2. Nghiên cứu sự di truyền bệnh Beta-Thalassemia trong một số gia đình bệnh nhân khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long-PHạm Thi NGọc NGa.docx

1
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
NGHIÊN CỨU SỰ DI TRUYỀN
BỆNH BETA THALASSEMIA TRONG MỘT SỐ
GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN KHU VỰC ĐỒNG BẰNG SÔNG
CỬU LONG
TS. PHẠM THỊ NGỌC NGA
Cần Thơ – năm 2019

2
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ
ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CÔNG NGHỆ CẤP TRƯỜNG
NGHIÊN CỨU SỰ DI TRUYỀN
BỆNH BETA THALASSEMIA TRONG MỘT SỐ
GIA ĐÌNH BỆNH NHÂN KHU VỰC ĐỒNG BẰNG
SÔNG CỬU LONG
Chủ nhiệm đề tài: TS. PHẠM THỊ NGỌC NGA
Cán bộ phối hợp: TS. CAO THỊ TÀI NGUYÊN
CNCĐ. TRỊNH MINH THIẾT
Cần Thơ – năm 2019

3
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân và nhóm
nghiên cứu. Các số liệu, kết quả trình bày trong đề tài là trung thực và chưa
được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào trước đây.
Tác giả đề tài
Phạm Thị Ngọc Nga

4
MỤC LỤC
Trang
LỜI CAM ĐOAN
MỤC LỤC
PHẦN I. TÓM TẮT ĐỀ TÀI
PHẦN 2. TOÀN VĂN CÔNG TRÌNH
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH SÁCH BẢNG
DANH SÁCH HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................3
1.1. Bệnh Beta thalassemia.......................................................................................3
1.1.1. Đặc điểm phân tử của bệnh Beta thalassemia ....................................3
1.1.2. Di truyền bệnh Beta thalassemia .........................................................4
1.1.3. Cơ chế gây mất chức năng sinh học của các kiểu đột biến gen beta-
globin...........................................................................................................................4
1.1.4. Đột biến gây bệnh Beta thalassemia....................................................6
1.1.5. Các thể bệnh Beta thalassemia ...........................................................11
1.1.6. Chẩn đoán bệnh Beta thalassemia......................................................15
1.1.7. Điều trị Beta thalassemia ....................................................................16
1.1.8. Phòng bệnh Beta thalassemia .............................................................18
1.2. Phương pháp lập và phân tích phả hệ bệnh Beta thalassemia ..................19
1.2.1. Ý nghĩa của phương pháp nghiên cứu phả hệ ..................................19
1.2.2. Phương pháp lập phả hệ ......................................................................20
1.2.3. Phân tích phả hệ ...................................................................................20
1.2.4. Các ký hiệu dùng để lập gia hệ ..........................................................21

5
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...........23
2.1. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................23
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu..................................................................23
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................24
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu .............................................................................24
2.3.2. Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu ..................................................24
2.3.3. Nội dung nghiên cứu ...........................................................................24
2.3.4. Phương pháp thu thập số liệu .............................................................26
2.3.5. Phương pháp hạn chế sai số................................................................35
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................36
2.4. Đạo đức trong nghiên cứu...............................................................................36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU .........................................................37
3.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu..............................................................37
3.2. Phả hệ di truyền của một số bệnh nhân Beta thalassemia..........................37
3.3.1. Các xét nghiệm và kỹ thuật dùng sàng lọc, xác định người mang
gen và các đột biến trong phả hệ nghiên cứu .......................................................37
3.3.2. Xây dựng phả hệ di truyền..................................................................40
3.3. Tỷ lệ mang gen bệnh, tỷ lệ các kiểu đột biến và các thể bệnh trong phả hệ
nghiên cứu.................................................................................................................53
3.3.1. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu ................................53
3.3.2. Tỷ lệ các kiểu đột biến và tỷ lệ các thể bệnh trong 12 phả hệ ........54
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN ....................................................................................56
4.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu..............................................................56
4.2. Phả hệ di truyền của một số bệnh nhân Beta thalassemia..........................56
gen và các đột biến trong phả hệ nghiên cứu .......................................................56
4.3.2. Xây dựng phả hệ di truyền..................................................................57

6
4.3. Tỷ lệ mang gen bệnh, tỷ lệ các kiểu đột biến và các thể bệnh trong phả hệ
nghiên cứu.................................................................................................................62
4.3.1. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu ................................62
4.3.2. Tỷ lệ các kiểu đột biến và tỷ lệ các thể bệnh trong 12 phả hệ ........64
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: tờ thông tin dành cho bệnh nhân và gia đình nghiên cứu.
Phụ lục 2: phiếu đồng thuận nghiên cứu về bệnh Beta thalassemia
Phụ lục 3: phiếu thông tin
Phụ lục 4: danh sách các đối tượng tham gia trong 12 phả hệ

7
PHẦN I
TÓM TẮT ĐỀ TÀI
1. Đặt vấn đề và mục tiêu nghiên cứu
Thalassemia là bệnh Hemoglobin (Hb) di truyền đơn gen theo kiểu
Mendel phổ biến nhất. Bệnh do đột biến (ĐB) trên gen globin gây ra. Bệnh đa
số di truyền theo quy luật gen lặn, nhưng β-Thal di truyền trội cũng đã được
phát hiện ở người châu Âu và Nhật Bản [43], [58], [82], [83].
Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ mắc bệnh và mang gen bệnh
cao. Và theo báo cáo của Chi hội Tan máu bẩm sinh khu vực Tây Nam Bộ,
năm 2015, Đồng bằng sông Cửu Long có khoảng 2.105 người bị Thalassemia
được các bệnh viện chẩn đoán, nhưng hiện nay chưa tìm thấy nghiên cứu về sự
di truyền bệnh β-Thal trong các gia đình có bệnh nhân mắc bệnh. Đây chính là
lý do đề tài “Nghiên cứu sự di truyền bệnh Beta-Thalassemia trong một số gia
đình bệnh nhân khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long” được thực hiện nhằm
mục tiêu:
(1). Xây dựng phả hệ di truyền 3 thế hệ của 12 gia đình bệnh nhân β-
Thal ở khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long.
(2). Xác định tỷ lệ mang gen bệnh, tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh
và các thể bệnh β-Thal trong các phả hệ.
2. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng là bệnh nhân không phân biệt tuổi và giới tính, có hộ khẩu
thuộc 13 tỉnh và thành phố thuộc khu vực Đồng bằng sông Cửu Long được
chẩn đoán mắc bệnh -Thal dựa theo kết quả điện di Hb và tất cả người thân
có mối quan hệ huyết thống trong phạm vi 3 thế hệ với bệnh nhân.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
- Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu mô tả cắt ngang
- Cỡ mẫu: áp dụng công thức:
n = Z(1-α/2)
2 x p(1-p)/d2
Trong đó: Z = 1,96 (hệ số tin cậy với mức ý nghĩa α = 0,05)
p là tỷ lệ người mang gen bệnh trong các phả hệ của bệnh nhân β-Thal.

8
Theo nghiên cứu của Phạm Thị Phượng (2013) thì tỷ lệ này là 17,6%. Do đó,
nghiên cứu chọn p= 0,176.
d = sai số cho phép của nghiên cứu, chọn d = 0,05.
Vậy n = 223 người.
Ước tính trung bình mỗi phả hệ nghiên cứu khoảng 20 thành viên. Như vậy, số
phả hệ cần xây dựng trong nghiên cứu là 12 phả hệ.
- Phương pháp chọn mẫu: chọn mẫu thuận tiện ở 12 đối tượng được
xác định bệnh -Thal thể nặng theo các nhóm dân tộc sống ở Đồng bằng Sông
Cửu Long: 07 gia đình bệnh nhân dân tộc Kinh, 3 gia đình bệnh nhân dân tộc
Khmer, 1 gia đình bệnh nhân dân tộc Hoa và 1 gia đình bệnh nhân dân tộc
Chăm.
- Các bước nghiên cứu:
+ 12 bệnh nhân và người có quan hệ huyết thống 3 thế hệ đồng ý tham
gia nghiên cứu, lấy thông tin và 2mL máu tĩnh mạch, chống đông bằng EDTA
làm công thức máu 18 thông số.
+ Người nhà tham gia nghiên cứu có kết quả dương tính với chỉ số MCV
và/hoặc MCH sẽ được thực hiện kỹ thuật điện di Hb để tìm người mang gen
bệnh.
+ Người mang gen bệnh sẽ được ly trích DNA và thực hiện xác định 22
kiểu ĐB phổ biến bằng kỹ thuật RDB để xác định thể bệnh β-Thal và GAP-
PCR tìm ĐB gây α-Thal.
+ Tổng kết vẽ phả hệ theo quy ước quốc tế, xác định tỷ lệ mang gen bệnh
và tỷ lệ các thể bệnh trong các phả hệ nghiên cứu.
3. Kết quả nghiên cứu
3.1. Xây dựng phả hệ di truyền
gen và các đột biến trong phả hệ nghiên cứu
- Công thức máu: 146/251 (58,2%) đối tượng có kết quả dương tính với
chỉ số MCV/MCH (MCV<80fL, MCH<28pg).

