa có nghiên cứu nào về phân
tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh phân lập được

2
từ thực phẩm bằng công nghệ giải trình tự thế hệ mới. Theo tổ chức Nông lương
Liên Hiệp Quốc, Việt Nam là quốc gia có lượng tiêu thụ thịt bò, thịt lợn, và thịt
gia cầm tăng lên rất nhanh kể từ năm 1993 trở lại đây. Trong đó lượng thịt lợn
tiêu thụ trên đầu người tăng 3 lần, lượng thịt bò tăng lên 6 lần và thịt gia cầm
tăng gấp 7 lần khi so sánh lượng thịt tiêu thụ giữa năm 2015 và năm 1993.
Lượng thịt tiêu thụ này được dự báo là sẽ tăng lên đáng kể trong những năm
tiếp theo. Vì vậy, luận án: "Nghiên cứu đặc điểm kháng kháng sinh và gen
liên quan ở các chủng Salmonella đa kháng" đã được thực hiện với mục tiêu
và nội dung sau:
Mục tiêu:
1. Phân lập và định danh các chủng Salmonella từ thịt lợn, thịt bò, và thịt gà
tại các chợ bán lẻ ở khu vực Hà Nội.
2. Xác định đặc điểm kháng kháng sinh của các chủng Salmonella phân lập
được.
3. Phân tích các nhóm gen ở các chủng Salmonella đa kháng kháng sinh.
Nội dung nghiên cứu:
1. Nuôi cấy phân lập, định danh vi khuẩn từ các mẫu thịt thu thập được ở các
chợ trên địa bàn Hà Nội, lựa chọn các mẫu nhiễm vi khuẩn Salmonella.
2. Tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ, từ đó lựa chọn ra các chủng
Salmonella đa kháng kháng sinh.
3. Giải trình tự gen thế hệ mới một số chủng Salmonella đa kháng kháng sinh
để phân tích các nhóm gen liên quan. Xác nhận một số kết quả bằng phương
pháp giải trình tự gen Sanger.

3
Chương 1. TỔNG QUAN
Salmonella được phân lập lần đầu tiên từ ruột lợn rừng năm 1884 bởi
Salmon. Vào thời điểm đó, loài vi khuẩn này được đặt tên là Bacillus
choleraesuis. Tên này sau đó được thay đổi thành Salmonella Choleraesuis bởi
Lignières vào năm 1900 khi ông tìm cách đặt tên cho nhóm vi khuẩn gây bệnh
tiêu chảy ở lợn. Tên này cũng được sử dụng bởi Buchanan năm 1918 khi ông
nghiên cứu loài vi khuẩn thuộc giống Salmonella, có tính chất sinh hóa như
glucose dương tính, lactose âm tính, sinh acid và CO2. Cũng trong những năm
1900, một vài loài Salmonella quan trọng được phát hiện và nghiên cứu gồm S.
Typhosum (sau này được đặt tên là Typhimurium), Paratyphosum A và B
(Paratyphi A và B). Ở thời kỳ đó, hai loài S. Gallinarum và S. Typhimurium
được nghiên cứu và chỉ ra vai trò gây bệnh của chúng ở người và động vật đã
được công nhận rộng rãi. Cho đến năm 1960 tên Salmonella, dùng để chỉ loài
vi khuẩn đặc biệt thuộc họ Enterobacteriaceae mới được chấp nhận và sử dụng
rộng rãi trên thế giới [1].
1.1. Đặc điểm sinh học của Salmonella
Salmonella là một trong những tác nhân gây bệnh chủ yếu ở người và
động vật. Loài vi khuẩn này gây ra nhiều bệnh như thương hàn và viêm dạ dày
ruột, đe dọa đến sức khỏe nhân loại [2].
1.1.1. Hình thái
Salmonella là trực khuẩn Gram âm, kích thước trung bình 2-3 x 0,5-1,0
µm, có nhiều lông quanh thân (trừ S. Gallinarum và S. Pullorum). Hầu hết
Salmonella đều di động được. Salmonella không có vỏ, không sinh bào tử [2].
1.1.2. Tính chất nuôi cấy
Salmonella dễ nuôi, vừa ưa khí vừa kỵ khí. Phát triển được trên các môi
trường nuôi cấy thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37o
C. Salmonella có thể
sống được ở khoảng pH từ 3,8 đến 9,5 và pH thích hợp là 6,5-7,5 [1]. Trên môi
trường thích hợp khuẩn lạc sau 24 giờ có kích thước trung bình 2 - 4 mm.
Salmonella có thể mọc trên một số môi trường có chất ức chế chọn lọc như
DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate). Trên

4
môi trường XLD, khuẩn lạc của Salmonella thường có màu đỏ (ngoại trừ loại
không có xylose hoặc không khử carbonyl của lysine), ở giữa có màu đen
(ngoại trừ loại không sinh H2S) [2].
1.1.3. Tính chất hóa sinh
Salmonella có lactose âm tính, glucose dương tính và thường sinh hơi,
đa số có sucrose âm tính, salicin âm tính, inositol âm tính, citrate dương tính ở
môi trường Simmons. Salmonella có catalase dương tính, oxidase âm tính,
lysine decarboxylase dương tính. Hầu hết sinh H2S, không sinh urease, lipase,
và deoxyribonuclease.
Không phải tất cả các Salmonella đều có đầy đủ tính chất trên. Ví dụ, S.
Typhi có glucose âm tính, không sinh hơi và citrate Simmons âm tính. Hầu hết
các S. Paratyphi A và S. Choleraesuis không sinh H2S. Khoảng 5% các
Salmonella có khả năng sinh bacteriocin kháng lại E. coli, Shigella và một số
Salmonella khác [2].
1.1.4. Sức đề kháng
Salmonella có sức đề kháng cao ở ngoại cảnh. Chúng có khả năng sống
trong môi trường khô. Trong rác thải, chúng có khả năng sống nhiều năm. Một
vài loài có khả năng sống nhiều tuần trong môi trường có 20% muối.
Salmonella nhạy cảm với nhiệt độ, chúng có thể bị tiêu diệt từ 70o
C trở lên [3].
1.1.5. Kháng nguyên
Salmonella có 3 loại kháng nguyên được trình bày trong hình 1.1.
Hình 1.1. Kháng nguyên của Salmonella [4].
Chú thích: ba loại kháng nguyên của Salmonella là kháng nguyên thân
O, kháng nguyên lông H, và kháng nguyên Vi. Kháng nguyên Vi có thể bao phủ
kín kháng nguyên O, kháng nguyên này chỉ có ở S. Typhi và S. Paratyphi C.

5
1.1.5.1. Kháng nguyên O
Kauffmann và White là những nhà khoa học đã nghiên cứu một cách hệ
thống cấu trúc kháng nguyên O của Salmonella. Có khoảng gần 70 yếu tố kháng
nguyên O khác nhau. Mỗi type huyết thanh mang một số yếu tố kháng nguyên
khác nhau. Kháng nguyên O có bản chất là Lipopolysaccharide (LPS) của màng
ngoài tế bào Salmonella. Kháng nguyên này có khả năng chịu nhiệt và là nội
độc tố của vi khuẩn, đóng vai trò gây bệnh. Dựa vào kháng nguyên O,
Salmonella được chia thành các nhóm huyết thanh từ A đến Z [2].
Mỗi kháng nguyên O gồm từ 5 đến 6 đơn vị đường, sự biến đổi ở các
đơn vị đường, liên kết cộng hóa trị giữa chúng và liên kết giữa các tiểu đơn vị
kháng nguyên O tạo ra các kháng nguyên O khác nhau [1].
Kháng nguyên O ở Salmonella có thể được chia thành hai nhóm chính.
Nhóm một gồm có các phân tử đường N-acetylglucosamine hoặc N-
acetylgalactosamine và nhóm hai gồm có phân tử đường galactose trong cấu
trúc. Trong những năm gần đây, người ta đã xác định được 21 cấu trúc hóa học
và trình tự của 28 nhóm gen mã hóa cho kháng nguyên O thuộc nhóm một.
Hiện tại, đã xác định được cấu trúc hóa học và trình tự các gen mã hóa cho 46
kháng nguyên O của Salmonella. Cấu trúc hóa học và các gen mã hóa cho
kháng nguyên O thuộc nhóm một có tính đa dạng cao [5].
1.1.5.2. Kháng nguyên H
Hầu hết Salmonella đều có kháng nguyên H trừ S. Gallinarum và S.
Pullorum. Kháng nguyên H của Salmonella có thể có tính đặc hiệu đơn hoặc
kép. Những Salmonella có kháng nguyên H mang tính đặc hiệu đơn khi gặp
kháng huyết thanh tương ứng sẽ mất khả năng di động. Một số Salmonella có
kháng nguyên H mang tính đặc hiệu kép, khi nuôi cấy trong môi trường có
kháng huyết thanh tương ứng với một kháng nguyên thì Salmonella vẫn di động
và biểu hiện tính đặc hiệu của kháng nguyên H kia. Ví dụ S. Paratyphi B có
kháng nguyên H mang tính đặc hiệu kép là đặc hiệu b và đặc hiệu 1, 2. Nếu
nuôi trong môi trường có huyết thanh kháng cả hai đặc hiệu kháng nguyên trên
thì S. Paratyphi B bị ngưng kết và mất khả năng di động. Tuy nhiên, chúng

6
không bị ngưng kết và vẫn di động được khi nuôi trong môi trường có huyết
thanh chỉ kháng một loại đặc hiệu kháng nguyên. Kháng nguyên H dễ bị phá
hủy bởi nhiệt độ, cồn và acid. Kháng nguyên H được ứng dụng để chẩn đoán
huyết thanh [2].
1.1.5.3. Kháng nguyên Vi
Kháng nguyên Vi là kháng nguyên bề mặt. Kháng nguyên Vi là
polysaccaride của N-acetylglucosamine uronic acid dưới dạng một lớp rất
mỏng không quan sát được bằng kính hiển vi quang học. Kháng nguyên Vi có
thể bao phủ kín kháng nguyên O. Kháng nguyên Vi chịu trách nhiệm sinh độc
tố, có vai trò quan trọng trong chẩn đoán bệnh thương hàn. Kháng nguyên này
chỉ có ở S. Typhi và S. Paratyphi C [2].
1.1.6. Phân loại
Lúc đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng mà
chúng gây ra như S. Typhi và các S. Paratyphi A, B, C (typhoid là bệnh thương
hàn và para là phó thương hàn). Salmonella còn được đặt tên theo vật chủ như
S. Typhimurium gây bệnh ở chuột (murine nghĩa là chuột). Về sau người ta
thấy rằng một loài Salmonella có thể gây ra một số hội chứng và có thể phân
lập được ở nhiều loài động vật khác nhau. Vì thế, các loài mới phát hiện được
đặt tên theo địa phương nơi nó lần đầu tiên được phát hiện. Ví dụ S. Teheran,
S. Congo, S. London [2].
Bằng kỹ thuật sinh học phân tử, những nghiên cứu sâu về cấu trúc DNA
cho phép xếp tất cả Salmonella vào một loài duy nhất. Tuy nhiên đề xuất này
không được chấp nhận vì cách phân loại truyền thống đã được sử dụng quá
quen và có ý nghĩa thực tiễn riêng [2].
Ngày nay, Salmonella được phân thành hai loài là S. bongori và S.
enterica. Trong đó, S. enterica được chia thành 6 dưới loài là: I (enterica), II
(salamae), IIIa (arizonae), IIIb (diarizonae), IV (houtenae) và VI (indica). Hiện
nay, người ta đã phát hiện được 2.610 serovar khác nhau (hình 1.2). Salmonella
được phân thành các serovar bằng cách sử dụng hệ thống phân loại cổ điển của
Kauffman. Các serovar được xác định nhờ sự kết hợp của 46 kháng nguyên O

