Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn

DANH M C CH CÁI VI T T T
ABA Abcisis acid
DNA Deoxyribonucleic acid
RNA Ribonucleic acid
ATP Adenozin triphosphata
ATP-ase Enzym phân gi i ATP
cDNA S i DNA b sung ư c t ng h p t RNA thông tin nh enzym
phiên mã ngư c (Complementary DNA)
AS Acetosyringone
A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens
BAP 6-benzyladenine
bar gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin acetyl transferase
bp Base pair
CCM Cocultivation medium -
DEPC Diethyl pyrocarbonate
tg ng tác gi
dNTP deoxynucleoside triphosphate
EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid
E. coli Escherichia coli
GA3 Gibberellic acid
GM Germination medium – môi trư ng n y m m h t
GUS β –Glucuronidase gene = Gen mã hóa enzyme β-Glucuronidase
HSP Heat shock protein (Protein s c nhi t)
IAA Indoleacetic acid
IBA Indole-3-butyric acid
IPTG Isopropylthio-beta-D-galactoside
kb kilo base
LB Luria Bertani
LSD Least significant difference = l ch chu n
LEA Late embryogenesis abundant
MES 2-[N-morpholino]ethanesulfonic acid
MS Môi trư ng mu i cơ b n theo Murashige và Skoog (1962)
NAA α-Naphthaleneacetic acid
nptII Neomycin phosphotransferase gene
OD Optical density
P5CS pyroline-5-carboxylate synthetase
P5CDH Pyrroline 5 carboxylate dehydrogenase
P5CR Pyrroline 5 carboxylate reductase
PDH Pyrroline dehydrogenase

1
rd29A Responsive Dehydration
PCR Polymerase Chain Reaction – ph n ng chu i polymerase
RM Rooting medium – môi trư ng ra r
SDS Sodium dodecylsulfat
SIM Shoot induction medium – môi trư ng t o a ch i
SEM Shoot elongation medium – môi trư ng kéo dài ch i
Taq Thermus aquaticus DNA
T-DNA Transfer –DNA = o n ADN ư c chuy n
Ti- plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây kh i u
TBE Tris - Boric acid - EDTA
TAE Tris - Acetate - EDTA
TE Tris - EDTA
v/p vòng/phút
X-gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide
X-gal 5-brom- 4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase
YEP Yeast extract peptone

M C L C
M U................................................................................................................ 0
1. t v n ........................................................................................................... 1
2. M c tiêu nghiên c u............................................................................................ 2
3. N i dung nghiên c u........................................................................................... 2
Chương 1: T NG QUAN TÀI LI U................................................................... 4
1.1. CÂY U TƯƠNG (GLYCINE MAX (L.) MERRILL), GIÁ TR KINH T VÀ
GIÁ TR S D NG ............................................................................................... 4
1.1.1. Ngu n g c và phân lo i................................................................................. 4
1.1.2. c i m sinh h c......................................................................................... 4
1.1.3. Giá tr kinh t và giá tr s d ng c a cây u tương....................................... 5
1.1.4. Tình hình s n xu t u tương trên th gi i và Vi t Nam............................. 6
1.2. CƠ S SINH LÝ, HÓA SINH C A C TÍNH CH NG CH U H N C A
CÂY U TƯƠNG ............................................................................................. 10
1.2.1. Kh năng thích nghi c a b r trong i u ki n h n ...................................... 11
1.2.1.1.S phát tri n c a b r ............................................................................... 11
1.2.1.2. Kh năng c nh nitơ c a cây u tương trong i u ki n h n .................. 13
1.2.2. Các tính tr ng liên quan n s thích ng c a lá cây u tương trong i u ki n
h n........................................................................................................................ 14
1.2.2.1. Cư ng thoát hơi nư c c a khí kh ng ................................................... 14
1.2.2.2. Cư ng thoát hơi nư c c a bi u bì........................................................ 15
1.2.2.3. M t lông tơ c a lá................................................................................ 16
1.2.2.4. Hi u qu s d ng nư c............................................................................. 17
1.2.3. áp ng v phương di n hóa sinh c a cây u tương trong i u ki n h n ... 18
1.2.4. M t s gen liên quan n tính ch u h n ................................................................... 19
1.3. PROLIN VÀ VAI TRÒ C A ENZYME P5CS TRONG CON Ư NG SINH
T NG H P PROLIN ........................................................................................... 21
1.3.1. Quá trình sinh t ng h p prolin..................................................................... 21
1.3.2. i u hòa quá trình trao i prolin th c v t ............................................... 23
1.3.3. Vai trò c a s tích lũy prolin i v i tính ch ng ch u c a cây...................... 25
1.3.4. Vaitrò c aenzympyrroline-5-carboxylatesynthetase i v itính ch ng ch uc a cây tr ng
.............................................................................................................................. 27
1.4. PROMOTER VÀ VAI TRÒ I U KHI N HO T NG C A GEN
DƯ I I U KI N KHÔ H N 29
1.4.1. C u trúc và ch c năng c a promoter 29

1
1.4.2. Các lo i promoter s d ng trong công ngh sinh h c 30
1.4.3. Promoter rd29A 32
1.5. NGHIÊN C U NÂNG CAO KH NĂNG CH U H N C A CÂY U
TƯƠNG................................................................................................................ 32
1.5.1. Nâng cao kh năng ch u h n c a cây u tương b ng phương pháp t bi n th c
nghi m.................................................................................................................. 32
1.5.2. S d ng công ngh t bào th c v t trong ch n dòng u tương ch u h n..... 33
1.5.3. S d ng k thu t chuy n gen nâng cao kh năng ch u h n c a cây u tương
.............................................................................................................................. 35
1.5.3.1. Các phương pháp chuy n gen th c v t .................................................. 35
1.5.3.2. Ti m năng c a phương pháp chuy n gen th c v t trong nghiên c u t o cây
u tương ch u h n................................................................................................ 37
Chương 2: V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U.......................... 38
2.1. V T LI U, HÓA CH T, THI T B ............................................................. 38
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U .................................................................. 39
2.2.1. Phương pháp sinh lý, hoá sinh..................................................................... 39
2.2.1.1. ánh giá nhanh kh năng ch u h n ........................................................... 39
2.2.1.2. nh lư ng protein, lipit, hàm lư ng và thành ph n axit amin trong h t .... 39
2.2.1.3. Xác nh hàm lư ng prolin....................................................................... 40
2.2.1.4. Phương pháp tính toán và x lý s li u..................................................... 40
2.2.2. Các phương pháp s d ng nuôi c y in vitro................................................. 40
2.2.2.1. Arabidopsis ............................................................................................. 40
2.2.2.2. Thu c lá .................................................................................................. 40
2.2.2.3. u tương ............................................................................................... 41
2.2.3. Phương pháp sinh h c phân t ..................................................................... 44
2.2.3.1. Thi t k m i ............................................................................................. 44
2.2.3.2. Phương pháp tách chi t, tinh s ch DNA và RNA...................................... 44
2.2.3.3. Phương pháp t ng h p cDNA................................................................... 45
2.2.3.4. Ph n ng PCR......................................................................................... 45
2.2.3.5. Phương pháp OE - PCR ( Overlap Extention)........................................... 46
2.2.3.6. Phương pháp tách dòng ............................................................................ 46
2.2.3.7. Phương pháp PCR tr c ti p t khu n l c (colony-PCR) ........................... 49
2.2.2.8. Thi t k c u trúc rd29A::GUS và rd29A::P5CSM……… ..……………49
2.2.3.9. Các phương pháp phân tích cây bi n n p.................................................. 52

2
Chương 3: K T QU VÀ TH O LU N .......................................................... 53
3.1. K T QU SƯU T P VÀ ÁNH GIÁ CÁC GI NG U TƯƠNG A
PHƯƠNG C A T NH SƠN LA........................................................................... 53
3.1.1. c i m hình thái, hóa sinh c a h t u tương........................................... 53
3.1.2. K t qu ánh giá kh năng ch u h n c a các gi ng u tương nghiên c u ... 55
3.2. PHÂN L P GEN P5CS VÀ T BI N I M LO I B C CH NGƯ C..... 58
3.2.1. K t qu phân l p gen P5CS ......................................................................... 58
3.2.2. K t qu khu ch i, tách dòng và xác nh trình t gen P5CS ..................... 58
3.2.3. T o tbi n i mlo ib hi u ng c ch ngư cP5CS phân l p t cây utương..... 69
3.3. PHÂN L P VÀ KI M TRA HO T NG C A PROMOTER C M NG
KHÔ H N rd29A ................................................................................................. 72
3.3.1. Phân l p promoter rd29A............................................................................. 72
3.3.2. Phân tích trình t promoter rd29A ............................................................... 73
3.3.3. Thi t k vector chuy n gen mang c u trúc rd29A ........................................ 75
3.3.4. T o cây thu c lá chuy n gen mang c u trúc rd29A :: GUS.......................... 75
3.4. K T QU ÁNH GIÁ KH NĂNG CH U H N C A CÂY THU C LÁ
CHUY N GEN MANG C U TRÚC rd29A::P5CSM.......................................... 78
3.4.1. Thi t k vector chuy n gen mang c u trúc rd29A::P5CSM.......................... 78
3.4.2. T o cây thu c lá chuy n gen mang c u trúc rd29A::P5CSM ....................... 81
3.4.3. ánh giá kh năng ch u h n c a các dòng thu c lá chuy n gen ................... 82
3.5. K T QU T O CÂY U TƯƠNG CHUY N GEN.................................. 84
3.5.1. K t qu tái sinh t o a ch i gi ng u tương DT84 .................................. 84
3.5.1.1. T i ưu th i gian kh trùng h t.................................................................. 84
3.5.1.2. nh hư ng c a BAP n kh năng t o a ch i t lá m m h t chín........... 87
3.5.1.3. nh hư ng c a hocmon sinh trư ng GA3 t i kh năng kéo dài ch i ................... 89
3.5.1.4. nh hư ng c a IBA n hi u qu t o r ................................................... 91
3.5.1.5. Xác nh giá th thích h p cho ra cây in vitro.......................................... 93
3.5.2. K t qu bư c u chuy n gen GUS vào cây u tương DT84...................... 94
3.5.3. K t qu chuy n c u trúc gen ch u h n vào u tương .................................. 96
K T LU N VÀ NGH ................................................................................. 99
TÀI LI U THAM KH O ................................................................................ 102

3
DANH M C B NG
Trang
B ng 1.1 Di n tích s n xu t u tương m t s qu c gia trên th gi i 7
B ng 1.2 S n lư ng u tương m t s qu c gia trên th gi i 7
B ng 1.3 Năng su t u tương m t s qu c gia trên th gi i 8
B ng 1.4 S n lư ng u tương t i các t nh và thành ph 9
B ng 1.5 Cây chuy n gen mang gen P5CS 29
B ng 2.1 Thành ph n dung d ch m tách chi t 45
B ng 2.2 Thành ph n ph n ng PCR 46
B ng 2.3 Thành ph n ph n ng OE -PCR 46
B ng 2.4 Thành ph n ph n ng g n gen/promoter vào vector tách dòng 47
B ng 2.5 Thành ph n hoá ch t tách plasmid 48
B ng 2.6 Thành ph n ph n ng colony - PCR 49
B ng 2.7 Thành ph n ph n ng c t rd29A và vector pBI 101 b ng
BamHI và HindII
50
B ng 2.8 Thành ph n ph n ng ghép n i rd29A :: pBI 101 50
B ng 2.9 Thành ph n ph n ng c t rd29A:: P5CSM b ng BamHI và SacI 50
B ng 2.10 Thành ph n ph n ng ghép n i rd29A:: pBI 101 51
B ng 2.11 Thành ph n ph n ng c t plasmid rd29A :: pBI101 ::P5CSM 52
B ng 3.1 Các gi ng u tương a phương sưu t p t i t nh Sơn La 53
B ng 3.2 Ch s ch u h n và t l tăng hàm lư ng prolin c a 7 gi ng u
tương nghiên c u
57
B ng 3.3 V trí và trình t nucleotid c a các m i c hi u gen P5CS 58
B ng 3.4 V trí sai khác trong trình t nucleotid c a gen P5CS 3 gi ng
u tương
64
B ng 3.5 V trí sai khác trong trình t axit amin c a gen P5CS 3 gi ng
u tương
65
B ng 3.6 V trí và trình t nucleotid c a các m i c hi u gen P5CS 69
B ng 3.7 Hàm lư ng prolin tích lũy trong các dòng thu c lá nghiên c u
(µmol/g)
82

4
B ng 3.8 nh hư ng c a th i gian kh trùng b ng javen n kh năng
n y m m u tương DT84
85
B ng 3.9 nh hư ng c a th i gian kh trùng b ng khí clo n kh năng
n y m m u tương DT84
86
B ng 3.10 nh hư ng c a BAP t i kh năng t o a ch i 88
B ng 3.11 nh hư ng c a GA3 n kh năng kéo dài ch i 90
B ng 3.12 nh hư ng c a IBA n kh năng t o r 92
B ng 3.13 T l tái sinh/ s ng sót c a các m u qua các giai o n 97

5
DANH M C HÌNH
Trang
Hình 1.1 Chu trình sinh t ng h p prolin th c v t b c cao 22
Hình 1.2 Cơ ch và các tác nhân i u hòa quá trình trao i prolin
th c v t
23
Hình 1.3 Vai trò c a prolin i v i tính ch ng ch u c a cây 25
Hình 2.1 Sơ thí nghi m tái sinh cây u tương 42
Hình 2.2
Hình 2.3
Sơ chuy n gen vào cây u tương qua nách lá m m
T o vector chuy n gen mang promoter rd 29A
43
49
Hình 3.1 th bi u di n kh năng ch u h n tương i c a m t s gi ng
u tương a phương và gi ng DT84
56
Hình 3.2 S n ph m tách RNA 59
Hình 3.3 K t qu nhân hai o n gen P5CS t 2 gi ng u tương DT84
và SL5
59
Hình 3.4 K t qu PCR ghép n i hai o n gen P5CS t 2 gi ng u
tương DT84 và SL5
60
Hình 3.5 K t qu tách dòng gen P5CS t 2 gi ng u tương DT84 và
SL5
62
Hình 3.6 Trình t nucleotid c a gen P5CS 3 gi ng u tương 64
Hình 3.7 Trình t axit amin c a Protein do gen P5CS mã hóa 3 gi ng
u tương
67
Hình 3.8 M c tương ng c a các axit amin gen P5CS mã hóa c a
các gi ng u tương.
68
Hình 3.9 Sơ cây phát sinh ch ng lo i so sánh m c tương ng
c a các axit amin c a protein do gen P5CS c a các gi ng u
68
Hình 3.10 i n di s n ph m PCR 70
Hình 3.11 Ph n ng n i hai o n gen theo phương pháp OE-PCR v i
c p m i BamHI-P5CS và Sacl -P5CS
70
Hình 3.12 i n di s n ph m c t plasmid tái t h p b ng enzym c t gi i
h n BamHI
71
Hình 3.13 Phân tích, so sánh trình t nucleotid và phát hi n t bi n t i
v trí nucleotid 374 c a gen P5CS
71