9
- Điện di Hb: 103/146 (70,5%) người nhà có dương tính gồm: 9 thể phối
hợp HbE/β-Thal (HbE và HbF cao), 2 thể đồng hợp HbEE (HbE cao>90%),
59 thể dị hợp tử β-Thal (HbA2 >3,5), 33 thể dị hợp HbE (HbE tăng).
- Kỹ thuật RDB tìm đột biến gây bệnh β-Thal: 101/103 (98,1%) bệnh
nhân tìm được ĐB trên gen β-globin; 2 bệnh nhân không tìm được ĐB tiếp tục
tìm ĐB bằng kỹ thuật MLPA.
- Kỹ thuật GAP-PCR tìm đột biến gây bệnh α-Thal, kết quả có 8 bệnh
nhân mang có đột biến –SEA. Trong đó, 6/8 bệnh nhân là người chỉ mang gen
gây bệnh α-Thal và 2/8 bệnh nhân là người mang gen phối hợp α và β-Thal
(thể dị hợp tử phối hợp ĐB của α/β-Thal) do cả 2 bệnh nhân này ngoài đột
biến –SEA, kỹ thuật RDB cũng tìm được ĐB gây bệnh β-Thal.
- Kỹ thuật MLPA: 2 bệnh nhân làm MLPA đều mang đột biến giống
nhau (δβ)del.
3.1.2. Xây dựng phả hệ di truyền
263 thành viên gồm: 12 bệnh nhân β-Thal và 251 người nhà tham gia
trong 12 phả hệ. Trong đó có 141 nữ và 122 nam, ngoài ra các phả hệ còn có 2
thai nhi bị sảy, 1 thai đang phát triển và 1 bị chấm dứt thai kỳ do kết quả chẩn
đoán trước sinh thai nhi ở thể bệnh β-Thal đồng hợp tử βCd41/42.
11/12 phả hệ có 3 thế hệ, chỉ có duy nhất một phả hệ kinh có 4 thế hệ. Số
người trung bình trong mỗi phả hệ là 22 người.
Tất cả các bệnh nhân β-Thal (có hai ĐB) và người mang gen bệnh (có 1
đột biến) trong phả hệ đều được di truyền và tổ hợp các ĐB từ bố mẹ, ông bà ở
thế thệ thứ I và thứ II.
100% phả hệ mang đặc điểm di truyền gen lặn trên NST thường theo quy
luật của Mendel.
3.2. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu
3.2.1. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu
Ở mỗi phả hệ tỷ lệ mang gen bệnh đều ≤50%. Tỷ lệ mang gen β khác
nhau: thấp nhất là 9,4% và cao nhất là 50%. Tỷ lệ mang gen HbE cũng dao
động từ 0%-37,5% trong từng phả hệ. Tỷ lệ mang gen bệnh chung cả beta và

10
HbE của 12 phả hệ 34,6% và là 35,4% nếu thêm 0,8% BN mang gen phối hợp
giữa α/β-Thal.
3.2.2 Tỷ lệ các kiểu đột biến và tỷ lệ các thể bệnh β-Thal trong 12 phả hệ
Trong 12 phả hệ, có 145 alen mang ĐB và 6 kiểu ĐB được phát hiện.
Ngoại trừ ĐB gây bệnh α do mất đoạn –SEA được phát hiện trong gia đình
mắc bệnh β-Thal Kinh 04 và một ĐB gây β0 rất hiếm gặp (δβ)del ở gia đình
Chăm, 4 kiểu gây bệnh β-Thal còn lại đều là ĐB phổ biến ở Việt Nam. Trong
đó βHbE chiếm tỷ lệ cao nhất (35,8%), tiếp theo là βCd41/42 (32,4%); βCd17
(17,9%) và β-28(6,2%).
Về tỷ lệ các thể bệnh, có đủ 4 thể bệnh β-Thal trong 12 phả hệ: đồng hợp
tử, dị hợp tử kép, dị hợp tử và thể phối hợp HbE/β-Thal. Nếu tách HbE thành
thể bệnh riêng và tính cả thể dị hợp tử phối hợp α/β-Thal ở phả hệ Kinh 04, thì
6 kiểu đột biến đã tạo nên 7 thể bệnh trong 12 phả hệ. Tần số xuất hiện của các
thể bệnh khác nhau, cao nhất là thể dị hợp tử β-Thal 52,2%, thể dị hợp HbE
27%, thể phối hợp HbE/β-Thal 14,8%. Thể bệnh đồng hợp HbE, thể dị hợp tử
kép, thể phối hợp α/β-Thal chiếm tỷ lệ bằng nhau 1,7% và thấp nhất là β-Thal
thể đồng hợp tử 0,9%.
4. Kết luận
12 phả hệ khảo sát ở khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long đều tuân thủ
theo quy luật di truyền của Mendel. Kết quả nghiên cứu này tạo cơ sở thuận
lợi cho việc tính xác suất mắc bệnh cũng như mang gen cho thế hệ con cháu.
Ngoài ra, tỉ lệ mang gen bệnh rất cao trong các phả hệ cảnh báo gia tăng nguy
cơ xuất hiện thể đồng hợp trong các thế hệ tương lai. Đồng thời sự xuất hiện
của đột biến gây –SEAvà đột biến hiếm δβdel bên cạnh các đột biến phổ biến,
cho thấy việc cần thiết phải sử dụng nhiều kỹ thuật khác nhau trong trường
hợp chẩn đoán bệnh β-Thal. Như vậy, nghiên cứu phả hệ kết hợp với xét
nghiệm sinh học phân tử sẽ là hai công cụ đắc lực giúp bác sĩ trong tư vấn di
truyền và chẩn đoán xác định nguy cơ mắc bệnh -Thal.

11
PHẦN 2
TOÀN VĂN CÔNG TRÌNH

12
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt Tiếng Anh Tiếng việt
ARMS Amplification refractory
mutation system
Hệ thống nhân bản đột biến
chịu nhiệt
ASO Allele-specific
oligonucleotide
Oligonucleotide đặc trưng alen
β-Thal Beta Thalassemia
Cd Codon Bộ ba giải mã
ddNTP Dideoxynucleotide
DQ Dosage quotient Liều lượng
ĐB Đột biến
ĐBSCL Đồng bằng sông Cửu Long
Hb Hemoglobin
HLA Human leukocyte antigen Kháng nguyên bạch cầu người
MCH Mean Corpuscular
Hemoglobin
Số lượng hemoglobin trung
bình trong một hồng cầu
MCV Mean Corpuscular Volume Thể tích trung bình một hồng
cầu
MLPA Multiplex Ligation-
dependent Probe
Amplification
Khuếch đại đa đoạn dò
NST Nhiễm sắc thể
PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi
Probe Đoạn dò
RBC Red blood cell Hồng cầu
RDB Reverse Dot Blot Lai dò ngược
TRC Thalassemia reseach center Trung tâm Thalassemia
TIF Thalassaemia International
Federation
Liên đoàn Thalassemia thế giới

13
DANH SÁCH BẢNG
Trang
Bảng 1.1 Phân bố bệnh nhân theo các thể bệnh tại Đức 7
Bảng 1.2 Các đột biến -Thal phổ biến ở một số quần thể trên thế giới 9
Bảng 1.3 Phân bố các kiểu gen -Thal ở Hy Lạp và Thổ Nhĩ Kỳ 10
Bảng 1.4 Các kiểu đột biến thường gặp, mức độ nặng và phân bố theo
chủng tộc
11
Bảng 1.5 Kiểu gen, công thức máu, điện di hemoglobin và triệu chứng
của các thể bệnh -Thal
12
Bảng 1.6 Kiểu gen, công thức máu, điện di hemoglobin và triệu chứng
của các thể bệnh -Thal có đột biến HbE
14
Bảng 1.7 Một số kỹ thuật sinh học phân tử dùng trong chẩn đoán β-
Thal
16
Bảng 2.1 Một số ký hiệu sử dụng trong 12 phả hệ nghiên cứu 25
Bảng 2.2 Chỉ số DQ đọc kết quả MLPA 32
Bảng 2.3 Trình tự các primer trong phản ứng GAP-PCR 33
Bảng 2.5 Kích thước các loại đột biến 33
Bảng 3.1 Phân bố độ tuổi, giới tính theo các dân tộc của đối tượng xây
dựng phả hệ
37
Bảng 3.2 Tỷ lệ mang gen bệnh trong 12 phả hệ 53
Bảng 3.3 Tỷ lệ mang gen bệnh theo dân tộc trong 12 phả hệ 54
Bảng 3.4 Tỷ lệ các kiểu đột biến trong 12 phả hệ 54
Bảng 3.5 Tỷ lệ các thể bệnh trong 12 phả hệ 55