7
và 85 kháng nguyên H (bao gồm kháng nguyên H1 và H2). Sự kết hợp này tạo
ra khoảng 1.500 serovar trong S. enterica subspecies enterica và khoảng 1.000
serovar trong các phân loài khác của S. enterica và S. bongori [6].
Hình 1.2. Phân loại Salmonella [6].
Chú thích: Salmonella được phân thành hai loài là S. bongori và S.
enterica. Salmonella còn được chia thành dưới loài, trong đó, S. enterica gồm
6 dưới loài là I, II, IIIa, IIIb, IV và VI. S. bongori thuộc dưới loài V với 23
serovar. Salmonella dưới loài I có số lượng lớn nhất (1.547 serovar) trong đó
99% gây nhiễm trùng ở người và động vật.

8
1.2. Đặc điểm hệ gen của Salmonella
1.2.1. Cấu trúc hệ gen
Kích thước hệ gen của Salmonella rất khác nhau, dao động từ 3,39 Mb
đến 5,59 Mb. Số gen trung bình của Salmonella là 4.742 (dao động từ 3.969
đến 9.898 gen). Không có mối liên quan giữa kích thước hệ gen và số lượng
gen. Ngoài ra, Salmonella còn sở hữu từ 1 đến 2 plasmid. Các plasmid của
Salmonella có kích thước rất khác nhau, dao động từ 2 kb đến 200 kb. Tuy
nhiên, hầu hết Salmonella enterica không có plasmid. Ví dụ, các serovar như S.
Typhi, S. Paratyphi, S. Hadar, S. Infantis và hầu hết các serovar độc khác
thường không có plasmid. Ngược lại, các Salmonella thường xuyên gây bệnh
ở người và động vật, ví dụ, S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Dublin, S.
Choleraesuis, S. Gallinarum, S. Pullorum, và S. Abortus-ovis thường sở hữu
plasmid. S. enterica cần khoảng 3.499 gen và S. bongori cần khoảng 3.368 gen
để đảm bảo cho quá trình sinh trưởng bình thường [7].
So sánh trình tự protein ở Salmonella enterica người ta thấy rằng chúng
có độ tương đồng từ 65% đến 99%. Hệ gen của Salmonella có tính bảo thủ cao
và sự biến đổi trong hệ gen thường chỉ tập trung vào một số vùng đặc biệt. Có
khoảng 2.800 họ gen có mặt ở tất cả các Salmonella và tổng số họ gen của tất
cả các serovar là khoảng 10.000 (hình 1.3). Salmonella có số lượng lớn các gen
có tính bảo thủ cao, bên cạnh đó, số lượng các gen thu được trong quá trình
sống cũng rất phong phú, bao gồm các Salmonella Pathogenicity Islands (SPI),
các yếu tố di truyền chuyển vị, thực khuẩn thể, và plasmid (hình 1.4). Các gen
thu được này thường biến đổi, phong phú và khác nhau giữa các serovar [8].

9
Hình 1.3. Số lượng các gen chung và gen riêng ở một số loài Salmonella [8].
Chú thích: hình bông hoa thể hiện gen chung và các gen riêng ở các
serovar khác nhau. Salmonella có khoảng 2.811 gen chung (vòng tròn ở trung
tâm cánh hoa) và các gen riêng tùy thuộc vào các serovar với số lượng rất khác
nhau (phần cánh hoa).
Hình 1.4. Cấu trúc hệ gen của S. Gallinarum [9].
Chú thích: vòng tròn ngoài cùng thể hiện vị trí các vùng gen khác nhau.
Vòng tròn thứ hai từ ngoài vào thể hiện kích thước của hệ gen. Vòng tròn thứ

10
ba và thứ tư thể hiện vị trí của các vùng gen mã hóa theo chiều kim đồng hồ và
ngược chiều kim đồng hồ. Vòng tròn thứ năm thể hiện vị trí của các gen giả.
Vòng tròn số 6 là gen chung với S. Typhimurium LT2 (màu xanh lá cây). Vòng
tròn số 8 là các gen chung với S. Enteritidis PT4 (màu xanh lam). Vòng tròn số
7 là gen riêng so với S. Typhimurium LT2 (màu hồng). Vòng tròn số 9 là gen
riêng so với S. Enteritidis PT4 (màu xám). Vòng tròn số 10 là vị trí các rRNA
(màu đỏ).
Hệ gen của Salmonella rất giống với hệ gen của E. coli nhưng có thêm
một số lượng lớn các gen độc tố. Một số các gen độc này tập trung thành các
cụm trong hệ gen, còn được gọi là GI (genomic island), GI là một đoạn DNA
kích thước lớn, thu được nhờ hình thức chuyển ngang. Các GI nằm gần các gen
tRNA, người ta cho rằng gen tRNA là nguyên nhân để tích hợp GI vào nhiễm
sắc thể của Salmonella. Các GI và SPI có vai trò tạo ra độc tố và tạo ra khả
năng xâm nhập của vi khuẩn. Nhiều SPI được tìm thấy nằm bên cạnh một gen
mã hóa cho tRNA, tỷ lệ GC của chúng cũng khác so với tỷ lệ GC của hệ gen.
Vì vậy, hầu hết các SPI là gen ngoại lai được chèn vào hệ gen của Salmonella.
Hiện nay người ta đã tìm thấy 23 SPI, tuy nhiên, chức năng của các gen độc
trên các SPI còn chưa được nghiên cứu đầy đủ. Ngoài SPI-1 và SPI-2 là được
nghiên cứu đầy đủ, vai trò gây bệnh của các SPI khác còn ít được biết đến [10].
Sự khác biệt chính trong hệ gen của Salmonella xảy ra chủ yếu do sự tái
sắp xếp lại hệ gen liên quan đến tái tổ hợp của các operon rRNA khác nhau
hoặc các yếu tố chèn IS200. Mỗi serovar tiến hóa thông qua việc tiếp nhận các
yếu tố di truyền bằng chuyển gen theo chiều ngang hoặc do sự thoái biến các
gen. Sự đa dạng trong hệ gen của Salmonella chủ yếu là do các SPI, plasmid,
và thực khuẩn thể. Trong đó, các thực khuẩn thể tích hợp vào hệ gen là một
trong những yếu tố chính tạo ra sự đa dạng di truyền trong bộ gen của
Salmonella [11].
1.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh ở Salmonella

11
Vi khuẩn kháng kháng sinh theo nhiều cách khác nhau như làm biến đổi
hoặc phá hủy kháng sinh, bơm kháng sinh ra khỏi tế bào bằng hệ thống bơm
thải thuốc (efflux pumps), biến đổi hoặc thay thế mục tiêu tác dụng của kháng
sinh, và giảm tính thấm của màng tế bào. Có nhiều nhóm kháng sinh khác nhau,
nhưng Salmonella thường đề kháng một số nhóm kháng sinh phổ biến gồm
aminoglycoside, β-lactam, chloramphenicol, quinolone, tetracycline,
sulfonamide và trimethoprim [12].
1.2.2.1. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm aminoglycoside
Có ba cơ chế đề kháng aminoglycoside ở vi khuẩn là: (1) làm giảm hấp
thụ kháng sinh hoặc giảm tính thấm màng tế bào, (2) thay đổi các vị trí liên kết
của kháng sinh trên ribosome và làm biến đổi kháng sinh, (3) ở E. coli, khả
năng đề kháng aminoglycoside là do các kênh bơm thải kháng sinh ra khỏi tế
bào. Cơ chế này không đóng vai trò quan trọng trong đề kháng aminoglycoside
ở Salmonella nhưng tạo điều kiện để đề kháng các kháng sinh khác. Chưa thấy
báo cáo nào về biến đổi ribosome là nguyên nhân gây kháng aminoglycoside ở
Salmonella. Loài vi khuẩn này sử dụng các cơ chế như biểu hiện các enzyme
để biến đổi aminoglycoside qua trung gian plasmid để đề kháng kháng sinh
này. Các enzyme này được phân loại thành ba nhóm và được đặt tên dựa trên
các phản ứng mà chúng thực hiện, gồm acetyltransferase, phosphotransferase
và nucleotidyltransferase [12].
Tùy thuộc vào khu vực mà enzyme làm biến đổi, người ta phân AAC
(aminoglycoside acetyltransferase) thành bốn nhóm enzyme, bao gồm AAC
(1), AAC (2'), AAC (3) và AAC (6'). Các gen mã hóa các enzyme này gọi là
aac. Những gen này đã được tìm thấy ở nhiều serovar như S. Agona, S.
Typhimurium, S. Newport, S. Copenhagen, S. Kentucky. Aminoglycoside
acetyltransferase có khả năng đề kháng tobramycin, gentamicin, và kanamycin.
Aminoglycoside phosphotransferase được chia thành hai nhóm tùy thuộc vào
vị trí đặc hiệu mà chúng tiến hành phosphoryl hóa. Nhóm APH (3”) và APH
(6) có khả năng đề kháng streptomycin. Hầu hết các gen mã hóa enzyme này
được đặt tên là aph. Nucleotidyl transferase có khả năng đề kháng