6
Hình 3.14 K t qu nuôi c y invitro cây Arabidopsis thaliana 72
Hình 3.15 i n di s n ph m PCR và c t h n ch vector pBT/rd29A 73
Hình 3.16 Phân tích trình t promoter rd29A 74
Hình 3.17 Sơ thi t k vector chuy n gen mang c u trúc rd29A 75
Hình 3.18 i n di s n ph m PCR và c t h n ch vector pBI101/rd29A 75
Hình 3.19 M t s hình nh chuy n c u trúc promoter rd29A vào thu c lá 76
Hình 3.20 Bi u hi n gen GUS trên cây chuy n gen 77
Hình 2.21 Ho t tính c a enzym GUS các dòng cây thu c lá chuy n gen
mang promoter rd29A dư i i u ki n h n nhân t o 78
Hình 3.22 Các s n ph m c t ng th i b ng enzym BamHI và SacI 79
Hình 3.23 i n di s n ph m cloning PCR và c t h n ch vector pBT
rd29A::/P5CSM
80
Hình 3.24 K t qu colny PCR ch n dòng trong A. tumefaciens 81
Hình 3.25 K t qu PCR các dòng chuy n gen b ng c p m i rd29A
for/rd29Arev
82
Hình 3.26 Hàm lư ng prolin tích lũy trong các th i gian gây h n nhân t o 83
Hình 3.27 Các dòng cây thu c lá sau 20 ngày h n nhân t o (A) và sau
ph c h i (B)
84
Hình 3.28 H t n y m m b ng các phương pháp kh trùng khác nhau 87
Hình 3.29 C m ch i hình thành trên môi trư ng có n ng BAP khác nhau 89
Hình 3.30 Ch i kéo dài trên môi trư ng có n ng GA3 khác nhau 90
Hình 3.31 nh hư ng c a IBA t i vi c hình thành r cây in vitro 93
Hình 3.32 Hu n luy n cây, tr ng nhà lư i và thu ho ch qu 94
Hình 3.33
Hình 3.34
Bi u hi n c a gen GUS
Sơ hoàn ch nh chuy n gen vào cây u tương qua nách lá
m m
95
96
Hình 3.35 Hình nh minh h a quá trình chuy n gen 97
Hình 3.36 Ki m tra cây u tương T0 chuy n gen b ng PCR 98
Hình 3.37 Cây u tương T0 chuy n gen 98

1
M U
1. t v n
Cây u tương (Glycine max L. Merrill) là m t trong nh ng cây tr ng quan tr ng
không ch Vi t Nam mà còn i v i nhi u qu c gia trên th gi i. H t u tương có
th ư c dùng làm ngu n th c ăn giàu m cho con ngư i và là ngu n nguyên li u
quan tr ng cho nhi u ngành công nghi p ch bi n. u tương là lo i cây tr ng ng n
ngày, có giá tr kinh t cao khi s d ng làm thương ph m, và ư c s d ng cho m c
ích c i t o t. Bên c nh ó, u tương r t d canh tác, có kh năng thích nghi v i
nhi u vùng sinh thái, khí h u khác nhau và ư c tr ng nhi u vùng qu c gia và vùng
lãnh th v i s n lư ng năm 2009 là trên 222 tri u t n [107].
T i Vi t Nam, cây u tương cũng gi vai trò r t quan tr ng trong cơ c u cây
tr ng nhi u a phương, v i s n lư ng trung bình t 2001 - 2009 là 239,1 nghìn t n.
Theo th ng kê năm 2009 cho th y, cây u tương ư c canh tác có h th ng trên di n
tích là 146,2 nghìn ha 28 t nh thành tr i u t B c vào Nam, nhưng t p trung ch
y u v n là mi n B c v i s n lư ng c a c nư c là 213,6 nghìn t n [107]. Trong khu
v c ASEAN, năng su t u tương năm 2009 c a Vi t Nam ng th 3 trong s 6 nư c
tr ng u tương là Campuchia, Lào, Myanmar, Philipin, Thái Lan và Vi t Nam. Tuy
nhiên so v i các trung tâm s n xu t u tương c a th gi i là Argentina, Brazil và Hoa
Kỳ thì s n lư ng u tương c a nư c ta còn khá th p [107]. Vì th , áp ng nhu
c u trong nư c nên chúng ta ph i nh p kh u u tương v i s lư ng l n t các qu c
gia bên ngoài c bi t là Hoa Kỳ.
Tình tr ng h n hán nh hư ng t i tình hình s n xu t u tương không ch
Vi t Nam mà ngay c nh ng nư c s n xu t u tương hàng u th gi i như
Argentina. Th ng kê cho th y, s n lư ng u tương c a Argentina vào v mùa năm
2009 gi m t 34,5 tri u t n so v i cùng th i i m năm 2008 là 46,2 tri u t n. Vi t
Nam, tình hình thi u nư c tr m tr ng t i các a phương làm cho s n lư ng u tương
c a năm 2009 gi m xu ng ch còn 213,6 nghìn t n so v i năm 2007 là 275,2 nghìn t n
và năm 2008 là 267,6 nghìn t n [106]. u tương là cây tr ng thu c nhóm cây có kh

2
năng ch u h n kém. Chính vì v y nghiên c u t o gi ng u tương có kh năng s ng
trong i u ki n b t l i v nư c ang là hư ng nghiên c u r t ư c quan tâm c a các
nhà ch n gi ng. Vi t Nam, nhi u gi ng u tương có kh năng ch ng ch u h n ã
ư c ch n t o thành công và ang ư c tri n khai canh tác m t s a phương. Có
th k n các gi ng DT96, DT2008 do các nhà khoa h c t i Vi n Di truy n Nông
nghi p, Vi n Khoa h c Nông nghi p Vi t Nam ch n t o. Dòng u tương ML48,
ML61 do tác gi Chu Hoàng M u ch n t o có kh năng ch u h n cao [15]. Tuy nhiên
các phương pháp ch n gi ng truy n th ng t n nhi u th i gian, ph c t p và c n ph i có
qu n th l n và không n nh. Nh ng như c i m c a phương pháp truy n th ng
có th ư c kh c ph c b ng vi c áp d ng các k thu t m i c a công ngh sinh h c. K
thu t chuy n gen th c v t thông qua vi khu n Agrobacterium tumefaciens ã ư c
các nhà khoa h c trên th gi i ng d ng và t ư c nh ng k t qu r t có tri n v ng
trên cây u tương. Vi t Nam, nhóm nghiên c u c a Tr n Th Cúc Hòa t i Vi n
nghiên c u lúa ng b ng sông C u Long ã thành công trong vi c t o ra các gi ng
u tương m i mang tính kháng sâu b nh [9]. Tuy nhiên, cho n nay công trình
nghiên c u v chuy n gen ch u h n vào cây u tương v n chưa ư c quan tâm úng
m c. Xu t phát t nh ng lý do trên, chúng tôi ti n hành tài lu n án ti n sĩ là: “Phân
l p, t o t bi n i m gen P5CS liên quan n tính ch u h n và th nghi m
chuy n vào cây u tương Vi t Nam”
2. M c tiêu nghiên c u
2.1. So sánh trình t gen mã hóa P5CS c a gi ng a phương thu c nhóm ch u h n t t
và gi ng u tương DT84. T o ư c t bi n lo i b hi u ng c ch ph n h i b i
prolin.
2.2. T o ư c vector chuy n gen mang c u trúc liên quan n tính ch u h n cây u
tương.
2.3. T o cây u tương mang c u trúc gen liên quan n c tính ch u h n.
3. N i dung nghiên c u
3.1. Phân tích c i m sinh lý, hóa sinh c a m t s gi ng u tương tr ng t i khu v c
mi n B c.

3
3.2. Phân l p và xác nh trình t gen mã hóa enzyme pyroline-5 carboxylate synthetase
(P5CS).
3.3. T o t bi n lo i b hi u ng c ch ph n h i (feedback inhibition) b i prolin
b ng phương pháp t o t bi n i m.
3.4. Phân l p promoter c m ng dư i i u ki n khô h n rd29A t cây Arabidopsis
thaliana. Phân tích ho t ng c a promoter d a vào ho t ng c a gen GUS các
dòng cây thu c lá chuy n gen.
3.5. Thi t k c u trúc mang gen P5CS t bi n ư c i u khi n b i promoter rd29A và
chuy n c u trúc này vào cây thu c lá.
3.6. Phân tích các ch tiêu hóa sinh và kh năng ch ng ch u c a các dòng thu c lá
trong i u ki n gây h n nhân t o.
3.7. Bi n n p c u trúc mang gen P5CS vào cây u tương thông qua vi khu n
Agrobacterium tumefaciens. Phân tích s có m t c a gen bi n n p.

4
Chương 1
T NG QUAN TÀI LI U
1.1. CÂY U TƯƠNG (GLYCINE MAX L. MERRILL), GIÁ TR KINH T
VÀ GIÁ TR S D NG
1.1.1. Ngu n g c và phân lo i
Cây u tương là m t trong nh ng loài cây tr ng ư c bi t n t r t s m.
Các b ng ch ng v l ch s , a lý và kh o c h c ch ra r ng u tương có ngu n
g c t Trung Qu c. Cây u tương ư c thu n hóa và tr ng làm cây th c ph m
Trung Qu c vào kho ng th k XVII trư c công nguyên. Cây u tương ư c
truy n bá sang Nh t B n vào kho ng th k th VIII, du nh p vào nhi u nư c Châu
Á khác như: Indonesia, Philippin, Thái Lan, n , Vi t Nam,… vài th k sau ó.
Cây u tương ư c tr ng Châu Âu vào th k XVII và Hoa Kỳ th k XVIII .
Cây u tương thu c b Phaseoleae, h u Fabaceae, h ph cánh bư m
Papilionoideae, chi Glycine v i tên khoa h c là Glycine max (L.) Merrill. Tuy nhiên
theo Hymowit và Newell (1984) thì ngoài chi Glycine còn có chi ph Soja. Chi
Glycine ư c chia thành 7 loài hoang d i lâu năm, chi Soja g m 2 loài trong ó có loài
u tương tr ng Glycine max L. Merrill (Ngô Th Dân và tg, 1999) [6], (Tr n Văn
i n, 2007) [8].
1.1.2. c i m sinh h c
u tương là cây hai lá m m, thân th o. Thân cây có nhi u lông nh , khi còn
non thân có màu xanh ho c tím, khi v già chuy n màu nâu nh t. Màu s c c a thân cây
cho ta bi t màu c a hoa sau này, n u thân có màu xanh hoa s có màu tr ng, n u thân
có màu tím thì sau hoa s có màu tím , chi u cao c a thân t 0,3 - 1m tùy theo
gi ng.
Cây u tương có ba lo i lá: lá m m, lá ơn, lá kép. M i lá kép thư ng có 3
thuỳ (lá chét), lá kép m c so le, trên phi n lá có nhi u lông tơ. Hình d ng c a lá thay
i theo gi ng, nh ng gi ng có lá dài và nh ch u h n t t, nhưng cho năng su t th p,
nh ng gi ng lá to thư ng cho năng su t cao hơn nhưng cũng ch u h n kém hơn.

5
Hoa u tương ư c phát sinh t nách lá, u cành ho c u thân. Hoa m c
thành chùm, m i chùm thư ng có t 3 - 5 hoa. Hoa lư ng tính nên u tương là cây t
th ph n, t l giao ph n r t th p ch chi m 0,5 - 1%.
Qu u tương th ng ho c hơi cong, dài t 2 - 7cm. M i qu thư ng có 2 - 3
h t. H t u tương có hình tròn, b u d c…, nh ng gi ng có h t màu vàng có giá tr
thương ph m cao. Kh i lư ng 1000 h t dao ng trung bình t 100 - 200g. Hình d ng
và màu s c c a r n h t c trưng cho m i gi ng.
B r u tương g m r chính và r ph . Trên r có r t nhi u n t s n, ó là k t
qu c a s c ng sinh gi a vi khu n Rhizobium japonicum v i r . N t s n có th dài
1cm, ư ng kính 5 - 6mm, khi m i hình thành nó có màu tr ng s a, khi phát tri n t t
nh t n t s n có màu h ng. N t s n t p trung nhi u t ng t có sâu t 0 - 20cm, có
vai trò quan tr ng trong vi c c nh m t nitơ không khí, v i lư ng m cung c p
cho cây kho ng 30 - 60 kg/ha.
D a vào th i gian sinh trư ng, u tương ư c chia thành các lo i: chín r t
s m: thu ho ch sau 80-90 ngày; chín s m: thu ho ch sau 90 - 100 ngày; chín trung
bình: thu ho ch sau 100 - 110 ngày; chín mu n trung bình: thu ho ch sau 110 - 120
ngày; chín mu n: thu ho ch sau 130 - 140 ngày; chín r t mu n: thu ho ch sau 140 -
150 ngày (Ngô Th Dân và tg, 1999) [6], (Tr n Văn i n, 2007) [8].
1.1.3. Giá tr kinh t và giá tr s d ng c a cây u tương
u tương là cây tr ng ng n ngày có giá tr kinh t cao, s n ph m c a nó ư c
dùng làm th c ph m cho con ngư i, th c ăn cho gia súc, nguyên li u cho công nghi p,
làm hàng xu t kh u và là loài cây c i t o t tr ng r t t t. u tương ư c xem là ông
hoàng trong các cây h u vì giá tr r t toàn di n c a nó (Tr n Văn i n, 2007) [8].
Giá tr v m t th c ph m: Hàm lư ng protein trong u tương cao hơn trong cá, th t và
cao g p 2 l n các lo i u khác, protein trong h t u chi m kho ng 35 - 50% (ph
thu c vào gi ng và i u ki n chăm sóc), d tiêu hóa hơn th t và không có thành ph n
t o cholesteron. u tương còn ư c xem là cây cung c p d u th c v t quan tr ng,
lipit u tương ch a thành ph n các axit béo không no cao, t ng s ch t béo chi m
kho ng 18%. Trong h t u tương còn ch a nhi u lo i vitamin, áng k là các vitamin

6
nhóm B như: B1, B2, B6, vitamin E,… Ngoài ra, nó còn ch a s t, canxi, photpho và
các thành ph n ch t xơ t t cho tiêu hóa.
Giá tr v m t công nghi p: Hi n nay trên th gi i, u tương là cây ng u v cung
c p nguyên li u cho ép d u, d u u tương chi m 50% d u th c v t, d u u tương
khô ch m, ch s i t cao 120 - 127, nhi t ngưng t -15 n -180
C và t d u ngư i ta
có th làm n n, xà phòng, nilon,… u tương còn là nguyên li u c a nhi u ngành công
nghi p khác như: ch bi n cao su nhân t o, m c in, ch t d o, tơ nhân t o, ch t t
l ng,…
Giá tr v m t nông nghi p: Toàn b cây u tương c khi tươi và khô u có th dùng
làm th c ăn cho gia súc. u tương có vai trò quan tr ng trong c i t o t tr ng, m t ha
u tương n u sinh trư ng và phát tri n t t s l i trong t 30 - 60 kg nitơ, thân và lá
v i hàm lư ng m cao có th dùng bón cho t thay cho phân h u cơ. Vi c luân
canh u tương v i cây tr ng khác có th xem là bi n pháp c i t o t tr ng h u hi u.
1.1.4. Tình hình s n xu t u tương trên th gi i và Vi t Nam
Trên th gi i: V i nh ng giá tr kinh t và s d ng c a cây u tương nên ây ư c
xem là m t trong nh ng lo i cây tr ng chi n lư c nhi u qu c gia v i v trí ch ng
sau lúa, ngô và lúa mì. Do có kh năng thích nghi r ng v i các i u ki n khí h u và
sinh thái khác nhau nên u tương ư c tr ng r ng rãi trên c năm châu l c, t p trung
nhi u nh t Châu M , ti p n là Châu Á. Theo th ng kê c a t ch c Lương th c và
Nông nghi p Liên hi p qu c, di n tích gieo tr ng u tương trên th gi i tăng kho ng
3,6 tri u ha trong vòng 4 năm tr l i ây (năm 2006 là 95,2 tri u ha và năm 2009 là
98,8 tri u ha) [107].
Trong ó, Hoa Kỳ là qu c gia có di n tích gieo tr ng cây u tương l n nh t là
30,91 tri u ha ti p n là qu c gia Brazil (21,76 tri u ha) và Argentina (16,77 tri u ha)
vào năm 2009 (B ng 1.1) trong khi ó Vi t Nam ch có 0,15 tri u ha.
M c dù di n tích gieo tr ng cây u tương tăng lên áng k trong các năm tr
l i ây tuy nhiên s n lư ng u tương c a c th gi i l i có nh ng bi n ng khác
nhau gi a các năm. Năm 2006 s n xu t u tương c a c th gi i t 221,9 tri u t n,
năm 2007 gi m xu ng còn 219,5 tri u t n, tăng lên vào năm 2008 là 230,5 tri u t n
nhưng năm 2009 ch còn 222,2 tri u t n.