14
DANH SÁCH HÌNH
Trang
Hình 1.1 Cấu trúc gen -Thal 4
Hình 1.2 Di truyền bệnh -Thal 4
Hình 1.3 Hình dạng hồng cầu bất thường của bệnh nhân -Thal 5
Hình 1.4 Bản đồ phân bố tỷ lệ bệnh -Thal và HbE ở Đông Nam Á 8
Hình 1.5 Bệnh nhân -Thal thể nặng 12
Hình 2.1 Biểu đồ kết quả điện di Hemoglobin 27
Hình 2.2 Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi bằng Kit
QIAGEN
28
Hình 2.3 Các bước chính trong kỹ thuật RDB 28
Hình 2.4 Strip mang 22 kiểu đột biến và thể bệnh -Thal tương ứng 29
Hình 2.5 Đọc kết quả kỹ thuật RDB 30
Hình 2.6 Cấu tạo đoạn dò trong kỹ thuật MLPA 31
Hình 2.7 Kết quả của kỹ thuật MLPA 32
Hình 2.8 Hình điện di sản phẩm PCR phát hiện đột biến α-Thal trên
gel
34
Hình 3.1 Kết quả một số mẫu bệnh nhân phát hiện đột biến bằng
RDB
39
Hình 3.2 Đột biến (δ)del được phát hiện bằng MLPA 40
Hình 5.1 Test sức bền thẩm thấu hồng cầu
Kết quả xét nghiệm DCIP mẫu HbE (bên phải) và mẫu
bình thường
125
Hình 5.2 126
Sơ đồ 1.1 Cơ chế sinh bệnh do thừa chuỗi α ở bệnh nhân β-Thal 6
Sơ đồ 2.1 Các bước chính trong nghiên cứu 35
Sơ đồ 3.1 Các bước sàng lọc, xác định người mang gen và các đột 38

15
biến trong 12 phả hệ nghiên cứu
Sơ đồ 3.2 Phả hệ gia đình Kinh 01 41
Sơ đồ 3.9 Phả hệ gia đình Khmer 01 48
Sơ đồ 3.12 Phả hệ gia đình Hoa 51
Sơ đồ 3.13 Phả hệ gia đình Chăm 80
Biểu đồ 3.1 Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 01 41
Biểu đồ 3.8 Tần số mắc bệnh trong phả hệ Khmer 01 47
Biểu đồ 3.11 Tần số mắc bệnh trong phả hệ gia đình Hoa 50
Biểu đồ 3.12 Tần số mắc bệnh trong phả hệ gia đình Chăm 51

16
ĐẶT VẤN ĐỀ
Thalassemia là bệnh Hemoglobin (Hb) di truyền đơn gen theo kiểu
Mendel phổ biến nhất. Bệnh do đột biến (ĐB) trên gen globin gây ra. Bệnh đa
số di truyền theo quy luật gen lặn, nhưng β-Thal di truyền trội cũng đã được
phát hiện ở người châu Âu và Nhật Bản [43], [58], [82], [83].
Hiện có khoảng 71% quốc gia trên thế giới có bệnh lưu hành với 7% dân
số thế giới mang gen bệnh. Bệnh phân bố rộng từ Địa Trung Hải qua Trung
Cận Đông, châu Á đến Đông Nam Á,… thường là ở những nước có nguồn lực
thấp và tạo ra một gánh nặng lên hệ thống y tế của các nước này [53], 54],
[82]. Tổ chức Y tế Thế giới đã xác định thalassemia là vấn đề sức khỏe
nghiêm trọng và khuyến cáo các nước Đông Nam Á nên chọn thalassemia là
một trong những ưu tiên về di truyền người [4], [8], [43], [48], [61].
Trẻ mắc bệnh -Thal sẽ gặp những hậu quả nghiêm trọng về phát triển
cơ thể, tuổi thọ bởi sự tan máu và các biến chứng của nó. Việc điều trị chủ yếu
là truyền máu, thải sắt rất tốn kém, ít hiệu quả và chỉ để duy trì sự sống tạm
thời nên trẻ thường tử vong sớm trong những năm đầu của cuộc sống. Ghép
tuỷ xương giúp cải thiện bệnh nhưng chỉ hạn chế ở một vài trường hợp. Đây là
lý do khiến bệnh thalassemia trở thành gánh nặng cho gia đình và xã hội. Vì
vậy, việc phòng bệnh được đặt ra như một giải pháp nhằm ngăn chặn sự lan
tràn của bệnh di truyền này [30], [31], [35], [36], [40], [50], [53], [70].
Việt Nam là một trong những nước có tỷ lệ mắc bệnh và mang gen bệnh
cao. Nhiều nghiên cứu đã được tiến hành cho thấy tần suất mang gen bệnh β-
Thal khoảng 1,7-25% tùy từng vùng miền và dân tộc, một số thể bệnh -Thal.
Theo hiệp hội Tan huyết Việt Nam, hiện có khoảng hơn 20.000 bệnh nhân
nặng cần điều trị, mỗi năm có khoảng gần 2.000 trẻ sinh ra bị bệnh. Và theo
báo cáo của Chi hội Tan máu bẩm sinh khu vực Tây Nam Bộ, năm 2015,
Đồng bằng sông Cửu Long có khoảng 2.105 người bị Thalassemia được các
bệnh viện chẩn đoán, nhưng hiện nay chưa tìm thấy nghiên cứu về sự di truyền
bệnh β-Thal trong các gia đình có bệnh nhân mắc bệnh. Đây chính là lý do đề
tài “Nghiên cứu sự di truyền bệnh Beta-Thalassemia trong một số gia đình

17
bệnh nhân khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long” được thực hiện nhằm mục
tiêu:
(1). Xây dựng phả hệ di truyền 3 thế hệ của 12 gia đình bệnh nhân β-
Thal ở khu vực Đồng Bằng Sông Cửu Long.
(2). Xác định tỷ lệ mang gen bệnh, tỷ lệ các kiểu đột biến gen gây bệnh
và các thể bệnh β-Thal trong các phả hệ.

18
Chương 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Bệnh Beta thalassemia
Bệnh β-Thal là một loại bệnh Hb xảy ra do các đột biến gen làm giảm
hoặc không tổng hợp được chuỗi β-globin của phân tử Hb. Kết quả tạo nên
các Hb bất thường dẫn đến giảm hoặc không thực hiện được chức năng vận
chuyển khí cho cơ thể. Nếu ĐB gen làm chuỗi -globin giảm hay không được
tạo thành gọi là bệnh -Thal. Cũng có trường hợp cả hai chuỗi β và α bị thiếu
hụt hơn bình thường, trường hợp này gọi là thể phối hợp α/β thalassemia.
Bệnh hemoglobin E (HbE) do ĐB sai nghĩa tại vị trí nucleotide 129 của
chuỗi -globin (bộ ba mã hoá thứ 26 trên exon 1): GAG bị thay bằng AAG,
làm cho acid amin vị trí thứ 26 là Glutamic acid bị thay bằng Lysine, dẫn đến
giảm số lượng chuỗi -globin. Như vậy, HbE cũng là -Thal thể nhẹ.
1.1.1. Đặc điểm phân tử của bệnh Beta thalassemia
Cụm gen β-globin nằm trên nhánh ngắn nhiễm sắc thể (NST) số 11
(11p15.5), với đoạn DNA dài 73.308 cặp base, mã số trên ngân hàng gen là
U01317, bao gồm các gen có trật tự: 5’– epsilon – gamma – G – gamma – A –
delta – beta – 3’.
Gen β-globin dài 1606 cặp base, nằm ở vị trí nucleotide 5203272-
5204877 của NST số 11, tương ứng với nucleotide 62137-63742 của cụm gen
β-globin và đoạn khởi động sát đầu 5’ ở vị trí các nucleotide thứ 62061, 62106
và 62144.
Gen β-globin có 3 exon và 2 intron mã hoá cho chuỗi -globin dài 146
acid amin. Exon 1 ở nucleotide 1-142 và mã hoá các acid amin 1-30, acid
amin thứ nhất bắt đầu từ vị trí nucleotide 50. Exon 2 ở nucleotide 273-495 và
mã hoá các acid amin 31-104. Exon 3 bắt đầu từ nucleotide 1346-1606 và mã
hoá các acid amin 105-146. Các exon này tương ứng với 3 vùng cấu trúc và
chức năng của chuỗi -globin. Exon 1 và exon 3 nằm phía ngoài chủ yếu là
các acid amin ưa nước. Exon 2 nằm bên trong phân tử tạo bởi các acid amin
kỵ nước. Khi có ĐB gen xảy ra thì trình tự các acid amin sẽ thay đổi. Các acid