12
aminoglycoside, các enzyme này được chia thành nhiều nhóm dựa trên vị trí
biến đổi các nhóm hydroxyl. Gen mã hóa các enzyme này thường được gọi là
aad, một số gen còn được gọi là ant. Gen aadA còn được gọi là ant (3”), được
tìm thấy ở Salmonella, có khả năng đề kháng streptomycin. Gen aadB, còn
được gọi là ant (2')-Ia, có khả năng đề kháng tobramycin và gentamicin [13].
1.2.2.2. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm β-lactam
Ở Salmonella, tiết enzyme β-lactam là cơ chế phổ biến đề kháng kháng
sinh nhóm β-lactam. Các enzyme này hoạt động bằng cách thủy phân các vòng
cấu trúc của β-lactam, tạo ra các β amino acid không có hoạt tính kháng khuẩn.
Người ta đã tìm ra hơn 340 gen mã hóa enzyme β-lactam thuộc các nhóm như
blaTEM, blaOXA, blaPER, blaPSE, blaSHV, blaCTX-M và blaCMY, trong đó một số nhóm
rất phổ biến ở Salmonella. Phân loại Ambler của enzyme β-lactam là phương
pháp phân loại được sử dụng rộng rãi nhất hiện nay. Theo đó, enzyme này được
phân chia thành bốn loại là A, B, C và D dựa trên trình tự của các amino acid
của chúng. Trong đó loại A phổ biến nhất ở Salmonella, chúng có khả năng đề
kháng penicillin, cephalosproin và carbapenem [13]. Có nhiều họ gen khác
nhau mã hóa cho các enzyme này, trong đó, họ TEM là phổ biến nhất ở
Salmonella. Các gen blaTEM-1 và blaTEM-52 đã được tìm thấy trong nhiều serovar
gồm S. Enteritidis, S. Dublin, S. Haadrt, S. Muenchen, S. Panama và S.
Typhimurium [14].
Enzyme β-lactam loại C phổ biến thứ hai sau loại A, có khả năng đề
kháng cephalosporin như cefoxitin và ceftiofur, enzyme này được mã hóa bởi
gen ampC nằm trên nhiễm sắc thể. Gen blaCMY-2 có liên quan đến đề kháng
ceftiofur, đây là kháng sinh thuộc nhóm cephalosporin thế hệ thứ ba và tương
tự với ceftriaxone. Đề kháng kháng sinh này và sự lây lan của gen blaCMY-2 là
một vấn đề lo ngại trên toàn thế giới vì ceftraxone là một trong những thuốc
lựa chọn để điều trị nhiễm Salmonella ở trẻ sơ sinh. Nhiều serovar như S.
Typhimurium, S. Agona và S. Newport đã được báo cáo là mang gen kháng
thuốc này [15].

13
Enzyme β-lactam loại B có khả năng đề kháng tất cả các kháng sinh
nhóm β -lactam, gen mã hóa enzyme này thường nắm trên nhiễm sắc thể, một
số gen như imp-1 và vim-1 nằm trên plasmid [13]. Enzyme β-lactam loại D có
khả năng đề kháng một số kháng sinh nhóm β-lactam như oxacillin, cloxacillin
và methicillin. Gen blaOXA-1 được tìm thấy trong một số serovar. Tuy nhiên,
enzyme loại B và D đều không phổ biến ở Salmonella [12].
1.2.2.3. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm phenicol
Chloramphenicol là chất ức chế tổng hợp protein bằng cách liên kết với
trung tâm peptidyltransferase của đơn vị 50S ribosome [13]. Có hai cơ chế đề
kháng chloramphenicol ở Salmonella gồm: (1) do chloramphenicol
acetyltransferase hoặc gen đề kháng chloramphenicol cm1A và (2) các kênh
bơm thải chloramphenicol. Gen floR mã hóa kênh bơm thải thuốc rất phổ biến
ở Salmonella, trong khi gen cmlA ít phổ biến hơn. Gen floR có tính di động cao,
có mặt ở cả nhiễm sắc thể và plasmid của Salmonella, liên quan chặt chẽ với
khả năng đa kháng kháng sinh [12].
1.2.2.4. Cơ chế kháng kháng sinh nhóm quinolone
Quinolone hoạt động bằng cách ức chế hoạt động của topoisomerase II,
DNA gyrase và topoisomerase IV, liên quan đến quá trình tổng hợp DNA,
phiên mã và phân chia tế bào. Đề kháng quinolone ở Salmonella được phân
thành 2 cơ chế: (1) đột biến các gen gyrA, gyrB mã hóa DNA gyrase và gen
parC mã hóa topisomerase IV, và (2) tăng biểu hiện của kênh bơm thải thuốc
AcrAB-TolC. Sự kết hợp nhiều đột biến sẽ tạo ra khả năng đề kháng quinolone
hơn là một đột biến đơn lẻ [12].
Ở một số vi khuẩn như E. coli và Klebsiella, biểu hiện các gen thuộc họ
qnr cũng liên quan đến kháng quinolone. Plasmid chứa gen qnr có thể chuyển
từ vi khuẩn khác vào Salmonella qua tiếp hợp. Tuy nhiên, khả năng đề kháng
quinolone bởi gen này ở Salmonella là ít xảy ra [16].
1.2.2.5. Cơ chế kháng kháng sinh tetracycline

14
Cơ chế chính trong kháng tetracycline ở Salmonella là do hệ thống các
kênh bơm thải thuốc, kênh này làm giảm nồng độ tetracycline ở trong tế bào.
Có 46 gen đề kháng tetracycline đã được xác định (bảng 1.1) [17].
Bảng 1.1. Các gen kháng tetracycline [17]
Các gen mã hóa kênh
bơm thải thuốc
Các gen bảo vệ
Ribosome
Các gen làm thoái
biến kháng sinh
Đột biến
rRNA
tetA tet31 tetM tetX G1058C
tetB tet33 tetO tet37 A926T
tetC tet35 tetQ G927T
tetD tet38 tetS A928C
tetE tet39 tetT ΔG942
tetG tet40 tetW
tetH tet41 tetB(P)
tetC tet42 tet32
tetJ tet45 tet36
tetK tetAB(46) tet44
tetL tcr3 otrA
tetC otrC tet
tetA(P) otrB
tetV
tetY
tetZ
tet30
Hầu hết các gen đề kháng tetracycline thuộc nhóm mã hóa kênh bơm thải
tetracycline (28 gen). Tiếp theo là các gen thuộc nhóm có chức năng loại bỏ
tetracycline bám vào ribosome vi khuẩn, còn gọi là gen bảo vệ ribosome. Chiếm
tỷ lệ ít nhất là các gen mã hóa monooxygenase làm biến đổi kháng sinh
tetracycline (2 gen). Cuối cùng là các đột biến gen 16S rRNA làm giảm khả
năng bám của tetracycline với ribosome [17].
1.2.2.6. Cơ chế kháng sulfonamide và trimethoprim

15
Những kháng sinh này có hoạt tính kìm khuẩn và cơ chế hoạt động là ức
chế cạnh tranh các enzyme tham gia vào quá trình tổng hợp tetrahydrofolic
acid. Sulfonamide ức chế dihyrdropteroate synthetase, trong khi trimethoprim
ức chế reductase dihydrofolate [13]. Khả năng đề kháng của Salmonella với
sulfonamide là do gen sul. Các gen sul1, sul2 và sul3 là ba gen chính đã được
xác định, trong đó, gen sul1 phổ biến nhất, được tìm thấy ở đa số các serovar
như S. Enteritidis, S. Hadar, S. Heidelberg, S. Orion, S. Rissen, S. Agona, S.
Albany, S. Derby, S. Djugu và S. Typhimurium. Gen sul1 nằm trên các yếu tố
di truyền chuyển vị, chẳng hạn như integron nhóm 1 hoặc nằm trên plasmid,
gen sul2 nằm trên plasmid. Một số gen kháng kháng sinh nhóm này đã được
tìm thấy là dhfr và dfr. Những gen này có vị trí gần với sul1 và sul3 trong một
integron, nằm trên plasmid, hoặc nằm trên các GI của hệ gen ở Salmonella [18].
1.2.3. Liên quan giữa đột biến gen và kiểu hình kháng kháng sinh ở vi khuẩn
Mặc dù nhiều đột biến gây ra kháng kháng sinh ở vi khuẩn đã được xác
định, nhưng mối quan hệ giữa đột biến và những thay đổi kiểu hình kháng
kháng sinh vẫn chưa được làm sáng tỏ đầy đủ [19]. Một số đột biến được xác
định cho chúng ta biết được làm thế nào vi khuẩn có khả năng kháng kháng
sinh. Đối với những đột biến này, nhà khoa học có thể dễ dàng xác định mối
quan hệ nhân quả với tính kháng kháng sinh ở vi khuẩn, chẳng hạn như đột biến
làm thay đổi đích tác động của thuốc. Tuy nhiên, mối quan hệ giữa đột biến và
kháng kháng sinh không phải lúc nào cũng đơn giản là quan hệ nhân quả.
Thường là nhiều đột biến mới tạo ra được một kiểu hình đề kháng một loại
kháng sinh [20]. Ngược lại, một đột biến riêng lẻ cũng có thể tạo ra nhiều kiểu
hình khác nhau (nhạy cảm hoặc đề kháng kháng sinh). Các nghiên cứu đã chỉ
ra rằng một số lượng lớn các gen đột biến gây ảnh hưởng đến tính nhạy cảm và
đề kháng kháng sinh, bao gồm cả các gen không liên quan trực tiếp đến kháng
kháng sinh đã biết ở vi khuẩn. Nhìn chung, mối quan hệ phức tạp giữa khả năng
kháng kháng sinh và đột biến gen vẫn chưa rõ ràng [19].
1.2.4. Các gen liên quan đến kênh bơm thải thuốc