7
B ng 1.1. Di n tích s n xu t u tương m t s qu c gia trên th gi i
Di n tích gieo tr ng (tri u ha)*
Qu c gia
Năm 2006 Năm 2007 Năm 2008 Năm 2009
Argentina 15,13 15,98 16,39 16,77
Brazil 22,05 20,57 21,06 21,76
Trung Qu c 9,30 8,75 9,13 8,80
n 8,33 8,88 9,52 9,60
Indonesia 0,58 0,46 0,59 0,72
Thái Lan 0,14 0,13 0,12 0,11
Hoa Kỳ 30,19 25,96 30,22 30,91
Vi t Nam 0,19 0,19 0,19 0,15
* Theo s li u th ng kê c a T ch c Lương th c và Nông nghi p Liên hi p qu c (FAO)
[107].
Năm 2009, Hoa Kỳ là qu c gia s n xu t u tương nhi u nh t th gi i v i 91,42 tri u t n,
ti p theo là Brazil v i 56,96 tri u t n và Argentina là 30,99 tri u t n [107] (B ng 1.2).
B ng 1.2. S n lư ng u tương m t s qu c gia trên th gi i
S n lư ng (tri u t n)*
Qu c gia
Năm 2006 Năm 2007 Năm 2008 Năm 2009
Argentina 40,54 47,48 46,24 30,99
Brazil 52,46 57,86 59,24 56,96
Trung Qu c 15,50 12,73 15.55 14,50
n 8,86 10,97 9,91 10,22
Indonesia 0,75 0,59 0,78 0,97
Thái Lan 0,21 0,20 0,19 0,19
Hoa Kỳ 87,00 72,86 80,75 91,42
Vi t Nam 0,26 0,28 0,27 0,21
[107].
Trong b n năm tr l i ây năng su t cao nh t t ư c vào năm 2007 là 24,3 t /ha
và th p nh t là năm 2009 là 22,4 t /ha. Trong s các qu c gia tr ng cây u tương hàng
u th gi i ch duy nh t Hoa Kỳ v n duy trì ư c năng su t cây u tương th m chí có

8
ph n tăng vào năm 2009 so v i các năm 2006, 2007 và 2008 (B ng 1.3). Argentina là
nư c có năng su t u tương gi m m nh nh t vào năm 2009 ch còn 18,48 t /ha so v i
các năm trư c trung bình t kho ng 27 t /ha (B ng 1.3).
B ng 1.3. Năng su t u tương m t s qu c gia trên th gi i
Năng su t (t /ha)*
Qu c gia
Năm 2006 Năm 2007 Năm 2008 Năm 2009
Argentina 26,79 29,71 28,22 18,48
Brazil 23,80 28,13 28,13 26,18
Trung Qu c 16,66 14,54 17,03 16,48
n 10,63 12,35 10,40 10,64
Indonesia 12,88 12,91 13,12 13,48
Thái Lan 15,60 15,93 15,99 16,33
Hoa Kỳ 28,82 28,07 26,72 29,58
Vi t Nam 13,91 14,70 14,03 14,61
[107].
Có th k n nhi u nguyên nhân làm cho năng su t và s n lư ng u tương
không n nh trong m t vài năm tr l i ây trên th gi i và t i các qu c gia tr ng
u tương là do d ch b nh, k thu t canh tác nhưng áng chú ý nh t ph i k n là do
tình hình bi n i khí h u và h n là m t y u t có nh hư ng không nh n s n xu t
u tương trên th gi i. H n hán hay v n không ch ng ư c ngu n nư c làm
gi m t i 40% ph n năng su t c a cây u tương. Theo th ng kê c a cơ quan nông
nghi p Hoa Kỳ thì s n lư ng u tương c a Argentina hơn 10 tri u t n vào năm 2009,
trong ó năng su t kho ng 10 t /ha. Nguyên nhân gây ra tình tr ng này chính là do
tình tr ng h n hán t i m t s nư c Châu M Latinh trong ó có Argentina (B ng 1.3).
Do s suy gi m năng su t và s n lư ng t i hai qu c gia hàng u v s n xu t u
tương là Brazil và Argentina nên ã nh hư ng n s n lư ng u tương c a c th
gi i (B ng 1.3).
Vi t Nam: u tương ư c gieo tr ng t lâu i, trư c cây u xanh và u en.
Tuy nhiên, v i các phương pháp canh tác truy n th ng, b gi ng có năng su t th p,
s n xu t nh l , giá thành u tương trong nư c không có kh năng c nh tranh v i u
tương nh p kh u là lý do khi n cho nông dân không m n mà v i cây u tương. Di n
tích tr ng u tương tăng qua các năm nhưng v n ch chi m m t t l nh (1,5 - 1,6%
t ng di n tích cây nông nghi p).

9
B ng 1.4. S n lư ng s n xu t u tương t i các t nh và thành ph
S n lư ng các a phương (nghìn t n)*
Các a phương
2006 2007 2008 2009
Hà N i 2,1 2,1 43,9 11,8
Hà Tây 47,7 51,7
Vĩnh Phúc 10,2 6,4 10,5 4,2
B c Ninh 2,9 3,2 4,0 4,1
Qu ng Ninh 1,1 1,1 1,1 1,3
H i Dương 2,9 2,5 2,3 2,7
Hưng Yên 8,4 7,9 6,9 5,8
Thái Bình 12,4 13,8 14,0 16,8
Hà Nam 11,1 12,0 13,0 2,1
Nam nh 5,3 5,6 5,4 4,0
Hà Giang 14,1 14,1 20,4 23,7
Cao B ng 4,4 5,2 5,1 4,1
B c K n 2,9 2,8 3,6 4,0
Tuyên Quang 3,2 4,1 4,5 3,9
Lào Cai 4,7 5,4 4,9 5,3
Thái Nguyên 3,6 3,1 2,8 2,5
L ng Sơn 2,0 3,0 2,7 2,2
B c Giang 4,5 3,4 3,1 3,0
i n Biên 10,7 11,2 13,0 11,7
Lai Châu 1,7 1,8 2,1 2,4
Sơn La 11,1 11,5 10,0 9,8
Hoà Bình 3,4 4,3 3,6 1,9
Thanh Hóa 6,6 7,6 6,3 7,4
k L k 10,4 11,3 11,2 10,4
k Nông 26,7 30,3 30,5 33,2
ng Nai 3,2 3,2 2,1 1,5
ng Tháp 14,0 16,6 13,7 10,7
An Giang 2,8 3,1 2,0 1,6
* Theo s li u c a T ng C c Th ng kê [107].
M c dù chưa có nh ng s li u th ng kê c th thi t h i do h n hán gây ra i
v i s n xu t u tương Vi t Nam. Tuy nhiên, khi nhìn vào s li u th ng kê s n

10
lư ng u tương t i các t nh và thành ph c a Vi t Nam có th th y r ng t i nhi u khu
v c s n lư ng s n xu t u tương gi m áng k so v i nh ng năm trư c ây, thêm vào
ó k t h p v i nh ng thông tin v tình hình th i ti t b t thư ng trong vòng 3 năm tr
l i ây có th th y r ng bên c nh nh ng y u t b t l i sinh h c và phi sinh h c khác
thì h n hán cũng ã nh hư ng không nh t i s n lư ng u tương m t s t nh thành
nói riêng và do ó nh hư ng n s n lư ng s n xu t u tương c a c nư c nói
chung.
K t h p v i nh ng s li u th ng kê c th v s n lư ng u tương các qu c
gia trên th gi i và ánh giá tình hình s n xu t u tương t i Vi t Nam trong vòng 4
năm tr l i ây có th kh ng nh r ng, v n nâng cao kh năng kháng h n tr nên
c p thi t i v i cây u tương. Thêm vào ó nh ng nghiên c u này hoàn toàn m i
i v i tình hình nghiên c u cây u tương t i Vi t Nam và phù h p v i xu th chung
trên th gi i.
1.2. CƠ S SINH LÝ, HÓA SINH C A C TÍNH CH U H N C A CÂY U
TƯƠNG
Khi g p các i u ki n b t l i v nư c, th c v t có nh ng ph n ng có th
thích ng, sinh trư ng và phát tri n. Các cơ ch này khá a d ng nhưng có th chia
thành ba cơ ch ch o bao g m: cơ ch tr n thoát i u ki n h n (drought escape),
cơ ch tránh h n (drought avoiandgce) và cơ ch ch ng ch u h n (drought tolerance).
Cơ ch tr n thoát i u ki n h n cho phép cây có th hoàn thành chu kì s ng c a mình
trong giai o n ư c cung c p nư c trư c khi h n x y ra. Các gi ng u tương
ng n ngày ư c tr ng khá ph bi n khu v c Nam M ch y u s d ng cơ ch này
thích ng v i các i u ki n b t l i v nư c. Các gi ng này có tính chín s m và b t
u n hoa vào cu i tháng 4 và t o qu trong tháng 5, chính vì th mà các gi ng này
có th hoàn thành chu kì sinh s n c a mình trư c khi tình tr ng khan hi m v nư c
x y ra t tháng 6 t i tháng 8. i v i cơ ch tránh h n thì các gi ng u tương s có
các cơ ch duy trì lư ng nư c trong cơ th trong giai o n h n thông qua vi c
tăng kh năng h p thu nư c t r ho c gi m quá trình thoát hơi nư c các b ph n
khác nhau c a cây. các gi ng u tương có kh năng ch ng ch u h n, thì cây có
th duy trì s c căng c a các mô và t bào, chính vì th các quá trình trao i ch t có

11
th di n ra bình thư ng trong i u ki n lư ng nư c bên ngoài môi trư ng xu ng r t
th p. S c căng c a các mô và t bào c a cây ư c duy trì thông qua vi c t ng h p
m nh các ch t ch ng áp su t th m th u, các ch t trao i (Nguyen và tg, 2007) [68].
1.2.1. Kh năng thích nghi c a b r trong i u ki n h n
1.2.1.1.S phát tri n c a b r
B r là m t trong nh ng b ph n quan tr ng c a cây th c hi n nhi m v l y
nư c cung c p cho các ho t ng s ng và phát tri n c a cơ th th c v t. cây u
tương s thích nghi v i các i u ki n h n hán ch y u thông qua vi c phát tri n r tr
có th tìm ki m các ngu n nư c t các l p t sâu (Taylor và tg, 1978) [93]. Bên
c nh ó h th ng r s i phát tri n cũng giúp cho cây có th vươn t i các l p t có
m cao và tìm ki m các ch t dinh dư ng. M t trong nh ng nhân t chính nh hư ng
n sâu c a r u tương là t s kéo dài r tr (taproot elongation rate). Do r tr
ư c hình thành u tiên u tương, chính vì th vi c xác nh các gi ng u tương
có c tính kéo dài r tr nhanh s cho phép xác nh kh năng âm sâu c a r . S
khác nhau v tính tr ng kéo dài b r các gi ng u tương ã ư c nghiên c u khá
chi ti t trong i u ki n nhà lư i (Kaspar và tg, 1984) [54]. ã ánh giá 105 gi ng
u tương khác nhau cho th y t s kéo dài r tr khác nhau gi a các gi ng vào kho ng
1,3cm/ngày. Nh ng nghiên c u ti p theo trên các gi ng có t s kéo dài r tr cao cho
th y nh ng gi ng này có th l y nư c chi u sâu trên 120cm so v i các gi ng còn l i.
M t vài nghiên c u cũng ã ư c th c hi n i v i h th ng r nhánh c a cây u
tương cho th y trong i u ki n h n s lư ng r nhánh trên ơn v chi u dài r tr tăng
áng k , nhưng chi u dài và ư ng kính r tr không thay i. H n ch v nư c cây
u tương thư ng làm tăng sinh kh i c a r , t ó làm tăng t l r : thân. cây u
tương không ư c tư i nư c thì b r có chi u dài hơn h n cây u tương ư c tư i
nư c (Huck và tg, 1983) [47]. Ngoài ra các nhà khoa h c cũng nh n th y m i tương
quan r t ch t ch i v i nhi u tính tr ng r như kh i lư ng khô, chi u dài t ng s , c u
trúc và s lư ng r nhánh các gi ng ch u h n. Nh ng tính tr ng này thư ng ư c
dùng như các ch tiêu quan tr ng ánh giá và nh n d ng các gi ng u tương có
tính ch u h n. Quá trình sinh trư ng và phát tri n c a cây u tương ư c chia thành
hai giai o n là sinh trư ng sinh dư ng (V) và sinh trư ng sinh s n (R). Giai o n V

12
ư c chia thành VE n VN, trong giai o n VN nh sinh trư ng xu t hi n và các
giai o n VN ư c ánh s ph thu c s lư ng lá bánh t xu t hi n. Giai o n R ư c
chia thành các giai o n t R1 n R8. Trong hai giai o n u R1 và R2 hình thành
hoa, giai o n R3 và R4 là s hình thành qu u tương, các giai o n chín và làm
ch c h t là t R5 t i R8. cây u tương, khi h n hán x y ra các giai o n s m hay
mu n c a giai o n sinh trư ng sinh s n làm tăng m nh s phát tri n b r , c bi t là
h th ng r các l p t sâu. Kh năng phát tri n b r không quá b nh hư ng khi
h n hán x y ra giai o n R4 và R5 (Hoogenboom và tg, 1987) [43]. Trong m t
nghiên c u khác cho th y cây u tương khi b x lý h n giai o n trư c khi ra hoa
s cho năng su t h n cao nh ng cây u tương b x lý h n giai o n sau khi n hoa,
i u này ư c gi i thích là do chúng ã phát tri n b r y thích ng v i i u
ki n h n trư c khi n hoa (Hirasawa và tg, 1994) [39]. Các k t qu này cho th y n u
khi cây u tương phát tri n b r l n nh ng giai o n s m c a quá trình sinh trư ng
sinh dư ng s giúp cho cây có th thích ng t t trong các i u ki n h n.
Các k t qu t các nghiên c u ư c trình bày trên ây cho th y nh ng tính
tr ng b r có th s d ng c i thi n tính ch u h n cây u tương b ng các phương
pháp nhân gi ng thông thư ng. Tuy nhiên, các phương pháp o c các tính tr ng liên
quan n b r thư ng r t khó th c hi n. Thay vào ó các phương pháp phân t s là
công c h tr cho các phương pháp truy n th ng nghiên c u các tính tr ng v r .
Quá trình ch n l c các gen liên quan n các tính tr ng v r bao g m các nghiên c u
sàng l c gen t các cơ s d li u, thi t k m i nhân b n gen, xác nh s a d ng,
phát tri n phương pháp phân tích h gen, xác nh qu n th nghiên c u. Phương pháp
này ã thành công trong vi c xác nh nhi u gen quý quy nh các tính tr ng r lúa
trong i u ki n h n (Valliyodan và tg, 2006) [98]. Thêm vào ó, vi c hi u bi t các cơ
ch sinh lý và quá trình i u hòa di truy n c a s thích nghi c a b r dư i i u ki n
h n s giúp ích cho vi c xác nh các gen c hi u, các quá trình chuy n hóa s
d ng cho vi c nâng cao kh năng ch u h n c a cây u tương b ng phương pháp s
d ng ch th gen ho c k thu t chuy n gen.

