Cá hộp Hichef Thái Lan 1 thùng 100 hộp, mỗi hộp 145gram Zalo sỉ: 0968.994.923 -0778.633.384 Hotline: 070605.95.91 Giao hàng khu vực TP.HCM và đưa hàng ra chành đi các tỉnh.

1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
THỬ NGHIỆM CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ KHẢ
NĂNG ĐỐI KHÁNG CỦA CÁC CHỦNG VI KHUẨN
BACILLUS SPP. VÀ LACTOBACILLUS SPP. ĐỐI VỚI
MỘT SỐ NẤM MỐC SINH ĐỘC TỐ AFLATOXIN
Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Giảng viên hướng dẫn : TS. NGUYỄN HOÀI HƯƠNG
Sinh viên thực hiện : LÊ NGÔ VŨ PHƯỢNG
MSSV: 1515100007 Lớp: 15HSH01
TP. Hồ Chí Minh, 2016.

2. Đồ án tốt nghiệp
i
LỜI CAM ĐOAN
Đồ án tốt nghiệp này là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dưới sự
hướng dẫn của TS. Nguyễn Hoài Hương khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm-
Môi Trường của trường Đại Học Công Nghệ Tp. Hồ Chí Minh.
Những kết quả trong đồ án này hoàn toàn không sao chép từ đồ án tốt nghiệp
của người khác với bất kì hình thức nào. Các số liệu trích dẫn trong đồ án tốt nghiệp
hoàn toàn trung thực. Tôi xin chịu toàn bộ trách nhiệm về đồ án của mình.
TP.HCM, ngày 12 tháng 8 năm 2016
Sinh viên thực hiện
Lê Ngô Vũ Phượng.

3. Đồ án tốt nghiệp
ii
LỜI CÁM ƠN
Đầu tiên, xin gửi lời cảm ơn đến cha mẹ, người đã nuôi nấng dạy dỗ khuyến
khích và tạo mọi điều kiện cho con học tập để con có được thành quả như ngày hôm
nay.
Trong suốt khoảng thời gian học tại trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM, em
đã được các thây, cô trong khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường hết
lòng hướng dẫn, giúp đỡ em trong quá trình học tập tại trường cũng như trong quá
trình thực hiện đồ án tốt nghiệp. Em xin chân thành cảm ơn đến quý Thầy, Cô nhờ
có thầy, cô đã trang bị cho chúng em kiến thức cần thiết để tự tin bước vào đời.
Đặc biệt, em xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Hoài Hương, đã tận tình
hướng dẫn, chỉ bảo em trong suốt khoảng thời gian xây dựng đề cương và thực
hiện, hoàn thành đồ án này.
Em cũng xin cám ơn các Thầy, Cô trong phòng thí nghiệm và bạn bè đã quan
tâm, giúp đỡ và tạo điều kiện cho em hoàn thành đồ án tốt nghiệp này.
Cuối cùng, em xin cảm ơn các Thầy, Cô trong Hội Đồng Phản Biện đã dành
thời gian đọc và nhận xét đồ án này. Em xin gửi đến quý Thầy, Cô lời chúc sức
khỏe.
TP. HCM, ngày 12 tháng 8 năm 2016
Sinh viên thực hiện
Lê Ngô Vũ Phượng

4. Đồ án tốt nghiệp
iii
MỤC LỤC
TRANG
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT.......................................................... vi
DANH MỤC BẢNG.................................................................................. vii
DANH MỤC HÌNH................................................................................... ix
MỞ ĐẦU .................................................................................................... 2
CHƢƠNG I: TÔNG QUAN................................................................... 4
1.1. Tổng quan về nấm:..................................................................................4
1.1.1. Giới thiệu chung....................................................................................4
1.1.2. Độc tố do nấm tiết ra.............................................................................4
1.1.3. Tác hại của nấm ....................................................................................5
1.1.3.1. Tác hại của nấm gây cho người và động vật......................................5
1.1.3.2. Tác hại của nấm gây cho thực vật......................................................6
1.1.4. Một số chủng nấm gây hại trên thực phẩm...........................................6
1.2. Tổng quan về hợp chất kháng nấm: ........................................................7
1.2.1. Hợp chất kháng nấm hóa học................................................................10
1.2.2. Tác hại của hợp chất kháng nấm hóa học .............................................10
1.2.3. Hợp chất kháng nấm trong sinh học .....................................................13
1.2.3.1. Hợp chất kháng nấm từ thực vật: ....................................................13
1.2.3.2. Hợp chất kháng nấm từ vi khuẩn: ...................................................17
a. Khả năng kháng nấm mốc của Bacillus spp. .............................17
b. Khả năng kháng nấm mốc của Lactobacillus spp......................19
1.3. Các phương pháp sàng lọc các chủngVSV kháng nấm mốc:..................21
1.3.1. Phương pháp đối kháng trực tiếp (cấy 2 đường vi khuẩn)....................21
1.3.2. Phương pháp đối kháng trực tiếp (đặt thạch khuếch tán) .....................23
1.3.3. Phương pháp đối kháng che phủ (đổ dĩa 2 lớp):...................................25

5. Đồ án tốt nghiệp
iv
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU....... 26
2.1. Địa điểm nghiên cứu:................................................................................26
2.2. Thời gian nghiên cứu:...............................................................................26
2.3. Vật liệu nghiên cứu:..................................................................................26
2.3.1. Giống vi sinh vật:..................................................................................26
2.3.1. Hóa chất và môi trường sử dụng...........................................................26
2.3.1.1. Hóa chất: .............................................................................................26
2.3.1.2. Môi trường nuôi cấy:...........................................................................26
2.4. Thiết bị và dụng cụ:...................................................................................27
2.4.1. Thiết bị: ..................................................................................................27
2.4.2. Dụng cụ:.................................................................................................28
2.5. Phương pháp luận:....................................................................................28
2.6. Phương pháp nghiên cứu:.........................................................................29
2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu....................................................................................29
2.6.2. Khảo sát sự tăng trường của nấm mốc:..................................................30
2.6.3. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2
đường vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc:
..........................................................................................................................30
2.6.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch
khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với nấm mốc:
..........................................................................................................................35
2.6.5. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ theo phương pháp đỗ dĩa 2
lớp của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm mốc: .
..........................................................................................................................39
2.6.6. Một số phương pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hóa của một số
chủng vi khuẩn .................................................................................................43
2.6.6.1. Nhuộm gram........................................................................................43
2.6.6.2. Nhuộm bào tử......................................................................................44
2.6.6.3. Một số thử nghiệm sinh hóa:...............................................................44

6. Đồ án tốt nghiệp
v
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN.......................................... 45
3.1. Định danh sơ bộ khảo sát sinh lý - sinh hóa của một số chủng vi khuẩn
..................................................................................................................... 45
3.1.1. Nhuộm Gram:.................................................................................... 45
3.1.2. Nhuộm bào tử:................................................................................... 46
3.1.3. Một số thử nghiệm sinh hóa:............................................................. 47
3.2. Khảo sát sự tăng trưởng của nấm mốc:............................................... 48
3.3. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp ria 2 đường vi khuẩn
của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với các chủng nấm mốc:
..........................................................................................................................50
3.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phương pháp đặt thạch
khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với các chủng nấm
mốc:..................................................................................................................66
3.5. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ thep phương pháp đỗ dĩa 2
lớp 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với các chủng nấm mốc
..........................................................................................................................81
3.6. So sánh khả năng đối kháng nấm mốc của 20 chủng vi khuẩn thông qua cách
chấm điểm LSD (Sai số khác biệt nhỏ nhất) ....................................................90
KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ..................................................................... 94
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................ 96
PHỤ LỤC

7. Đồ án tốt nghiệp
vi
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
LAB Lactobacillus spp
NA Nutrient Agar
NB Nutrient Broth
MT Môi trường
PDA Potato dextrose agar
VK Vi khuẩn
VSV Vi sinh vật

8. Đồ án tốt nghiệp
vii
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1.Một số hợp chất kháng nấm hóa học được sử dụng để bảo quản hạt giống
..........................................................................................................................9
Bảng 1.2.Một số hợp chất được xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm men
(Corsetti và cộng sự, 1998) ..............................................................................18
Bảng 3.1. Đặc điểm hình thái của các chủng Bacillus spp. .............................45
Bảng 3.2. Một số phản ứng sinh hóa của các chủng Bacillus spp. .................47
Bảng 3.3. Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các chủng vi khuẩn
Bacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn...........
..........................................................................................................................53
Bảng 3.4. So sánh sô liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn Bacillus
spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn....
..........................................................................................................................54
Bảng 3.5. Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn
Lactobacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn..
..........................................................................................................................62
Bảng 3.6. So sánh số liệu tỉ lệ ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn
Lactobacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp cấy 2 đường vi
khuẩn ...............................................................................................................63
Bảng 3.7. Thống kê số liệu vòng ức chế các chủng nấm mốccủa các chủng vi khuẩn
Bacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán ...........
..........................................................................................................................68
Bảng 3.8. So sánh sô liệu vòng ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn
Bacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán
..........................................................................................................................69
Bảng 3.9. Thống kê số liệu vòng ức chế của các chủng nấm mốc của các vi khuẩn
Lactobacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đặt thạch khuếch tán....
..........................................................................................................................76

9. Đồ án tốt nghiệp
viii
Bảng 3.10.So sánh số liệu vòng ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn
Lactobacillus spp. mạnh nhất trong từng nhóm theo phương pháp đặt thạch khuếch
tán.....................................................................................................................77
Bảng 3.11. Thống kê số liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các chủng vi
khuẩn Bacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đỗ dĩa 2 lớp ..............
..........................................................................................................................84
Bảng 3.12. Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn
Bacillus spp. trong các nhóm theo phương pháp đõ dĩa 2 lớp.........................85
Bảng 3.13. Sắp xếp số liệu trung bình ức chế của các chủng nấm mốc của các vi
khuẩn Lactobacillus spp. theo từng nhóm với phương pháp đỗ dĩa 2 lớp.......
..........................................................................................................................89
Bảng 3.14. Sắp xếp sô liệu trung bình ức chế các chủng nấm mốc của các vi khuẩn
Lactobacillus spp. trong các nhóm theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp ...............90
Bảng 3.15. Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Bacillus spp. theo từng phương pháp
dựa theo xếp hạng LSD....................................................................................91
Bảng 3.16.. Thống kê điểm các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. theo từng
phương pháp dựa theo xếp hạng LSD..............................................................92

10. Đồ án tốt nghiệp
ix
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc hóa học của Metalaxyl.......................................................10
Hình 1.2. Cấu trúc hóa học của Manocozeb ....................................................11
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của Hexacoconazole ............................................11
Hình 1.4. Cấu trúc hóa học của Pyrones .........................................................14
Hình 1.5. Cấu trúc hóa học của Viridines........................................................15
Hình 1.6. Phương pháp cấy ria 2 đường thể hiện sự đối kháng của vi khuẩn
LAB đối với nấm mốc (trích từ Nora Laref, 2013)..........................................20
Hình 1.7. Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương
pháp ria 2 đường vi khuẩn................................................................................21
Hình 1.8. Phương pháp đặt thạch khuếch tán thể hiện sự đối kháng giữa vi khuẩn
Bacillus spp với Calbicans (trích dẫn Mounyr Balouiri, 2015) .......................
..........................................................................................................................22
Hình 1.9. Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương
pháp đặt thạch khuếch tán................................................................................23
Hình 1.10. Phương pháp đối kháng che phủ của Bacillus spp. với các loại nấm
(trích từ Kumar và các cộng sự,2009)..............................................................24
Hình 1.11. Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của vi khuẩn có lợi theo phương
pháp đỗ dĩa .......................................................................................................25
Hình 2.1. Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khả năng dối kháng của các chủng vi khuẩn
có lợi đối với nấm mốc ....................................................................................29
Hình 2.2. Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với
nấm mốc theo phương pháp cấy ria 2 đường...................................................31

11. Đồ án tốt nghiệp
x
Hình 2.3. Mô tả cách đo đường kính vòng ức chế theo phương pháp ria 2 đường vi
khuẩn................................................................................................................35
Hình 2.4. Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với
nấm mốc theo phương pháp đặt thạch khuếch tán...........................................36
HÌnh 2.5. Cách đặt thạch vi khuẩn trong phương pháp đặt thạch khuếch tán .
..........................................................................................................................37
Hình 2.6. Mô tả cách đo vòng ức chế của vi khuẩn theo phương pháp đặt thạch
khuếch tán ........................................................................................................38
Hìn h 2.7.Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn với
nấm mốc theo phương pháp đỗ dĩa 2 lớp thạch ...............................................40
Hình 3.1. HÌnh thái khuẩn lạc của các chủng vi khuẩn Bacillus spp...............45
HÌnh 3.2. Nhuộm Gram các chủng vi khuẩn ...................................................46
Hình 3.3. Nhuộm bào tử các chủng vi khuẩn...................................................47
Hình 3.4. Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT PDA .....................48
Hình 3.5. Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày trên MT MRS Cải tiến .......49
Hình 3.8. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập tử
phụ phế phẩm ...................................................................................................55
Hình 3.9. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Bacillus spp phân lập tử
phụ đất..............................................................................................................56
Hình 3.10 Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập
tử nước thải ......................................................................................................57
Hình 3.13. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốccủa nhóm Lactobacillus sp phân
lập tử nem.........................................................................................................63