16
Trong số các cơ chế kháng kháng sinh phổ biến ở vi khuẩn thì cơ chế
thải thuốc bằng hệ thống bơm là một cơ chế quan trọng. Các kênh bơm thải
thuốc không những có khả năng đào thải một lượng lớn các loại kháng sinh mà
còn hỗ trợ các cơ chế kháng kháng sinh khác bằng cách làm giảm nồng độ
kháng sinh trong tế bào và thúc đẩy quá trình tích tụ đột biến. Tăng biểu hiện
của hệ thống kênh bơm thải thuốc ở vi khuẩn có liên quan đến tính kháng kháng
sinh của chúng trên lâm sàng. Mặt khác, hệ thống kênh bơm thải thuốc cũng có
các chức năng sinh lý trong vi khuẩn và sự biểu hiện của chúng có liên quan
đến việc đáp ứng lại nhiều môi trường khác nhau. Sự hiểu biết toàn diện về cơ
chế bơm thải thuốc là cần thiết cho sự phát triển của các biện pháp can thiệp để
hạn chế kháng kháng sinh ở vi khuẩn [21].
1.2.4.1. Phân loại các loại kênh bơm thải thuốc
Trong hơn 20 năm qua, hệ thống kênh bơm thải thuốc ở vi khuẩn đa
kháng kháng sinh đã được nghiên cứu về vai trò của chúng đối với tính kháng
kháng sinh. Tuy nhiên, các câu hỏi quan trọng vẫn còn chưa được làm sáng tỏ.
Đó là tại sao kênh bơm thải thuốc tồn tại ở vi khuẩn trong điều kiện không tiếp
xúc với kháng sinh, và tại sao có nhiều kênh bơm thải thuốc chỉ với mục đích
là bơm kháng sinh ra khỏi tế bào. Hệ thống các kênh bơm thải thuốc ở
Salmonella gây khó khăn cho dự phòng và điều trị các bệnh do nhiễm
Salmonella vì chúng có khả năng đề kháng các kháng sinh và độc tố [22].
S. Typhimurium có bốn họ kênh bơm thải thuốc chính là: (1) MFS (major
facilitator superfamily) gồm các kênh EmrAB và MdfA; (2) họ RND
(resistance-nodulation-division), gồm các kênh AcrAB, AcrD, AcrEF,
MdtABC và MdsAB; (3) họ MATE (multidrug and toxic compound extrusion)
gồm kênh MdtK; và (4) họ ABC (ATP binding cassette) gồm kênh MacAB.
TolC là một kênh vận chuyển màng ngoài, có vai trò chính trong việc bơm
kháng sinh ra khỏi tế bào vi khuẩn. Vị trí, cơ chế vận chuyển, cơ chất của các
kênh bơm thải thuốc ở Salmonella được thể hiện trong hình 1.5 và bảng 1.2.

17
Hình 1.5. Các kênh bơm thải thuốc ở Salmonella [23]
Chú thích: AMG (aminoglycoside), NVB (novobiocin), SDS (sodium
dodecyl sulfate), SDC (sodium deoxycholate), ACF (acriflavine), CV (crystal
violet), MB (methylene blue), R6G (rhodamine 6G), BNKC (benzalkonium
chloride), NAL (nalidixic acid), TET (tetracycline), CLP (chloramphenicol),
NOR (norfloxacin), DOX (doxorubicin), và MAC (macrolide).
Các hệ thống kênh bơm thải thuốc ở Salmonella có khả năng kháng các
kháng sinh và nhiều cơ chất khác nhau được trình bày trong bảng 1.2 [24].
Bảng 1.2. Hệ thống kênh bơm thải thuốc và cơ chất ở Salmonella
Họ kênh vận chuyển Cơ chất
RND
AcrAB
ACF, BAC, CAR, CEF, CHL, CHO, CLX, CTX, CV,
DOC, DOR, EB, ERY, FOX, FUA, MB, NAF, NAL,
NOR, NVB, PEN, R6G, RIF, SDS, SUL, TET, TPP,
TRI, TRX, quinolone
AcrD
AZT, CAR, DOC, NAF, NVB, OXA, SDS, SUL,
AMG, SDC
AcrEF
ACF, CHL, CV, DOC, DOR, EB, ERY, NAL, NOR,
MB, NVB, R6G, SDS, TET, TPP, TRI
MdtABC
ACF, BAC, CHL, CLX, CV, EB, MB, NAF, NVB,
THL, TPP, SDS, SDC
MsdAB NVB, ACF, CV, MB, R6G, BNKC, SDS

18
Họ kênh vận chuyển Cơ chất
MFS EmrAB NAL, NVB, R6G, SDS, TRI, SDC
MdfA CHL, DOR, NOR, TET, DOX
MATE MtdK ACF, DOR, NOR, DOX, ACR
ABC MacAB ERY, MAC
Chú thích: ACF (acriflavine), AZT (aztreonam), BAC (benzalkonium),
CAR (carbenicillin), CEF (cephalothin), CHL (chloramphenicol), CHO
(cholate), CLX (cloxacillin), CTX (cefotaxime), CV (crystal violet), DOC
(deoxycholate), DOR (doxorubicin), EB (ethidium bromide), ERY
(erythromycin), FOX (cefoxitin), FQ (fluoroquinolone), FUA (fusidic acid),
MB (methylene blue), MG (malachite green), NAF (nafcillin), NAL (nalidixic
acid), NOR (norfloxacin), NVB (novobiocin), OQX (olaquindox), OXA
(oxacillin), PEN (penicillin G), PQ (paraquat), PY (pyronine B), R6G
(rhodamine), RIF (rifampicin), SDS (sodium dodecyl sulfate), SUL
(sulbenicillin), TET (tetracycline), THL (thiamphenicol), TPP
(tetraphenylphosphonium), TRI (triclosan), TRX (triton-100), AMG
(aminoglycoside), SDC (sodium deoxycholate), BNKC (benzalkonium
chloride), MAC (macrolide) [24].
Ở Salmonella, vai trò của MFS còn chưa được nghiên cứu đầy đủ [23].
1.2.4.2. Liên quan giữa kênh bơm thải thuốc và kháng kháng sinh ở Salmonella
Trong những năm gần đây, nhiều báo cáo cho thấy có mối liên quan giữa
hệ thống bơm thải thuốc và gia tăng kháng kháng sinh ở vi khuẩn trên lâm sàng.
Biểu hiện của kênh AcrAB liên quan đến kháng cyclohexane ở Salmonella phân
lập được từ người và động vật. Theo đó, Salmonella kháng cyclohexane thì
đồng thời kháng các kháng sinh ampicillin, chloramphenicol, ciprofloxacin,
erythromycin, nalidixic acid, tetracycline, trimethoprim, cetrimide và triclosan.
Người ta thấy rằng S. Typhimurium đề kháng fluoroquinolone có liên quan đến
biểu hiện của các kênh bơm thải thuốc acrA, acrB, acrE, acrF, emrB, emrD, và
mdlB [25]. Bơm thải thuốc là một cơ chế chính cho đề kháng erythromycin,

19
benzalkonium chloride và triclosan ở Salmonella. Kênh bơm thải thuốc AcrD
và MdtABC đề kháng oxacillin, cloxacillin, và nafcillin còn liên quan đến đề
kháng đồng, kẽm, và indol ở Salmonella [26].
Hệ thống bơm thải thuốc có tính hiệu quả cao trong việc bơm thuốc ra
khỏi tế bào và tính đặc hiệu cho rất nhiều thuốc khác nhau, điều này làm nên
vai trò của chúng trong đa kháng thuốc. Kênh AcrAB-TolC ở S. Typhimurium
có thể đào thải được nhiều nhóm kháng sinh khác nhau như quinolone,
chloramphenicol, tetracycline và nalidixic acid [26]. Bằng chứng thực nghiệm
đã chứng minh rằng Salmonella tăng tính nhạy cảm với một số kháng sinh khi
loại bỏ các gen mã hóa các kênh bơm thải thuốc như tolC, acrAB, acrD, acrEF,
mdtABC, mdsABC, emrAB, mdfA, mdtK hoặc macAB [27].
1.3. Tình hình nhiễm và đề kháng kháng sinh của Salmonella trong thực
phẩm
1.3.1. Trên thế giới
Tình trạng nhiễm Salmonella đã và đang xảy ra ở mọi nơi trên thế giới.
Hậu quả là làm gia tăng tỷ lệ bệnh tật và gánh nặng cho nền kinh tế toàn cầu.
Salmonella sống phổ biến ở môi trường và đóng vai trò quan trọng trong lây
nhiễm giữa các nguồn thực phẩm. Salmonella có thể nhiễm ở rất nhiều loại thực
phẩm khác nhau. Tất cả Salmonella đều có khả năng gây bệnh cho người. Tác
nhân gây bệnh này được truyền qua thức ăn hoặc nước bị ô nhiễm cho nên các
nguồn thực phẩm khác nhau có thể nhiễm các loài Salmonella khác nhau. Các
loài Salmonella phân bố rất khác nhau tùy theo từng quốc gia, khu vực [28].
Đã có rất nhiều nghiên cứu khác nhau về tỷ lệ ô nhiễm Salmonella trong thực
phẩm đã được công bố rộng rãi trên thế giới. Nhìn chung, các kết quả nghiên
cứu cho thấy rằng các chủng Salmonella phân bố khác nhau tùy theo từng khu
vực địa lý và theo nguồn thực phẩm. Các type huyết thanh phổ biến cũng khác
nhau theo vùng địa lý. Vì vậy việc tiến hành nghiên cứu tỷ lệ nhiễm và đặc
điểm kháng kháng sinh của Salmonella ở từng loại thực phẩm ở từng khu vực
địa lý vào từng khoảng thời gian là cần thiết. Dưới đây là một số công bố gần

20
đây trên thế giới về tỷ lệ nhiễm và đặc điểm kháng kháng sinh của Salmonella
trong thực phẩm.
Niyomdecha và cộng sự, 2016 đã nghiên cứu khả năng kháng kháng sinh
của S. enterica phân lập từ 120 mẫu (40 mẫu thịt lợn, 40 mẫu thịt gà và 40 mẫu
rau diếp) từ các chợ bán lẻ ở Bangkok, Thái Lan từ tháng 7 đến tháng 8 năm
2015. Kết quả có 82% mẫu thịt lợn, 62% mẫu thịt bò và 20% mẫu rau diếp
nhiễm Salmonella. Serovar phổ biến nhất là S. Panama (15%). Tỷ lệ đề kháng
ampicillin, chloramphenicol, nalidixic acid, sulfamethoxazole/trimethoprim và
tetracycline ở mức cao. Hầu hết các serovar phổ biến là đa kháng kháng sinh.
Nghiên cứu này chỉ ra rằng có nhiều loại thực phẩm khác nhau nhiễm
Salmonella trong đó có một số serovar chiếm ưu thế [29].
Năm 2016, Cai và cộng sự phân lập Salmonella từ các lò giết mổ và thịt
bán lẻ ở Dương Châu, tỉnh Giang Tô, Trung Quốc. Có 71,8% mẫu lợn, thịt lợn
ở lò giết mổ và 70,9% mẫu thịt bán lẻ nhiễm Salmonella. Có 7 serovar được
phát hiện, trong đó phổ biến là S. Derby, S. Typhimurium và S. Uganda.
Tetracycline bị đề kháng nhiều nhất. Nghiên cứu này chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm
Salmonella từ lò mổ và thị trường bán lẻ là tương đương. Ngoài ra, Salmonella
có thể lây nhiễm dọc theo dây chuyền giết mổ từ các lò mổ đến chợ bán lẻ [30].
Katoh và cộng sự, 2015 thu thập mẫu thịt gà bán lẻ ở Tokyo từ năm 1992
đến 2012. Tỷ lệ nhiễm Salmonella là 29,8%. Có 22 serovar được phát hiện
trong đó phổ biến là S. Infantis, S. Hadar, S. Typhimurium, S. Manhattan, S.
Schwarzengrund, S. Agona. Tỷ lệ đề kháng kháng sinh là 89,9%, trong đó
90,2% là đa kháng. Tỷ lệ kháng streptomycine và tetracycline ở mức cao với
81,8% và 77,8% tương ứng [31]. Tirziu và cộng sự, 2015 đã tiến hành nghiên
cứu tỷ lệ nhiễm và khả năng kháng kháng sinh của Salmonella phân lập được
từ mẫu thịt gà bán lẻ và thịt gà từ các lò mổ ở Romani. Kết quả có 13,2% các
mẫu nghiên cứu nhiễm Salmonella. Có 8 serovar được phân lập, gồm S. Infanti,
S. Bredeney, S. Virchow, S. Djugu, S. Grampian, S. Brandenburg, S. Derby và
S. Ruzizi. Tetracycline là kháng sinh có tỷ lệ đề kháng cao nhất, không có chủng
nào đề kháng cefotaxime và ceftazidime [32].