19
amin ở bề mặt bị thay bằng các acid amin kỵ nước và tạo ra các thay đổi hoá
học dẫn đến giảm đàn hồi, gây mất ổn định của phân tử protein, tạo ra các
chuỗi β-globin bị lỗi [23], [45], [86], [87].
Hình 1.1. Cấu trúc gen -Thal (Chanane Wanapirak et al, 2009)
1.1.2. Di truyền bệnh Beta thalassemia
Beta thalassemia là bệnh di truyền lặn trên NST thường, theo quy luật di
truyền Mendel. Khi chỉ có cha hoặc mẹ mang gen bệnh, 50% khả năng con
sinh ra là thalassemia dị hợp tử và không có trẻ đồng hợp tử bị bệnh. Nếu cả
cha và mẹ đều bị thalassemia dị hợp tử thì 25% khả năng sinh con bình
thường, 50% khả năng con dị hợp tử và 25% khả năng con đồng hợp tử [10],
[26], [79], [87].
Hình 1.2. Di truyền bệnh -Thal
1.1.3. Cơ chế gây mất chức năng sinh học của các kiểu đột biến gen
beta-globin
Khi các ĐB xuất hiện trên gen β-globin tùy theo vị trí mà ĐB này sẽ làm
thay đổi cấu trúc và số lượng của phân tử Hb và tạo ra các hồng cầu với nhiều
biến đổi khác nhau. Thông thường các ĐB đều làm giảm hoặc không tổng hợp

20
loại Hb bình thường nên hồng cầu có biểu hiện nhược sắc và tăng sinh các
hồng cầu non trong tủy.
Đột biến gây thiếu hụt chuỗi  dẫn đến dư thừa chuỗi . Các chuỗi  dư
thừa tạo thành các hạt tủa xuống màng hồng cầu và nguyên sinh chất của hồng
cầu. Với hồng cầu ở máu ngoại vi, những hạt tủa này làm cho màng hồng cầu
mất độ mềm dẻo, hồng cầu trở thành tế bào cứng nên khó vượt qua các “màng
lọc” ở lách [5], [44], [66], [75], [82].
Hình 1.3. Hình dạng hồng cầu bất thường của bệnh nhân -Thal [23]
Mặt khác, các hạt tủa cũng làm cho màng hồng cầu tăng diện tiếp xúc, dễ
bị các tác nhân oxy hóa phá hủy. Đồng thời tính thấm của màng thay đổi nên
kali ở bên trong tế bào thoát ra ngoài huyết tương. Những tác hại trên của các
hạt tủa làm hồng cầu bị vỡ sớm gây nên hiện tượng tan máu. Còn ở tủy xương,
các hạt tủa gắn lên nguyên sinh chất và màng của hồng cầu non, làm cho hồng
cầu bị chết trước khi trưởng thành, dẫn đến tăng sinh mạnh các hồng cầu trong
tủy, gây nên các biến dạng xương, tăng hấp thu sắt dẫn đến nhiễm sắt cho cơ
thể. Hiện tượng các hồng cầu non bị chết sớm không đến được giai đoạn
trưởng thành như trên gọi là hiện tượng sinh hồng cầu không hiệu quả. Như
vậy, dư thừa chuỗi dẫn đến tuỷ xương sinh hồng cầu không hiệu quả, đây là
cơ chế chủ yếu gây ra những biến đổi về lâm sàng và huyết học ở những bệnh
nhân -Thal thể nặng (Sơ đồ 1.1) [51], [66], [75], [82].
Ở thể dị hợp tử, các biến đổi về hồng cầu cũng tương tự như đồng hợp
tử, nhưng mức độ không trầm trọng, vì thế chỉ có hiện tượng thiếu máu nhẹ.
Cũng tương tự, ở các bệnh nhân thể nhẹ, sự mất cân bằng giữa chuỗi  và

21
chuỗi  không nặng nề nên bệnh nhân hầu như không có biểu hiện lâm sàng
thiếu máu [73].
Sơ đồ 1.1. Cơ chế sinh bệnh do thừa chuỗi ở bệnh nhân β-Thal
1.1.4. Đột biến gây bệnh Beta thalassemia
De Siva, S. et al, 2000 cho biết bệnh β-Thal phân bố rộng rãi từ Địa
Trung Hải, Trung Đông, Ấn Độ qua Pakistan cho đến Đông Nam Á (Hình 1.4)
[42]. Bệnh cũng có tần số cao ở một số vùng thuộc Liên Xô cũ và Trung
Quốc. Ở châu Âu, châu Phi bệnh tương đối ít gặp, gần đây do sự di dân, gen
bệnh phát tán đi khắp nơi và thalassemia trở thành vấn nạn toàn cầu [65], [72].
Đức, một quốc gia không nằm trong vành đai phân bố của bệnh β-Thal
là một minh chứng. Theo nghiên cứu của Elisabeth Kohne và Enno Kleihauer
(2010) β-Thal chiếm 23,2% trên tổng số bệnh nhân mắc bệnh thiếu máu tại
Đức [44]. Trong tổng số 23.330 bệnh nhân mắc bệnh β-Thal ở quốc gia này,
số người có nguồn gốc bản địa là 3.693 chiếm chỉ 15,8%. 84,2% bệnh nhân
còn lại được di cư từ các quốc gia Địa Trung Hải nằm ở phía nam châu Âu và
Thổ Nhĩ Kì.

22
Bảng 1.1. Phân bố bệnh nhân theo các thể bệnh tại Đức
Thể bệnh - thal Số người (%) Dân nhập cư (%) Dân bản xứ (%)
- thal 23.330 (100) 19.637 (84,2) 3.693 (15,8)
- thal thể ẩn 21.555 (92,4) 18.101 (84) 3.454 (16)
- thal thể nặng 861 (3,7) 858 (99,7) 3 (0,3)
- thal thể trung gian 96 (0,4) 94 (97,9) 2 (2,1)
- thal dạng phối hợp 818 (3,5) 584 (73,4) 234 (26,6)
Ngày nay, gần 200 kiểu ĐB khác nhau trên gen β-globin đã được mô tả.
Có rất nhiều dạng như: ĐB điểm (point mutations), ĐB khung (frameshift
mutation), ĐB vô nghĩa (nonsense mutations),… xuất hiện trên tất cả các vùng
của gen β-globin bao gồm cả intron, vùng promotor. Các ĐB xuất hiện tùy
theo kiểu và vị trí mà sẽ ảnh hưởng nhiều hay ít đối với việc tổng hợp chuỗi β
gây ra bệnh β-Thal với biểu hiện thiếu máu mức độ nặng, nhẹ khác nhau. Các
ĐB chủ yếu rơi vào các nhóm sau [72], [83]:
- Nhóm 1: đột biến gây mất hoàn toàn chuỗi β-globin, gọi là β0
thalassemia: gồm các ĐB vô nghĩa, lệch khung hoặc ĐB cắt/nối RNA. - Nhóm
2: đột biến gây giảm tổng hợp chuỗi  globin, gọi là + thalassemia: gồm các
ĐB ở đoạn khởi động, poly A, đầu 5’ hoặc đầu 3’ không dịch mã hoặc do cắt
nối RNA. Có thể chia các ĐB như sau:
+ Đột biến đoạn khởi động: có 18 đột biến đoạn khởi động được phát
hiện. Các ĐB này ảnh hưởng đến phiên mã do làm giảm khả năng gắn enzyme
RNA polymerase và chỉ gây giảm số lượng chuỗi -globin với các biểu hiện
lâm sàng -Thal thể trung gian. Ví dụ: đột biến c.-78A>G (-28A>G).
+ Đột biến cắt/nối mRNA: sau phiên mã, mRNA được cắt/nối để loại bỏ
intron. Các ĐB cắt nối có thể gây mất hoàn toàn hoặc giảm một phần quá trình
cắt/nối bình thường hoặc tạo ra vị trí cắt/nối mới intron hoặc ở exon gây ra 0
hoặc + thalassemia như các đột biến c.92+1 G>T (IVS1.1 G>T), c.316-197
C>T (IVS2.654 C>T).