12. Đồ án tốt nghiệp
xi
Hình 3.14. Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp phân
lập tử cơm mẻ...................................................................................................64
Hình 3.18. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus spp phân lập
tử phụ phế phẩm...............................................................................................70
Hình 3.19. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Bacillus 66spp phân
lập tử đất...........................................................................................................71
Hình 3.20. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấmmốccủa nhóm Bacillus spp phân lập
tử nước thải ......................................................................................................72
Hình 3.24. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp
phân lập tử nem................................................................................................78
Hình 3.25. Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của nhóm Lactobacillus sp
phân lập tử cơm mẻ..........................................................................................79

13. 1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề:
Hiện nay, trên thế giới và nước ta đang nghiên cứu về các phương pháp đối
kháng lại các loại nấm mốc khác nhau như đối kháng giữa nấm có lợi với nấm
mốc hay đối kháng giữa các vi sinh vật có lợi với nấm mốc.
Độc tố của các loại vi nấm có nhiều loại như aflatoxin, ocharatoxin,
tricothecenes, zearalenone…. Các loại độc tố này rất nguy hiểm, thường gây
nhiễm trên nông sản, gây độc cho con người và gia súc như là gây tổn thương
gan (ung thư gan…), gây quái thai, gây đột biến và nếu bị nhiễm ở hàm lượng
cao sẽ gây chết người. Trong khi đó, thuốc trừ nấm mốc hóa học lại gây nhiều tác
dụng phụ ảnh hường đến đời sống của con người và động vật.
Vì vậy, ở nước ta đã có khá nhiều công trình nghiên cứu về khả năng đối kháng
lại nấm mốc gây hại trên nông sản và thực phẩm bằng các loại nấm có lợi khác
như Trichoderma spp…và sử dụng các thuốc bảo vệ thực vật hóa học. Nhưng
việc sử dụng vi sinh vật có lợi để đối kháng lại các loại nấm mốc gây hại vẫn còn
khá mới và chưa được áp dụng rộng rãi ở các phòng thí nghiệm.
Từ những vấn đề trên, để phân lập được các chủng vi sinh vật có khả năng kháng
nấm mốc trong in vitro đã có nhiều đề tài và các phương pháp kháng nấm mốc
khác nhau nhưng chưa có sự so sánh giữa các phương pháp đó với nhau. Từ đó,
em đã thực hiện nhiều phương pháp kháng nấm mốc khác nhau và so sánh chúng
và sau đó, tìm ra phương pháp thích hợp và hiệu quả nhất với phòng thí nghiệm
của trường .Chính vì vậy, em xin thực đề tài “Thử nghiệm các phƣơng pháp
đánh giá khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và
Lactobacillus spp. đối với một số nấm mốc Aspergillus spp. sinh aflatoxin”.

14. 2
2. Tình hình nghiên cứu:
Có rất nhiều công trình nghiên cứu ứng dụng vi sinh vật để kháng nấm mốc gây
hại trong nông sản và thực phẩm theo nhiều phương pháp khác nhau.
 Trong nước đã có nhiều công trình nghiên cứu dùng vi sinh vật để kháng lại
nấm mốc theo phương pháp đối kháng trực tiếp (Magaldi,2004) như: “ Phân
lập tuyển chọn vi khuẩn Bacillus spp. ứng dụng trong bảo quản nông sản”
(Văn Hương, 2015), đồ án tốt nghiệp “Khảo sát khả năng kháng nấm nhiễm
thực phẩm Aspergillus Niger và Mucor sp. Của vi khuẩn Lactobacillus
L5”(Phan Nguyễn Hương Thảo, 2015)….
 Ngoài nước có công trình nghiên cứu hoạt động kháng nấm của vi khuẩn
lactic được phân lập từ Kim Chi để kháng lại Aspergillus fumigatus Jeong-
75, Hàn Quốc theo phương pháp đối kháng che phủ (Magnusson và
Schnurer,2001) .
3. Mục đích nghiên cứu:
Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng kháng nấm mốc cao và hiệu quả
nhất từ bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. của
phòng thí nghiệm Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm- Môi Trường của trường.
4. Mục tiêu nghiên cứu:
Tìm ra phương pháp đánh giá khả năng đối kháng vi nấm hiệu quả nhất và dễ
thực hiện áp dụng trên bộ sưu tập các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và
Lactobacillus spp. của phòng thí nghiệm khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực
Phẩm- Môi Trường.
5. Nhiệm vụ nghiên cứu:
 Xác định tỉ lệ đối kháng của 10 chủng Bacillus spp. và 10 chủng
Lactobacillus spp. đối với 5 chủng nấm mốc Aspergillus spp. tiềm năng sinh
aflatoxin được phân lập từ hạt đậu phông, đậu nành và cà phê bằng phương
pháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line Culture Method).
 Xác định tỉ lệ đối kháng nấm theo phương pháp đặt thạch khuếch tán.(Agar
Plug Diffusion Method).

15. 3
 Đánh giá khả năng đối kháng nấm theo phương pháp đối kháng che phủ
.(Overlay Method).
 Đánh giá tương quan giữa các phương pháp, từ đó đề nghị phương pháp
thích hợp nhất cho phòng thí nghiệm.
6. Phƣơng pháp nghiên cứu:
a. Phƣơng pháp luận:
Dựa trên các chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. đã được phân
lập trong phòng thí nghiệm để thử nghiệm các phương pháp đối kháng nấm đã
được mô tả trong tài liệu.Từ đó, đưa ra phương pháp thích hợp nhất trong phòng
thí nghiệm để đối kháng lại các loại nấm mốc gây hại trên thực phẩm và hạt
giống cây trồng.
b. Phƣơng pháp xử lí số liệu:
 Sử dụng phần mềm Excel để vẽ đồ thị.
 Sử dụng phần mềm SAS 9.1 để xử lí số liệu.
7. Kết quả đạt đƣợc từ đề tài:
 Tuyển chọn được chủng vi khuẩn Bacillusspp.và vi khuẩn Lactobacillus spp.
có hoạt tính kháng nấm tốt nhất trong bộ sưu tập của phòng thí nghiệm.
 Đánh giá tỉ lệ ức chế các loại vi nấm của 2 chủng vi khuẩn thông qua phương
pháp kháng nấm trực tiếp theo phương pháp cấy 2 đường vi khuẩn. (Dual
Culture Two Line Culture Method).
 Xác định đường kính ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn qua
phương pháp đối kháng trực tiếp theo cách đặt thạch khuếch tán (Agar Plug
Diffusion Method).
 Đánh giá khả năng ức chế các loại nấm mốc của 2 chủng vi khuẩn qua
phương pháp đối kháng che phủ (Overlay Method).
 Đã chọn được phương pháp cho kết quả ổn định nhất trong phòng thí
nghiệm.

16. 4
8. Kết cấu đồ án:
 Mở đầu
 Chương 1: Tổng quan tài liệu- Nội dung chương đề cập đến các nội dung liên
quan đến tài liệu nghiên cứu.
 Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu – Nội dung chương đề cập
đến các dụng cụ, thiết bị và phương pháp nghiên cứu trong đồ án.
 Chương 3: Kết quả và thảo luận – Nội dung chương đưa ra những kết quả
mà đề tài thực hiện được và đưa ra những thảo luận, biện chứng kết quả thu
được
 Kết luận và kiến nghị- Nội dung tóm lại những kết quả mà đề tài đã đạt được
và kiến nghị cho những hướng cần cải tiến thêm trong đề tài.

17. 5
Chƣơng I: TỔNG QUAN
1.1.Tổng quan về nấm:
1.1.1. Giới thiệu chung về nấm:
 Nấm học (Mycology) được nhà khoa học người Ý là Pier Antonio
Micheli (1729) nghiên cứu ra qua tài liệu “Giống cây lạ” (Nova
Plantarum Genera) nhưng theo giáo sư Ekriksson Gunnan (1978) thì
người có công nghiên cứu sâu về nấm mốc lại là Elias Fries (1794-
1874).Những đại diện tiêu biểu của nấm là nấm mốc, nấm men và nấm
lớn (nấm quả thể). Phần lớn các loài nấm này không quan sát được bằng
mắt thường. Đa phần chúng sống trong đất, chất mùn, xác của vi sinh
vật, cộng sinh hay kí sinh trên cơ thể của động vật, thực vật hay nấm
khác. Vi nấm có vai trò quan trọng trong hệ sinh thái, chúng phân hủy
các chất hữu cơ và không thể thiếu trong quá trình chuyển hóa và trao
đổi chất
 Nấm mốc (hay còn gọi là vi nấm) là vi sinh vật chân hạch, ở thể tản, là tế
bào không có diệp lục tố, thường sinh sản thông qua bào tử hoặc sống dị
dưỡng (hoại sinh, kí sinh, cộng sinh),quá trình sinh sản có thể là vô tính
nhay hữu tính.Vách tế bào chủ yếu là chitin, có hoặc không có cenllulose
và một số thành phần khác có hàm lượng thấp. Nấm mốc thường thường
phát triển dưới dạng sợi đa bào gọi là sợi nấm (hyphae) tạo hệ sợi
(mycelium). Có 2 loại sợi:
 Sợi nấm dinh dưỡng: nằm trong lớp môi trường, làm nhiệm vụ hấp
thu chất dinh dưỡng cho toàn bộ hệ nấm.
 Sợi nấm khí sinh: thường nhô ra môi trường, giữ vai trò sinh sản (tạo
bào tử).
1.1.2. Độc tố do nấm tiết ra:
 Theo Nguyễn Duy Tường (2009), độc tố của nấm mốc (mycotoxin) là
nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo

18. 6
ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có
vú, gia cầm và con người.
 Hiện nay, có khoảng 300 loài độc tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy
nhiên, chỉ có khoảng 20 loài độc tố gây hại lên thực phẩm ở mức độ
nghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm. Được tạo ra từ 5 chi
nấm: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria, Clavicep, chúng
bao gồm:
 Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin (B1, B2, M1, M2 và G1, G2),
Ochratoxin A, Stermatocystin, Axit Cyclopianxoic.
 Các độc tố của Penicillium: Pautulin, Ochratoxin A, Citrinin,
Penitrem A, Fumonisin, Moniliformin….
 Các độc tố của Fusarium: Deoxynivalenon, Nivalenon, Zearalenon,
T-2 toxin.
 Các độc tố của Alternaria: Axit Tenuazoic, Alternarion, Methyl
Ether Alternarion.
 Các độc tố của Clavicep: các alkaloid của nấm cựa gà.
 Trong đó, nấm gây độc chủ yếu và nguy hại nhất là Aflatoxin. Chúng là
độc tố vi nấm do nấm mốc Aspergillus flavus, A.parasiticus sản sinh ra,
thường gây độc tố ô nhiễm lên các loại đậu (như đậu phộng). Phản ứng
gây độc chủ yếu của chúng là trong gan. Nếu mức độ gây nhiễm thấp sẽ
tích lũy dần trong gan và làm giảm khả năng sinh sản của động vật về lâu
dài sẽ gây ra bệnh ung thư.
 Ngoài ra, còn có 1 số độc tố của các vi nấm thường gặp như Ochratoxin
Penicillium và Aspergillus tiết ra. Độc tố Zearalenon và Tricothecenes
chủ yếu do nấm Fusarium tiết ra, độc tố Patulin lại do nấm Penicillium
và Fumonisin tiết ra.