21
Salmonella đề kháng kháng sinh là vấn đề nghiêm trọng, đe dọa sức khỏe
nhân loại. Vào đầu những năm 1960, chủng Salmonella đầu tiên đề kháng
chloramphenicol đã được báo cáo. Kể từ đó, tần suất phân lập được các chủng
Salmonella đề kháng một hoặc nhiều kháng sinh đã tăng lên ở nhiều nước trên
thế giới. Các kháng sinh ampicillin, chloramphenicol và trimethoprim-
sulfamethoxazole là các thuốc đầu tay, hay được sử dụng trong điều trị nhiễm
Salmonella. Trong nhiều năm, tỷ lệ đa kháng kháng sinh ở S. Typhi tăng mạnh.
Châu Phi và Châu Á có tỷ lệ S. Typhi đa kháng kháng sinh ở mức cao [33].
Trong lịch sử, các kháng sinh đầu tiên được sử dụng để điều trị bệnh
thương hàn là ampicillin, trimethoprim-sulfamethoxazole, và chloramphenicol.
Các chủng S. Typhi đề kháng ba loại kháng sinh này được coi là đa kháng kháng
sinh và chúng được báo cáo xuất hiện vào cuối những năm 1970 đến đầu những
năm 1980. Đề kháng fluoroquinolone cũng đã được báo cáo thường xuyên vì
đây là kháng sinh hay được sử dụng để điều trị nhiễm Salmonella đa kháng.
Ceftriaxone và azithromycin hiện nay cũng hay được sử dụng để điều trị sốt
thương hàn khi không còn lựa chọn khác. Vì vậy, một số ít các trường hợp S.
Typhi đề kháng ceftriaxone hoặc azithromycin gần đây đã được báo cáo [33].
Trong hai thập kỷ qua, S. Typhi H58 đa kháng kháng sinh đã lan rộng
trên toàn cầu, phổ biến trên khắp các vùng Nam, Đông nam Châu Á và một
phần của Châu Phi và châu Đại Dương. Đã có nhiều đợt bùng phát dịch sốt
thương hàn ở địa phương do loài vi khuẩn này [34].
Đối với Salmonella không gây sốt thương hàn (Non-typhoidal
Salmonella: NTS), số chủng đa kháng kháng sinh đã tăng lên ở nhiều quốc gia
kể từ lần đầu tiên xuất hiện chủng S. Typhimurium DT104 đa kháng kháng sinh
vào năm 1990 [35]. Dựa trên dữ liệu từ năm 2005 đến năm 2006 được công bố
bởi Hệ thống giám sát kháng khuẩn quốc gia Hoa Kỳ (National Antimicrobial
Resistance Monitoring System: NARMS), 84 % số mẫu NTS phân lập trên lâm
sàng là đa kháng kháng sinh và 4,1% giảm tính nhạy cảm với cephalosporin ở
Mỹ. Dữ liệu của NARMS 1996–2007 cũng cho thấy sự xuất hiện của các chủng
NTS có khả năng đề kháng nalidixic acid và ceftriaxone. Hiện tượng này đã

22
gây ra khó khăn cho các cơ quan y tế công cộng về quản lý lâm sàng và phòng
chống các bệnh nhiễm trùng [36].
Salmonella kháng kháng sinh chủ yếu là do lạm dụng kháng sinh trong
điều trị bệnh ở người và trong chăn nuôi. Điều này gây ra nguy cơ lây truyền
cao các loài Salmonella đa kháng từ động vật sang người thông qua thức ăn
hoặc nước uống, tiếp xúc trực tiếp hoặc tiêu thụ động vật bị nhiễm bệnh [33].
1.3.2. Tại Việt Nam
Trong những năm gần đây, Bộ Y tế Việt Nam đã thành lập chương trình
kiểm soát vi khuẩn kháng kháng sinh. Động vật và các sản phẩm từ chúng là
nguồn chủ yếu nhiễm Salmonella, từ đó lây truyền sang người. Do đó, việc
nghiên cứu về tình hình kháng kháng sinh của Salmonella trong thực phẩm là
quan trọng [37].
Hơn 70% S. Typhi phân lập được ở miền nam Việt Nam năm 1994 là đa
kháng kháng sinh. Tỷ lệ S. Typhi đa kháng kháng sinh vẫn cao kể từ năm 1993.
Tỷ lệ kháng nalidixic acid tăng mạnh từ 1993 (4%) đến 2005 (97%) [38].
Nghiên cứu về tình hình kháng kháng sinh của các loại vi khuẩn gây ô nhiễm
thực phẩm tại Việt Nam năm 2007 cho thấy có tới 50,5% Salmonella đề kháng
ít nhất một kháng sinh [39].
Tỷ lệ Salmonella trong thực phẩm kháng kháng sinh và đa kháng kháng
sinh ở Việt Nam tăng lên theo các công bố hàng năm, cụ thể như sau:
Thu thập mẫu thịt bò bán lẻ tại Hà Nội năm 2009 cho thấy có khoảng
39,9% nhiễm Salmonella. Trong đó 9 loài là S. Anatum (28,6%), S. Rissen
(25,4%), S. Weltevreden (12,7%), S. Typhimurium (7,9%), S. Derby (7,9%), S.
Lexington (7,9%), S. Dublin (4,6%), S. Newport (3.2% ) và S. London (1,8%)
đã được phát hiện. Tỷ lệ đề kháng ít nhất một kháng sinh là 58,7%, trong đó
46% là đa kháng. Tỷ lệ đề kháng các kháng sinh là: tetracycline (46,0%),
sulphonamide (39,7%), ampicillin (31,7%), streptomycin (30,2%),
trimethoprim (28,6%), kanamycin (28,6%) và chloramphenicol (22,2%). Kết
quả nghiên cứu trên cho thấy rằng Salmonella đa kháng kháng sinh được phân
bố rộng rãi ở miền Bắc Việt Nam thông qua chuỗi thức ăn. Như vậy, các nghiên

23
cứu liên tục là cần thiết để làm rõ các cơ chế đa kháng kháng sinh ở Salmonella
và phương thức lây nhiễm của chúng trong môi trường chăn nuôi [40].
Nghiên cứu tình hình kháng kháng sinh của Salmonella phân lập được ở
thịt lợn và thịt gà bán lẻ ở miền bắc Việt Nam năm 2012 cho thấy có 39,6%
mẫu thịt lợn và 42,9% mẫu thịt gà nhiễm với Salmonella, có 14 serovar được
xác định. Các loài phổ biến là S. Anatum, S. Infantis, S. Emek, S. Derby, S.
Rissen, S. Typhimurium, S. Reading và S. London. Tỷ lệ đề kháng ít nhất một
kháng sinh là 78,4%. Có 14 serovar đa kháng kháng sinh. Nghiên cứu này chỉ
ra rằng tỷ lệ đa kháng kháng sinh giữa các loài Salmonella ngày càng tăng.
Nguyên nhân có thể do tình trạng lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi [41].
Phân lập Salmonella từ thịt gà sống tại Việt Nam năm 2014 cho thấy
48,7% nhiễm Salmonella. Có 22 serovar phân lập được, trong đó phổ biến là S.
Albany, S. Agona và S. Dabou. Tỷ lệ đề kháng ít nhất một kháng sinh là 73,3%,
tỷ lệ đa kháng là 17,7%, đặc biệt xuất hiện serovar đề kháng 9 loại kháng sinh.
Các kháng sinh bị đề kháng cao là tetracycline (59,1%) và ampicillin (41,6%).
Việc bảo quản không đúng cách thịt gà sống đã gây nhiễm chéo và làm tăng tỷ
lệ nhiễm Salmonella. Những kết quả này có thể hữu ích trong việc phát triển
mô hình đánh giá nguy cơ và dự phòng lây nhiễm Salmonella từ thực phẩm
sang người ở Việt Nam [42].
Tại Sài Gòn, mẫu thịt sống bán lẻ và hải sản đã được thu thập để phân
lập Salmonella trong tháng 8 năm 2012 và tháng 3 năm 2015. Kết quả là 69,7%
mẫu thịt lợn, 65,3% mẫu thịt gà, 58,3% mẫu thịt bò, 49,1% mẫu tôm, 36,6%
mẫu cá nước ngọt nhiễm Salmonella. Có 53 serovar phân lập được, phổ biến là
S. Rissen, S. Weltevreden, S. London, S. Anatum, S. Typhimurium và S.
Corvallis. Hơn 62,2% Salmonella phân lập được đề kháng kháng sinh, trong đó
41,1% đa kháng [43].
1.4. Một số kỹ thuật hay được sử dụng trong nghiên cứu biểu hiện gen
Hiện nay các kỹ thuật được sử dụng rộng rãi để phân tích biểu hiện gen
là reverse transcription PCR (RT-PCR), real-time PCR (qPCR), microarray và
giải trình tự gen thế hệ mới (next generation sequencing, NGS).