23
Hình 1.4. Bản đồ phân bố tỷ lệ bệnh -Thal và HbE ở Đông Nam Á [42]
+ Đột biến tạo mRNA không có chức năng:
. Đột biến vô nghĩa: xảy ra khi thay thế một nucleotide này bằng một
nucleotide khác làm xuất hiện mã dừng, gây chấm dứt dịch mã sớm tạo chuỗi
globin không hoàn chỉnh, nhanh chóng bị thoái hoá. Các ĐB này gây ra kiểu
hình 0 thalassemia. Ví dụ: đột biến c.52A>T (Cd17AAG>TAG).
. Đột biến lệch khung: xảy ra khi mất hoặc thêm một hoặc vài
nucleotide ở vùng mã hoá của gen làm thay đổi khung đọc bình thường bắt
đầu từ vị trí ĐB và tạo mã vùng xuất hiện sớm, tạo ra các chuỗi - globin
không hoàn chỉnh. Đây là ĐB nghiêm trọng, gây ra kiểu 0 thalassemia. Một
số ĐB loại này là đột biến c.124-127delTTCT (Cd41/42 –TTCT), c.214insA
(Cd 71/72 +A) và c.28insA (Cd95 +A) [68], [62].

24
Bảng 1.2. Các đột biến -Thal phổ biến ở một số quần thể trên thế giới
Quần thể Đột biến Quần thể Đột biến
Việt Nam
-28 A>G
Đông Nam
Á
-28 A>G
Codon 17 AAG>TAG Codon 17 AAG>TAG
Codon 26 GAG>AAG Codon 41/42 –TTCT
Codon 41/42 –TTCT Codon 26 GAG>AAG
Codon 71/72 +A IVS 1-5 G>C
IVS 2-654 C>T IVS 2-654 C>T
Codon 95 +A Codon 8 –AA
IVS1-1 G>T -29 A>C
Trung
Quốc
Codon 17 AAG>TAG
Trung
Đông
Codon 8/9 +G
Codon 26 GAG>AAG IVS 1-5 G>C
Codon 41/42 –TTCT Codon 39 CAG>TAG
Codon 71/72 +A Codon 44 –C
IVS 2-654 C>T IVS 2-1 G>A
Địa
Trung
Hải
IVS 1-1 G>A
Ấn Độ
Codon 8/9 +G
IVS 1-6 T>C IVS 1-1 G>T
IVS 1-110 G>A IVS 1-5 G>C
Codon 39 CAG>TAG Codon 41/42 –TTCT
IVS 2-745 C>G 619 bp deletion
Theo một vài tác giả như Weatherall, D. et al, 2001; Loukopoulos, D.
and Kollia, P., 2001; Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2013, ở những vùng có tỷ lệ
gen bệnh cao, thường có một số ĐB mang tính phổ biến, các ĐB này có tính
đặc trưng theo dân tộc và vùng miền [16], [65], [83]. Thường mỗi cộng đồng
có khoảng 4 đến 10 đột biến phổ biến như ở Ấn Độ Dương và các nước lân
cận: các ĐB hay gặp là c.92+5 G>C, c.46 G>A, c.27-28 +G và c.124-127 –
TTCT. Một số khu vực khác, các kiểu ĐB được trình bày trong bảng 1.2.
Tại vùng Địa Trung Hải, tần số người mang bệnh cao (6,8 - 15% dân số).
Đột biến hay gặp nhất tại khu vực này là +: IVS1.110 G>A. Tuy nhiên, ở mỗi

25
quốc gia trong khu vực này có một số đột biến đặc trưng. Ví dụ: tại Iran:
IVS2.1 G>A, IVS1.1 G>A, Codon 8/9 +G, Cd8 -AA, IVS1.110 G>A, Cd39
C>T, IVS1.6 T>C), IVS2.745 C>G), IVS1.5 G>C), Cd5 -CT. Ở Hy Lạp và
Thổ Nhĩ Kỳ được trình bày trong bảng 1.3 [65]. Các loại ĐB thường gặp này
sẽ biểu hiện mức độ thiếu máu khác nhau trên bệnh nhân và cũng phân bố đặc
trưng theo các chủng tộc (Bảng 1.4) [66].
Bảng 1.3. Phân bố các kiểu gen -Thal ở Hy Lạp và Thổ Nhĩ Kỳ
Kiểu gen Hy Lạp (989 alen) Thổ Nhĩ Kỳ (1227 alen)
-101 (C>T) 3 6
-87 (C>G) 19 12
-30 (T>A) 1 33
-28 (A>C) - 3
IVS1.1 (G>A) 135 54
IVS1.5 (G>A, C, T) 5 19
IYS1.6 (T>G) 81 181
IVS1.110 (G>A) 425 519
IVS2.1 (G>A) 20 91
Cd 39 (C>T) 193 48
FS5 (-CT) 6 22
FS6 (- A) 28 5
FS8 (-AA) 9 81
FS8/9 (+G) 1 19
ĐB khác 7 -
Chưa rõ 14 86
Ở Việt Nam theo các nghiên cứu, có 8 loại ĐB phổ biến (Bảng 1.2). Các
ĐB này luôn chiếm >90% các trường hợp khi nghiên cứu trên người Việt
Nam, trong đó Cd95 +A (c.286insA) là ĐB đặc trưng của nước ta.

26
Bảng 1.4. Các kiểu đột biến thường gặp, mức độ nặng và phân bố theo chủng
tộc
Chủng tộc Đột biến gen β-globin Mức độ nặng
Ấn Độ -619 del β0
Địa Trung Hải -101 (C>T) β++
Da đen -88 (C>T) β++
Địa Trung Hải; châu Phi -87 (C>G) β++
Nhật -31 (A>G) β++
Châu Phi -29 (A>G) β++
Đông Nam Á -28 (A>C) β++
Địa Trung Hải; Ấn Độ IVS1-1 (G>A),
IVS1-5 (G> A,C,T)
β0
Địa Trung Hải IVS1-6 (T>C) β++/+
Địa Trung Hải IVS1-110 (G>A) β+
Trung Quốc IVS2-654 (C>T) β+
Địa Trung Hải IVS2-745 (C>G) β+
Địa Trung Hải Cd39 (C>T) β0
Địa Trung Hải Cd5 (-CT) β0
Địa Trung Hải; Mỹ gốc Phi Cd6 (-A ) β0
Đông Nam Á Cd41/42 (-TCTT) β0
Mỹ gốc Phi AATAAA > AACAAA β++
Địa Trung Hải AATAAA > AATGAA
Hb Knossos
β++
Đông Nam Á HbE β++
Malaysia Cd19 G>A β++
1.1.5. Các thể bệnh Beta thalassemia
1.1.5.1. Các thể bệnh Beta thalassemia theo lâm sàng
Theo Cao, A. et al, 1997; Thein, S. L., 2004, trên lâm sàng bệnh được
chia thành 3 thể chính [37], [78].
* Thể nặng: còn gọi là bệnh Cooley, thể đồng hợp tử.

27
Bệnh nhân có thiếu máu, tan máu mạn tính mức độ nặng với các triệu
chứng thiếu máu, lách to, gan to, da bị nhiễm sắc tố, biến dạng xương, chậm
phát triển thể chất.
Hình 1.5. Bệnh nhân -Thal thể nặng [23]
* Thể nhẹ - thể ẩn: còn gọi là thể dị hợp tử.
Là một thể bệnh tương đối nhẹ, không có biểu hiện lâm sàng, cơ thể phát
triển bình thường, không có biến dạng xương, thiếu máu thường rất nhẹ.
* Thể trung gian (intermedia): có thể là thể đồng hợp tử, thể dị hợp tử
kép hay thể phối hợp.
Bảng 1.5. Kiểu gen, công thức máu, điện di Hb và triệu chứng của các thể bệnh
-Thal [58]
Thể bệnh Kiểu gen ĐB Công thức máu Chỉ số Hb Triệu chứng
-Thal
thể nặng
β0/β0
β+/β+
β0/β+
Hb <7g/dL
MCV 50-60fL
MCH 14-20pg
HbA2 tăng,
thay đổi
HbF 70-90%
thiếu máu nặng
cần truyền máu
phụ thuộc
-Thal
thể nhẹ
β+/β
β0/β
β++/β
Hb nam 9-15g/dL
Hb nữ 9-13g/dL
MCV 55-75fL
MCH 19-25pg
HbA2 >3,2%
HbF 0,5-6%
không có triệu
chứng thiếu máu
trên lâm sàng
-Thal thể
trung gian
β+/β++
β0/β+
β0/β0 + yếu
tố khác
Hb 6-10g/dL
MCV 55-70fL
MCH 15-23pg
HbA2 tăng,
thay đổi
HbF tăng đến
100%
thiếu máu vừa, cần
truyền máu nhưng
không phụ thuộc