19. 7
1.1.3. Tác hại của nấm mốc:
1.1.3.1. Tác hại của nấm gây ra cho con người và động vật:
 Dị ứng hoặc ngộ độc do ăn hay tiếp xúc với nấm: Có khoảng 70 loài nấm
sinh bào tử là những tác nhân gây dị ứng. Chúng có thể là nấm mốc trong
nhà hay ngoài trời, đa phần là nấm sợi thuộc các chi Alternaria,
Aspergillus, Cladosporium, Helminthosporium, Epicoccum, Penicillium,
Fusarium..., chỉ có vài loài nấm đơn bào như Candida, Rhodotorula, có
một số loài là nấm lớn như Agaricus, Coprinus, Fomer, Ganoderma...
Bào tử nấm có thể gây ra những chứng như hen suyễn, viêm mũi dị ứng,
các bệnh nấm dị ứng phế quản phổi và viêm phổi quá mẫn. Ngộ độc do
ăn phải nấm độc, có thể làm rối loạn tiêu hóa, ảo giác, bào mòn ống tiêu
hóa, làm giảm khả năng đề kháng tiêu hóa các chât dinh dưỡng trong
thức ăn, nghiêm trọng hơn có thể dẫn tử vong.
 Nấm kí sinh trên cơ thể người gây bệnh trực tiếp: Những loài có thể gây
bệnh cho người thuộc các chi như: Aspergillus, Candida, Cryptococcus,
Histoplasma và Pneumocystic. Chúng có thể gây ra các bệnh ngoài da ở
người như nấm chân, nấm móng, nấm tóc, hắc lào, lang ben,... cho đến
những bệnh nguy hiểm có thể gây chết người như viêm màng não (nấm
Cryptococcus), hay Viêm phổi do nấm Pneumocystic carinii.
1.1.3.2. Tác hại của nấm gây ra cho thực vật:
 Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng có thể gây thiệt hại lớn cho
ngành nông nghiệp và lâm nghiệp. Ví dụ như nấm đạo ôn (Magnaporthe
oryzae) gây bệnh cho lúa. Những loài gây bệnh cho cây thuộc các chi
Fusarium, Ustilago, Alternaría và Cochliobolus. Chúng làm thối rễ, tổn
thương các bộ phận của cây trồng, hoa, quả, làm giảm năng suất hoặc chất
lượng sản phẩm nông nghiệp do bị ẩm mốc,...
1.1.4. Một số chủng nấm gây hại trên thực phẩm:
 Trong hệ vi khuẩn, nấm mốc thiên nhiên (Fungal flora) có 3 chủng giống
nấm mốc chiếm ưu thế đã và đang gây độc cho thực phẩm là Aspergillus,

20. 8
Fusarium và Penicillium thường tiết độc tố vi nấm vào thực phẩm vào
thời gian trước, trong và sau khi thu hoạch ngũ cốc, hạt có dầu, đậu
đỗ,…
 Có 4 tác động gây độc của độc tố vi nấm là: độc cấp tính, mãn tính, gây
đột biến và quái thai. Phổ biến nhất là độc cấp tính, làm hư gan và rối
loạn chức năng hoạt động của thận, có thể gây chết đối với trường hợp
nặng. Các độc tố vi nấm tác động lên hệ thần kinh, ở nồng độ thấp gây tê
liệt động vật và ở nồng độ cao có thể gây tổn thương não và chết. Nhiều
công trình thử nghiệm đã xác định độc tố vi nấm có thể gây ung thư, đặc
biệt là ở gan. Qua thử nghiệm trên động vật nuôi trong nhà đã xác định
có một số độc tố vi nấm gây rối loạn tới sự sao chép ADN và gây hậu
quả là đột biến hoặc quái thai.
1.2. Tổng quan về các hợp chất kháng nấm:
Hợp chất kháng nấm là các chất ức chế sự tăng trưởng của nấm có tầm
quan trọng trong việc kiểm soát các tác nhân gây bệnh của nấm đối với
con người và động vật và trong việc phòng chống nấm mốc trong thực
phẩm và các vật liệu khác.
1.2.1. Hợp chất kháng nấm hóa học:
 Các hợp chất kháng nấm hóa học đa số đều có mặt trong các loại thuốc
trừ nấm mốc gây hại cho nông sản như Carbendazim, Metalaxyl, Anvil,
….

21. 9
Bảng 1.1: Một số hợp chất kháng nấm hóa học thƣờng gặp trong
thuốc bảo quản hạt giống. (Mathre và các cộng sự,2011).
 Các hoạt chất kháng nấm hóa học phổ biến như metalaxyl, mancozeb và
hexaconazole… chúng đều thông qua tế bào mô thực vật tiêu diệt các
nấm gây bệnh phát triển trong đó.
 Metalaxyl có tên hóa học là methyl N-(methoxyacetyl)-N-(2,6-xylyl)-DL-
alaninate là hoạt chất trừ nấm thuộc nhóm Alanine, đặc biệt hiêu quả với
nhóm nấm Oomycetes mà hai đại diện điển hình là Phytophthora và
Pythium gây nên các bệnh nghiêm trọng cho cây trồng. Hoạt chất
Metalaxyl có tác dụng nội hấp và lưu dẫn mạnh, thuốc được hấp thụ qua
lá, thân, rễ của cây trồng sau đó vẫn chuyển, lưu dẫn trong cây, ức chế sự
tổng hợp protein, can thiệp vào quá trình tổng hợp ARN ribosome của tế
bào nấm. Phòng trừ hiệu quả các loại nấm phát sinh từ đất và các loại nấm
phát tán bào tử trong không khí. (trích Chi cục trồng trọt và bảo vệ thực
vật tỉnh Lâm Đồng,2015).

22. 10
Hình 1.1: Cấu trúc hóa học của Metalaxyl
 Manocozeb có tên hóa học là Manganese Ethylene bisdithiocarbamate
phức hợp với kẽm, là hoạt chất thuộc nhóm thuốc diệt nấm
Dithiocarbamate. Manocozeb là phức hợp của kẽm và muối mangan, dạng
bột màu vàng hung, không tan trong nước và các dung môi hữu cơ khác,
bền trong môi trường khô nhưng thủy phân trong môi trường nóng, ẩm và
acid. Hoạt chất này không diệt nấm trực tiếp chỉ khi tiếp xúc với nước,
manocozeb mới bị hoạt hóa, giải phóng ethylene bisthiocyanate sunfua
(EBIS). Dưới tác động của tia cực tím, EBIS chuyển hóa thành ethylene
bisthiocyanate (EBI). EBIS và EBI tác động tới các enzyme có chứa nhóm
sulphydryl gây ức chế hoạt động của sáu quá trình sinh hóa khác nhau
trong tế bào chất và ty thể, phá vỡ sự nảy nầm của bào tử nấm mốc.( trích
dẫn từ Chi cục trồng trọt và bảo vệ thực vật tỉnh Lâm Đồng, 2014).
Hình 1.2: Cấu trúc hóa học của Manocozeb

23. 11
 Hexaconazole có công thức hóa học là C19H17Cl2N3O3 là hoạt chất có chứa
trong thuốc kháng nấm hóa học Anvil 5SC. Là hoạt chất trừ nấm phổ
rộng, tiêu diệt nấm mốc thông qua cơ chế ngăn cản sinh tổng hợp
Ergosterol (chất cấu tạo nên màng nấm mốc), nấm sẽ bị cô lập và ngừng
phát triển do chúng không hình thành được tế bào mới. Chất này được mô
cây hấp thu rất nhanh, chuyển vị và lưu dẫn mạnh nên kiểm soát nấm mốc
nhanh chóng và hiệu quả và kéo dài cơ chế vừa phòng vừa trị bệnh.
Hình 1.3: Cấu trúc hóa học của Hexaconazole.
1.2.2. Tác hại của hợp chất kháng nấm hóa học:
 Bên cạnh các lợi ích trong việc kháng nấm thì các hợp chất hóa học gây
ảnh hưởng mạnh đến môi trường và sức khỏe của con người và động vật.
Theo điều tra của cục Y tế dự phòng và môi trường Việt Nam, hằng năm
có trên 5000 trường hợp nhiễm độc hợp chất hóa học phải cấp cứu tại
bệnh viện và có trên 300 trường hợp tử vong (do ngộ độc cấp tính) vì
lượng chất hóa học còn tồn đọng quá cao trong thực phẩm. Nếu liều
lượng ít, được đưa gián tiếp vào cơ thể thông qua thực phẩm, về lâu dài
từ 3-5 năm sẽ phát bệnh (tim mạch, ung thư…)
 Đối với con người: cơ thể con người nhiễm độc các hợp chất hóa học
biểu hiện ở nhiều mức độ như là giảm sức khỏe, gây rối loạn hoạt động ở
hệ thần kinh, tim mạch, tiêu hóa hô hấp, bài tiết, gây các tổn thương bệnh
lý ở các cơ quan từ mức độ nhẹ đến nặng thậm chí tàn phế và tử vong. Ví

24. 12
dụ: hoạt chất Mancozeb gây bệnh da đối với người tiếp xúc, hoạt chất
Metalaxyl gây độc cấp tính thấp nhưng gây kích ứng ở mắt ở mức trung
bình và nhóm độc II về tác động kích thích mắt.
 Đối với môi trường xung quanh: các hợp chất hóa học sẽ diệt hết tất cả
các loài côn trùng, sâu bệnh và nấm gây bệnh có thể làm mất đi sự cân
bằng tự nhiên trong của hệ sinh thái gây ô nhiễm môi trường, đất, nước
và không khí. Các chất tồn dư, không phân hủy ở trong đất và nước có
thể làm cho động vật, cây trồng sống ở đó bị nhiễm các chất đó lâu dài,
con người khi ăn các sản phẩm trồng trọt và chăn nuôi bị nhiễm chất hóa
học hằng ngày một cách gián tiếp, lâu ngày sẽ rất có hại đến sức khỏe.
 Đối với các loại thực vật, chúng sẽ hình thành sự kháng thuốc và có khả
năng sẽ tạo ra các loại vi sinh vật hay nấm gây bệnh mới, mạnh hơn các
loài vi sinh vật và nấm gây bệnh cũ. Chẳng hạn như: hoạt chất Metalaxyl
khi sử dụng liên tục dễ hình thành tính kháng thuốc của vi sinh vật gây
hại; còn hoạt chất Manocozeb chỉ có tác dụng phong bệnh tiếp xúc, sau
khi phun thuốc lên thực vật thi chỉ ngăn ngừa sự hình thành mầm bệnh,
không xâm nhập được vào bên trong mô thực vật, do đó chúng không có
tác dụng khi nấm mốc hình thành và xâm nhiễm bên trong cây trồng.
1.2.3. Hợp chất kháng nấm sinh học:
1.2.3.1. Hợp chất kháng nấm từ thực vật:
 Các vi khuẩn có lợi thường tạo ra các chất có hoạt tính sinh học nhằmức
chế được các tác nhân gây bệnh, trong đó có 1 số chất như là chất có thể
chuyển hóa thành hợp chất thứ cấp hoặc chất có tính kháng sinh. Các
chất đó giúp cho vi khuẩn có thể ức chế hay tiêu diệt các loại vi sinh vật
cạnh tranh với chúng trong cùng điều kiện sống thích hợp. Thật vậy, ta
có thể tìm thấy một số hợp chất thứ cấp từ các vi khuẩn có lợi khác nhau
đóng vai trò quan trọng trong việc kiểm soát sinh học trong quá trình
phát hiện bệnh trong cây trồng, chúng đã và đang được mọi người trên
toàn thế giới sử dụng để làm thuốc bảo vệ cây trồng hay phân bón sinh

25. 13
học. Ngoài ra, các hợp chất thứ cấp khôn những giúp cho thực vật chống
lại các tác nhân gây bệnh từ nấm mốc mà còn giúp chúng tăng trưởng và
phát triển tốt hơn. Điển hình là hợp chất thứ cấp được tiết ra từ nấm
Trichoderma, chúng chống lại được phytopathogens và một số chất khác
ảnh hương đến sự trao đổi chất của thực vật.
 Chất gây hại chủ yếu trong các bệnh của cây trồng chủ yếu là
phytopathogenic, các hợp chất thứ cấp trong sinh học có thể kháng lại
chúng mà không gây ô nhiễm môi trường, không gây hại đến con người
và động vật, ít tốn kém, quan trọng hơn hết là không làm cho các chất
hây hại có khả năng kháng thuốc nhanh như các chất hóa học.
 Các hợp chất thứ cấp (SM) là sự chuyển hóa hóa học các hợp chất khác
nhau có trọng lượng phân tử tương đối thấp (<3kDa) và được sản xuất
dựa bởi các vi sinh vật và thực vật có liên quan đến các chi, loài hay
chủng. Các hợp chất thứ cấp này được chuyển hóa bằng con đường sinh
tổng hợp từ các chất chuyên biệt (như polypeptide hhay con đường bắt
nguồn từ Acetyl Co-enzyme A hoặc các amino aicd). Các hợp chất này
còn có một số tác nhân sinh học ảnh hưởng đến sự sống, các chức năng
của cơ thể hay cạnh tranh với các vi sinh vật khác.
 Đối với nấm, việc sản xuất các hợp chất thứ cấp thường tương quan đến
các giai đoạn như sự khác biệt về cấu trúc, hình thái và giai đoạn tăng
trường.
 SM còn biểu hiện một số chức năng sinh học và đóng vai trò quan trọng
trong việc điều chỉnh sự tương tác giữa các vi sinh vật. Ví dụ:
phytotoxins là hợp chất thứ cấp của nấm mốc tiết ra để gây hại cho cây
trồng, độc tố nấm là hợp chât thứ cấp được sản xuất ra để gây hại cho
cây trồng và có khả năng gây hại cho con người và động vật, kháng sinh
là các chất trong tự nhiên có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt đối thủ cạnh
tranh của vi sinh vật. Ngoài ra, các hợp chất thứ cấp từ nấm có thể thay
đổi sự tăng trưởng và trao đổi chất cho cây nhằm mục đích kéo dài sự

26. 14
hình thành bào tử và sơi nấm. Chính vì vậy, người ta tập trung nghiên
cứu các hợp chất thứ cấp từ nấm có lợi và vai trò của nó để chống lại các
vi sinh vật và nấm gây bệnh khác.
 Trong các nghiên cứu cho thấy,sự phân lập nấm Trichoderma tiết ra hợp
chất thứ cấp quan trọng có hoạt tính kháng nấm và gây độc chống lại
phytopathogenic. Trong nấm Trichoderma có chứa các chất kháng nấm
như là pyrones, viridins, butenolides và Hydroxy-lacton….
 Pyrones hay còn có tên gọi là 6-pentyl-2H-pyran-2-one (6PP): là
chất được chuyển hóa từ các loại nấm Trichoderma spp khác nhau(
T.viride, T.atroviride, T.harzianum, T.koningii). Hợp chất này đã thể
hiện được khả năng kháng lại một số nấm gây bệnh trong cả in vitro
và in vivo. Ngoài ra, còn có cytosporone S thuộc nhóm hợp chất
pyrones được phân lập từ Trichoderma có hoạt tính kháng sinh đối
với 1 số loài vi sinh vật và nấm gây bệnh.
Hình 1.4: Cấu trúc hóa học của Pyrones.