24
1.4.1. Reverse transcription PCR (RT-PCR)
Vào đầu những năm 1990, sử dụng kỹ thuật RT-PCR để phân tích biểu
hiện gen trở nên phổ biến. RT-PCR là công cụ mạnh mẽ để xác định các gen
biểu hiện trong hệ gen của sinh vật. Phương pháp này sử dụng đĩa gồm 96 giếng
để khuếch đại và yêu cầu một lượng nhỏ RNA mẫu. Tiến bộ của kỹ thuật này
ở thời điểm đó là có thể tiến hành phân tích biểu hiện gen với quy mô lớn. Tuy
nhiên, RT-PCR chỉ là một kỹ thuật bán định lượng đơn giản, phương pháp này
yêu cầu phải biết trình tự chính xác của gen nghiên cứu để thiết kế và tổng hợp
primer. Hơn nữa, việc phải sử dụng mẫu chuẩn để định lượng là cản trở lớn cho
phép kỹ thuật này được sử dụng làm nền tảng ở quy mô lớn cho nhiều gen [44].
1.4.2. Real-time PCR (qPCR)
Với sự tiến bộ của khoa học, PCR thời gian thực (real-time PCR) đã ra
đời, cho phép định lượng mRNA trong mẫu nghiên cứu. Ngày nay, người ta có
thể sử dụng khay gồm nhiều giếng để định lượng mRNA trong hàng trăm mẫu
mỗi ngày. Tuy nhiên, phương pháp này về cơ bản vẫn là một chuỗi các phân
tích nối tiếp khi phân tích nhiều gen, theo đó, mỗi mẫu chỉ kiểm tra được một
gen trong một giếng phản ứng. Vì vậy việc phân tích sẽ rất đắt tiền nếu muốn
nghiên cứu hàng trăm hoặc hàng ngàn gen khác nhau. Do đó, qPCR thường
được coi là một phương pháp xác nhận, phù hợp để xác nhận mức biểu hiện
của một số lượng nhỏ các gen trong nhiều mẫu sinh học [45].
1.4.3. Microarray
Ngoài công nghệ giải trình tự thế hệ mới, microarray có lẽ là công nghệ
thành công nhất trong nghiên cứu biểu hiện của toàn bộ hệ gen. Ưu thế của
công nghệ này là đo được mức độ biểu hiện của hàng chục ngàn gen đồng thời
chỉ trong một thí nghiệm duy nhất. Theo đó, RNA được tách ra từ tế bào nghiên
cứu, gắn màu huỳnh quang trực tiếp, và chuyển thành cDNA. Sau đó cDNA
được lai vào các array. Những array sau đó được rửa và tín hiệu lai được xác
định bằng cách đo cường độ màu ở mỗi spot, cường độ tín hiệu màu đo được
chính là mức độ biểu hiện gen [46].

25
Microarray tạo ra dữ liệu có kích thước nhỏ, chỉ khoảng 0,7 MB nên dễ
dàng chia sẻ dữ liệu nghiên cứu. Các phần mềm phân tích số liệu của microarray
khá nhiều, trong đó nhiều phần mềm miễn phí, dễ sử dụng. Hơn nữa, giá thành
của microarray rất rẻ so với giải trình tự thế hệ mới. Microarray là kỹ thuật tin
cậy và có hiệu quả về kinh tế trong nghiên cứu hệ gen biểu hiện của sinh vật.
Microarray hiện không còn được sử dụng phổ biến bằng kỹ thuật giải trình tự
thế hệ mới, nhưng kỹ thuật này sẽ không bị loại bỏ mà có thể sẽ ít được sử dụng
[47]. Với ưu điểm của mình, microarry đã được ứng dụng nhiều trong nghiên
cứu hệ gen biểu hiện ở sinh vật nói chung và ở Salmonella nói riêng.
Mặc dù chúng có nhiều ưu điểm không thể phủ nhận, nhưng microarray
có một số hạn chế sau:
Thứ nhất, microarray là phương pháp đo gián tiếp nồng độ DNA hoặc
RNA. Có nghĩa là cường độ tín hiệu đo được tại một vị trí trên array thường
được cho là tỷ lệ với nồng độ của DNA, hoặc RNA. Tuy nhiên, do động học
của phép lai, mức tín hiệu tại một vị trí nhất định trên array không tỉ lệ thuận
với nồng độ của DNA, RNA. Cụ thể là ở nồng độ cao, array sẽ trở nên bão hòa
và ở nồng độ thấp sẽ không xảy ra hiện tượng lai. Do đó, tín hiệu chỉ tuyến tính
khi nồng độ DNA, RNA trong dung dịch nằm trong một khoảng giới hạn nhất
định [46].
Thứ hai, với hệ gen phức tạp của động vật có vú thì sẽ rất khó, thậm chí
là không thể thiết kế array vì có rất nhiều trình tự DNA, RNA tương đồng bám
vào các probe giống nhau trên array. Ví dụ, trình tự trên một array được thiết
kế để phát hiện gen A cũng có thể phát hiện gen B, gen C, và gen D nếu những
gen này có độ tương đồng cao với gen A. Đây là một vấn đề cho các gen nằm
trong một họ gen và các gen với các biến thể của chúng. Tất nhiên, có thể thiết
kế array đặc hiệu để phát hiện các biến thể của gen bằng cách thiết kế probe
phát hiện từng exon trong hệ gen hoặc từng điểm nối các exon. Tuy nhiên, sẽ
rất khó để thiết kế các array để phát hiện từng exon hoặc từng gen trong hệ gen
với nhiều gen tương đồng [46].

26
Cuối cùng, một DNA array chỉ có thể phát hiện trình tự mà array đó đã
được thiết kế để phát hiện, nghĩa là nếu trong dung dịch lai có nhiều DNA,
RNA có trình tự không bổ sung với trình tự trên array thì chúng sẽ không được
phát hiện. Điều này có nghĩa là các gen chưa có thông tin trong hệ gen sẽ không
được phát hiện. Hơn nữa các gen không mã hóa RNA sẽ không thể phát hiện
được bằng phương pháp này. Có rất nhiều hệ gen khác nhau, ví dụ hệ gen của
vi khuẩn, array thường được thiết kế bằng cách sử dụng thông tin hệ gen của
một loài liên quan. Kiểu thiết kế này có thể làm mất một lượng lớn sự biểu hiện
của các đoạn gen có trong loài nghiên cứu. Ví dụ, cùng một loài
Aggregatibacter actinomycetemcomitans nhưng khác nhau đến 20% số gen
giữa hai nguồn phân lập [48]. Vì vậy, một array được thiết kế dựa trên trình tự
của loài tham chiếu này sẽ làm mất đi nhiều gen ở loài nghiên cứu [46].
1.4.4. Giải trình tự thế hệ mới
Giải trình tự thế hệ mới là phương pháp đo trực tiếp trình tự nucleic acid
có mặt trong mẫu nghiên cứu, do đó chỉ cần đếm số lượng của một loại trình tự
có mặt trong mẫu. Số lượng trình tự tuyến tính với nồng độ trình tự nucleic acid
có mặt trong mẫu nghiên cứu. Hơn nữa, giải trình tự thế hệ mới không phụ
thuộc vào thông tin của trình tự nucleic acid có thể biểu hiện trong mẫu nghiên
cứu, không phụ thuộc vào các gen có mức tương đồng cao [49].
Trong số các công nghệ giải trình tự thế hệ mới thì công nghệ Illumina
tạo ra dữ liệu có độ chính xác cao nhất, quy trình làm thí nghiệm đơn giản, và
được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau như trong nghiên cứu
hệ gen và transcriptome. Nguyên tắc của giải trình tự thế hệ mới cũng tương tự
như giải trình tự thế hệ đầu tiên. DNA polymerase xúc tác sự kết hợp của các
deoxyribonucleotide triphosphate được gắn huỳnh quang tạo thành các DNA.
Các nucleotide được xác định bằng cách đo cường độ các tín hiệu màu. Sự khác
biệt quan trọng của giải trình tự thế hệ mới so với phương pháp cũ là tiến hành
giải trình tự đồng thời hàng triệu mảnh DNA. Các bước cơ bản trong giải trình
tự gen Illumina như sau:

27
Bước 1. Chuẩn bị mẫu: Mẫu DNA, hoặc cDNA được cắt ngẫu nhiên
thành các đoạn nhỏ và gắn adapter ở hai đầu. Mỗi nền tảng công nghệ giải trình
tự gen khác nhau sẽ sử dụng các trình tự adapter đặc trưng riêng.
Bước 2. Khuếch đại mẫu: Illumina sử dụng phương pháp khuếch đại kiểu
cầu nối. Các đoạn DNA gắn adapter được phủ lên flow cell và biến tính thành
mạch đơn. Các đoạn DNA mạch đơn này sẽ lai với các đoạn mồi đã phủ sẵn ở
trên flow cell. Quá trình này tạo ra bản copy đầu tiên của các đoạn DNA được
lai. Tiếp theo, các DNA mẫu được rửa đi, chỉ giữ lại các bản sao của chúng đã
được gắn lên flow cell. Các bản copy này được khuếch đại đẳng nhiệt thành
một cụm (cluster) khoảng 1.000 bản sao giống hệt nhau.
Bước 3. Giải trình tự: Sử dụng bốn loại màu huỳnh quang khác nhau để
gắn vào bốn loại nucleotide để tìm trình tự đồng thời của hàng chục triệu
cluster. Trong mỗi chu kỳ giải trình tự, một nucleotide gắn màu được gắn vào
chuỗi DNA. Nucleotide gắn màu này đóng vai trò là chất kết thúc quá trình
tổng hợp chuỗi DNA, vì vậy sau mỗi lần kết gắn vào DNA, màu huỳnh quang
được ghi lại và sau đó được enzyme tách ra để cho các nucleotide tiếp theo gắn
vào chuỗi DNA đang tổng hợp. Kết quả là tìm được trình tự các DNA có độ
chính xác cao, với số lượng rất lớn của bộ gen, không xuất hiện lỗi ở các vùng
trình tự lặp và các vùng trình tự tương đồng.
Bước 4. Phân tích số liệu: Các read được sắp xếp lại và lắp gép với trình
tự của hệ gen tham chiếu hoặc lắp ráp de novo bằng các phần mềm tin sinh học.
Sử dụng phần mềm tin sinh học khác nhau để chú thích hệ gen.
Hiện nay, hơn 90% dữ liệu trình tự trên thế giới được tạo ra bởi công
nghệ Illumina [50].