13
1.2.1.2. Kh năng c nh nitơ c a cây u tương trong i u ki n h n
Kh năng c nh nitơ các loài cây h u thư ng r t nh y c m i v i tình
tr ng nư c trong t. Trong i u ki n h n, cây u tương không ch gi m kh năng
c nh CO2, gi m s phát tri n lá mà kh năng c nh nitơ cũng b nh hư ng
nghiêm tr ng. K t qu này làm gi m sinh t ng h p protein (Purcell và King, 1996)
[75]. Nhi u nhân t h n ch kh năng c nh nitơ trong i u ki n h n ã ư c xác
nh cây u tương bao g m kh năng s d ng O2 gi m, ngu n carbon t i các n t
s n gi m, ho t tính c a enzym sucrose synthase gi m, hàm lư ng ure và axit amin t
do tăng (King và Purcell, 2005) [56]. c bi t, m i quan h v th năng nư c c a lá và
n t s n ã ư c xác nh cây u tương trong i u ki n h n. Ho t tính c a enzym
nitrogenase gi m 70% trong 4 ngày u tiên khi cây g p h n, trong khi ó quá trình
quang h p gi m kho ng 5%. Ngoài ra, s thi u h t v nư c cũng nh hư ng tr c ti p
n ho t tính c a n t s n thông qua s tăng cư ng tính kháng i v i kh năng
khuy ch tán oxy. Tình tr ng thi u nư c trong t cũng d n t i s tích lũy ure lá
c a cây u tương và h u qu này chính là m t nhân t c ch quá trình hình thành n t
s n.
S thay i v di truy n cũng ư c xác nh các cá th nh y c m v i kh
năng c nh nitơ trong i u ki n h n. Khi so sánh các gi ng u tương có ho c không
có kh năng duy trì tính căng mô (tissue turgidity) dư i i u ki n h n giai o n sinh
trư ng sinh s n cho th y, gi ng có kh năng duy trì tính căng mô t t hơn có năng su t
h t t t hơn v i nh ng gi ng còn l i (Hàm lư ng ure cu ng lá cũng là m t trong
nh ng ch tiêu sàng l c các dòng cây u tương có kh năng tích lũy nitơ t t hơn
trong i u ki n khô h n. B ng vi c sàng l c s lư ng l n (>3000) dòng u tương d a
vào ch tiêu này, 8 dòng u tương có kh năng c nh nitơ t t mang tính ch u h n t t
hơn. Nghiên c u sâu hơn các dòng u tương này, Sinclair và tg (2007) [86] tìm ra
r ng quá trình d hóa ure không ph thu c vào Mn t n t i 6 trong s 8 dòng nghiên
c u. Gi ng u tương Jackson, gi ng kháng h n và có kh năng c nh nitơ cao, ã
ư c dùng làm th b m trong các c p lai t o ra gi ng u tương có năng su t cao
các i u ki n h n. Hai dòng con lai t các c p lai này là ngu n gen t t ư c dùng
c i thi n kh năng c nh nitơ và năng su t trong các i u ki n ng p úng (Sinclair và

14
tg, 2007) [86]. Cho n nay, các nhà khoa h c v n chưa th gi i thích ư c li u kh
năng c nh nitơ trong i u ki n h n có ư c i u hòa m c cơ th c a cây u
tương hay không hay quá trình này ch t n t i khu trú trong n t s n. Chúng ta ã bi t
r ng, tín hi u i u hòa quá trình c nh nitơ là do cơ ch ph n h i b i nitơ (nitrogen
feedback mechanism) bao g m c tr ng thái nitơ thân và lá. King và Purcell (2005)
[56] xu t gi thi t là s k t h p ure và axit aspartic n t s n và quá trình v n
chuy n m t s các axit amin t lá có th tham gia vào cơ ch c ch ph n h i cây
u tương. G n ây m t nghiên c u trên h th ng r phân tách i u ki n h n cho
th y ho t tính c nh nitơ ư c i u khi n m c khu trú (local) hơn là m c
tín hi u nitơ h th ng (Marino và tg, 2007) [64]. Nhi u nghiên c u cũng ang ư c
th c hi n theo hư ng này hi u hơn b n ch t phân t các nhân t h n ch và i u
hòa quá trình c nh nitơ trong i u ki n h n cây u tương.
1.2.2. Các tính tr ng liên quan n s thích ng c a lá cây u tương trong i u
ki n h n
1.2.2.1. Cư ng thoát hơi nư c c a khí kh ng
Cư ng thoái hơi nư c c a khí kh ng là m t trong nh ng tính tr ng sinh lý
c a lá có liên quan ch t ch n kh năng s d ng nư c c a cơ th th c v t khi cây
g p i u ki n khô h n. Khi cây g p b t l i v nư c, cơ th th c v t s th c hi n quá
trình chuy n i t pha trung hòa nư c, mà trong ó vi c s d ng nư c trong cơ th
không tùy thu c vào lư ng nư c bên ngoài, sang pha th c p khi mà vi c s d ng
nư c s liên quan tr c ti p n lư ng nư c bên ngoài (Sinclair và tg, 1986) [85].
Quá trình chuy n hóa này liên quan n vi c gi m cư ng thoát hơi nư c qua khí
kh ng lá và có th x y ra nhi u loài cây khác nhau trong các i u ki n khác nhau.
Cư ng thoát hơi nư c là m t nhân t quan tr ng nh hư ng n s trao i khí và
hơi nư c lá. nh hư ng c a h n hán n s sinh trư ng c a lá, cư ng thoát hơi
nư c và lư ng nư c trong cây ư c nghiên c u khá chi ti t u tương. Chúng ta
bi t r ng, h n hán làm gi m t c m r ng c a lá, cư ng thoát hơi nư c c a khí
kh ng và s c căng c a lá. Trong ó, nó làm tăng hàm lư ng axit abscisic (ABA) lá
và xylem. Nghiên c u này cho th y vi c gi m cư ng thoát hơi nư c c a khí kh ng
x y ra ng th i v i vi c tăng hàm lư ng ABA trong xylem và x y ra trư c khi có

15
nh ng thay i v s c căng c a lá. i u này ch ra r ng các tín hi u hóa h c ABA b t
ngu n t r i u khi n ho t ng c a khí kh ng khi tính tr ng thi u nư c tương i
trong t x y ra (Liu và tg, 2003) [61]. S khác nhau v m t di truy n v kh năng
duy trì khí kh ng m dư i i u ki n b t l i v nư c ã ư c nghiên c u u tương.
Khi so sánh các loài cây h u khác v i cây u tương cho th y, cây u xanh, u
en và u ũa có kh năng i u khi n s óng m khí kh ng t t hơn khi cây b m t
nư c. Các nghiên c u khác cũng ã ch ng minh r t rõ ràng r ng cư ng thoát hơi
nư c c a khí kh ng gi m t l thu n v i s m t nư c cây u tương (Liu và tg,
2005) [62]. Kh năng i u khi n cư ng thoát hơi nư c c a khí kh ng dư i i u
ki n h n là m t c tính sinh lý t t phát hi n các gi ng u tương ch u h n do các
phương pháp o c chính xác ã ư c phát tri n. Tuy nhiên, kh năng di truy n tính
tr ng này cũng là m t y u t r t quan tr ng c n ư c quan tâm.
1.2.2.2. Cư ng thoát hơi nư c c a bi u bì
c tính sinh lý th hai c a lá cũng có th ư c s d ng ánh giá và xác
nh kh năng ch u h n và kh năng sinh trư ng c a cây tr ng trong i u ki n h n ó
là cư ng thoát hơi nư c c a bi u bì c a lá (Epidermal conductance). Cư ng
thoát hơi nư c t ng s c a lá ư c tính b ng t ng c a cư ng thoát hơi nư c c a khí
kh ng và c a m t bi u bì. Khi khí kh ng m , quá trình thoát hơi nư c c a bi u bì
thư ng không ư c tính n khi tính toán cư ng thoát hơi nư c t ng s c a lá. Tuy
nhiên, khi lá b thi u nư c hay b bóng t i, trong các i u ki n này thì khí kh ng
thư ng óng, thì h th ng thoát hơi nư c b m t bi u bì có th vư t qua c cư ng
thoát hơi nư c c a khí kh ng. Trong nh ng i u ki n thi u nư c nghiêm tr ng khi khí
kh ng óng hoàn toàn, cư ng thoát hơi nư c c a bi u bì ư c dùng xác nh
lư ng nư c m t mát c a mô lá. Nhi u lo i th c v t s ng trong môi trư ng khô có
cư ng thoát hơi nư c c a bi u bì r t th p (Riederer và tg, 2001) [77], và nh ng
loài cây tr ng có cư ng thoát hơi nư c c a bi u bì th p thư ng duy trì kh năng
s ng t t và dài hơn trong nh ng i u ki n khô h n (Jovanovi và tg, 1996) [52].
Nghiên c u trên 74 gi ng u tương thu th p t các vùng sinh thái khác nhau cho th y
s khác nhau áng k v cư ng thoát hơi nư c c a bi u bì các gi ng này và có
quan h ch t ch v i môi trư ng mà các gi ng nghiên c u sinh s ng. i u ang quan

16
tâm ó là s khác nhau này không liên quan n s khác nhau v m t khí kh ng
lá. Nh ng gi ng có cư ng thoát hơi nư c c a bi u bì th p có th c i thi n kh năng
phát tri n và sinh trư ng c a lá nh ng i u ki n b t l i v nư c, vì th di n tích lá
ư c duy trì m b o s sinh trư ng c a cây sau khi b h n. Nghiên c u g n ây cho
th y m i tương quan ngh ch (r = -0,74) gi a cư ng thoát hơi nư c c a bi u bì và
hi u qu s d ng nư c trong i u ki n h n, k t qu này d n n m t gi thi t cho r ng
cư ng thoát hơi nư c c a bi u bì th p s là m t ch tiêu áng tin c y v tính ch u
h n (Hufstetler và tg, 2007) [48]. Gi ng u tương d i có cư ng thoát hơi nư c
c a bi u bì th p hơn h n so v i các gi ng u tương canh tác. Trong s các gi ng u
tương ư c gieo tr ng ngày nay, các gi ng khu v c nhi t i có cư ng thoát hơi
nư c c a bi u bì th p nh t và th năng th m th u nh hơn so v i các gi ng khu v c
khí h u ôn hòa, i u này có th là do quá trình ch n l c t nhiên dư i các i u ki n
môi trư ng (James và tg, 2008a) [49]. Nghiên c u trên các qu n th lai cho th y
cư ng thoát hơi nư c c a bi u bì khác nhau m t cách có ý nghĩa dao ng t 60 -
93% (James và tg, 2008b) [50]. Như v y tính tr ng này có tính di truy n khá cao. Tuy
nhiên, kh ng nh tính h u d ng c a các tính tr ng này trong vi c t o ra các gi ng
u tương có tính kháng h n c n nhi u nghiên c u sâu hơn xác nh m i quan h
gi a cư ng thoát hơi nư c c a bi u bì, kh năng duy trì s c căng c a lá và s c s ng
c a cây.
1.2.2.3. M t lông tơ c a lá
H th ng lông tơ c a lá là m t c i m chung c a các loài th c v t ch u h n,
cũng như m t s loài cây tr ng trong ó có u tương. Trong i u ki n h n thì ây là
m t trong nh ng tính tr ng thích nghi quan tr ng c a cây u tương. Các dòng có m t
lông tơ cao có s c sinh trư ng sinh dư ng t t hơn, m t r nhi u hơn và r âm
sâu hơn. M t lông tơ c a lá tăng lên làm tăng tính kháng các l p b m t c a lá lên
t i 50%. Nhi t c a lá gi m, s m t nư c b gi i h n và quá trình quang h p tăng
lên do s thâm nh p c a phóng x th p hơn cũng có liên quan n m t lông tơ c a
lá (Specht và tg, 1985) [87]. Hơn n a, n u h lông tơ càng dày c thì có th làm
gi m hi n tư ng nhi m b nh gây ra b i virus kh m u tương. Tuy nhiên, m t lông
tơ ư c i u khi n b i hai allen là Pd1 và Pd2, tăng lên s t o ra nh ng hi u ng có l i

17
và không có l i v m t nông h c. c bi t, các allen này ã ư c ch ng minh là làm
gi m năng su t h t, làm tr quá trình chín và tăng chi u cao c a cây i kèm v i làm
tăng di n tích tr ng (Specht và tg, 1985) [87]. Chính vì v y, m i liên quan b t l i
gi a m t lông tơ c a lá và năng su t h t c n ư c xem xét trư c khi ưa tính tr ng
này vào các dòng/gi ng u tương quý.
1.2.2.4. Hi u qu s d ng nư c
Hi u qu s d ng nư c c a cây ư c nh nghĩa chung là lư ng sinh kh i tích
lũy trên m t ơn v nư c s d ng. S a d ng v di truy n liên quan n hi u qu s
d ng ư c ã ư c nghiên c u nhi u năm trên nhi u i tư ng cây tr ng bao g m cây
u tương. Hi u qu s d ng nư c cao giúp c i thi n năng su t c a cây tr ng trong
i u ki n h n. M i tương quan thu n gi a hi u qu s d ng nư c và năng su t sinh
kh i t ng s trong i u ki n h n cho th y vi c c i thi n hi u qu s d ng nư c c a
m t cây tr ng có th d n t i năng su t cao n u ch s thu ho ch ư c duy trì. Gi ng
u tương “Young” có hi u qu s d ng nư c tương i cao (4,4g dw/l) trong i u
ki n nhà lư i. Trong m t nghiên c u khác cho th y gi ng u tương “Jackson” tích
lũy sinh kh i t t hơn và lư ng nitơ t ng s cao hơn các gi ng khác trong cùng i u
ki n h n nhân t o. M i tương quan ch t ch gi a ki u gen và năng su t trung bình là
m t b ng ch ng cho th y hi u qu s d ng nư c c a cây u tương có th ư c c i
thi n m t cách ơn gi n b ng cách ch n l c cá th mang ki u gen có năng su t trung
bình cao hơn. Trong m t nghiên c u trên 24 gi ng u tương khác nhau, hi u qu s
d ng nư c dao ng t 2,7g tr ng lư ng khô/kg nư c cho t i 3,4g tr ng lư ng khô/kg
nư c (Hufstetler và tg, 2007) [48]. M t gi thi t ư c t ra là kh năng m khí
kh ng có th ư c i u hòa theo các m c óng c a khí kh ng tùy theo s m t nư c
t có th làm tăng hi u qu s d ng nư c (Liu và tg, 2005) [62]. M c dù có nhi u
k t qu kh quan t ư c theo hư ng này nhưng v n còn nhi u i u không ch c ch n
liên quan n vi c th c hi n các k thu t tư i tiêu các loài cây tr ng khác nhau các
i u ki n môi trư ng khác nhau. Do ó, nh ng hi u bi t sâu s c b n ch t sinh lý quá
trình i u hòa ho t ng khí kh ng và c i thi n hi u qu s d ng nư c khi cây b
h n là c n thi t.