27. 15
 Viridins là hợp chất steroid được chuyển hóa từ sự phân lập các loài
nấm Trichoderma spp, hợp chất này ngăn chặn sự tăng trưởng từ các
loài nấm gây bệnh như: Aspergillus Niger, Fusarium caeruleum,
Penicillium expansum….
Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của Viridins.
 Butenolides và Hydroxy-Lactones cũng là các hợp chât thứ cấp được
phân lập từ các chủng Trichoderma spp khác nhau và thông qua các
nghiên cứu trong in vitro thấy được khả năng kháng nấm gây bệnh
của chúng, đặc biệt là chống lại được phytopathogenic.
1.2.3.2. Hợp chất kháng nấm từ vi khuẩn:
Một số loài vi sinh vật khác nhau sẽ thích hợp ở điều kiện và môi trường
khác nhau, sinh ra các khuẩn lạc khác nhau. Thay đổi môi trường hoặc các
yếu tố môi trường bất lợi là thay đổi điều kiện sống sẽ hạn chế hoặc ức
chế sự phát triển của vi sinh vật. Trong thực tế, trong môi trường nuôi cấy
nấm gây bệnh sẽ có sự hiện diện của rất nhiều loài vi sinh vật khác tranh
dành chất dinh dưỡng, không gian sống giữa vi khuẩn và nấm. Do vi
khuẩn phát triển nhanh hơn (trong 24 giờ) sẽ sử dụng phần lớn các chất
dinh dưỡng trong môi trường, đồng thời tạo ra một số loại kháng sinh nên
sự sinh trưởng của nấm bị ức chế (Theo Nguyễn Lân Dũng và Hoàng Đức
Nhuận,1976, trích dẫn Lý Kim Hữu, 2005).

28. 16
a. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn Bacillus spp.:
 Trước tiên, vi khuẩn Bacillus spp. tạo thành khối xung quanh các nấm gây
bệnh ngăn chặn và không cho chúng bám lên vật chủ để gây bệnh.
 Sau đó, Bacillus spp. sẽ tiết ra hỗn hợp gồm nhiều chất lipopeptid (hay
còn gọi là serenade) làm thủng vách tế bào và màng tế bào của các loại
nấm gây bệnh đó, vì vậy ngăn chặn sự phát triển của chúng. Serenda có
thể được bảo quản và được sử dụng như một loại thuốc trừ sâu hóa học
tổng hợp, đã được kiểm tra và chứng minh trong phòng thí nghiệm không
gây ngộ độc tới các loài động vật như cá hồi, ong mật, chim cút sâu đất….
 Serenda gồm có 3 nhóm lipopetid có tên là surfactin, agrastatin và iturin.
Ba nhóm chất này kết hợp lại với nhau sẽ làm tăng hoạt tính diệt các mầm
bệnh gây hại như nấm mốc và các bào tử gây bệnh của chúng.
 Surfactin là nhóm chất có hoạt tính sinh học, bản chất là lipopeptid.
Bản thân của chất này không gây độc cho nấm nhưng khi kết hợp với
inturin thì sẽ trở thành hợp chất diệt nấm. Sufactin có khả năng làm
thủng vách tế bào của nấm gây bệnh và bảo tử của chúng hỗ trợ cho
agrastatin và iturin phát huy tác dụng.
 Agrastatin vừa mới được phát hiện, cũng có khả năng diệt nấm giống
như sufactin và iturin.
 Iturin là nhóm chất chiếm vai trò quan trọng nhất trong quá trình diệt
nấm mốc, bản chất của chúng là lipopeptide được chiết từ môi
trường nuôi cấy Bacillus spp. Iturin diệt nấm bằng cách tác dụng lên
màng tế bào chất, làm tan màng, tạo thành nhiều lỗ thủng làm mất đi
tính thẩm thấu và chọn lọc của màng
 Các nghiên cứu trong và ngoài nước về tác dụng đối kháng của
Aspergillus spp. và Bacillus spp.:
 Trong nước:
Nguyễn Đình Đào (1993) đã kiểm tra đối kháng của Bacillus subtilis
AO1 với Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus và kết quả là

29. 17
ức chế nấm mốc Aspergillus (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Trân,
1995).
Nguyễn Hữu Phúc và cộng sự năm 1993 đã tiến hành sử dụng
Bacillus subtilis để ức chế sự sinh trưởng và sản xuất aflatoxin của
Aspergillus flavusvà Aspergillus parasiticus trên đậu phộng (trích
Lâm Thanh Thúy, 1995).
 Ngoài nước:
Một số thí nghiệm về khả năng ức chế sinh tổng hợp aflatoxin của
một số chủng Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus.
Norio Kimura (1990) đã sử dụng Bacillus subtilis để ngăn chặn sự
phát triển và sinh độc tố của chủng Aspergillus flavus và Aspergillus
parasiticus trên đậu phộng và bắp. Các chủng Bacillus subtilis
NK330 và NK-C-3 ức chế mạnh mẽ sự phát triển của nấm mốc và
tổng hợp aflatoxin. (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Ngọc Trân, 1995).
b. Khả năng kháng nấm của vi khuẩn Lactic:
 Khả năng ức chế của các vi khuẩn Lactic liên quan đến sự ức chế các vi
sinh vật khác, được gây ra bởi sự cạnh tranh các chất dinh dưỡng và sự
sản xuất ra các chất kháng sinh (Holzapfel, 1995). Khả năng kháng nấm
và các thành phần ức chế đã tìm thấy và được công nhận qua các nghiên
cứu.
 Các vi khuẩn Lactic có thể sản xuất ra các chất kháng sinh như acid lactic
và reuterin, ngoài ra còn có các acid hữu cơ, peroxit hydro, bacteriocin
kháng khuẩn và các loại peptide kháng nấm. Các vi khuẩn Lactic đã được
biết đến trong nhiều năm và có vai trò quan trọng trong việc sản xuất các
sản phẩm lên men phục vụ vho đời sống con người. Lợi ích của chúng
mang lại là ảnh hưởng quan trọng đến đường tiêu hóa của con người
(Cogan và cộng sự,1995; Hafidh và cộng sự, 2010). Giống Lactobacillus
đã được báo cáo có hoạt tính kháng nấm đánh giá bằng thử nghiệm thạch
lớp phủ chống lại loạt các nấm hư hỏng. Hoạt chất kháng nấm của

30. 18
L.coryniformis subsp ổn định khi bị nung nóng ở nhiệt độ cao và độ pH 3-
4.5 (Magnusson và Schnurer, 2001).
 Hầu hết các nghiên cứu kháng nấm của vi khuẩn Lactic là do việc sản xuất
một loại protein kháng nấm hoặc hoạt chất proteinaceous và một số các vi
khuẩn Lactic L.Plantarum và L.Sanfrancisco đặc biệt sản xuất acid hữu cơ
và đặc tính kháng nấm (Corsetti và cộng sự năm 1998; Lavermicocca và
cộng sự, 2003). Hiện nay, hợp chất bảo quản sinh học duy nhất là Nisin có
thể thêm được vào thực phẩm sản phẩm của vi khuẩn Lactic (Gardiner và
cộng sự,2003; Corcoran và cộng sự,2004).
 Nghiên cứu về tiềm năng kháng nấm của vi khuẩn Lactic đã xác định
được một số hợp chất có tác dụng ức chế lại nấm mốc và các loại nấm
men khác nhau (Corsetti và cộng sự, 1998, (Bảng 1.1).; Lavermicocca và
cộng sự, 2000;.Niku-Paavola và cộng sự, 1999; Magnusson, 2003;
Sjogren và cộng sự, 2003.Sjogren, 2005).
Bảng 1.2:Một số hợp chất đƣợc xác định có tiềm năng kháng nấm mốc và nấm
men (Corsetti và cộng sự, 1998)
Hợp chất đƣợc xác định Nguồn sản xuất giống
4-hydroxy-phenyllacticacid 3-
phenyllacticacid
Lactobacillusplantar 21B
3 -hydroxydecanoicacid 3 -
hydroxydodecanoicacid 3 -
hydroxytetradecanoicacid 3-
hydroxy-5-cis –dodecenoicacid
Lactobacillusplantarum MILAB14
cyclo(Gly-Leu) methylhydantoin
mevalonolactone
Lactobacillusplantarum VTTE-
78076
Caproic-, propionic-, buturic-,
acetic-, formic- and n-valeric acid.
Lactibacillus sanfranciscensis CB1

31. 19
 Roy và cộng sự báo cáo đã phân lập được 2100 khuẩn lạc lactic từ phô
mai cũ và sữa trâu sống, đã cho thấy hoạt tính kháng nấm chống lại
Aspergillus flavus IARI và phân lập nhiều nhất vi khuẩn Lactococcus
subsp CHD-28.3 có hoạt tính kháng nấm chống lại Aspergillus flavus
IARI, A.flavus NCIM 555, A.parasiticus NCIM 898 và Fusarium sp..
Nấm Aspergillus IARI được xem là chất cảm ứng cho chủng lactic này
(Roy và cộng sự, 1996).
 Vi khuẩn Lactic có khả năng sản xuất một lượng lớn các sản phẩm có tính
acid và các tổ hợp khác với hoạt tính kháng nấm mạnh. Đa số các chất
kháng nấm được xác định đều có trọng lượng phân tử thấp bao gồm acid
hữu cơ, H2O2, hợp chất proteinaceous, acid béo hydroxyl…..Ngoài sự ức
chế tăng trưởng thực tế của nấm, các vi khuẩn Lactic cũng có thể ức chế
sản phẩm đặc biệt của độc tố nấm mốc (Gourama và Bullerman, 1997)
hoặc làm bất động độc tố thông qua liên kết với bề mặt của chúng (El-
Nezami và cộng sự, 2004).
1.3. Các phƣơng pháp sàng lọc các chủng VSV kháng nấm mốc:
 Từ cuối những năm 50 và đầu các thập niên 60, các nhà khoa học đã
nghiên cứu hoạt tính kháng nấm mốc của các vi khuẩn có lợi thông qua
nhiều phương pháp khác nhau để từ đó, các nhà khoa học có thể khẳng
định được sự kháng nấm của các vi khuẩn có lợi sẽ ức chế được sự tăng
trưởng và phát triển của các bào tử và sợi nấm của các chủng nấm gây hại,
đặc biệt là chủng nấm Aspergillus spp.
 Dựa trên tiêu chí đó, để lựa chọn ra được chủng vi khuẩn có lợi từ bộ sưu
tập của phòng thí nghiệm có khả năng kháng nấm mốc hiệu quả thích hợp
nhất, em đã thực hiện theo 3 phương pháp khác nhau: phương pháp đối
kháng trực tiếp, phương pháp đặt thạch khuếch tán và phương pháp đối
kháng che phủ. Từ đó, dựa trên sự đường kính của sợi nấm đánh giá được
mức độ đối kháng của vi khuẩn có lợi nào mạnh nhất và cũng như phương
pháp nào tối ưu nhất.