28
Thể này có thiếu máu vừa hoặc nhẹ, bệnh tiến triển chậm và nhẹ, thường
kèm theo vàng da, gan, lách to. Bệnh nhân không có thay đổi về thể trạng, chỉ
bị thiếu máu mức độ trung bình và thỉnh thoảng mới cần truyền máu.
Kiểu gen ĐB, công thức máu, chỉ số điện di Hb và triệu chứng chính của
3 thể bệnh được trình bày trong bảng 1.5.
2.1.5.2. Các thể bệnh Beta thalassemia khác
* Các thể bệnh β-Thal có đột biến HbE
HbE rất phổ biến ở Đông Nam Á khi chỉ có mỗi đột biến HbE hoặc
kết hợp thêm với đột biến HbE hay ĐB khác gây β-Thal sẽ tạo ra 4 thể bệnh
và kiểu hình của từng thể bệnh được mô tả ở bảng 1.6.
* Các thể bệnh phối hợp giữa β-Thal và α-Thal
Sự cùng tồn tại của ĐB gây giảm tổng hợp chuỗi α-globin dẫn đến bệnh
α-Thal có thể điều chỉnh kiểu hình của đột biến β-Thal. Sự kết hợp của hai ĐB
này sẽ giúp bệnh nhân giảm triệu chứng thiếu máu do ĐB β-Thal gây ra nhờ
cơ chế giảm sự mất cân bằng của chuỗi α và β globin. Ví dụ: sự kết hợp ĐB
mất 2 gen alpha (-α/-α hoặc --/αα) phối hợp với thể dị hợp thử kép β0/β+ hay
kiểu gen bệnh HbH của alpha α-Thal phối hợp với thể β0/β+ hoặc β+/β+ sẽ làm
giảm bệnh cảnh của bệnh nhân β-Thal từ thiếu máu nặng thành thiếu máu vừa
hoặc nhẹ.
Ngược lại, khi ĐB gây thừa gen α-globin kết hợp với các thể bệnh β-
Thal làm sẽ nghiêm trọng hơn mức độ thiếu máu của bệnh nhân, người mang
cùng lúc hai ĐB này. Ví dụ: đột biến tăng thêm 2 gen α (ααα/ααα hoặc
αααα/αα) kết hợp với β-Thal thể nhẹ sẽ tạo ra β-Thal thể trung gian. Tuy
nhiên, nếu chỉ thừa một gen α (ααα/αα) thì kiểu hình bệnh nhân β-Thal thể
nhẹ sẽ thay đổi tùy thuộc vào loại ĐB của gen α-globin [58].
* Thể bệnh β-Thal trội
β-Thal trội được phát hiện ở người châu Âu và Nhật Bản. Mặc dù các
cá thể chỉ có kiểu gen dị hợp tử (mang một ĐB gây bệnh β-Thal) vốn không
có biểu hiện triệu chứng trên lâm sàng nhưng các bệnh nhân này lại có bệnh
cảnh của β-Thal trung gian. Đã có hơn 30 đột biến di truyền theo kiểu trội
được mô tả, trong đó ĐB phổ biến nhất là codon 121GAA>TAA [53], [83].

29
Bảng 1.6. Kiểu gen, công thức máu, điện di Hb và triệu chứng của các thể
bệnh -Thal có đột biến HbE [53].
Thể bệnh Kiểu gen ĐB Công thức máu Chỉ số Hb Triệu chứng
Dị hợp tử
HbE
βE/β
Hb bình thường
hoặc giảm nhẹ
MCV <80fL
MCH <28pg
HbE =25-35%
bệnh nhân thiếu
máu nhược sắc
nhẹ
Đồng hợp
tử HbE
βE/βE
Hb 10-14g/dL
MCV <80fL
MCH <28pg
HbE > 95%
HbA2 ≈ 2,5%
HbF < 3%
Thiếu máu
nhược sắc nhẹ,
tan huyết khi
nhiễm trùng
HbE phối
hợp với
β+-Thal
βE/β+
Hb thấp
MCV <80fL
MCH <28pg
HbE+HbA2
= 25-80%
HbF = 6-50%
HbA = 5-60%
Thiếu máu
tương tự như β-
Thal thể trung
gian
HbE phối
hợp với
β0-Thal
βE/β0
Hb<8g/dL
MCV <80fL
MCH <28pg
HbA2 < 5%
HbF = 15-25%
HbE tăng đến
85%
Thiếu máu
tương tự như β-
Thal thể nặng
* Thể bệnh HPFH và δβ-Thal
Đây là các thể bệnh hiếm gặp, cả hai thể HPFH (duy trì HbF của bào
thai) và δβ-Thal có chung đặc điểm là tăng lên đáng kể lượng HbF nhưng chỉ
số HbA2 vẫn duy trì ở mức bình thường. Nguyên nhân thường do ĐB trên
cụm gen β-globin trên nhiễm sắc thể 11 như: ĐB mất gen Gamma (HbG) kéo
dài đến gen β-globin hay gen Delta (HbD) kết hợp với ĐB trên gen β-globin
(HbB) hoặc các ĐB mất đoạn lớn từ gen HbD kéo dài đến gen β-globin. Các
bệnh nhân này sẽ có lâm sàng biểu hiện từ nhẹ đến trung gian hay nặng tùy
vào loại ĐB và kiểu gen có phối hợp hay không [74], [81],
Hai thể bệnh này phân biệt dựa vào lâm sàng và huyết học. Thường thì
HPFH dị hợp tử có HbF tăng trong khoảng 15-30% nhưng chỉ số hồng cầu lại

30
bình thường, trong khi δβ-Thal lại có khuynh hướng tăng HbF thấp hơn 5-
20% nhưng lại đi kèm biểu hiện lâm sàng thiếu máu nhẹ kết hợp với chỉ số
hồng cầu nhỏ, nhược sắt (MCV<80fL và/hoặc MCH <28pg) [47], 67], [77].
* Thể bệnh β-Thal có HbA2 tăng cao bất thường
Nghiên cứu của Cao, A. et al, 1998; Weatherall, D. J. et al, 2001; Thein,
S.L., 2008, thể bệnh β-Thal này có HbA2 tăng cao khác thường trên 6,5%.
Nguyên nhân thường do mất đoạn DNA chứa các yếu tố điều hòa nhóm gen
. Các bệnh nhân này có HbA2 tăng cao thường kèm với HbF tăng nhẹ
[38], [78], [83].
1.1.6. Chẩn đoán bệnh Beta thalassemia
Tùy ĐB ở mỗi quốc gia mà các kỹ thuật chẩn đoán bệnh β-Thal được
ứng dụng cho phù hợp. Dù áp dụng kỹ thuật nào thì xét nghiệm huyết học
luôn được sử dụng để sàng lọc cơ bản bệnh β-Thal và chủ yếu dựa vào chỉ số
MCV và MCH. Ở những quốc gia y tế còn kém (một số quốc gia ở châu phi),
hoặc quốc gia có tỷ lệ mắc bệnh hạn chế, kỹ thuật điện di Hb là kỹ thuật chủ
yếu được sử dụng để chẩn đoán bệnh. Theo Cai, S.P. et al, 1990; Martin, H. et
al, 2008, tiêu chí sàng lọc và chẩn đoán bệnh qua xét nghiệm huyết học và
điện di của từng thể bệnh được trình bày trong các bảng 1.5 và 1.6 [34], [66].
Ngoài điện di, các nước nằm trong vành đai bệnh và các nước có y tế phát
triển còn sử dụng thêm các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại như PCR, giải
trình tự... để phát hiện bệnh. Các kỹ thuật này giúp chẩn đoán chính xác loại
ĐB gây bệnh trên một hay hai chuỗi β-globin từ đó đánh giá chính xác hơn
kiểu gen, cũng như thể bệnh và tình trạng thiếu máu hiện tại, mức độ cần
truyền máu của bệnh nhân [34], [66].
Nhiều phương pháp sinh học phân tử đã được phát triển, ứng dụng vào
chẩn đoán thalassemia ở người bệnh và chẩn đoán trước sinh cho thai nhi.
Tùy theo điều kiện của mỗi quốc gia và của phòng thí nghiệm cũng như mục
đích ứng dụng mà kỹ thuật cụ thể được sử dụng và điều chỉnh cho phù hợp
(Bảng 1.7).