18
M t tính tr ng liên quan n hi u qu s d ng nư c khác ó là hi u qu thoát
hơi, mà ư c nh nghĩa là quá trình ng hóa và tích lũy ch t khô trên m t ơn v
thoát hơi nư c. Quá trình thoát hơi nư c ư c ki m soát b i y u t di truy n và lo i b
lư ng nư c m t mát do s bay hơi c a t, và do v y c n ph i ư c xem như là m t
tính tr ng ti m năng.
1.2.3. áp ng v phương di n hóa sinh c a cây u tương trong i u ki n h n
M t trong nh ng áp ng v phương di n hóa sinh thư ng th y th c v t khi
cây g p tình tr ng khan hi m v nư c, ó là kh năng i u ch nh áp su t th m th u
trong t bào. Áp su t th m th u ư c nh nghĩa là s tích lũy ch ng các ch t trao
i trong mô, th bào c a th c v t duy trì s c căng c a t bào và mô khi lư ng
nư c bên ngoài t bào th t gi m. Áp su t th m th u có th duy trì cư ng thoát hơi
nư c c a khí kh ng và quá trình quang h p trong các trư ng h p th năng nư c th p,
làm ch m quá trình úa c a lá, gi m quá trình héo hoa, kích thích r phát tri n và tăng
cư ng kh năng hút nư c t t (Turner và tg, 2001) [96]. cây u tương áp su t
th m th u c a t bào dao ng t 0,3 t i 1,0 Mpa, dao ng ít hơn so v i u cove
và u pigeon (Turner và tg, 2001) [96]. Trong s 6 loài u tương nghiên c u thì áp
su t th m th u c a lá o ư c giao ng t 0,3 cho t i 0,5 Mpa trong i u ki n gây
h n th c nghi m. Trong m t nghiên c u g n ây các nhà khoa h c ã th o c th
năng th m th u lá c a các gi ng u tương tr ng và u tương d i. K t qu cho th y
th năng th m th u c a lá trong i u ki n hàm lư ng nư c tương i ch là 70% các
gi ng u tương tr ng dao ng t -2,3 cho t i -3,5 Mpa và các loài u tương d i là
-4,3 Mpa. Các nhà khoa h c cũng ã xác nh ư c m i tương quan r t có ý nghĩa (r =
0,98) gi a hàm lư ng nư c tương i c a lá và th năng th m th u tương i trong s
các gi ng u tương nghiên c u, k t qu này ch ra r ng, i v i các gi ng có th năng
th m th u cao hơn thì hàm lư ng nư c tương i c a lá gi m ch m hơn do ó kh
năng duy trì s c căng c a mô dài và m nh hơn trong i u ki n h n (James và tg,
2008b) [50]. H u h t các nghiên c u ư c công b v áp su t th m th u các loài cây
tr ng ch ư c th c hi n ơn thu n b i các o c lá và ch r t ít các nghiên c u ưa
ra ư c m i quan h gi a áp su t th m th u và năng su t cây tr ng. Trên i tư ng
cây lúa mì, ã ch ng minh ư c ti m năng và giá tr c a áp su t th m th u i v i

19
năng su t cây tr ng, cây u răng ng a thì m i quan h gi a áp su t th m th u lá
và năng su t trong i u ki n gi i h n v nư c l i không n nh (Turner và tg, 2001)
[96]. Nghiên c u các dòng u răng ng a thu th p t các khu v c khác nhau trên th
gi i ã ch ng minh ư c r ng s khác nhau v kh năng duy trì áp su t th m th u
loài cây này có kh năng di truy n, nhưng kh năng i u hòa áp su t th m th u l i
không n nh và khác nhau i v i m i v gieo tr ng. Thêm vào ó các nhà khoa h c
cũng nh n th y r ng s khác nhau v kh năng duy trì áp su t th m th u không nh
hư ng nhi u n năng su t trong i u ki n h n c c b hay khi gieo tr ng trong i u
ki n tư i tiêu y . Nh ng k t qu này có th b t ngu n t nguyên nhân là do t p
tính sinh trư ng, m c h n và các c tính c a các gi ng nghiên c u. Ngo i tr duy
nh t mà các nhà khoa h c tin r ng kh năng duy trì áp su t th m th u gi vai trò quan
tr ng, ó là kh năng duy trì áp su t th m th u c a b r do nh hư ng n s c căng
c a r s giúp cho vi c âm sâu vào các l p t và vì v y kh năng thu nh n nư c s
ư c c i thi n hơn cho cây trong các i u ki n h n. Tính tr ng này s là m t tính tr ng
áng ư c quan tâm trong vi c nâng cao kh năng ch ng ch u h n c a cây trong i u
ki n b t l i v nư c. V n chính g p ph i i v i vi c ch n l c các gi ng có kh
năng duy trì áp su t th m th u ó là s gi i h n v s lư ng ngu n gen. M c dù v y,
(Turner và tg, 2001) [96] ã nh n nh r ng s phát tri n các công c ch th phân t
lúa và lúa mì có th ng d ng v i m c ích ch n l c các gi ng có kh năng duy trì
áp su t th m th u m nh cây u tương.
1.2.4. M t s gen liên quan n tính ch u h n c a cây u tương
Trong nh ng năm g n ây, cùng v i s phát tri n c a công ngh sinh h c, các
k thu t di truy n làm tăng kh năng ch ng ch u i u ki n b t l i ã ư c ng d ng
r ng rãi trong c i thi n di truy n c a m t s gi ng cây tr ng khác nhau. Vi c s d ng
các gen liên quan n ch ng ch u ã ư c thi t k chuy n vào h th ng th c v t, c i
thi n m c ch ng ch u các i u ki n b t l i c a m t s gi ng cây tr ng. G n ây các
nghiên c u ã phát hi n r ng s tác ng c a tác nhân b t l i có liên quan n s bi u
hi n c a m t s gen chia làm 3 nhóm chính: (1) nhóm gen mã hóa protein ch c năng
liên quan trong trao i các ch t gây áp su t th m th u, các protein b o v , … (2)
nhóm nhân t i u hòa s phiên mã (transcription factors) và (3) nhóm nhân t tín hi u

20
(signaling factors). th c v t khi b thi u h t nư c s x y ra s ho t hóa phosphoryl
hóa các protein. Có vài protein kinase ã ư c miêu t như nhân t truy n tín hi u
(signal transduction factor) liên quan n ph n ng th m th u th c v t. Trong ó,
SnRK2 (SNF1- related protein kinase 2) là protein kinase liên quan n các ph n ng
thích nghi v i i u ki n b t l i c a môi trư ng và nó i u hòa ho t ng b i ABA
(Umezawa và tg, 2004 [97]; Hiroaki Fujii tg, 2009) [40]. M t s nghiên c u cũng ã
ch ng minh ư c r ng SnRK2.8 (SRK2C) có liên quan n ph n ng i u ki n m t
nư c và siêu bi u hi n gen này có kh năng làm tăng kh năng ch ng ch u i u ki n
khô h n c a cây tr ng (Umezawa và tg, 2004 [97]).
Protein ch u nóng (Hsps) ch u nóng, mu i và nhi t cao, tích t nư c, óng vai
trò quan tr ng vi c b o v t bào (Vierling và tg, 1992 [99],Thomashow 1998 [94]).
Hsps có 5 dòng: Hsp100, Hsp90, Hps 70, Hps 60 và sHps. sHsps không ch ư c nh n
m nh trong ph n ng v i nóng, mà còn v i nư c, mu i, quá trình oxihóa và nhi t
th p (Sabehat và tg, 1998 [78], Hamilton và tg, 2001 [36]). sHsps và Hsps óng vai trò
quan tr ng trong vi c tăng kh năng ch ng ch u trong i u ki n b t l i c a môi trư ng.
Khi cây tr ng g p các i u ki n ngo i c nh b t l i như: nóng, l nh, phèn, m n,
h n,...làm cho t bào b m t nư c. LEA (Late embryogenesis abundant protein) là
lo i protein ư c t ng h p v i s lư ng l n trong giai o n cu i c a quá trình hình
thành phôi, nó là m t trong nh ng nhóm protein quan tr ng liên quan n i u ki n
m t nư c c a t bào, nhóm gen mã hoá lo i protein LEA còn óng vai trò trong s
ch u khô h n c a h t. Khi hi n tư ng m t nư c x y ra, gen LEA phiên mã m t lư ng
l n mARN và protein LEA ư c t ng h p. Ngoài ra LEA không nh ng i u ch nh quá
trình m t nư c sinh lí khi h t chín, mà còn h n ch s m t nư c b t bu c do các i u
ki n ngo i c nh b t l i gây ra (Tr n Th Phương Liên [13], Close T.J, 1997 [25], Porcel
R và tg, 2005) [74]. M c phiên mã c a gen LEA ư c i u khi n b i axit absisis
(ABA) và m t nư c c a t bào, áp su t th m th u trong t bào. Nhi u gen LEA ã
ư c nghiên c u, phân l p, xác nh ch c năng. LEA ư c chia thành các nhóm sau:
nhóm 2-D19, nhóm 2-D11 (còn g i là dehydrin) (Close T.J.1997 [25]), nhóm 3-D7;
nhóm 4-D113; nhóm5-D29; nhóm 6- D95 (Tr n Th Phương Liên và tg, 1999 [13],

21
Close T.J, 1997 [25]). Khi i u ki n m t nư c x y ra, protein LEA ư c t ng h p v i
s lư ng l n, trong ó dehydrin có th chi m t i 1% t ng s protein hoà tan c a h t
(Close T.J, 1997) [25].
P5CS (pyroline-5-carboxylase) là m t trong nh ng enzym ch c năng, liên quan
quá trình t ng h p prolin, m t ch t óng vai trò quan tr ng trong quá trình i u ch nh
áp su t th m th u khi cơ th th c v t s ng trong các i u ki n b t l i như h n, m n
(Kohl và tg, 1988 [59]; Kavi Kishor và tg, 1995 [55]; Peng và tg, 1996 [73]; Hua
và tg, 1997 [46]; Zhang và tg, 1997 [104]; Delauney và Verma, 1993 [30]). Gen
P5CS ã ư c s d ng cho bi n n p làm tăng kh năng ch ng ch u khô h n và m t
nư c m t s lo i cây tr ng (Zhang và tg, 1995 [103]; Hong và tg, 2000 [42]).
Tính ch u h n là tính tr ng a gen, òi h i nh ng nghiên c u t ng th v m t sinh
lý, hóa sinh k t h p v i sinh h c phân t , l p b n gen d a vào các ch th phân t
ng th i v i vi c phân l p các gen liên quan n tính ch u h n trên t ng i tư ng
cây, trong ó, vi c nghiên c u sâu hơn v protein liên quan n tính ch ng ch u v n
luôn c n thi t (Tr n th Phương Liên, 2010) [13].
1.3. PROLIN VÀ VAI TRÒ C A ENZYM P5CS TRONG CON Ư NG SINH T NG
H P PROLIN
1.3.1. Quá trình sinh t ng h p prolin
Sinh t ng h p prolin th c v t b c cao có th ư c th c hi n qua hai con ư ng
ho c t glutamate ho c t ornithine. Prolin ư c t ng h p t glutamate ư c coi là m t
trong nh ng chu trình sinh t ng h p quan tr ng nh t c a cơ th th c v t nh ng i u
ki n sinh lý nh t nh, khi cây b gi i h n v ngu n nitơ hay g p ph i nh ng b t l i v
áp su t th m th u (Csonka và tg, 1988) [26]. Trong khi ó con ư ng sinh t ng h p
prolin thông qua ornithine thư ng x y ra khi cây trong các i u ki n th a nitơ
(Delanuney và Verma, 1993) [30]. Sinh t ng h p prolin th c v t ư c minh h a t i
hình 1.1.