32. 20
1.3.1. Phƣơng pháp đối kháng trực tiếp (phƣơng pháp ria 2 đƣờng vi khuẩn):
Để xác định khả năng đối kháng nấm của các vi khuẩn có lợi thì ta sẽ sử
dụng phương pháp đối kháng trực tiếp (Dual Culture Two Line Culture
Method) trên môi trường rắn theo mô tả của Brunner và cộng sự (2005):
Đầu tiên, ta cấy khoanh thạch của nấm chỉ thị (đường kính 7mm) và đặt
vào tâm dĩa petri có môi trường thạch đã chuẩn bị, sau đó ủ 24h cho nấm
phát triển. Tiếp theo, ta tiến hành cấy 2 vạch vi khuẩn chỉ thị vào dĩa và
đặt cách ngoài mép dĩa 1,5cm (2 vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện
nhau qua tâm dĩa trên cùng một đường kính). Cuối cùng, ủ các dĩa thạch
trong 72h, nhiệt độ phòng. Hoạt động ức chế sẽ dựa trên đường kính của
sợi nấm.
Hình 1.6: Phƣơng pháp cấy ria 2 đƣờng vi khuẩn thể hiện sự đối kháng của vi
khuẩn LAB với nấm mốc (trích từ Brunner và cộng sự (2005).

33. 21
Hình 1.7: Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng của các vi khuẩn có
lợi theo phƣơng pháp ria 2 đƣờng vi khuân.

34. 22
1.3.2. Phƣơng pháp đối kháng trực tiếp (đảt thạch khuếch tán):
 Phương pháp khuếch tán(Agar Plug Diffusion Method) này được phát triển
vào năm 1940, là phương pháp thông dụng được sử dụng nhiều trong các
phòng thí nghiệm vi sinh lâm sàng để thử nghiệm nhạy cảm kháng sinh
thông thường. Hiện nay, nhiều tiêu chuẩn đã chấp nhận và phê duyệt được
công bố bởi CLSI cho vi khuẩn và nấm mốc thử nghiệm, mặc dù không phải
hầu hết các vi khuẩn đều thể hiện khả năng đối kháng trên phương pháp này
nhưng cũng đã thành công trên một số vi khuẩn và thể hiện rõ sự ức chế của
chống đối với nấm mốc.
 Phương pháp này được mô tả như sau: Đầu tiên, ta trang huyền phù của nấm
với mật độ 105
/ml nấm trên dĩa thạch PDA cho khô. Tiếp theo, sử dụng cây
khoanh thạch đục lỗ vi khuẩn chỉ thị đặt vào 3 điểm đã xác định trên dĩa petri
có chứa nấm. Cuối cùng, ủ trong 72h ở nhiệt độ phòng.Hoạt động ức chế sẽ
dựa trên sụ phát triển của đường kính nấm.
Hình 1.8: Phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán thể hiện sự đối kháng
giữa vi khuẩn Bacillus spp với C.albicans (trích dẫn Mounyr Balouiri,
2011).

35. 23
Hình 1.9: Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng nấm của các vi khuẩn
có lợi theo phƣơng pháp khuếch tán.

36. 24
1.3.3. Phƣơng pháp đối kháng che phủ: (phƣơng pháp đỗ dĩa)
Phương pháp che phủ (Overlay Method) này như mô tả của Kumar và các
cộng sự, 2009 .Sử dụng dịch tăng sinh của vi khuẩn chỉ thị được cấy trang
lên môi trường đặc thù của chúng, sau đó ủ 24h trong nhiệt độ phòng.
Tiếp theo, chúng được phủ lên bằng 10ml chiết xuất malt thạch mềm có
chứa 105
/ml nấm ủ hiếu khí trong vòng 72h. Sau 72h nuôi cấy, vùng ức
chế sẽ hiện ra.Hoạt động ức chế dựa trên độ bao phủ của nấm thể hiện trên
dĩa.
Hình 1.10: Phƣơng pháp đối kháng che phủ của vi khuẩn Bacillus
spp. với nấm mốc - Nấm Trichorphyton sp. (a) - Nấm Microsporum
fulvum (b). (trích dẫn Kumar và các cộng sự, 2009).

37. 25
Hình 1.11: Sơ đồ nghiên cứu khả năng đối kháng nấm với các vi khuẩn có lợi
theo phƣơng pháp đõ dĩa.

38. 26
Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Địa điểm nghiên cứu:
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh khoa Công Nghệ Sinh
Học- Thực Phẩm- Môi Trường của Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM.
2.2. Thời gian thực hiện:
Đề tài được thực hiện từ 20/3/2016 đến 30/7/2016
2.3. Vật liệu nghiên cứu:
2.3.1. Giống vi sinh vật:
 Các giống vi khuẩn Bacillus spp.:
 Nhóm phân lập từ phụ phế phẩm: CS1a, CS1+, CS1b,VK4.
 Nhóm phân lập từ đất: D9, Paenibacillus
 Nhóm phân lập từ nước thải: Sb NT 1.4, Sb NT 1.3, Sb NT 2.3, Sb NT 3.3.
 Các giống vi khuẩn lên men lactic Lactobacillus spp.:
 Nhóm phân lập từ nem: L5, L6, LN2-5(L3), LN2-7 (L4), LN3-5, LN3-7.
 Nhóm phân lập từ cơm mẻ: LC6-5, LC7-7, LC1-1(C1), LC3(LC3-3).
 Các loại nấm thuộc nhóm Aspergillus spp.:
 Nhóm nấm phân lập từ đậu nành: ĐN3, ĐN2.
 Nhóm phân lập từ đậu phộng: CĐP1, CĐP2.
 Nhóm phân lập từ hạt cà phê: HCP2.
 Do phòng thí nghiệm vi sinh thuộc khoa Công Nghệ Sinh Học- Thực Phẩm-
Môi Trường của Trường Đại Học Công Nghệ TP.HCM cung cấp.
 Nystatin từ nhà sản xuất F.T.Pharma 500000IU/viên, 1mg chứa 4855IU và 1IU
tương đương 0,0002059 mg chế phẩm tương đương chứa 0,9996445mg
Nystatin.

39. 27
2.3.2. Hóa chất và môi trƣờng sử dụng:
2.3.2.1. Hóa chất:
 Các hóa chất dùng để pha môi trường NA, NB, PDA, MRS cải tiến và MRS-
broth.
 Các hóa chất dùng để làm huyền phù nấm.
 Các hóa chất để pha các loại thuốc nhuộm: Tím kết tinh (Crystal Violet), Iod
ethanol 95%, Aceton, thuốc nhuộm Fushin, xanh methylen.
2.3.2.2. Môi trường nuôi cấy:
 Môi trường NA- NB
 Môi trường PDA
 Môi trường MRS-broth và MRS agar
2.4. Thiết bị và dụng cụ:
2.4.1. Thiết bị:
 Tủ cấy vi sinh (Brlad France)
 Tủ ủ (Memmert Germany)
 Tủ lạnh Toshiba
 Autoclave (Memmert- Đức)
 Cân phân tích (Orbital Germany)
 Bếp từ (Billy- England)
 Máy nước cất (Branstead USA)
 Máy lắc
 Kính hiển vi quang học
 Bể điều nhiệt

40. 28
2.4.2. Dụng cụ:
 Ống nghiệm, đĩa petri, erlen, cốc thủy tinh, bình định mức, đũa thủy tinh, ống
đong.
 Pipet thủy tinh 10ml, 20ml, pipetman 100-1000µl
 Que cấy, que trang, kẹp gấp thạch,que đục lỗ thạch, dao phẫu thuật, đèn cồn.
 Bông thấm nước, bông không thấm nước, lame, lamell, giá đỡ ống nghiệm, rổ
nhựa.
2.5. Phƣơng pháp luận:
 Mục tiêu: Khảo sát các phương pháp đối kháng của 2 chủng vi khuẩn Bacillus
spp.và Lactobacillus spp.đối kháng lại 1 số loại nấm mốc gây hại trên các loại
hạt nông sản.
 Nội dung:
 Khảo sát sự tăng trưởng của nấm mốc Aspergillus spp.
 Khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa của 1 số chủng vi khuẩn.
 Đánh giá khả năng đối kháng trực tiếp thông qua phương pháp cấy 2 đường
vi khuẩn của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp. với nấm
mốc Aspergillus spp.
 Xác định khả năng đối kháng trực tiếp thông qua phương pháp khuếch tán
của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp. với nấm mốc
Aspergillus spp.
 Khảo sát khả năng đối kháng thông qua phương pháp che phủ của 2 chủng
vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp.với nấm mốc Aspergillus spp.
 So sánh kết quả để lựa chọn ra phương pháp đối kháng mạnh nhất của 2
chủng vi khuẩn Bacillus spp.và Lactobacillus spp.
2.6. Phƣơng pháp nghiên cứu:
2.6.1. Sơ đồ nghiên cứu:

41. 29
Hình 2.1: Sơ đồ tổng quát nghiên cứu khả năng đối kháng của các chủng VK
có lợi với nấm mốc.

42. 30
2.6.2. Khảo sát sự tăng trƣởng của nấm mốc:
 Mục đích: Khảo sát sự phát triển của nấm mốc và chứng tỏ rằng đây là các
giống nấm mốc Aspergillus spp. khỏe mạnh
 Tiến hành:
 Từ dĩa giống nấm của phòng thí nghiệm, ta đục một khoanh thạch nấm cấy
và đặt vào môi trường PDA đã hấp khử trùng ở 1210
C trong 30 phút.
 Sau đó, ủ trong 72h trong nhiệt độ phòng và quan sát,
2.6.3. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phƣơng pháp ria 2
đƣờng vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với
nấm mốc Aspergillus spp. :
 Quy trình thí nghiệm:

43. 31
Hình 2.2: Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng đối kháng của các chủng vi khuẩn
với nấm mốc theo phƣơng pháp cấy 2 đƣờng vi khuẩn.

44. 32
 Thuyết minh quy trình:
Mục đích: Khảo sát khả năng kháng các chủng nấm mốc của 20 chủng vi khuẩn
theo phương pháp vạch 2 đường vi khuẩn.
Tiến hành:
Chuẩn bị môi trường vi khuẩn:
 Hoạt hóa 20 chủng vi khuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm:
 Đối với vi khuẩn Bacillus spp., hoạt hóa trong môi trường NB đã hấp
khử trùng ở 370
C và lắc trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2
trong môi trường NB ở 370
C trong 24h.
 Đối với vi khuẩn Lactobacillus spp., hoạt hóa giống trong môi trường
MRS broth ở 370
C trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong
môi trường MRS broth ở 370
C trong 24h..
 Cấy truyền dịch tăng sinh:
 Đối với vi khuẩn Bacillus spp., cấy ria vào môi trường NA đã hấp khử
trùng 1210
C trong vòng 30 phút. Sau đó, ủ 24h ở 370
C.
 Đối với vi khuẩn Lactobacillus spp., cấy ria vào môi trường MRS agar
đã hấp khử trùng ở 1210
C trong vòng 30 phút. Sau đó, ủ 24h ở 370
C
Chuẩn bị môi trường khảo sát đối kháng:
 Môi trường sử dụng là môi trường PDA và MRS cải tiến đều được hấp khử
trùng ở 1210
C trong 30 phút. Sau đó, phối vào dĩa petri đã được hấp khử
trùng, mỗi dĩa 15ml.
 Khi thạch đã đông, ta tiến hành cấy nấm mốc vào tâm các dĩa. Mỗi dĩa lặp
lại 3 lần. Sau đó, ủ 24h ở nhiệt độ phòng.
 Sau 24h, ta tiến hành cấy 2 vạch vi khuẩn cách ngoài mép dĩa 1,5cm (2
vạch chủng vi khuẩn phải nằm đối diện nhau qua tâm dĩa trên cùng một
đường kính)cần thử đối kháng vào.Mẫu đối chứng là chỉ cấy nấm vào tâm
dĩa, không cấy 2 vạch vi khuẩn lên. Tiếp tục ủ 72h ở nhiệt độ phòng.
 Quan sát, đọc kết quả đối kháng dựa vào sự phát triển của nấm sau 3 ngày.

45. 33
 Ta tiến hành đo tỉ lệ ức chế theo hình và công thức phần trăm:
Hình 2.3: Mô tả cách đo đƣờng kính vòng ức chế của phƣơng pháp vạch 2
đƣờng vi khuẩn
Trong đó:
Dđc: đường kính (cm) đĩa nấm đối chứng
Dtn: đường kính (cm) đĩa thí nghiệm
Số liệu được xử lí bằng phần mền SAS 9.1
Dđc Dtn
1.5
cm

46. 34
2.6.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phƣơng pháp đặt
thạch khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với
nấm mốc Aspergillus spp. :
 Quy trình thí nghiệm:

47. 35
Hình 2.4 : Sơ đồ chi tiết khảo sát khả năng kháng nấm của 20 chủng vi khuẩn
với nấm mốc theo phƣơng pháp đục thạch khuếch tán.