28
Chương 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
Tổng số 90 mẫu thịt, gồm 30 mẫu thịt lợn, 30 mẫu thịt gà, và 30 mẫu thịt
bò, thu thập ngẫu nhiên tại 10 chợ ở Hà Nội. Danh sách địa điểm lấy mẫu và
ký hiệu mẫu được thể hiện trong bảng 2.1.
Bảng 2.1. Địa điểm lấy mẫu, số mẫu và ký hiệu mẫu
STT Địa điểm (chợ) Nguồn mẫu Số lượng Ký hiệu mẫu
1 Long Biên
Thịt gà 3 TG-1 đến TG-3
Thịt lợn 3 TL-1 đến TL-3
Thịt bò 3 TB-1 đến TB-3
2 Cầu Giấy
3 Đống Đa
4
Nguyễn Công
Trứ
5 Mai Động
6 Tân Mai
7 Trương Định
8 Tứ Liên

29
STT Địa điểm (chợ) Nguồn mẫu Số lượng Ký hiệu mẫu
9 Kim Giang
10 Hà Đông
2.1.2. Môi trường, hóa chất, kháng sinh, các bộ kit
Môi trường nuôi cấy, kháng sinh, các bộ kit sử dụng trong nghiên cứu
này đều được cung cấp bởi các hãng có uy tín trên thế giới.
2.1.2.1. Môi trường, hóa chất phân lập Salmonella theo tiêu chuẩn ISO
6579:2002
Tất cả các môi trường được sử dụng để định danh Salmonella theo quy
trình ISO 6579:2002 đều vô trùng trước khi sử dụng. Thành phần các môi
trường, hóa chất, nguồn gốc và cách pha chế được trình bày trong bảng 2.2.
Bảng 2.2. Thành phần các môi trường và hóa chất sử dụng để định danh
Salmonella
Môi trường, hóa
chất
Thành phần
Hàm
lượng (g/l)
Nước pepton,
Oxoid (Anh),
Code: CM0509
Peptone 10
Sodium chloride 5
Disodium phosphate 3,5
Potassium dihydrogen phosphate 1,5
pH 7,2 ± 0,2 ở 25°C
Cho 20 gam vào 1lít nước vô trùng, hấp ở 121°C trong
15 phút
Thạch MSRV
(Modified semi-
solid Rappaport-
Vassiliadis),
Enzymatic digest of animal and plant
tissue
4,6
Acid hydrolysate of casein 4,6
Sodium chloride 7,3
Potassium dihydrogenphosphate 1,5

30
chất
Thành phần
Hàm
lượng (g/l)
Oxoid (Anh),
Code: CM1112.
Magnesium chloride anhydrous 10,9
Malachite green oxalate 0,04
Agar 2,7
pH 5,2 (5,1 đến 5,4) ở 25°C
Novobiocin 0,01
Hòa 31,6 g MSRV trong 1 lít nước vô trùng, lắc đều khi
đun sôi (không được hấp), để nguội 50°C và thêm kháng
sinh novobiocin, lắc đều và đổ ra đĩa petri (không lật úp
đĩa).
Môi trường
MKTTn (Muller-
Kauffmann
tetrathionate-
novobiocin
broth), Oxoid
(Anh), Code:
CM1048
Meat extract 4,3
Enzymatic digest of casein 8,6
Sodium chloride 2,6
Calcium carbonate 38,7
Sodium thiosulphate (anhydrous) 30,5
Ox bile 4,78
Brilliant green 0,0096
pH 8,0 ± 0,2 ở 25°C
Hòa 89,5 g MKTTn trong 1 lít nước vô trùng, lắc đều và
đun sôi, để nguội dưới 45°C. Ngay trước khi sử dụng,
cho 20ml dung dịch iodine, được điều chế bằng cách hòa
tan 25g kali iodua trong 10ml nước, thêm 20g iốt rồi pha
loãng thành 100 ml bằng nước vô trùng. Đồng thời thêm
4 lọ novobiocin, trộn đều và chia thành ác ống.
Thạch SS
(Salmonella
Shigella), Oxoid
(Anh), Code:
CM0099.
Dùng làm môi
trường phân lập
thứ hai
‘Lab-Lemco’ powder 5,0
Peptone 5,0
Lactose 10,0
Bile salts 8,5
Sodium citrate 10,0
Sodium thiosulfate 8,5
Ferric citrate 1,0
Brilliant green 0,00033
Neutral red 0,025
Agar 15,0
pH 7,0 ± 0,2 ở 25°C

31
chất
Thành phần
Hàm
lượng (g/l)
Hòa 63 g SS trong 1 lít nước vô trùng, lắc đều khi đun
sôi (không được hấp). Để nguội đến khoảng 50°C và đổ
ra đĩa.
Thạch XLD
(Xylose lysine
deoxycholate
agar), Oxoid
(Anh), Code:
CM0469
Yeast extract 3,0
L-Lysine HCl 5,0
Xylose 3,75
Lactose 7,5
Sucrose 7,5
Sodium desoxycholate 1,0
Sodium chloride 5,0
Sodium thiosulphate 6,8
Ferric ammonium citrate 0,8
Phenol red 0,08
Agar 12,5
pH 7,4 ± 0,2 ở 25°C
Hòa 53 g XLD trong 1 lít nước vô trùng, lắc đều khi
đun sôi (không được hấp). Chuyển ngay sang bể ủ nhiệt
ở 50°C và đổ ra đĩa ngay khi đạt nhiệt độ.
Thạch dinh
dưỡng (Nutrient
Agar), Merck
(Đức), Product
Number: 70116
Meat extract 3
Peptone 5
Agar 15
pH 7,0 ± 0,2 ở 25°C
Hòa 23 g thạch trong 1 lít nước vô trùng, đưa về pH 7,0.
Hấp ở 121°C trong 15 phút, để nguội và đổ ra đĩa.
Thạch Kligler,
Oxoid (Anh),
Code: CM0033
Lab-Lemco’ powder 3
Yeast extract 3
Peptone 20
Sodium chloride 5
Lactose 10
Glucose 1
Ferric citrate 0,3
Sodium thiosulphate 0,3
Phenol red 0,05
Agar 12

32
chất
Thành phần
Hàm
lượng (g/l)
pH 7,4 ± 0,2 ở 25°C
Hòa 55 g trong 1 lít nước vô trùng, đun sôi cho tan thạch.
Chia vào các tube và hấp ở 121°C trong 15 phút.
Dung dịch Ure,
Sigma-Aldrich
(Mỹ), Product
Number: U1757
Peptic Digest of Animal Tissue 1
Dextrose 1
Sodium Chloride 5
Disodium Phosphate 1,2
Monopotassium Phosphate 0,8
Phenol Red 0,012
Agar 15
pH 6,8 ± 0,2 ở 25°C
Hòa 24 g trong 0,95 lít nước vô trùng, đun sôi cho tan
thạch. Hấp ở 115°C trong 20 phút. Làm nguội đến 50°C
rồi cho 50 ml dung dịch Ure 40% vào, trộn đều, chia ra
các tube.
Dung dịch L-
Lysine
decarboxylation,
hãng Merck
(Đức), Product
Number: 41932
L-Lysine monohydrochloride 5
Yeast extract 3
Dextrose 1
Bromocresol purple 0,015
pH 6,8 ± 0,2 ở 25°C
Hòa tan 9,01 g trong 1 lít nước vô trùng. Chia 5ml dung
dịch vào các tube có nắp vặn, hấp ở 121°C trong 15 phút
Dung dịch
ONPG, Biolab
(Hungary), code:
ONP60100
o-Nitrophenyl β-D-galactopyranoside
(ONPG) 0,3 g
-
Buffer 0,37 g
Pha loãng bột ONPG với 100 ml nước muối sinh lý, hòa
tan và chia 2 ml mỗi tube.
Dung dịch VP
(Voges-
Proskauer),
Merck (Đức),
Product Number:
39484
Peptone 7
Dextrose 5
Dipotassium Phosphate 5
pH 6,9 ± 0,2 ở 25°C
Hòa tan 17 g trong 1 lít nước vô trùng. Chia 10 ml dung
dịch vào các tube, hấp ở 121°C trong 15 phút
Tryptone/tryptop
han
Casein enzymic hydrolysate 10
Sodium chloride 5

33
chất
Thành phần
Hàm
lượng (g/l)
(cho phản ứng
Indole), Merck
(Đức), Product
Number: 09136
DL-Tryptophan 1
pH 7,5 ± 0,2 ở 25°C
Hòa tan 16 g trong 1 lít nước vô trùng. Chia 3 ml dung
dịch vào các tube có nắp vặn, hấp ở 121°C trong 15 phút
Kovacs, Merck
(Đức), Product
Number: 67309
4-(dimethlyamino)benzaldehyde 50
Hydrochloric acid 240
Isoamylic alcohol 710
Kháng huyết thanh O và H chuẩn của hãng Denka Seiken Co., Ltd. Tokyo,
Nhật Bản.
2.1.2.2. Môi trường dùng để làm kháng sinh đồ
• Canh thang BHI (Brain Heart Infusion broth).
Môi trường BHI (Biolife, Italy, mã số N0
551230 (P) BE-2), dùng cho
nuôi cấy rất nhiều loài vi sinh vật khác nhau. Môi trường này được bổ sung
thêm penicillin (20 I.U/ml) và streptomycin (40 I.U/ml) để chọn lọc các loài vi
khuẩn và nấm gây bệnh. Hòa tan 37 g BHI trong 1000 ml nước cất vô trùng,
đun sôi và khử trùng bằng cách hấp ở 121o
C trong 15 phút, pH cuối cùng là 7,4
± 0,2. Thành phần môi trường BHI được trình bày trong bảng 2.3.
Bảng 2.3. Thành phần môi trường BHI
Thành phần Hàm lượng (g/l)
Brain infusion solids 12,5
Beef heart infusion solids 5
Peptocomplex 10
Glucose 2
NaCl 5
Disodium hydrogen phosphate 2,5
• Thạch Muller Hinton.
Thạch Muller Hinton (Biolife, Italy, mã số N0
401740 BE-0) dùng để làm
kháng sinh đồ. Thạch này được CLSI khuyên dùng cho thử nghiệm kháng sinh
đồ theo phương pháp khoanh giấy khuếch tán đối với hầu hết các loài vi khuẩn
thông thường. Môi trường Muller Hinton của hãng Biolife được thêm các hóa