22
Hình 1.1. Chu trình sinh t ng h p prolin th c v t b c cao
(Delanuney và Verma, 1993) [30]
P5CS là enzym gi hai ch c năng, th nh t enzym ho t hóa glutamate tr thành
d ng ho t ng và th hai xúc tác cho ph n ng óng vòng t o ra pyrroline-5-
carboxylate. D n xu t này sau ó s b kh b ng ph n ng xúc tác b i enzym
pyroline-5-carboxylate reductase t o prolin (Hu và tg, 1992) [44].
Trong quá trình sinh t ng h p g c amin c a ornithine có th ư c chuy n thành
glutamic semialdehyde b i s xúc tác c a ornithine aminotransferase ho c thành keto-
aminovalerate b i s xúc tác c a ornithine aminotransferase. Theo con ư ng th
nh t, glutamic semialdehyde s ư c óng vòng t o pyroline-5-carboxylate do ho t
tính c a pyroline-5-carboxylate reductase. con ư ng th hai keto-aminovalerate
ư c óng vòng t o pyroline-2-carboxylate do ho t tính c a pyroline-2-carboxylate
reductase (Hình 1.1). Nh ng phân tích v s bi u hi n c a ornithine aminotransferase
cây u cho th y gen mã hóa cho enzym này bi u hi n r t y u trong i u ki n bình
thư ng và i u ki n b t l i, nhưng trong i u ki n th a nitơ thì gen này bi u hi n r t
m nh (Armengaud và tg, 2004) [20]. Chính vì lý do này mà quá trình t ng h p prolin
t ornithine ư c cho là x y ra trong các i u ki n th a nitơ. M c dù v y, trong m t
vài trư ng h p c bi t như cây c ng t và lá non c a cây Arabidopsis thì hàm
lư ng mRNA c a gen ornithine aminotransferase tăng lên r t m nh các i u ki n b t

23
l i v áp su t th m th u. Vì v y, s tích lũy prolin theo chu trình này cũng ư c coi là
có vai trò i v i tính ch ng ch u c a cây khi g p các i u ki n b t l i v áp su t th m
th u.
1.3.2. i u hòa quá trình trao i prolin th c v t
M c dù quá trình trao i prolin th c v t ã ư c nghiên c u trên 40 năm,
nhưng ki n th c v cơ ch i u hòa quá trình này còn r t h n ch . Hình 1.2 mô t cơ
ch và các tác nhân có vai trò trong quá trình i u hòa trao i prolin th c v t. Quá
trình sinh t ng h p prolin ư c ho t hóa và quá trình d hóa prolin b h n ch khi cây
b x lý b i h n, trong khi ó cung c p nư c tr l i cho cây thì các quá trình này s
ho t ng theo hư ng ngư c l i.
Hình 1.2. Cơ ch và các tác nhân i u hòa quá trình trao i prolin th c v t
(Szabados và tg, 2009) [89]
th c v t, quá trình sinh t ng h p prolin ư c ki m soát b i ho t tính c a hai
gen mã hóa cho enzym P5CS. Hai gen này có tương ng r t cao v trình t mã hóa
nhưng bi u hi n l i r t khác nhau trong nh ng i u ki n khác nhau. cây
Arabidopsis, gen P5CS2 là m t gen “gi nhà” (housekeeping), ho t ng c a gen này
ch y u các mô phân sinh như u r và nh ch i, hoa và các t bào nuôi c y
(Székely và tg, 2008) [90]. C hai gen P5CS u ho t ng các mô phân sinh c a
hoa, ch y u cung c p prolin cho quá trình phát tri n c a hoa (Mattioli và tg,
2009) [65]. Gen P5CS1 c a cây Arabidopsis ho t ng r t m nh và ư c c m ng b i

24
các y u t b t l i v th m th u, m n và nó cũng ư c ho t hóa b i axit abscisic. Ngoài
ra, ho t ng c a gen này và s tích lũy prolin cũng b kích thích b i ánh sáng và b c
ch b i các h p ch t brassinosteroid. Trong i u ki n bình thư ng, enzym phospholip
D (PLD) gi ch c năng như m t ch t i u hòa quá trình tích lũy prolin, trong khi ó
calcium và phospholipase C (PLC) kích thích quá trình phiên mã gen P5CS và s tích
lũy prolin khi cây b b t l i v m n. loài cây ch u m n Thellungiella halophila, PLD
l i là m t ch t i u hòa có tác d ng kích thích và PLC ư c cho là ch t i u hòa có tác
d ng b t ho t s tích lũy prolin trong t bào. Calcium có ch c năng như m t ch t
truy n tín hi u tương tác v i nhân t phiên mã MYB2 ho t hóa s phiên mã c a
gen P5CS1.
Tương t như cơ ch i u hòa quá trình trao i prolin thông qua i u hòa s
phiên mã các gen P5CS, ho t tính c a enzym P5CS cũng ư c ki m soát b i quá trình
trao i. M t trong nh ng ví d i n hình ó là s c ch ngư c ho t tính P5CS b i
prolin (Zhang và tg, 1995) [103]. Khi enzym P5CS không b c ch b i prolin thì s
tích lũy axit amin này s tăng r t m nh trong t bào. Quá trình chuy n hóa P5C thành
prolin không ph i là bư c gi i h n trong chu trình sinh t ng h p prolin, chính vì v y
s i u hòa ho t tính enzym P5CR cho th y s ph c t p trong cơ ch i u hòa s
phiên mã c a gen này. Khi phân tích promoter c a gen P5CR cây Arabidopsis ã xác
nh ư c m t o n trình t có chi u dài 69 nucleotid qui nh ho t ng c hi u mô
c a gen (Hua và tg, 1999) [45]. Tuy nhiên, các nhân t tác ng d ng trans liên k t
v i o n trình t cho n nay v n chưa ư c xác nh.
Trong khi quá trình sinh t ng h p prolin b kích ho t b i ánh sáng và các y u t
b t l i v áp su t th m th u thì quá trình d hóa prolin l i ư c ho t hóa trong i u
ki n không có ánh sáng và trong quá trình cây g p các tác ng b t l i t môi trư ng.
Quá trình này ư c ki m soát b i hai enzym là PDH và P5CDH (Hình 1.2). Quá trình
phiên mã c a gen PDH ư c ho t hóa b i prolin và khi cây ư c cung c p nư c
sau khi b h n, nhưng s phiên mã c a gen l i b c ch khi cây g p i u ki n h n do
ó m b o prolin không b phân gi i khi cơ th g p các i u ki n b t l i t môi
trư ng. S phiên mã c a gen PDH1 b c ch vào ban ngày và ư c ho t hóa vào bu i
t i do ó ho t ng c a gen ngư c v i ho t ng c a gen P5CS1. Phân tích promoter

25
c a gen PDH1 ã xác nh ư c nhân t c m ng v i tr ng thái th m th u và prolin,
và nhân t gi vai trò r t quan tr ng i v i quá trình ho t hóa c a gen (Satoh và tg,
2002) [83]. Y u t phiên mã liên k t v i nhân t trên là h protein giàu leucine
(Leucine Zipper Protein). Phân tích ho t ng c a gen P5CDH cho th y gen bi u hi n
r t y u các mô c a cây Arabidopsis và bi u hi n c a gen tăng lên khi b sung prolin.
Trên promoter c a gen phân l p t Arabidopsis và lúa, các nhà khoa h c cũng xác nh
ư c các nhân t tương t trên promoter c a gen PDH1. Ho t ng c a gen FIS1 mã
hóa cho enzym P5CDH cây lanh b ho t hóa khi cây b nhi m virus và b t n thương.
K t qu phân tích cơ ch i u hòa h u phiên mã (post-transcription) cho th y các o n
i mã t n t i trong t nhiên c a gen P5CDH t o ra các c u trúc c ch RNA nh
(small interfering RNA) ho t hóa cho quá trình c t các phân t RNA c a gen P5CDH,
do v y làm gi m m c phiên mã c a gen khi cây g p các i u ki n b t l i t môi
trư ng. K t qu này cho th y cơ ch c ch ho t ng c a gen m c h u phiên mã
là r t quan tr ng trong vi c i u khi n ho t ng c a gen P5CDH th c v t (Borsani
và tg, 2005) [24].
1.3.3. Vai trò c a s tích lũy prolin i v i tính ch ng ch u c a cây
Prolin ư c xem là m t ch t th m th u có tác d ng b o v các c u trúc n i bào
và các i phân t khi t bào g p các i u ki n b t l i v áp su t th m th u. Tuy nhiên,
s tích lũy prolin có th nh hư ng n tính ch ng ch u c a cơ th th c v t theo nhi u
con ư ng khác nhau. Hình 1.3 khái quát các vai trò c a prolin i v i tính ch ng ch u
th c v t.
Hình 1.3. Sơ mô t vai trò c a prolin i v i tính ch ng ch u c a cây
(Szabados và tg, 2009) [89]

26
Prolin có vai trò như là m t ch t nh hình phân t (molecular chaperone) trong
vi c b o v các c u trúc protein và nâng cao ho t tính c a nhi u lo i enzym khác nhau.
Các ví d i n hình có th k n ó là kh năng n nh ho t tính c a M4 lactate
dehydrogenase khi có các tác ng b t l i v nhi t x y ra; b o v nitrate reductase
khi t bào g p các tác ng b t l i v áp su t th m th u và kim lo i n ng; n nh ho t
ng c a các ribonuclease và protease trong i u ki n n ng arsen ngoài môi trư ng
tăng cao. Nhi u nghiên c u ã ch ng minh vai trò c a prolin như m t ch t ch ng oxy
hóa v i ch c năng phân c t các g c oxy ph n ng (reactive oxygen residues) và b t
ho t các g c oxy t do (singlet oxygen quencher) (Matysik và tg, 2002) [66]. Khi x
lý các t bào n m men b ng prolin cho th y hàm lư ng các g c oxy ph n ng gi m, do
ó làm ch m quá trình gây ch t t bào theo chương trình (programmed cell death). i
v i các t bào ngư i, prolin có th ngăn ng a tác ng c a các ch t có kh năng gây ung
thư, trong khi ó i v i các t bào t o nuôi c y các i u ki n có n ng kim lo i cao
thì prolin có th làm gi m quá trình phân gi i các h p ch t béo. D n ch ng trên cây lúa
cho th y, prolin làm gi m c tính c a th y ngân thông qua quá trình phân c t các g c
oxy ph n ng như hydro peroxide. Hi u ng phá h y c a các g c oxy t do i v i h
th ng quang hóa II có th b c ch b i prolin khi nghiên c u trên h màng thylakoid. Tác
ng c a tia phóng x n các t bào t o và cây thu c lá chuy n gen tăng cư ng tích lũy
prolin cũng b gi m thi u khá m nh (Szavados và tg, 2009) [89].
S tích lũy prolin ã ư c ch ng minh là có tính c hi u loài, tuy nhiên li u s
khác nhau này có liên quan n tính thích ng c a m i loài hay không v n còn là câu
h i m i v i các nhà khoa h c. hai loài cây ch u m n có h hàng v i Arabidopsis
là Thellungiella halophila và Lepidium crassifolium, tích lũy prolin m nh hơn h n so
v i Arabidopsis trong i u ki n m n. S tích lũy prolin c a cây Thellungiella là k t
qu c a s tăng cư ng ho t ng c a gen P5CS và gi m ho t ng c a gen PDH (Taji
và tg, 2004) [92]. Hàm lư ng prolin cao có th c i thi n tính ch u m n loài cây ưa
m n Pancratium maritimum thông qua kh năng n nh ho t ng c a nhi u enzym
kh c và c a b máy luân chuy n protein và kích thích s tích lũy các protein có
ch c năng b o v . Hàm lư ng prolin các loài cây ưa m n khác như Camphorosma
annua và Limonium spp. không cao nhưng thay vào ó các loài này l i tích lũy m nh

27
nhi u ch t th m th u khác như các lo i carbohydrate hay các ch t t ng h p t betain
(Murakeozy và tg, 2003) [67]. Nh ng nghiên c u trên ây cho th y, s tích lũy prolin
thư ng i kèm v i nh ng c tính ch ng ch u các loài cây; vì th có th cho r ng,
quá trình này là giúp tăng cư ng tính ch ng ch u, tuy nhiên ây l i không ph i là
m t y u t quá c n thi t cho s thích ng c a các loài th c v t khác nhau i v i các
i u ki n kh c nghi t t môi trư ng (Szabados và tg, 2009) [89].
1.3.4. Vai trò c a enzym pyrroline-5-carboxylate synthetase i v i tính ch ng
ch u c a cây tr ng
Thu c lá là cây tr ng u tiên ư c chuy n gen P5CS phân l p t cây nho ư c
i u khi n b i promoter 35S. Phân tích các dòng thu c lá chuy n gen này cho th y:
ho t ng c a enzym P5CS r t m nh và hàm lư ng prolin tích lũy tăng lên t 10-18
l n so v i cây i ch ng không chuy n gen. Tăng cư ng tích lũy prolin các dòng
thu c lá này còn kích thích s phát tri n c a sinh kh i r khi cây b x lý m n trong
các i u ki n thí nghi m t i nhà lư i. Do hàm lư ng prolin tăng lên r t m nh các
dòng chuy n gen nên k t qu này cho th y ho t tính c a enzym P5CS gi vai trò quy t
nh t i quá trình sinh t ng h p prolin cây. c bi t hơn, khi b sung thêm nitơ vào
môi trư ng nuôi c y các dòng thu c lá này thì hàm lư ng prolin tăng lên áng k so
v i dòng thu c lá chuy n gen không ư c b sung nitơ. Nh ng nghiên c u enzym
P5CS tinh s ch t cây u xanh cũng cho th y, enzym này b nh hư ng b i hi u ng
c ch ngư c b i prolin và ho t tính c a enzym này gi m t i 50% khi b sung 50mM
prolin ngo i bào. Bên c nh ó, nitơ óng vai trò như là cơ ch t và cũng là s n ph m
cu i cùng c a quá trình trao i prolin và cũng gi ch c năng i u hòa ho t ng c a
prolin. Nghiên c u trên cây Arabidopsis, các nhà khoa h c ã ch ng minh ư c m i
quan h ch t ch gi a ho t ng c a enzym P5CS và s tích lũy prolin trong i u ki n
cây b x lý m n; và hi u ng c ch ngư c c a prolin t i ho t tính c a P5CS cũng b
nh hư ng trong các i u ki n b t l i này. Khi chuy n gen P5CS ã b gây t bi n
lo i b hi u ng c ch ngư c b i prolin vào cây thu c lá, các nhà khoa h c ã nh n
ra r ng các dòng thu c lá chuy n gen này tăng cư ng tích lũy prolin nhi u hơn g p 2
l n so v i các dòng thu c lá ư c chuy n gen P5CS ki u d i. Thêm vào ó, khi x lý
các dòng chuy n gen này v i 200mM NaCl thì kích thích s tích lũy prolin (Hong và

28
tg, 2000) [42]. Nh ng k t qu này là nh ng d n ch ng r t rõ ràng r ng hi u ng c
ch ngư c c a enzym P5CS b i prolin gi vai trò r t quan tr ng i v i quá trình sinh
t ng h p prolin trong c i u ki n bình thư ng và khi cây g p ph i các i u ki n b t
l i v áp su t th m th u. các loài th c v t t ng h p m nh prolin thì cây có tính
ch ng ch u t t hơn so v i các loài th c v t khác trong các i u ki n h n, m n… Ví d
cây lúa chuy n gen P5CS phân l p t cây u có tính kháng m n t t hơn h n các dòng
lúa i ch ng không chuy n gen. Tương t như v y, khi các nhà khoa h c ti n hành
chuy n tr c ti p gen P5CS vào h t ph n c a c a cây lúa mì và ti n hành ki m tra tính
kháng trong i u ki n m n thì cũng cho th y các k t qu tương t như cây lúa. cây
cà r t khi ư c chuy n gen P5CS các dòng cà r t có tính kháng mu i cao hơn t i 6 l n
so v i dòng i ch ng. Nh ng k t qu này không ch ư c ch ng minh th c v t b c
cao mà còn c loài vi t o Chlamydomonas reinhardtii khi ư c chuy n gen P5CS.
Các dòng vi t o chuy n gen tích lũy prolin cao hơn 80% so v i các dòng không
chuy n gen. Nh ng dòng chuy n gen này sinh trư ng nhanh hơn trong môi trư ng có
ch a 100 micromole cadmium và kh năng tích lũy cadmium cao hơn t i 4 l n so v i
dòng i ch ng. G n ây, gen P5CS ư c phân l p thành công t cây lúa và khi ư c
chuy n tr l i lúa nh m tăng cư ng ho t ng c a gen này các nhà khoa h c ã nh n
th y r ng tính ch u m n và ch u l nh ư c c i thi n rõ r t. Promoter c a gen P5CS
cũng ư c nghiên c u khá chi ti t cây Arabidopsis chuy n gen trong i u ki n h n
(Kishor và tg, 2005) [57]. B ng 1.5 trích d n nh ng loài th c v t ã ư c chuy n gen
P5CS và các c i m quan tâm ư c c i thi n.
B n ch t tính kháng mu i cũng ư c các nhà khoa h c nghiên c u trên i
tư ng cây thu c lá Nicotinana plumbaginifolia t bi n b ng phương pháp s d ng
ng v phóng x c a carbon. Các nhà khoa h c sg d ng glutamate mang ion carbon
13 làm cơ ch t cho s t ng h p prolin. Trong i u ki n m n, các dòng t bi n tích
lũy prolin m nh hơn các dòng ki u d i. Nghiên c u ch ra, r ng ho t tính c a các
enzym trong chu trình sinh t ng h p prolin t ornithine và quá trình d hóa prolin
không b nh hư ng và enzym P5CS cũng không b nh hư ng b i hi u ng c ch
ngư c b i prolin do t bi n các dòng thu c lá này.