48. 36
 Thuyết minh quy trình :
Mục đích: Khảo sát khả năng kháng các chủng nấm mốc của 20 chủng vi khuẩn
theo phương pháp khuếch tán.
Tiến hành:
Chuẩn bị môi trường vi khuẩn:
 Hoạt hóa 20 chủng vi khuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm:
 Đối với vi khuẩn Bacillus spp., hoạt hóa trong môi trường NB đã hấp
khử trùng ở 370
C và lắc trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2
trong môi trường NB ở 370
C trong 24h.
 Đối với vi khuẩn Lactobacillus spp., hoạt hóa giống trong môi trường
MRS broth ở 370
C trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong
môi trường MRS broth ở 370
C trong 24h..
 Cấy truyền dịch tăng sinh:
 Đối với vi khuẩn Bacillus spp., hút 0.1ml dịch tăng sinh và trang vi
khuẩn vào môi trường NA đã hấp khử trùng 1210
C trong vòng 30 phút.
Sau đó, ủ 24h ở 370
C.
 Đối với vi khuẩn Lactobacillus spp., hút 0.1ml dịch tăng sinh và trang
vi khuẩn vào môi trường MRS agar đã hấp khử trùng ở 1210
C trong
vòng 30 phút. Sau đó, ủ 24h ở 370
C.
Chuẩn bị huyền phù nấm:
 Cấy truyền giống nấm vào dĩa có chứa môi trường PDA đã hấp khử trùng ở
1210
C trong 30 phút. Sau đó, ủ trong 72h ở nhiệt độ phòng.
 Sau 72h, ta dùng muỗng đã hấp khử trùng cào hết phần bào tử nấm đã mọc
tròn dĩa và pha loãng với nước muối sinh lí có Tween 80 đã hấp khử trùng
để nấm đạt đến mật độ 105
/ml nấm.
Chuẩn bị môi trường để khảo sát sự đối kháng:

49. 37
 Môi trường sử dụng là môi trường PDA và MRS cải tiến đều được hấp khử
trùng ở 1210
C trong 30 phút. Sau đó, phối vào dĩa petri đã được hấp khử
trùng, mỗi dĩa 15ml.
 Khi thạch đã đông, ta tiến hành hút 0.1ml dịch huyền phù nấm đã pha loãng
và trang đều cho khô. Sau đó, đặt khoanh thạch vi khuẩn vào các điểm đã
được chấm trước trên dĩa.Mỗi dĩa được lặp lại 3 lần. Đối với dĩa đối chứng,
ta chỉ hút dịch huyền phù nấm và trang khô, không đặt thạch vi khuẩn. Cuối
cùng, ủ 72h ở nhiệt độ phòng.
(A) (B)
Hình 2.5:Cách đặt thạch vi khuẩn theo phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán-
Đĩa petri có chứa huyền phù nấm để đặt thạch chứa vi khuẩn lên (A) – Đĩa
petri chứa vi khuẩn (B)
 Quan sát và đọc kết quả đối kháng dựa trên sự phát triển của vòng ức chế
nấm của vi khuẩn.

50. 38
 Ta tiến hành đo và tính toán kết quả dựa theo hình vẽ và công thức:
Hình 2.6: Cách đo đƣờng kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm mốc theo
phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán
Trong đó:
Dtn1: đường kính vòng ức chế (D) của vi khuẩn trong nghiệm thức 1 chưa trừ
ra đường kính lỗ thạch (d).
Dtn2: đường kính vòng ức chế (D) của vi khuẩn trong nghiệm thức 2 chưa trừ
ra đường kính lỗ thạch (d).
Dtn3: đường kính vòng ức chế (D) của vi khuẩn trong nghiệm thức 3 chưa trừ
ra đường kính lỗ thạch (d).
d
D

51. 39
2.6.5. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng che phủ theo phƣơng pháp đỗ dĩa
2 lớp của 2 chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm
mốc Aspergillus spp.:
 Thuyết minh quy trình:

52. 40
Hình 2.7: Sơ đồ khảo sát khả năng đối kháng che phủ của 20 chủng vi khuẩn
với các nấm mốc theo phƣơng pháp đỗ dĩa.

53. 41
 Thuyết minh quy trình:
Mục đích: Khảo sát khả năng kháng các chủng nấm mốc của 20 chủng vi khuẩn
theo phương pháp đỗ dĩa.
Tiến hành:
Chuẩn bị môi trường vi khuẩn:
 Hoạt hóa 20 chủng vi khuẩn có sẵn trong phòng thí nghiệm:
 Đối với vi khuẩn Bacillus spp. hoạt hóa trong môi trường NB đã hấp
khử trùng ở 370
C và lắc trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2
trong môi trường NB ở 370
C trong 24h.
 Đối với vi khuẩn Lactobacillus spp. hoạt hóa giống trong môi trường
MRS broth ở 370
C trong 24h. Sau 24h, tiến hành tăng sinh cấp 2 trong
môi trường MRS broth ở 370
C trong 24h..
 Pha loãng dịch tăng sinh:
 Hút 1ml dịch tăng sinh của các chủng vi khuẩn pha loãng với nước
muối sinh lí 85% cho đến 1 nồng độ nhất định.
Chuẩn bị huyền phù nấm:
 Cấy truyền giống nấm vào dĩa có chứa môi trường PDA đã hấp khử trùng ở
1210
C trong 30 phút. Sau đó, ủ trong 72h ở nhiệt độ phòng.
 Sau 72h, ta dùng muỗng đã hấp khử trùng cào hết phần bào tử nấm đã mọc
tròn dĩa và pha loãng với nước muối sinh lí có Tween 80 đã hấp khử trùng
để nấm đạt đến mật độ 105
/ml nấm.
Chuẩn bị môi trường để khảo sát sự đối kháng:
 Môi trường sử dụng là môi trường PDA và MRS agar đều được hấp khử
trùng ở 1210
C trong 30 phút. Sau đó, phối vào dĩa petri đã được hấp khử
trùng, mỗi dĩa 15ml.
 Khi môi trường đã đông, hút 0.1ml dịch vi khuẩn đã pha loãng và trang đều
cho khô. Sau đó, ủ trong 24h ở nhiệt độ phòng.

54. 42
 Cho dịch nấm đã pha loãng vào môi trường PDA đã hấp khử trùng đùng
theo tỉ lệ nồng độ. Sau đó, đổ 1 lớp PDA có chứa nấm lên dĩa môi trường
có chứa khuẩn lạc vi khuẩn đã ủ trong 24h và lắc đều. Mỗi dĩa được lặp lai
3 lần. Đối với dĩa đối chứng chỉ đổ lớp môi trường PDA có chứa dịch nấm
không trang vi khuẩn. Cuối cùng, đem ủ 72h ở nhiệt độ phòng.
 Quan sát và đọc kết quả dựa trên sự phát triển của nấm sau 3 ngày.
 Dựa theo hình ảnh quan sát, ta chia tỉ lệ ức chế nấm mốc của vi khuẩn theo
3 phân đoạn khác nhau:
 Không ức chế hay ức chế yếu từ 0 đến 30%
 Ức chế trung bình từ 35 đến 60%
 Ức chế mạnh từ 65-100%.

55. 43
2.6.6. Một số phƣơng pháp khảo sát hình thái, đặc điểm sinh lí, sinh hóa của một
số chủng vi khuẩn:
2.6.6.1. Nhuộm Gram:
Mục đích: Dựa vào cấu trúc vách tế bào giúp ta xác định nhóm của vi khuẩn là
vi khuẩn Gram dương (Gram – positive) hay vi khuẩn Gram âm (Gram –
negative). Ngoài ra nhuộm Gram cho phép ta quan sát rõ hình thái tế bào hơn so
với soi vi khuẩn sống.
Tiến hành: Sử dụng phương pháp Hucker cải tiến. Vi khuẩn đem nhuộm gram
phải là vi khuẩn mới cấy truyền sau 24 giờ. Ngược lại vi khuẩn già cho kết quả
sai lệch.
Kết quả: vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng.
2.6.6.2. Nhuộm bào tử:
Mục đích: Dựa trên cấu trúc đặc biệt của màng bào tử: dày, chắc, khó bắt màu,
chứa nhiều lipid. Trước hết xử lý để tế bào chất dễ bắt màu bằng nhiệt và acid.
Nhuộm màu cả tế bào chất của bào tử và tế bào bằng thuốc nhuộm có hoạt tính
mạnh. Tẩy màu tế bào chất của tế bào và nhuộm nó bằng thuốc nhuộm khác bổ
sung. Nhờ đó tế bào chất của bào tử và tế bào chất bắt màu phân biệt. Theo sơ đồ
Bergey thì chủng Bacillus spp. sinh bào tử. Do đó việc xác định này nhằm loại bỏ
các vi khuẩn sinh bào tử như Lactobacillus spp.
Tiến hành: Dùng phương pháp Schaefera – Fulton.
Kết quả: Bào tử có màu xanh lục, tế bào có màu đỏ hồng.
2.6.6.3. Các thí nghiệm sinh hóa:
 Thử khả năng lên men đường:
Mục đích : Kiểm tra vi sinh vật có khả năng lên men các loại đường nào.

56. 44
Tiến hành : Môi trường NB với lượng đường glucose lần lượt thay thế bằng
các loại đường cần kiểm tra. Phân môi trường vào các ống nghiệm, mỗi ống
10ml. Đặt vào mỗi ống nghiệm 1 ống nhỏ (ống Durham) lộn ngược đầu để
hứng khí CO2 sinh ra nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường. Khử trùng trong
15 phút ở 1210
C. Cấy vi khuẩn mới hoạt hóa vào các ống nghiệm, đặt ở 370
C,
theo dõi hiện tượng sinh acid sau 1-3 ngày. Có trường hợp cần dùng paraffin để
bịt kín nút bông và theo dõi trong 14-30 ngày.
Kết quả: Nếu vi khuẩn có khả năng lên men đường (sinh acid) chất chỉ thị
Phenol Red sẽ chuyển sang màu vàng.
 Thửnghiệm Catalase:
Mục đích: Để phát hiện được enzyme catalase trong vi khuẩn. Phản ứng
catalase rất cần thiết để phân biệt vi khuẩn kị khí và hiếu khí bắt buộc, vi khuẩn
kị khí sẽ không có enzyme này như Lactobacillus spp.còn vi khuẩn hiếu khí bắt
buộc sẽ có enzyme này như Bacillus spp.
Tiến hành: Dùng que cấy vòng lấy sinh khối từ khuẩn lạc thuần cho lên phiến
kính sạch, nhỏ 1 giọt H2O2 lên sinh khối vi sinh vật trên phiến kính.
Kết quả: Nếu là vi khuẩn hiếu khí sẽ sủi bọt khi nhỏ H2O2 lên còn kị khí thì
không sủi bọt.
 Thử khả năng di động:
Mục đích: Xác định khả năng di động của vi sinh vật.
Tiến hành: Sử dụng môi trường NA 0,5% agar. Hấp khử trùng 121o
C/ 15 phút.
Để cho môi trường đông lại, dùng que cấy thẳng thu lấy sinh khối từ khuẩn lạc
của chủng thuần, cấy điểm vào giữa đĩa môi trường thạch bán rắn. Ủ ở 370
C.
Đọc kết quả sau 24giờ.
Kết quả: Vi khuẩn Bacillus spp. có khả năng di động.

57. 45
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
3.1. Định danh sơ bộ khảo sát sinh lý- sinh hóa của một số chủng vi khuẩn:
Các chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. và Bacillus spp.được dùng trong thí nghiệm
đã được một số nghiên cứu trước định danh sơ bộ bằng khảo sát sinh lí và sinh hóa.
Tuy nhiên, vẫn còn ba vi khuẩn VK4, CS1a, CS1+ chưa được khảo sát sơ bộ bằng
khảo sát sinh lí và sinh hóa nên chúng ta khảo sát sinh lý và sinh hóa chúng lại để
khẳng định chúng có một số đặc điểm tiêu biểu của Bacillus spp. hay không. Vi
khuẩn Bacillus spp.cần phải đáp ứng các điều kiện: vi khuẩn gram dương, hình cầu
hoặc hình que, sinh bào tử, có khả năng di động… Các phản ứng sinh ly-sinh hóa
sau sẽ chứng minh vi khuẩn Bacillus spp.đạt được các yêu cầu đó. Hình thái khuẩn
lạc của các chủng Bacillus spp.thể hiện qua bảng 3.1:
Bảng 3.1: Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các chủng Bacillus spp.
Tên chủng Hình thái khuẩn lạc
CS1a Khuẩn lạc tròn, bờ răng cưa, nhẵn, ướt, màu trắng đục, có
tâm
CS1+ Khuẩn lạc tròn đều, ướt, nhẵn, có tâm, màu trắng đục
VK4 Khuản lạc tròn đều, nhẵn, không có tâm, màu trắng đục
Hình 3.1: Hình thái khuẩn lạc của các chủng Bacillus spp. CS1a (a) – CS1+ (b)
– VK4 (c).