31
Bảng 1.7. Một số kỹ thuật sinh học phân tử dùng trong chẩn đoán β-Thal
Mục đích và kỹ thuật chẩn đoán Tác giả
Tìm đột biến điểm và vi mất đoạn
- Giải trình tự gen
Hussey, 2002
Tìm đột biến điểm đã biết
- ASO (alen specific oligonucleotide hybridization)
Corner, 1983
- CCA (color complementation assay) Embury, 1990
- A-RFLP (artificial-restriction fragment length
polymorphism)
Chang, 1992
- RFLP (restriction fragment length polymorphism
analysis)
Craig, 1994
- MS-PCR (multiplexing mutagenically separated
PCR )
Chang, 1997
- RDB (reverse dot blots) Winichagoon, 1999
- ARMS (amplification refractory mutation system) Svasti, 2002
- Minisequencing Wang, 2003
- dHPLC (denaturing high performance liquid
chromatography)
Colosimo, 2003
- Microarrays Cremonesi, 2007
- Realtime PCR Pornprasert, 2011
Tìm đột biến chưa biết
- Chemical cleavage of mismatch Dianzani, 1991
- DGGE (Denaturing gradient gel electrophoresis) Gorakshakar, 2000
- MLPA (multiplex ligation-dependent probe
amplification)
Harterveld, 2005
1.1.7. Điều trị bệnh Beta thalassemia
Người mang gen β-Thal (thể nhẹ) không cần điều trị đặc hiệu kể cả khi
có thiếu máu nhẹ hoặc vừa.
β-Thal thể trung gian có thể truyền máu khi thiếu máu nặng, nhưng
không thường xuyên. Nếu phải truyền máu nhiều lần thì bệnh nhân β-Thal thể

32
trung gian cũng có thể có nhiễm sắt và phải dùng thuốc thải sắt từng đợt. Bệnh
nhân mang thể bệnh này có thể sống đến tuổi trưởng thành.
β-Thal thể nặng thường thiếu máu mạn tính, cần phải truyền máu thường
xuyên [29], [62], [66].
+ Truyền máu: hồng cầu lắng từng đợt để giữ ổn định tương đối hàm
lượng huyết cầu tố.
+ Cắt lách khi lượng máu truyền >200-250mL/Kg/năm hoặc có dấu hiệu
cường lách và có chỉ định trên 5 tuổi để hạn chế nguy cơ nhiễm trùng nặng do
Pneumocoque, Meningocoque, Haemoplilus. Ở trẻ nhỏ cần dự phòng bằng
kháng sinh (Penicilline) sau cắt lách. Sau cắt lách, tiểu cầu, bạch cầu có thể
tăng, cần dùng Aspirine liều thấp để ngừa tắc mạch.
+ Giảm lượng sắt huyết thanh thường sau 10-15 lần truyền máu bằng
Desferroxamine hoặc các dạng thuốc tương tự. Các thuốc này thường chứa
phức hợp có ái lực cao với sắt, tiêm bắp, tiêm dưới da, tĩnh mạch, liều 30-
40mg/Kg/ngày x 5-6 ngày.
+ Điều trị hỗ trợ:
. Acid ascorbic: làm chậm tốc độ chuyển ferritin thành hemosiderine.
Tuy nhiên, các acid ascorbic có thể làm tăng nguy cơ peroxidation của sắt đối
với lipid của màng tế bào. Liều 3mg/Kg lúc mới bắt đầu thải sắt.
. Vitamin E làm bền màng tế bào, giảm nguy cơ oxid hóa màng hồng cầu
và acid folic đóng vai trò quan trọng trong tổng hợp DNA, tạo nhiều chất liệu
tham gia sản xuất hồng cầu do tăng hoạt động của tuỷ xương.
Ghép tủy từ người cho HLA phù hợp (kháng nguyên bạch cầu người -
human leukocyte antigens) là biện pháp được cho là điều trị khỏi β-Thal thể
nặng. Kết quả ghép tủy tốt hơn ở trẻ em dưới 3 tuổi, mới truyền máu ít và
không biến chứng nặng [43], [56], [57].
Liệu pháp gen là một biện pháp tương lai, đang được nghiên cứu. Mục
tiêu là gắn gen β-globin bình thường vào tế bào nguồn và sử dụng tế bào
nguồn này để ghép tủy xương [31], [43].

33
1.1.8. Phòng bệnh Beta thalassemia
Với mức độ phân bố tương đối rộng, mang tính chất mạn tính nên bệnh
β-Thal nói riêng và bệnh thalassemia nói chung là một thách thức đối với
nhiều quốc gia trên thế giới. Truyền máu an toàn, chi phí thải sắt cao là những
thử thách lớn cho gia đình và bệnh nhân β-Thal. Fucharoen, S. (1997) ước tính
ở Thái Lan, tổng số tiền điều trị cho bệnh nhân thalassemia thể nặng vào
khoảng 220 triệu USD/năm. Còn tại Cryprus, Hy Lạp, nếu tất cả các trẻ bị
thalassemia đều được chào đời thì việc truyền máu và thải sắt cho các bệnh
nhân sẽ chiếm toàn bộ ngân sách y tế của địa phương này. Như vậy, phòng
bệnh là một vấn đề hết sức cần thiết nhằm làm giảm gánh nặng điều trị cho gia
đình bệnh nhân và cho xã hội.
Để phòng bệnh được hiệu quả, các chương trình tầm soát, sàng lọc phát
hiện bệnh thalassemia và người mang gen ở trạng thái dị hợp tử trong lứa tuổi
học đường, trước tuổi kết hôn nên được triển khai. Tư vấn di truyền cho các
gia đình có người mang gen bệnh, trong đó có tư vấn trước hôn nhân để cho
các cặp vợ chồng tự lựa chọn hạn chế sinh đẻ hoặc áp dụng chẩn đoán trước
sinh cũng là biện pháp phòng bệnh quan trọng. Các phương pháp chẩn đoán
trước sinh thường là các xét nghiệm dựa trên DNA chiết tách từ tế bào ối hay
tế bào tua rau hoặc những tế bào của bào thai lưu hành trong máu mẹ. Sự áp
dụng đồng bộ các phương pháp này có thể làm giảm tỷ lệ sinh ra những trẻ bị
bệnh thalassemia [30], [31].
Tại Việt Nam, có nhiều nghiên cứu về tầm soát bệnh β-Thal trên một số
dân tộc và một số vùng miền. Theo Nguyễn Công Khanh và ctv (1993), tần
suất người mang gen β-Thal ở miền Bắc là 1,49%, miền Trung 2,55%, miền
Nam 1,7%. Nguyễn Thị Hồng Nga (2002), sử dụng công thức Shine và Lal
trong tầm soát beta thể ẩn thì tỷ lệ dương tính thật là 92,5%. Phạm Thị Ngọc
Nga (2011), tỷ lệ mang gen bệnh β-Thal xác định qua điện di Hb trên dân tộc
Khmer tỉnh Bạc Liêu là 33,5%,.... Tuy nhiên, tất cả các nghiên cứu chỉ thực
hiện trên một bộ phận dân số, nước ta chưa có chương trình phòng bệnh
thalassemia thật sự hiệu quả từ các nghiên cứu.

34
Năm 2010, chương trình quốc gia đã quan tâm đến việc quản lý bệnh
nhân thalassemia, mong rằng trong tương lai không xa chúng ta sẽ có những
chính sách đặc biệt để việc tầm soát, chẩn đoán trước sinh, tư vấn di truyền
được thực hiện một cách rộng rãi nhằm giúp cho việc phòng bệnh được hiệu
quả hơn.
1.2. Phương pháp lập và phân tích phả hệ bệnh Beta thalassemia
1.2.1. Ý nghĩa của phương pháp nghiên cứu phả hệ
Phương pháp nghiên cứu phả hệ dùng để phân tích một tính trạng hay
một bệnh tật có di truyền hay không và thuộc quy luật di truyền nào. Phương
pháp này được ứng dụng rộng rãi để theo dõi một tính trạng hoặc một bệnh tật
qua một số thế hệ, ít nhất là ba thế hệ, từ đó có thể tiên đoán sự xuất hiện của
các tính trạng hoặc một bệnh tật ở thế hệ tiếp theo. Trong một số trường hợp,
chúng ta có thể xác định được người mang gen bệnh. Đây là cơ sở để cán bộ y
tế cho những lời khuyên về di truyền chính xác, hữu ích mà không tốn kém
giúp các gia đình đang mong muốn sinh con, các cặp nam nữ thanh niên trong
độ tuổi kết hôn có các quyết định đúng khi lập gia đình.
Ngoài ra, ở các gia đình có bệnh di truyền như bệnh β-Thal, phả hệ thật
sự rất có ý nghĩa. Phả hệ cung cấp các thông tin về tiền sử gia đình và điều này
luôn giữ yếu tố quan trọng về cuộc sống trong quá khứ và tương lai của một cá
nhân có nguy cơ mắc bệnh di truyền. Tiền sử gia đình có thể được sử dụng
như một công cụ chẩn đoán và giúp bác sĩ hướng dẫn, chỉ định các xét nghiệm
di truyền cho bệnh nhân và các thành viên trong gia đình có nguy cơ [30].
Trong gia đình của một bệnh nhân β-Thal, nghiên cứu phả hệ thậm chí
có thể giúp loại trừ căn bệnh di truyền này nếu gia đình kết hợp với tư vấn và
thực hành tốt. Việc hình thành ý thức phòng bệnh cho thế hệ sau, cách chăm
sóc bệnh nhân giúp giảm biến chứng... sẽ dễ dàng hình thành và đi vào ý thức
của các thành viên trong phả hệ. Tất cả sẽ là cơ sở quý giá cho phép cá nhân
và nhân viên y tế thực hiện các bước để giảm nguy cơ và ngăn chặn không cho
bệnh xuất hiện tiếp trong gia đình.