29
B ng 1.5. Cây chuy n gen P5CS
Tên loài Ki u hình c a cây chuy n gen
Thu c lá Tăng cư ng sinh kh i, lá và h t phát tri n bình thư ng
trong i u ki n mu i
Thu c lá Lo i b hi u ng ph n h i ngư c c a enzym P5CS và
t ng h p prolin nhi u g p 2 l n
Lúa Tăng cư ng sinh kh i trong i u ki n h n và m n
Arabidopsis Cây chuy n gen i mã cho th y cây d b h n và hình
thái cây không bình thư ng trong i u ki n nuôi c y
bình thư ng
Lúa Tăng cư ng tính ch ng ch u oxy hóa trong i u ki n b t
l i v áp su t th m th u
Lúa R sinh trư ng t t hơn và sinh kh i phát tri n trong i u
ki n n ng NaCl là 200 mM
Lúa Cây non chuy n gen bi u hi n tính kháng h n và m n t t
hơn
Lúa mì Cây chuy n gen t ng h p nhi u prolin và ch u m n t t
hơn
Chlamydomonas Dòng chuy n gen tích lũy nhi u prolin hơn t i 80% và
ch ng ch u kim lo i n ng t t hơn
N m men Sinh trư ng gi m trong i u ki n không x lý
Carot Ch ng ch u m n t t hơn
Lúa Ch u l nh và mu i t t hơn
Cây chanh Ch ng ch u h n t t hơn
(Kishor và tg, 2005) [57]
1.4. PROMOTER VÀ VAI TRÒ I U KHI N HO T NG C A GEN
TRONG I U KI N KHÔ H N
1.4.1. C u trúc và ch c năng c a promoter
Promoter là vùng DNA trong gen c a sinh v t có ch c năng kh i u quá
trình phiên mã c a gen. T n d ng ch c năng t nhiên c a promoter, các nhà khoa
h c có th i u khi n ho t ng c a các gen m t cách có ch ích các cá th .

30
các loài sinh v t nhân th c, c u trúc c a m t promoter bao g m các thành ph n
chính như sau: Ph n lõi (Core) promoter
• V trí kh i u phiên mã (TSS)
− V trí kho ng -35
• V trí bám c a RNA polymerase
− RNA-polymerase I: phiên mã gen mã hóa cho RNA ribosome
− RNA-polymerase II: phiên mã gen mã hóa cho mRNA và m t s RNA nhân
nh (small nuclear RNA)
− RNA-polymerase III: phiên mã gen mã hóa cho RNA v n chuy n và nh ng
RNA nh khác
• Ví trí bám c a các nhân t phiên mã
• Ph n c n biên (Proximal) promoter
− V trí kho ng -250
− i m bám c a m t s nhân t phiên mã c bi t
• Ph n ngo i biên (Distal) promoter
− Ví trí xa hơn phía thư ng ngu n (upstream) (ngo i tr enhancer ho c
các vùng i u hòa không ph thu c v trí và chi u)
− i m bám c a m t s nhân t phiên mã c bi t
Promoter là nhân t quan tr ng ph i h p v i enhancer, silencer, nhân t liên k t
trong vi c quy t nh m c bi u hi n c a m t gen nh t nh [108].
1.4.2. Các lo i promoter s d ng trong công ngh sinh h c
Promoter c a sinh v t nhân th c thư ng r t a hình và khó xác nh. Chúng có
th n m cách i m kh i u phiên mã vài kilobase. Ngư i ta thư ng tìm th y h p
TATA trong nhi u promoter c a sinh v t nhân th c. Các liên k t gi a protein v i h p
TATA có tác d ng h tr vi c hình thành ph c h phiên mã c a RNA polymerase.
H p TATA thư ng n m khá g n v trí kh i u phiên mã (trong kho ng 50 base) (H
Huỳnh Thùy Dương, 2005) [7].
Trình t i u hòa promoter c a sinh v t nhân th c thư ng liên k t v i các protein
g i là nhân t phiên mã.

31
Nh ng nghiên c u v promoter ã giúp các nhà khoa h c tìm ra các hư ng m i
nh m i u khi n s ho t ng c a gen. Vi c i sâu vào nghiên c u c u trúc, ch c năng
và các y u t liên quan c a promoter ã cho th y kh năng thay i s bi u hi n gen
trong sinh v t cũng như các gen quan tâm b ng vi c s d ng c u trúc (Promoter +
Gen). Do ó promoter ư c coi như là m t nhân t r t quan tr ng trong vi c ki m soát
quá trình bi u hi n c a gen (Goicoechea và tg, 2005) [34], (Sambrook và tg, 1989)
[81] (Xu và tg, 2004) [101].
Phân lo i các lo i promoter s d ng trong công ngh sinh h c ph thu c vào t ng
lo i gen c th . Các lo i promoter này bao g m:
Nhóm các promoter bi u hi n toàn ph n: Nh ng promoter này i u khi n ho t
ng c a gen quan tâm t t c các mô và t bào. S bi u hi n c a các gen quan tâm
này hoàn toàn không ph thu c vào các y u t tác ng t bên ngoài như môi
trư ng… Chính vì nh ng ưu i m này nên các lo i promoter thu c nhóm này thư ng
ư c dùng v i ph r t r ng các loài và các gi i th c v t khác nhau.
Nhóm các promoter bi u hi n c hi u mô ho c các giai o n phát tri n: Khác
v i nhóm trên, các lo i promoter thu c nhóm này s i u khi n s bi u hi n các gen
quan tâm các mô nh t nh trong cơ th th c v t ho c các giai o n phát tri n nh t
nh c a cây. th c v t, ho t ng c a promoter nh hư ng n s bi u hi n c a các
gen các lo i mô quan tâm bao g m h th ng bó m ch, các mô liên quan n quá
trình quang h p, các cơ quan d tr như c hay h t và các cơ quan sinh s n như
hoa i v i nh ng trư ng h p khác loài (thông thư ng ư c áp d ng cho các loài có
quan h h hàng xa)… Tuy nhiên s bi u hi n c hi u ch thư ng t ư c i v i
các promoter ư c phân l p t các i tư ng nghiên c u có quan h h hàng g n như
cùng loài, chi ho c h . i u này có th là do tương tác c a các y u t phiên mã n s
i u hòa ho t ng c a các promoter (Hai và tg, 2003 [35], (Hawkins và tg, 1997) [37].
Nhóm các promoter c m ng: i m khác bi t c a các promoter thu c nhóm này là
ho t ng c a chúng không ph thu c vào các nhân t n i sinh nhưng l i ph thu c
vào các y u t t môi trư ng bên ngoài hay các y u t kích thích nhân t o. Trong
nhóm này, ho t ng c a nhi u promoter ư c kích ho t b i các nhân t sinh h c như
ánh sáng, n ng oxy, nhi t và các y u t gây t n thương. Bên c nh ó, các lo i

32
promoter ư c kích ho t b i các h p ch t hóa h c cũng ư c quan tâm c bi t,
thư ng không có các cơ th nghiên c u. Trong s này, các promoter ph n ng v i
các nhân t phi sinh h c, kim lo i ng, c n, các nhóm ch t steroid hay các lo i thu c
tr sâu ã ư c ưa vào s d ng i u khi n ho t ng c a các gen quan tâm trong
các i u ki n ch ng.
Nhóm các promoter t ng h p: Các lo i promoter này ư c t o ra b ng cách ghép n i
các vùng cơ b n c a các promoter có ngu n g c khác nhau (Baucher và tg, 1999) [22].
Ngoài các nhóm promoter k trên, có th k n các h th ng bi u hi n khác d a
trên các lo i protein ho t hóa d ng trans (trans-activating). Các h th ng này i u hoà
s bi u hi n c a các gen quan tâm mà không ph thu c vào v trí c a gen ích. Trong
th c t , nhi u lo i promoter c m ng hóa h c liên k t v i các protein ho t hóa d ng
trans và các promoter bi u hi n toàn ph n (Baucher và tg, 1999) [22].
1.4.3. Promoter rd29A
Gen rd29A là m t gen b c m ng bi u hi n dư i các i u ki n b t l i như khô
h n, m n và l nh ã ư c nhi u nhà khoa h c quan tâm. M t s nghiên c u ã phát
hi n ư c trình t promoter rd29A ch a 2 vùng có ho t tính cis là vùng c m ng ABA
(ABRE) và vùng c m ng m t nư c (DRE)/C repeat (CRT). C 2 vùng u liên quan
n s bi u hi n các gen bi u hi n dư i i u ki n b t l i c a môi trư ng (Yamaguchi-
Shinozaki và Shinozaki, 1993 [102]). Nhi u phòng thí nghi m trên th gi i ã phân l p và
ki m tra ho t ng c a promoter rd29A trên nhi u loài cây như A. thaliana, thu c lá và
lúa mì (Sun và Chen, 2002 [88]). C u trúc promoter rd29A i u khi n gen ch th GUS
ư c chuy n vào cây khoai tây, mía. Ho t tính c a GUS u ư c phát hi n trong cây
chuy n gen dư i i u ki n b t l i c a môi trư ng nuôi c y (Zhang et al., 2005) [105].
1.5. NGHIÊN C U NÂNG CAO KH NĂNG CH U H N C A CÂY U
TƯƠNG
1.5.1. Nâng cao kh năng ch u h n c a cây u tương b ng phương pháp t bi n
th c nghi m
D a vào ngu n tác ng mà ngư i ta phân ra t bi n t nhiên hay t bi n gây
t o (Kodym và tg, 2003) [58], d a vào tính ch t bi n i c u trúc c a cơ s v t ch t
di truy n mà ngư i ta chia t bi n thành t bi n gen và t bi n nhi m s c th . t

33
bi n t nhiên phát sinh v i t n s th p, kh c ph c như c i m này ngư i ta ã s
d ng các tác nhân gây t bi n (tác nhân t v t lí, hóa h c) nh m làm tăng t n s lên
10 n 100 nghìn l n t o nguyên li u cho quá trình ch n l c (Kodym và tg, 2003)
[58]. Nghiên c u c i ti n gi ng cây tr ng b ng phương pháp t bi n th c nghi m ra
i t nh ng năm u c a th k 20, nhưng ch 30 năm g n ây m i phát tri n m nh
và có hi u qu trong lĩnh v c tăng năng su t và ph m ch t gi ng cây tr ng, góp ph n
không nh vào i s ng con ngư i. i v i cây u tương t i Vi t Nam, Tr n ình
Long và tg (1995) [14] t o ra gi ng M103, gi ng ư c t o ra t gi ng u tương V70
năm 1978 s d ng phương pháp x lý t bi n b ng ethylenimin n ng 0,01%. Sau
ó, gi ng này ã ư c ch n thu n l i, kh o nghi m và công nh n là gi ng qu c gia.
Gi ng M103 có kh năng ch u nóng t t, ch u sâu b nh m c trung bình, có th gieo
tr ng ư c c 3 v trong năm nhưng thích h p nh t là v hè. Sau 7 năm kh o nghi m
liên t c (1998-2004) t i nhi u vùng sinh thái khác nhau, các tác gi Vi n Di truy n
nông nghi p ã s n xu t thành công gi ng u tương ch u h n m i - DT96 có kh
năng ch u h n t t và cho năng su t cao. Hi n nay gi ng u tương này ang ư c
tr ng khá ph bi n nhi u vùng canh tác và ư c B NN&PTNT công nh n chính
th c là gi ng qu c gia vào tháng 7-2004. Chu Hoàng M u (2001) [15] s d ng tia
gamma, hóa ch t NMU, EI v i các li u lư ng và n ng khác nhau ã t o ư c các
t bi n v hình thái, sinh lý cũng như t bi n c u trúc nhi m s c th , t 60 dòng t
bi n u tương ánh giá và ch n l c qua 5 th h ã thu ư c 4 dòng u tương v i
nh ng c tính nông sinh h c ưu vi t như: chín s m (dòng ML59, ML61), có kh năng
ch u h n (dòng ML48, ML61). Nh ng dòng u tương này ư c gieo tr ng t i nhi u
a phương có i u ki n sinh thái khác nhau.
1.5.2. S d ng công ngh t bào th c v t trong ch n dòng u tương ch u h n
Cơ s khoa h c u tiên c a ch n dòng t bào th c v t là tính toàn năng c a t
bào. M i m t t bào b t kỳ l y t cơ th th c v t u có kh năng ti m tàng phát
tri n thành m t cá th hoàn ch nh. i u này ã ư c các nhà khoa h c ch ng minh qua
nhi u thí nghi m nuôi c y mô và t bào th c v t. Cơ s th hai là mô ho c qu n th t
bào nuôi c y bao g m m t s lư ng l n các t bào không ng nh t. Vì th qu n th t
bào nuôi c y có th xem như qu n th th c v t mà ó cũng di n ra nh ng thay i v
ki u gen, ki u hình và tu i. Khi nh ng t bào ư c tái sinh thành cây s th hi n thay
i ó m c cơ th . Th m chí có nh ng qu n th t bào phát tri n t m t t bào

34
ban u nhưng trong su t quá trình sinh trư ng và phát tri n t bào n khi hình thành
m t cơ th hoàn ch nh có th di n ra nhi u thay i di truy n do nh hư ng c a các
y u t môi trư ng nuôi c y, c bi t là các ch t i u hoà sinh trư ng. T bào nuôi c y
in vitro có t l bi n d di truy n l n (10-5
- 10-8
) vì th có th ch n ư c các cá th t
bi n nhanh hơn và có hi u qu hơn so v i các phương pháp ch n gi ng thông thư ng
khác áp d ng trên cây nguyên v n. K thu t nuôi c y mô và t bào còn cho phép làm
gi m áng k th i gian c n thi t ch n ư c nh ng tính tr ng mong mu n (Nguy n
c Thành, 2000) [18].
H th ng nuôi c y s d ng trong ch n dòng t bào soma bao g m t o mô s o,
Nuôi c y t bào huy n phù và Nuôi c y t bào tr n. Mô s o (Callus) là kh i mô th c
v t g m nh ng t bào chưa phân hoá, có kh năng phân chia liên t c và có tính bi n
ng di truy n cao. Trong nuôi c y in vitro, mô s o ư c t o ra b ng cách nuôi c y
các cơ quan c a th c v t (lá, hoa, qu , thân...) trong môi trư ng và i u ki n nuôi c y
thích h p. Mô s o có th ư c duy trì trên môi trư ng nuôi c y b ng cách c y chuy n
nh kỳ, song vi c c y chuy n nhi u l n có nh hư ng không t t n kh năng tái sinh
cây và làm tăng tính bi n ng di truy n c a mô. Nh ng cây tái sinh t mô s o v i
nh ng bi n i di truy n phong phú có ý nghĩa quan tr ng trong vi c t o ra ngu n
nguyên li u ban u cho quá trình ch n gi ng. Nhi u tác gi ã thu ư c nh ng gi ng
cây tr ng m i b ng con ư ng nuôi c y mô s o. H n ch l n nh t trong ch n dòng
b ng nuôi c y mô s o là ch n l c không tri t do kích thư c kh i mô l n và không
ng nh t. t ư c hi u qu cao ngư i ta ph i s d ng các kh i mô có kích thư c
nh và u nhau, kích thư c thư ng dùng các kh i mô s o có ư ng kính 1-3mm
x lý và ch n dòng ch ng ch u (Lê Tr n Bình và tg, 1998 [2]; inh Th Phòng, 2001
[16]; Dix và tg, 1986 [31]).
Ngư i ta ã s d ng các phương th c ch n dòng t bào như ch n tr c ti p,
ch n gián ti p và ch n t ng th . Hư ng nghiên c u ch n dòng t bào ch ng ch u
th c v t ã thu ư c nhi u thành t u, ó là s thành công t o ra các dòng cây ch u
h n, ch u l nh, ch u nóng. Nhóm nghiên c u c a Vi n Công ngh sinh h c ã t o ư c
2 gi ng lúa DR1 và DR2 v a có kh năng ch u l nh, ch u h n b ng k thu t ch n dòng
t bào và nuôi c y in vitro ( inh Th Phòng, 2001) [16].