58. 46
3.1.1. Nhuộm Gram:
 Vi khuẩn Bacillus spp. là vi khuẩn gram dương, hình que hoặc hình cầu nên ta
tiến hành nhuộm Gram với các tế bào tăng sinh ở 24h trong môi trường NB, vì
khi tế bào già sẽ bắt màu giống như vi khuẩn gram âm.
 Kết quả thu được vi khuẩn Bacillus spp.: VK4 là vi khuẩn gram dương
Hình 3.2: Nhuộm Gram vi khuẩn VK4
3.1.2. Nhuộm bào tử:
 Theo sơ đồ định danh của Bergey thì Bacillus spp.sinh bào tử nên nhuộm bào tử
giúp loại bỏ các vi khuẩn gram dương không sinh bảo tử như Lactobacillus spp.
và đây là cách nhận dạng của chúng. Kết quả sau khi nhuộm bào tử và được đối
chiếu với vi khuẩn Lactobacillus spp.gram dương.
 Kết quả cho thấy 3 chủng vi khuẩn Bacillus spp.CS1a,CS1+ và VK4 đều bắt
màu xanh lục sau khi nhuộm thuốc thử Malachite Green còn Lactobacillus spp.
L5 chỉ bắt màu đỏ hồng.

59. 47
Hình 3.3: Nhuộm bào tử các chủng vi khuẩn- Nhuộm bào tử của vi khuẩn VK4
(a) - Nhuộm bào tử của vi khuẩn Lactobacillus sp L5. (b)
3.1.3. Các thử nghiệm sinh hóa:
Một số thử nghiệm sinh hóa được thể hiện qua bảng:
Bảng 3.2: Một số phản ứng sinh hóa của chủng vi khuẩn Bacillus spp.
Phƣơng pháp Chủng
CS1a CS1+ VK4
Catalase + + +
Khả năng di động + + +
Khả năng lên men đường
Glucose + + +
Saccarose + + +
Xylose + - -
Lactose + + +
a b

60. 48
Chú thích: “-“ là kết quả âm tính; “+” là kết quả dương tính.
 Qua các định danh sơ bộ theo phương pháp cổ điển, người thực hiện đề tài
khẳng định được các chủng Bacillus spp. VK4, CS1a, CS1+ đều là vi khuẩn
Bacillus và đều thuẩn khiết.
3.2. Khảo sát sự tăng trƣởng của các chủng nấm mốc Aspergillus spp.:
 Để xác định được các chủng nấm trong phòng thí nghiệm là các chủng nấm
khỏe mạnh và thuần khiết, ta cấy bằng cách đặt thạch nấm và đo đường kính
phát triển của chúng sau 3 ngày.
 Vì ở đây ta thực hiện sự đối kháng của nấm với 2 chủng vi khuẩn là Bacillus
spp và Lactobacillus spp. nên ta sẽ đặt thạch nấm lên 2 môi trường đặt trưng
của 2 vi khuẩn đó và đo đường kính phát triển của chúng sau 3 ngày.
 Đối với Bacillus spp.ta dùng môi trường PDA để khảo sát:
Hình 3.4: Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày quan sát trên môi trƣờng
PDA – Nấm CĐP1 (a) – Nấm CĐP2 (b) – Nấm ĐN2 (c) – Nấm ĐN3 (d) – Nấm
HCP2 (e).

61. 49
 Đối với Lactobacillus spp. ta dùng MRS cải tiến (bỏ citrate amon) để khảo sát:
Hình 3.5: Sự phát triển của nấm mốc sau 3 ngày quan sát trên môi trƣờng
MRS cải tiến – Nấm CĐP1 (a) – Nấm CĐP2 (b) – Nấm ĐN2 (c) – Nấm ĐN3 (d)
– Nấm HCP2 (e).

62. 50
3.3. Khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phƣơng pháp ria 2 đƣờng
vi khuẩn của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp. với nấm
mốc Aspergillus spp.:
 Ta có 20 chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp.nên ở mỗi ta sẽ
sắp xếp chúng theo từng nhóm có nguồn phân lập giống nhau:
 Đối với vi khuẩn Bacillus spp. ta phân làm 3 nhóm:
 Nhóm phân lập từ phụ phế phẩm: CS1a, CS1b, CS1+, VK4.
 Nhóm phân lập từ đất: D9, Paenibacillus.
 Nhóm phân lập từ nước thải: Sb NT 1.4, Sb NT 1.3, Sb NT 2.3, Sb NT 3.3.
 Đối với vi khuẩn Lacobacillus spp. ta phân thành 2 nhóm:
 Nhóm phân lập từ nem: L5, L6, LN3-5, LN3-7, LN2-7, LN 2-5.
 Nhóm phân lập từ cơm mẻ: LC6-5, LC7-7, LC1-1,LC3-3.
 Thử nghiệm đối kháng nấm mốc ta sử dụng 5 chủng nấm mốc Aspergillus
spp. chỉ thị với mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Trong đó, ta sử dụng đối
chứng (+) là thuốc Nystatin vì Nystatin là hợp chất hóa học tác động lên
màng tế bào của nấm mốc của Steptomyces nourse. Nhằm mục đích để so
sánh sự đối kháng của chủng vi khuẩn thí nghiệm với hợp chất hóa học có
sự khác biệt hay không.

63. 51
 Đối với vi khuẩn Bacillus spp.:
Hình 3.6: Đối chứng CĐP2 (a)- Nystatin-CĐP2 (b)-Paenibacillus-CĐP2 (c) -
CS1b-CĐP2 (d)- NT 1.4-CĐP2(e).

64. 52
Hình 3.7: Đối chứng ĐN3 (a) – Nystatin-ĐN3 (b) –Paenibacillus-ĐN3 (c) –
CS1b-ĐN3 (d) – NT 1.4-ĐN3 (e).

65. 53
Bảng 3.3: Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế của các nhóm vi khuẩn Bacillus spp. với
nấm mốc theo từng nhóm theo phƣơng pháp cây 2 đƣờng vi khuẩn.
VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP2 CĐP1 HCP2
ĐC(+) 32.80a
±4.71 39.39b
±1.78 43.80ab
±2.66 38.95b
±1.51 27.99b
±4.66
NHÓM
VK
PHÂN
LẬP TỪ
PHỤ
PHẾ
PHẨM
VK4 37.58c
±4.81 35.28b
±3.08 5.24d
±4.26 34.73b
±4.62 8.59c
±3.73
CS1a 2.54a
±1.91 30.60c
±2.57 37.85bc
±4.39 60.61a
±4.78 28.92b
±4.44
CS1+ 16.71b
±3.59 16.79d
±4.71 32.00c
±2.66 54.79a
±4.12 10.27c
±2.52
CS1b 40.76a
±2.53 52.74a
±1.78 51.39a
±1.41 52.90a
±4.86 47.39a
±1.12
ĐC(+) 32.80b
±4.71 39.39b
±1.78 43.80a
±2.66 38.95b
±1.51 27.99b
±4.66
NHÓM
VK
PHÂN
LẬP TỪ
ĐẤT
D9 44.58a
±2.53 40.76a
±4.75 44.16a
±4.55 47.67b
±3.80 27.99b
±0.65
Paenibacillus 38.85ab
±3.45 32.20c
±1.78 44.00a
±3.24 50.29a
±3.80 38.44a
±4.48
ĐC(+) 32.80a
±4.71 39.39a
±1.78 43.80b
±2.66 38.95a
±1.51 27.99b
±4.66
NHÓM
VK
PHÂN
LẬP TỪ
NƢỚC
THẢI
Sb NT 1.3 21.33b
±3.86 29.26b
±4.37 31.08a
±3.73 46.65c
±4.78 34.15b
±4.27
Sb NT 2.3 29.93a
±1.46 27.40b
±4.15 45.54ab
±3.73 40.40b
±3.52 15.12c
±4.20
Sb NT 3.3 31.21a
±5.06 25.01b
±4.48 35.39ab
±2.77 41.86b
±4.80 32.47b
±4.13.
Sb NT 1.4 36.30a
±0.55 22.27b
±2.14 37.23a
±4.62 44.76ab
±3.06 53.73a
±2.58

66. 54
Bảng 3.4: So sánh tỉ lệ ức chế nấm mốc của 3 vi khuẩn Bacillus spp. mạnh nhất
trong từ nhóm với nhau theo phƣơng pháp cấy 2 đƣờng vi khuẩn.(dựa theo độ
tin cậy 95% của phần mền SAS 9.1.
VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP2 CĐP1 HCP2
ĐC(+) 32.80c
±4.71 39.39b
±1.78 43.80bc
±2.66 38.95b
±1.51 27.99c
±4.66
CS1b
(NHÓM VK PHÂN
LẬP TỪ PHỤ PHẾ
PHẨM)
40.76ab
±2.53 52.74a
±1.78 51.39a
±1.41 52.90a
±4.86 47.39a
±1.12
D9
(NHÓM VK PHÂN
LẬP TỪ ĐẤT)
44.58a
±2.53 40.76b
±4.75 44.16b
±4.55 47.67a
±3.80 27.99c
±0.65
Sb NT 1.4
(NHÓM VK PHÂN
LẬP TỪ NƢỚC
THẢI)
36.30bc
±0.55 22.27c
±2.14 37.23c
±4.62 44.76a
±3.06 53.73b
±2.58

67. 55
Hình 3.8: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế trung bình của nhóm vi khuẩn Bacillus
spp.đƣợc phân lập từ phụ phế phẩm.

68. 56
Hình 3.9: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế trung bình của nhóm vi khuẩn Bacillus
spp. đƣợc phân lập từ đất.

69. 57
Hình 3.10: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế trung bình của nhóm vi khuẩn Bacillus
spp .đƣợc phân lập từ nƣớc thải.

70. 58
 Sau khi xử lí số liệu bằng phần mền ANOVA (phân tích phương sai) với mức
độ tin cậy là 95% thì ta có:
 Phần trăm tỉ lệ ức chế của vi khuẩn CS1b là mạnh nhất với các chủng vi
khuẩn Bacillus spp. còn lại nằm trong khoảng 40.76-52.74% thể hiện trong
bảng 3.4 và hình 3.7
 Thông qua bảng 3.3, cho thấy được vi khuẩn thể hiện tỉ lệ ức chế yếu nhất là
vi khuẩn VK4, tỉ lệ ức chế chỉ nằm trong khoảng 5.24-37.58% trong bảng
3.3.
 Trong từng nhóm phân lập, các vi khuẩn Bacillus spp. thể hiện tỉ lệ đối kháng
thông qua biểu đồ:
 Ở biểu đồ 3.8, tỉ lệ đối kháng của vi khuẩn CS1b thể hiện qua sự bao phủ
hết các vi khuẩn khác trong nhóm vi khuẩn phân lập từ phụ phế phẩm.
 Trong nhóm phân lập từ đất, tỉ lệ đối kháng của vi khuẩn D9 thể hiện mạnh
và rõ ràng thông qua sự bao phủ của D9 trong biểu đồ 3.9.
 Nhóm vi khuẩn phân lập từ nước thải, Sb. NT 1.4 thể hiện sự đối kháng
thông qua biểu đồ 3.10 cho thấy tỉ lệ đối kháng khá mạnh đối với chủng
nấm HCP2.
 So với thí nghiệm của Nystatin với các chủng nấm mốc thì vi khuẩn CS1b có
khả năng kháng nấm mốc cao hơn rất nhiêu chiếm khoảng từ 40.00-50.00%
còn Nystatin chỉ khoảng 25.00-40.00%. (đồ thị hình 3.8).

71. 59
 Đối với vi khuẩn Latobacillus spp.:
Hình 3.11: Đối chứng CĐP2 (a) – Nystatin-CĐP2 (b) – LN2-5-CĐP2 (c) –
LC1-1-CĐP2 (d)

72. 60
Hình 3.12: Đối chứng ĐN3 (a) – Nystatin-ĐN3 (b) – LN2-5-ĐN3 (c) –
LC1-1-ĐN3 (d).