34
chất chọn lọc, gồm hàm lượng thấp của thymine và thymidine vì chúng ảnh
hưởng đến giá trị MIC của sulphonamide và trimethoprim. Thành phần môi
trường Muller Hinton được trình bày trong bảng 2.4.
Bảng 2.4. Thành phần môi trường Muller Hinton
Thành phần Hàm lượng (g/l)
Beet extract 2
Acid digest của casein 17,5
Tinh bột 1,5
Agar bios special 17
2.1.2.3. Kháng sinh
Khoanh giấy kháng sinh sử dụng làm kháng sinh đồ được cung cấp bởi
hãng BD Diagnostics. Các kháng sinh được lựa chọn theo hướng dẫn của CLSI-
2015. Những kháng sinh này đồng thời cũng là những kháng sinh thường được
sử dụng trong điều trị và trong chăn nuôi tại Việt Nam. Danh sách kháng sinh
được trình bày trong bảng 2.5.
Bảng 2.5. Kháng sinh sử dụng làm kháng sinh đồ
Tên kháng sinh Hàm lượng (μg)
Ampicillin 10
Ceftazidime 30
Gentamicin 10
Streptomycin 10
Ciprofloxacin 5
Chloramphenicol 30
Tetracycline 30
Trimethoprim/sulfamethoxazole 1,25/23,75
2.1.2.4. Các bộ kít
Sử dụng TRIzol Reagent được cung cấp bởi hãng Invitrogen (Catalog
Numbers 15596026 và 15596018) để tách chiết RNA tổng số từ các chủng
Salmonella đa kháng kháng sinh. Bộ kit TRIzol có khả năng phân lập RNA
tổng số với chất lượng cao từ nhiều mẫu sinh học khác nhau. Dung dịch

35
monolasic phenol và guanidine isothiocyanate được sử dụng để phân lập các
đoạn riêng biệt của RNA từ các tế bào và mô của người, động vật, thực vật,
nấm men hoặc vi khuẩn trong vòng một giờ. Sản phẩm cuối cùng tạo ra là các
RNA tổng số, transcriptome RNA, micro RNA. Sản phẩm này có thể được sử
dụng cho Cloning, Northern Blotting, qPCR, RT-PCR, và tổng hợp cDNA.
Tinh sạch sản phẩm RNA thu được bằng bộ kit RNase-free Dnase Set
(QIAGEN, Cat No./ID: 79254). Bộ kit này có khả năng phân hủy hiệu quả
DNA trên cột trong quá trình lọc RNA. Nói chung, DNase là không cần thiết
cho quá trình tinh sạch RNA với RNeasy Kit do màng silica-gel, công nghệ cột
spin có khả năng loại bỏ hiệu quả phần lớn DNA mà không cần xử lý với
DNase. Bộ đệm RDD trong bộ kit này được tối ưu hóa cho DNase trên cột trong
15 phút ở 20–30o
C. Bộ đệm cũng rất phù hợp cho DNase trong dung dịch.
Sử dụng bộ kít TruSeq RNA Sample Preparation v2 Kit (Illumina) và
TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation Kit (Illumina) để chuẩn bị mẫu
cho giải trình tự thế hệ mới bằng công nghệ Illumina theo quy trình hướng dẫn
của nhà sản xuất. Mục đích của bộ kit này là để gắn các trình tự adapter vào
cuối các đoạn DNA mẫu để tạo ra thư viện DNA cho việc giải trình tự.
2.1.3. Thiết bị nghiên cứu
Các thiết bị được sử dụng tại các phòng thí nghiệm sau:
• Phòng Hệ gen học Vi sinh, Viện Nghiên cứu Hệ gen, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam.
• Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Bỏng Quốc gia, Học viện Quân y.
• Viện Nghiên cứu Y Dược học Quân sự, Học viện Quân y.
Các thiết bị được sử dụng trong luận án
• Cân điện tử Shinko GS3002 (Shinko / Nhật)
• Hệ thống điện di Biorad PowerPac 200 (Biorad / Mỹ)
• Lò vi sóng (Panasonic / Nhật)
• Máy Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies / Mỹ)
• Máy chuẩn pH AE150 pH Benchtop Meter (Fisher Scientific / Anh)

36
• Máy giải trình tự thế hệ mới HiSeq4000 (Illumina / Mỹ)
• Máy ly tâm Eppendorf™ 5424 (Eppendorf / Đức)
• Máy Minispin (Eppendorf / Đức)
• Máy Nanodrop Spectrophotometer (ND-1000) (Thermo Scientific / Mỹ)
• Máy PCR Mastercycler®pro (Eppendorf / Đức)
• Máy so độ đục DensiCHEKTM Plus (BioMérieux / Pháp)
• Máy soi UV Herolab (Wiesloch / Đức)
• Máy vortex ZX3 (Velp / Italia)
• Nồi hấp tiệt trùng HVP-50 (Amerex Instruments / Mỹ)
• Tủ an toàn sinh học cấp 2 (Esco / Singapore)
• Tủ ấm 37o
C (Memmert / Đức)
• Tủ lạnh âm 20 GPF Series (Thermo Scientific / Mỹ)
• Tủ lạnh âm 80 TSU Series (Thermo Scientific / Mỹ)
• Tủ lạnh thường (Panasonic / Nhật)
• Tủ sấy dụng cụ DS – 80S-1 (Dasol – Hàn Quốc)

37
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Để thực hiện luận án này, chúng tôi sử dụng các phương pháp nghiên
cứu sau:
2.2.1. Phương pháp lấy mẫu
Lấy mẫu theo tiêu chuẩn TCVN 4833-2002 [51]. Để kiểm tra mức độ
nhiễm vi khuẩn Salmonella trong thịt tươi vào thời điểm mà người tiêu dùng
Hà Nội mua nhiều, chúng tôi tiến hành lấy mẫu từ 7-8 giờ sáng trong mùa đông,
từ tháng 10 đến tháng 12 năm 2016. Các mẫu được bỏ vào túi bóng vô trùng có
nẹp kéo và ủ ở nhiệt độ từ 4 đến 10o
C trong hộp vận chuyển mẫu chuyên dụng.
Mẫu đã thu thập được vận chuyển về phòng thí nghiệm trong vòng 4 giờ và tiến
hành nuôi cấy theo quy trình ISO 6579-2002 trong vòng 24 giờ. Tên các mẫu
được mã hóa riêng, ghi thời gian lấy mẫu, nhiệt độ môi trường xung quanh, tên
cửa hàng, địa điểm, loại mẫu, thời gian vận chuyển và nhiệt độ phòng thí
nghiệm lúc thực hiện nuôi cấy.
2.2.2. Định danh Salmonella
Salmonella được định danh theo quy trình ISO 6579:2002 (International
Organization for Standardization) [52], gồm các bước sau:
2.2.2.1. Tăng sinh sơ bộ không chọn lọc
Làm ấm nước pepton ở nhiệt độ phòng trước khi sử dụng. Cho 10 lần thể
tích nước pepton vào từng mẫu nghiên cứu, ví dụ, cho 225 ml nước pepton vào
25 g thịt, ủ ở 37o
C trong 18 ± 2 giờ.
2.2.2.2. Tăng sinh chọn lọc
Lấy 3 giọt (khoảng 0,1 ml) dung dịch nuôi cấy trên nhỏ vào 3 điểm cách
đều nhau trên đĩa thạch MSRV, không lật úp đĩa thạch, ủ ở 41,5o
C trong 24 ±
3 giờ. Đồng thời chuyển 1 ml dung dịch nuôi cấy vào 10 ml canh thang
MKTTn, ủ ở 37o
C trong 24 ± 3 giờ. Đĩa MSRV dương tính sẽ tạo vùng vi khuẩn
màu xám trắng mọc lan ra xa các giọt cấy, quầng trắng này có cạnh rõ ràng.
Đĩa MSRV âm tính sẽ được ủ tiếp trong 24 ± 3 giờ. Sử dụng que cấy 1 μl lấy
vi khuẩn ở vị trí mọc lan xa nhất trong đĩa MSRV dương tính, đồng thời dùng
que cấy 10 μl lấy dịch nuôi cấy trong MKTTn, cấy lên bề mặt các đĩa thạch

38
XLD khác nhau, lật úp đĩa thạch và ủ ở 37o
C trong 24 ± 3 giờ. Khuẩn lạc điển
hình của Salmonella trên thạch XLD sẽ có màu đen ở trung tâm, viền mỏng
xung quanh có màu đỏ nhạt do sự đổi màu của chất chỉ thị. Salmonella không
sinh H2S (ví dụ: S. Paratyphi A) có khuẩn lạc màu hồng, trung tâm hồng đậm
hơn trên thạch XLD. Với Salmonella có Lactose (+) trên thạch XLD sẽ có
khuẩn lạc màu vàng có hoặc không có màu đen ở trung tâm.
Chúng tôi lựa chọn môi trường chọn lọc thứ hai là thạch SS (Salmonella-
Shigella). Thạch SS là môi trường chọn lọc dùng để chọn lọc và phân lập các
loài Salmonella và Shigella từ các mẫu bệnh phẩm và thực phẩm. Vi khuẩn
gram dương và coliform bị ức chế bởi xanh brilliant, muối mật, thiosulphate và
citrate. Thiosulphate kết hợp với sắt là chất chỉ thị cho sự có mặt của sunfua,
sự kết hợp này tạo ra khuẩn lạc có màu đen ở trung tâm. Thực hiện thao tác cấy
lên đĩa thạch SS như với thạch XLD, ủ ở 35o
C trong 18-24 giờ. Vi khuẩn không
sử dụng đường lactose sẽ tạo khuẩn lạc không màu, các coliform nếu có thể
mọc hoặc các vi khuẩn có khả năng sử dụng lactose sẽ tạo khuẩn lạc màu hồng
hoặc đỏ.
2.2.2.3. Quy trình khẳng định
Chọn khuẩn lạc nghi ngờ, cấy chuyển sang môi trường thạch dinh dưỡng,
ủ ở 34o
C – 38o
C trong 24 ± 3 giờ. Nếu khuẩn lạc trên môi trường XLD riêng rẽ
và thuần thì không cần cấy chuyển sang môi trường dinh dưỡng.
• Khẳng định sinh hóa
Sử dụng khuẩn lạc thuần, nghi ngờ là Salmonella để thử các tính chất sinh
hóa như sau:
Cấy ria vi khuẩn lên bề mặt của ống thạch TSI (phát hiện khả năng sử
dụng lactose và/hoặc sucrose) và đâm sâu xuống đáy (phát hiện khả năng sử
dụng glucose và sinh H2S), ủ ở 37o
C trong 24 ± 3 giờ. Môi trường TSI tương
tự như môi trường thạch Kligler-Hajna. Phần lớn Salmonella có lactose (-),
glucose (+), và khoảng 90% sinh H2S.
Cấy ria khuẩn lạc lên bề mặt ống thạch ure, ủ ở 37o
C đến 24 giờ. Nếu
phản ứng (+) thì ure bị phân giải thành amoniac làm phenol đỏ chuyển thành

Đặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAY

Đặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAY

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Đặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAY

Similar to Đặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAY (20)

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864

More from Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (11)

Đặc điểm kháng kháng sinh ở các chủng salmonella đa kháng, HAY