35
1.5.3. S d ng k thu t chuy n gen nâng cao kh năng ch u h n c a cây u tương
1.5.3.1. Các phương pháp chuy n gen th c v t
Hi n nay có nhi u phương pháp chuy n gen th c v t ã ư c nghiên c u và
thành công trên nhi u i tư ng gi ng cây tr ng như: chuy n gen thông qua
Agrobacterium tumefaciens, chuy n gen tr c ti p b ng hóa ch t, xung i n, súng b n
gen, chuy n gen b ng vi tiêm, chuy n gen qua ng ph n, chuy n gen b ng dung d ch
h t khô v i dung d ch DNA… Hai phương pháp chuy n gen thành công nh t là
chuy n gen tr c ti p b ng súng b n gen và chuy n gen gián ti p thông qua vi khu n
Agrobacterium tumefaciens.
Chuy n gen tr c ti p b ng súng b n gen
Chuy n gen tr c ti p b ng súng b n gen là phương pháp ưa các gen ngo i lai vào t
bào ch , là k thu t s d ng các viên n là vàng (ho c Vonfam) kích thư c hi n vi (0.5-
5um) có t tr ng cao t gia t c cao xuyên qua v và màng t bào, ưa l p DNA b c ngoài
ti p c n v i b máy di truy n c a t bào. Phương pháp chuy n gen b ng súng b n gen ư c
áp d ng v i nh ng i tư ng mà vi c chuy n gen b ng A. tumefaciens khó th c hi n ư c
(do không m n c m v i A. tumefaciens) hay kh năng tái sinh kém (khi chuy n gen vào t
bào tr n). Phương pháp chuy n gen b ng súng b n gen ư c s d ng r ng rãi sau phương
pháp chuy n gen qua vi khu n Agrobacterium tumefaciens v i các ưu i m là có th áp d ng
v i h u h t các lo i mô và t bào, chuy n DNA ngo i lai vào t bào nhanh, d s d ng v i
quy trình ơn gi n, m t s lư ng l n m u có th ư c x lý trong th i gian ng n, các
vecto ư c thi t k ơn gi n, không òi h i các trình t DNA cho o n T-DNA như
chuy n gen b ng Agrobacterium tumefaciens, c n m t lư ng nh plasmid DNA, bi u hi n
gen t m th i có th ư c quan sát sau vài ngày. Tuy nhiên cũng có như c i m như nhi u
b n sao vào t bào cùng m t lúc, gây khó khăn cho vi c phân tích ch n l c v sau này,
hi u qu chuy n gen th p nhưng chi phí l i cao (Hiei và tg, 1994) [38].
Phương pháp chuy n gen b ng vi khu n Agrobacterium tumefaciens
Phương pháp chuy n gen thông qua Agrobacterium tumefaciens ư c ng d ng
r ng rãi chuy n m t hay nhi u gen vào cây tr ng nh nh ng c tính ưu vi t c a h
th ng chuy n gen này: giúp t o cây tr ng có tính b n v ng cao; có th chuy n m t o n
DNA có kích thư c tương i l n vào th c v t mà không c n thi t b cũng như h th ng

36
nuôi c y ph c t p; s b n copy c a gen chuy n trong cây chuy n gen ít, t o thu n l i cho
vi c phân tích cũng như nghiên c u s bi u hi n c a gen m i trong cây chuy n gen.
Phương pháp chuy n gen b ng Agrobacterium tumefaciens thư ng ư c dùng cho
các lo i cây hai lá m m vì Agrobacterium tumefaciens m n c m v i các lo i cây này. Tuy
nhiên, ngày nay ngư i ta ã tìm ra các ch ng A. tumefaciens m n c m v i cây m t lá m m
trong ó có ngô, lúa và các cây chuy n gen h u th ã nh n ư c. Chuy n gen b ng
Agrobacterium tumefaciens ã ư c nghiên c u thành công b i nhi u tác gi , các y u t
nh hư ng t i hi u qu chuy n gen ã ư c t i ưu hoá như ch ng Agrobacterium
tumefaciens, ki u gen c a t ng loài, gi ng, thành ph n môi trư ng nuôi c y, nhi t ...).
M t nghiên c u u tương ã k t h p hai phương pháp dùng súng b n gen và
Agrobacterium tumefaciens, trư c khi lây nhi m A. tumefaciens mô ư c làm b thương
b ng cách “b n” n không mang gen. Phương pháp này có th cho hi u qu lây nhi m
cao, b i sau khi b “b n” mô t o ph n ng i v i v t thương, t o i u ki n cho lây nhi m
b ng Agrobacterium tumefaciens.
Agrobacterium tumefaciens là loài vi khu n t, có kh năng chuy n m t o n
DNA t Ti plasmid (tumor-inducing plasmid) vào t bào th c v t. Ti plasmid - m t phân
t DNA m ch vòng, s i kép có tr ng lư ng phân t b ng 3-5% so v i tr ng lư ng phân t
c a nhi m s c th vi khu n. Ti plasmid có kích thư c kho ng 200 kb, trong t bào chúng
t n t i như m t ơn v sao chép c l p g m 4 vùng tương ng: A, B, C và D. Vùng A
luôn ư c truy n sang t bào th c v t nên có tên là T-DNA. T i ây có hai h gen: h gen
gây kh i u onc (oncogenic) g m các gen khi ho t ng s s n sinh m t lư ng l n các ch t
kích thích sinh trư ng như auxin, cytokinin t o thành kh i u th c v t; h gen mã hoá
m t s enzym i u khi n quá trình t ng h p các d n su t c a các axit amin hay ư ng,
g i là opin. Vùng B có liên quan n s tái b n. Vùng C liên quan n s ti p h p. Vùng
D ch a các gen vir, gi vai trò quan tr ng trong vi c chuy n T-DNA vào h gen nhân c a
t bào th c v t.
Các vector dùng trong chuy n gen thông qua Agrobacterium tumefaciens là: vector
liên h p và vector nh th , hai lo i vector này ang ư c s d ng r t có hi u qu .
o n T- DNA mu n ư c chuy n, trư c tiên nó ph i ư c ho t hoá b i ho t ng
c a các gen vir. Hi n tư ng này x y ra khi Agrobacterium tumefaciens b t u ti p xúc
v i h p ch t ch a phenol ư c ti t ra t v t thương c a cây ho c t t bào nuôi c y hay

37
protoplast, u tiên là s ho t ng c a các s n ph m ư c t o ra t gen virA. Potein virA
n m màng trong c a t bào Agrobacterium tumefaciens, óng vai trò như m t ch t th
c m i v i acetosyringon có trong môi trư ng. Tín hi u này s ư c truy n d n qua s
ho t hoá gen virG. Protein virG sau ó l i g n vào gen ch huy n m sát trình t kh i ng
thu c các gen vir khác nhau. B ng cách như v y, protein c a gen virG ã ư c ho t hoá
làm tăng quá trình ho t hoá c a chính nó, ng th i làm gi m ho t ng c a các operon
B, C, D và E. Trong ti n trình chuy n T-DNA, giai o n u xu t hi n các v t c t Ti-
plasmid t i hai tr t t biên, v trí gi a bazơ nitơ th ba và th tư c a m ch ơn n m phía
dư i. T ó m t m ch ơn T-DNA ư c gi i phóng ra kh i Ti-plasmid và thay th vào ó
là m t m ch ơn m i ư c t ng h p theo chi u 5’ – 3’, b t u t ch t c a tr t t biên
ph i. i u này gi i thích t i sao u biên ph i c n thi t cho quá trình chuy n T-DNA vào
th c v t. Trong quá trình di chuy n, s i ơn DNA ph i chui qua r t nhi u màng trư c khi
vào ư c n nhân t bào th c v t. Vì v y, gi ư c tình tr ng nguyên v n thì T- DNA
s i ơn ư c g n v i virE. S n ph m c a gen virB n m trên màng t bào vi khu n có
nhi m v chuy n tr c ti p DNA s i ơn sang t bào th c v t. Sau khi T-AND chui ư c
qua màng t bào, chúng i th ng vào nhân và k t h p v i DNA nhân th c v t nh ng v
trí ng u nhiên. T i ó các gen trên T- DNA dư i s i u khi n c a gen th c v t b t u
s n sinh ra auxin, cytokinin, opine d n n s hình thành kh i u trên cơ th th c v t (
Nguy n c Thành, 2000) [18].
1.5.3.2. Ti m năng c a phương pháp chuy n gen th c v t trong nghiên c u t o cây
u tương ch u h n
Nh ng nghiên c u ng d ng k thu t chuy n gen th c v t trong vi c nâng cao
kh năng ch u h n ã t ư c k t qu nhi u loài cây tr ng khác nhau như lúa,
Arabidopsis thalian, b ch dương… Tuy nhiên nh ng nghiên c u tương t u tương
còn khá là m i m không ch trong i u ki n Vi t Nam mà còn c trên th gi i. Các
nghiên c u ng d ng k thu t chuy n gen th c v t ch y u t p trung vào m t s tính
tr ng như ch ng ch u b nh và năng su t (Tr n Th Cúc Hòa, 2007) [9]. Ngoài ra cũng ph i
k n vi c ng d ng k thu t chuy n gen th c v t u tương nh m m c ích t o ra thư
vi n các dòng u tương mang T-DNA ph c v cho các nghiên c u ch c năng gen. Có
th nh n nh r ng tính kh thi và ti m năng ng d ng phương pháp chuy n gen th c v t
như là bi n pháp nâng cao kh năng ch u h n c a cây u tương t i Vi t Nam là r t cao.

38
Chương 2
V T LI U VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U
2.1. V T LI U, HÓA CH T, THI T B
Nguyên li u th c v t
S d ng 17 gi ng u tương làm v t li u nghiên c u, trong ó: 16 gi ng u
tương a phương thu th p t i các huy n c a t nh Sơn La và DT84 do Trung tâm
Nghiên c u Phát tri n u , Vi n Khoa h c Nông nghi p Vi t Nam cung c p.
Arabidopsis thaliana do trư ng i h c T do Vương qu c B cung c p; gi ng
thu c lá Nicotiana tabacum K326 do Phòng Công ngh T bào Th c V t-Vi n Công
ngh sinh h c cung c p.
Ch ng vi khu n và các nguyên li u DNA
Vector pBI 101, Ch ng Agrobacterium tumefaciens EHA 101 mang vector
pPTN289 ch a gen gus intron và gen ch n l c bar kháng ppt do i h c T ng
h p Nebraska, Hoa Kỳ cung c p. Vector tách dòng pBT do phòng Công ngh t bào
th c v t-Vi n Công ngh sinh h c cung c p.
Các ch ng vi khu n E. coli DH5α và A.tumefaciens CV58C1, EHA101 do
phòng Công ngh t bào th c v t-Vi n Công ngh sinh h c cung c p.
Hóa ch t
Kit tinh s ch DNA (AccuPrep®
Gel Purification Kit), các tách chi t và tinh s ch
plasmid (Plasmid Extraction Kit) c a hãng Bioneer (Hàn Qu c). Các lo i enzym h n
ch c a Fermentas (Hàn Qu c).
Bacto pepton, Yeast extract, NaCl, Agarose, Sucrose, Glucose, Trypton, KCl,
Tris HCl, EDTA, NaOH, MgSO4, MgCl2, Glycerol, CaCl2, Ethanol 70%, Nư c kh
ion. Các lo i kháng sinh kanamycin, rifapicine, cefotaxime, streptomycine,
spectinomycine và các hóa ch t thông d ng khác (X- gal, agarose,...) c a các hãng
Fermentas, Invitrogen, Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech…
Môi trư ng s d ng trong thí nghi m tái sinh và chuy n gen vào cây u tương
là môi trư ng GM, SIM, SEM, RM. Môi trư ng nuôi khu n và t o d ch huy n phù

39
khu n là LB, YEB, CCM. Thành ph n các lo i môi trư ng trên ư c trình bày trong
ph l c 1 và 2.
Các ch t i u ti t sinh trư ng: BAP, IBA, GA3,…và các kháng sinh:
kanamycin, cefotaxim, carbecillin
Thi t b
Máy PCR System 9700 (Appied Biosystem, M ), máy i n di Powerpac300
(Bio-Rad, M ), máy soi DNA (Mini-transllumminatior, Bio-Rad, M ), máy ch p
nh (Amersham Pharmacia Biotech, Thu i n), máy Vortex (Mimishaker, IKA,
c), máy hút chân không Speed-Vac 110A (Savant, M ), máy ly tâm, máy xung
i n Gen Plulser, cùng v i các trang thi t b khác c a Phòng Công ngh T bào
Th c v t và Phòng thí nghi m tr ng i m Công ngh gen, Vi n Công ngh Sinh
h c.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN C U
2.2.1. Phương pháp sinh lý, hoá sinh
2.2.1.1. ánh giá nhanh kh năng ch u h n
ánh giá nhanh kh năng ch u h n c a các gi ng u tương ư c ti n hành giai
o n cây non theo phương pháp c a Lê Tr n Bình và tg, 1997 [1].
2.2.1.2. nh lư ng protein, lipit, hàm lư ng và thành ph n axit amin trong h t
nh lư ng protein
nh lư ng protein tan ư c th c hi n theo phương pháp Lowry và tg, 1951
[63]
nh lư ng lipit
Nguyên t c: D a vào tính ch t hoà tan c a dung môi h u cơ chi t lipit. Dung
môi h u cơ ư c s d ng là ete d u ho (petroleum ether). Hàm lư ng lipit ư c tính
b ng hi u s gi a kh i lư ng m u trư c khi chi t và kh i lư ng m u sau khi chi t,
ư c mô t trong tài li u c a Ph m Th Trân Châu [4]
Hàm lư ng và thành ph n axit amin trong h t
Xác nh hàm lư ng và thành ph n axit amin trên máy phân tích axit amin t
ng HP-Amino Quant Seisee II c a Phòng hoá sinh protein, Vi n Công ngh Sinh

Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn

Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (17)

Similar to Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn

Similar to Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn (20)

More from Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864

More from Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (11)

Phân lập, tạo đột biến điểm ở gen P5CS liên quan đến tính chịu hạn