73. 61
Bảng 3.5: Thống kê số liệu tỉ lệ ức chế của các nhóm vi khuẩn Lactobacillus
spp. với nấm mốc theo từng nhóm theo phƣơng pháp cấy 2 đƣờng vi khuẩn.
VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP2 CĐP1 HCP2
ĐC(+) 63.49ab
±1.37 9.12d
±4.34 35.75c
±4.18 43.15c
±0.00 16.35e
±1.09
NHÓM
VK
PHÂN
LẬP TỪ
NEM
L5 64.48ab
±3.78 28.08ab
±4.29 51.06ab
±2.58 63.11a
±1.21 47.01ab
±3.14
L6 52.38c
±3.14 20.03bc
±4.26 43.36bc
±4.20 59.78ab
±4.45 39.94c
±3.03
LN3-5 60.12b
±3.90 9.75d
±1.24 22.46c
±0.00 48.59c
±1.05 25.63d
±4.82
LN3-7 60.91b
±1.37 15.38cd
±4.87 38.41c
±4.75 55.24b
±0.00 21.23de
±2.45
LN2-7 64.29ab
±1.57 24.86b
±3.87 52.05ab
±4.87 59.48ab
±3.68 43.40bc
±1.89
LN2-5 68.75a
±1.26 35.95a
±2.28 55.07a
±4.10 60.49ab
±3.42 52.83a
±2.67
ĐC(+) 63.49ab
±1.37 9.12b
±4.34 35.75b
±4.18 43.15b±0.00 16.35c
±1.09
NHÓM
VK
PHÂN
LẬP TỪ
CƠM
MẺ
LC7-7 60.71b
±2.73 3.03b
±2.17 39.37b
±2.41 36.49b
±2.77 16.51c
±4.03
LC6-5 63.29ab
±1.24 26.65a
±4.34 35.27b
±4.32 61.29a
±1.60 39.31a
±3.57
LC1-1 64.29ab
±0.00 9.47a
±2.23 36.47a
±4.18 62.10a
±4.12 24.06a
±4.19
LC3-3 61.31a
±2.73 31.84b
±4.68 50.60b
±4.20 65.32a
±0.00 34.91b
±4.55

74. 62
Bảng 3.6: So sánh tỉ lệ ức chế nấm mốc của 2 vi khuẩn Lactobacillus spp. mạnh
nhất trong từ nhóm với nhau theo phƣơng pháp cấy 2 đƣờng vi khuẩn.
(dựa theo độ tin cậy 95% của phần mền SAS 9.1)
VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP2 CĐP1 HCP2
ĐC(+) 63.49b
±1.37 9.12b
±4.34 35.75b
±4.18 43.15b
±0.00 16.35c
±1.09
LN2-5
(NHÓM VK PHÂN
LẬP TỪ NEM)
68.75a
±1.26 35.95a
±2.28 55.07a
±4.10 60.49a
±3.42 52.83a
±2.67
LC1-1
(NHÓM VK PHÂN
LẬP TỪ CƠM MẺ)
64.29b
±0.00 9.47a
±2.23 36.47a
±4.18 62.10a
±4.12 24.06b
±4.19

75. 63
Hình 3.13: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế trung bình của nhóm vi khuẩn
Lactobacillus spp. đƣợc phân lập từ nem.

76. 64
Hình 3.14: Biểu đồ thể hiện tỉ lệ ức chế trung bình của nhóm vi khuẩn
Lactobacillus spp. đƣợc phân lập từ cơm mẻ.

77. 65
 Theo số liệu trên phàn mền ANOVA (phân tích phương sai) cho thấy tỉ lệ ngày
thứ 3 là cho tỉ lệ ức chế tốt nhất nhóm nấm mốc Aspergillus spp.thể hiện qua
các hình 3.11 và 3.12 với độ tin cậy 95%.
 Trong đó, vi khuẩn LN2-5 (L3) thuộc nhóm vi khuẩn Lactobacillus spp.phân
lập từ nem là có khả năng kháng nấm mốc mạnh nhất và tỉ lệ ức chế nấm cũng
đồng đều hơn so với vi khuẩn Lactobacillus spp.khác trong 10 chủng vi khuẩn
Lactobacillus spp. của phòng thí nghiệm thể hiện qua bảng 3.6.
 Tỉ lệ ức chế của LN2-5 (L3) với các nấm mốc dao động từ khoảng 36.0-67.0%,
đối với nấm ĐN3 68.75%, nấm ĐN2 là 35.95%, nấm CĐP1 là 60.49%, nấm
CĐP2 là 55.07%, nấm HCP2 là 52.83% được thể hiện rõ qua bảng thống kê số
liệu 3.5.
 Trong từng nhóm phân lập của các chủng Lactobacillus spp.:
 Nhóm phân lập từ nem, LN2-5 thể hiện sự đối kháng mạnh đối với các
chủng nấm mốc thông qua sự bao phủ được biểu hiện qua biểu đồ 3.13.
 Trong biểu đồ 3.14, vi khuẩn LC1-1 thể hiện tỉ lệ kháng nấm mốc khá cao
qua sự bao phủ của nó so với các chủng vi khuẩn khác.
 Thí nghiệm của Nystatin với các chủng nấm mốc thì vi khuẩn LN2-5 có khả
năng kháng nấm mốc cao hơn rất nhiêu chiếm khoảng từ 40.00-75.00% còn
Nystatin chỉ khoảng 25.00-40.00%. (đồ thị hình 3.13).
Ƣu điểm và nhƣợc điểm của phƣơng pháp đối kháng nấm trực tiếp theo
cách cấy 2 đƣờng vi khuẩn:
 Ưu điểm: Đơn giản, dễ quan sát.
 Nhược điểm:
 Khi đặt thạch nấm vào dĩa môi trường phải nhanh nên không bào tử nấm sẽ
bay ảnh hưởng đến kết quả
 Sai số giữa các lần lặp lại trong cùng một nghiệm thức khá cao.

78. 66
3.4. Thí nghiệm khảo sát khả năng đối kháng trực tiếp theo phƣơng pháp
đặt thạch khuếch tán của 2 chủng VK Bacillus spp. và Lactobacillus spp.
với nấmmốc Aspergillus spp.:
 Ta có 20 chủng vi khuẩn Bacillus spp. và Lactobacillus spp. nên ở mỗi ta sẽ sắp
xếp chúng theo từng nhóm có nguồn phân lập giống nhau:
 Đối với vi khuẩn Bacillus spp. ta phân làm 3 nhóm:
 Nhóm phân lập từ phụ phế phẩm: CS1a, CS1b, CS1+, VK4.
 Nhóm phân lập từ đất: D9, Paenibacillus.
 Nhóm phân lập từ nước thải: Sb NT 1.4, Sb NT 1.3, Sb NT 2.3, Sb NT 3.3.
 Đối với vi khuẩn Lacobacillus spp. ta phân thành 2 nhóm:
 Nhóm phân lập từ nem: L5, L6, LN3-5, LN3-7, LN2-7, LN 2-5.
 Nhóm phân lập từ cơm mẻ: LC6-5, LC7-7, LC1-1,LC3-3.
 Thử nghiệm đối kháng nấm mốc với 2 chủng vi khuẩn ta sử dụng 5 chủng nấm
mốc Aspergillus spp. chỉ thị với mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần.
 Đối với vi khuẩn Bacillus spp.:
Hình 3.15 : Đối chứng ĐN3 (a)- Sb NT 1.4- ĐN3 (b)- Sb NT 3.3- ĐN3 (c).

79. 67
Hình 3.16 : Đối chứng ĐN2 (a)- Sb NT 1.4- ĐN2 (b)- D9- ĐN2 (c).
 So sánh vòng ức chế nấm mốc giữa các vi khuẩn Bacillus spp.mạnh nhất ở các
nhóm với nhau :
Hình 3.17: So sánh vòng ức chế giữa các nhóm VK mạnh nhất với nhau
Sb NT3.3-HCP2(a)-CS1b-HCP2(b)-D9-HCP2(c).

80. 68
Bảng 3.7 : Thống kê số liệu vòng ức chế của vi khuẩn Bacillus spp. theo từng
nhóm đối với nấm mốc trong phƣơng pháp đặt thạch khuếch tán.(dựa theo độ
tin cậy 95% của phần mền SAS 9.1)
VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP1 CĐP2 HCP2
NHÓM
VK
PHÂN
LẬP
TỪ
PHỤ
PHẾ
PHẨM
VK4 10.44b
±0.77 11.00b
±1.73 10.00b
±0.00 11.11a
±1.08 10.00b
±0.00
CS1a 13.17ab
±1.17 10.91b
±0.86 11.50ab
±0.60 10.67a
±1.15 10.00b
±0.00
CS1b 16.61a
±3.95 16.67a
±2.31 12.83a
±1.32 12.94a
±1.60 15.44a
±2.59
CS1+ 9.56b
±2.21 16.06a
±3.33 13.06a
±1.35 11.11a
±1.92 11.67b
±1.86
NHÓM
VK
PHÂN
LẬP
TỪ
ĐẤT
D9 21.33a
±2.89 17.83a
±0.58 14.11a
±1.11 19.11a
±4.33 19.72a
±2.42
Paenibacillus 11.94b
±2.31 16.33a
±2.74 14.44a
±1.17 16.11a
±2.81 10.61b
±0.54
NHÓM
VK
PHÂN
LẬP
TỪ
NƢỚC
THẢI
Sb NT 1.3 14.83b
±2.33 14.78a
±0.10 12.78a
±0.59 12.33a
±1.17 12.28a
±0.54
Sb NT 2.3 10.39b
±0.42 10.39c
±0.67 11.56ab
±1.02 12.06a
±0.67 10.00b
±0.00
Sb NT 3.3 21.83a
±6.64 15.78a
±1.35 13.17a
±1.45 12.00a
±0.93 13.22a
±1.86
Sb NT 1.4 11.06b
±1.08 12.72b
±0.67 10.28b
±0.48 10.83a
±1.44 11.22ab
±1.58

81. 69
Bảng 3.8 : So sánh vòng ức chế trung bình giữa các vi khuẩn Bacillus spp.
mạnh giƣa các nhóm với nhau đối với nấm mốc theo phƣơng pháp đặt thạch
khuếch tán.(dựa theo độ tin cậy 95% của phần mền SAS 9.1)
VI KHUẨN ĐN3 ĐN2 CĐP1 CĐP2 HCP2
CS1b
(NHÓM VK PHÂN
LẬP TỪ PHỤ PHẾ
PHẨM)
16.61a
±3.95 16.67a
±2.31 12.83a
±1.32 12.94b
±1.60 15.44ab
±2.59
D9
(NHÓM VK PHÂN
LẬP TỪ ĐẤT)
21.33a
±2.89 17.83a
±0.58 14.11a
±1.11 19.11a
±4.33 19.72a
±2.42
Sb NT 3.3
(NHÓM VK PHÂN
LẬP TỪ NƢỚC
THẢI)
21.83a
±6.64 15.78a
±1.35 13.17a
±1.45 12.00b
±0.93 13.22b
±1.86

82. 70
Hình 3.18: Biểu đồ thể hiện vòng ức chế trung bình nấm mốc của vi khuẩn
Bacillus spp. trong nhóm phân lập từ phụ phế phẩm.

83. 71
Hình 3.19 : Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốccủa vi khuẩn Bacillus
spp. trong nhóm phân lập từ đất.

84. 72
Hình 3.20 : Biểu đồ thể hiện vòng ức chế nấm mốc của vi khuẩn Bacillus
spp.trong nhóm phân lập từ đất.

85. 73
 Phân tích ANOVA (phân tích phương sai) cho thấy vòng ức chế nấm mốc
Aspergillus spp. của nhóm vi khuẩn Bacillus spp.thể hiện rõ nhất là vào ngày
thứ 3 với độ tin cậy 95%.(xem hình 3.17).
 Trong số 10 chủng Bacillus spp. do phòng thí nghiệm cung cấp thì D9 thể hiện
rõ nhất đường kính vòng ức chế nấm mốc Aspergillus spp.như hình 3.16 và
cũng có đường kính vòng ức chế trung bình tương đối đồng đều đối với tất cả
các loại nấm mốc như biểu đồ hình 3.19.
 Số đo đường kính vòng ức chế trung bình của D9 dao động từ khoảng 14,11-
21,33 (mm) như bảng 3.8 đây là số đo vòng ức chế cao nhất trong nhóm vi
khuẩn Bacillus spp.phân lập từ đất và cao so với các nhóm vi khuẩn Bacillus
spp.còn lại (nhóm vi phân lập từ phụ phế phẩm và nước thải).
 Trong từng nhóm phân lập Bacillus spp.:
 Nhóm phân lập từ phụ phế phẩm: CS1b có khả năng kháng nấm mốc cao
nhất vì thông qua biểu đô 3.18 cho thấy sự bao phủ của nó so với các vi
khuẩn còn lại rộng hơn.
 Thông qua biểu đồ 3.19, sự bao phủ của vi khuẩn D9 đối với các chủng nấm
mốc rộng hơn chủng vi khuẩn Paenibacillus trong nhóm phân lập từ đất.
 Biểu đồ 3.20 sự bao phủ vòng ức chế đối kháng của vi khuẩn Sb.NT 3.3 khá
rộng so với các chủng vi khuẩn còn lại.
 Số đo vòng ức chế trung bình (mm) của D9 đối với các nhóm nấm mốc
Aspergillus spp.như sau (bảng 3.8) : nấm ĐN3 là 21,33 mm, nấm ĐN2 là
17,83mm,nấm CĐP1 là 14.11mm, nấm CĐP2 là 19.11mm và nấm HCP2 là
19.72mm.