35
Như vậy, phương pháp phả hệ luôn là phương pháp kinh điển, nhưng nó
lại được sử dụng như một phương pháp phổ thông trong nghiên cứu, tiên đoán
bất cứ bệnh tật di truyền nào trong đó có cả bệnh β-Thal.
1.2.2. Phương pháp lập phả hệ
Mỗi cá thể trong một phả hệ có một ký hiệu theo quy ước quốc tế, tùy
theo giới tính, có bệnh tật đang cần phân tích hay không, có là người mang
gen bệnh lặn hay không...
Sơ đồ phả hệ thường được vẽ theo hình bậc thang, từ trên xuống theo thứ
tự các thế hệ ông bà, cha mẹ, con cháu.
Mỗi thế hệ là một bậc thang, các con của một cặp bố mẹ được ghi lần
lượt từ trái sang phải và từ người con lớn nhất. Đương sự là bệnh nhân mắc
bệnh đến khám và từ đó người bác sĩ hỏi và tìm hiểu dần đến các thành viên
còn lại trong phả hệ để lập sơ đồ phả hệ. Đương sự được đánh dấu bằng một
mũi tên bên dưới ký hiệu. Phía bên trái mỗi thế hệ của phả hệ ghi các chữ số
La mã để chỉ thứ tự các thế hệ trong phả hệ. Bên dưới (phía bên phải) của từng
thành viên có ghi các chữ số Ả rập để chỉ số thứ tự của thành viên trong thế hệ
đó (Hình 1.6). Khi theo dõi một tính trạng qua nhiều thế hệ, gồm nhiều cá thể,
sơ đồ phả hệ hình bậc thang không đủ chứa tất cả các cá thể, cho nên trường
hợp này phả hệ được lập theo hình cung [27].
Hình 1.6. Một phả hệ điển hình của di truyền alen trội
nhiễm sắc thể thường
1.2.3. Phân tích phả hệ
Khi phân tích phả hệ cần biết chi tiết về tất cả mối quan hệ huyết thống
của các cá thể trong sơ đồ phả hệ, sự biểu hiện bệnh liên tục hay ngắt quãng

36
qua các thế hệ liên tiếp, mức độ biểu hiện bệnh của các cá thể nặng hay nhẹ và
biểu hiện trên cá thể nam hay nữ [2].
Trong một phả hệ có bệnh di truyền, tần số một số bệnh trong phả hệ
giảm dần theo quan hệ huyết thống, theo hệ số di truyền: họ hàng bậc một (bố
mẹ, anh chị em ruột, con) có tỷ lệ mắc bệnh cao nhất; giảm dần ở họ hàng bậc
hai (ông, bà, chú, bác, cô dì ruột, cháu ruột); rồi đến họ hàng bậc ba (anh chị
em họ)…Từ đó, kết hợp với quy luật di truyền trong phả hệ ta có thể tiên đoán
khả năng xuất hiện bệnh tật cho thế hệ tiếp theo.
1.2.4. Các ký hiệu dùng để lập gia hệ
Ý nghĩa của các ký hiệu Ký hiệu theo hệ thống quốc tế
Nam giới
Nữ giới
Không biết giới
Thai
Người lành
Người bệnh
Người kiểu hình lành mang gen lặn
trên NST thường
Người kiểu hình lành mang gen lặn
liên kết NST X
Người chưa có thông tin hoặc thông
tin không đầy đủ về tính trạng
Người không được kiểm tra hoặc
cũng bị bệnh
Đương sự
Chết

37
Sẩy thai
Vợ chồng
Hai vợ (hai chồng)
Vợ chồng ngoài giá thú
Hôn nhân cùng huyết thống
Hôn nhân không có con
Anh chị em cùng bố mẹ
Hai hôn nhân với các con của mỗi
hôn nhân
Số con riêng không biết
Con nuôi (không cùng huyết thống)
Con sinh đôi một hợp tử
Con sinh đôi hai hợp tử
Không rõ kiểu sinh đôi là một hay
hai hợp tử
Con ngoài hôn nhân
Các thế hệ I, II, III, IV
Anh chị em cùng một thế hệ 1, 2, 3, 4…
?

38
Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
Đối tượng là bệnh nhân không phân biệt tuổi và giới tính, có hộ khẩu
thuộc 13 tỉnh và thành phố thuộc khu vực Đồng bằng sông Cửu Long được
chẩn đoán mắc bệnh -Thal dựa theo kết quả điện di Hb (Nguyễn Khắc Hân
Hoan, 2010) và tất cả người thân có mối quan hệ huyết thống trong phạm vi 3
thế hệ với bệnh nhân.
Tiêu chuẩn phân loại thể bệnh -Thal dựa theo kết quả điện di Hb theo
Nguyễn Khắc Hân Hoan, 2010:
- -Thal thể nhẹ (không cần truyền máu): HbA2 ≥3,5%; HbF<10%.
- -Thal thể phụ thuộc truyền máu: HbA<30%, HbF tăng cao (70-90%),
HbA2 bình thường hoặc thay đổi.
- Thể phối hợp -Thal/HbE: HbA<30%, HbF và HbE tăng cao, HbA2
bình thường hoặc thay đổi.
- Thể bệnh -Thal khác (δβ-Thal hoặc tăng HbF: HPFH): HbA giảm nhẹ,
HbA2 thấp hoặc bình thường, HbF tăng.
Chọn bệnh nhân theo dân tộc thì đối tượng được chọn cần phải có ít nhất
2 thế hệ trước (cha mẹ, ông bà) đều thuộc dân tộc đó.
Tiêu chuẩn loại trừ:
- Những người vắng mặt trong thời gian nghiên cứu.
- Những người không đồng ý tham gia nghiên cứu.
- Những người không xác định được nơi cư trú, những người sống ở
nước ngoài hoặc quá xa không thể tiếp cận để lấy mẫu xét nghiệm.
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ năm 2016–2018. Thu thập đối tượng nghiên cứu
tại khu vực Đồng bằng sông Cửu Long, thực hiện các xét nghiệm và kỹ thuật
sinh học phân tử, chẩn đoán trước sinh tại trung tâm nghiên cứu Thalassemia
(TRC) của trường Đại học Mahidol của Thái Lan, trung tâm Y - Sinh học phân
tử thuộc trường Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, khoa xét nghiệm Di

39
truyền Y học bệnh viện Từ Dũ, khoa Huyết học bệnh viện Trường Đại học Y
Dược Cần Thơ.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Thiết kế nghiên cứu: nghiên cứu mô tả cắt ngang
2.3.2. Cỡ mẫu và phương pháp chọn mẫu
* Xác định cỡ mẫu nghiên cứu: áp dụng công thức:
n = Z(1-α/2)
2 x p(1-p)/d2
Trong đó: Z = 1,96 (hệ số tin cậy với mức ý nghĩa α = 0,05)
p là tỷ lệ người mang gen bệnh trong các phả hệ của bệnh nhân β-Thal.
Theo nghiên cứu của Phạm Thị Phượng (2013) thì tỷ lệ này là 17,6%. Do đó,
nghiên cứu chọn p= 0,176.
d = sai số cho phép của nghiên cứu, chọn d = 0,05.
Vậy n = 223 người.
Ước tính trung bình mỗi phả hệ nghiên cứu khoảng 20 thành viên. Như
vậy, số phả hệ cần xây dựng trong nghiên cứu là 12 phả hệ.
* Chọn đối tượng xây dựng phả hệ:
- Chọn mẫu thuận tiện 12 đối tượng được xác định mắc bệnh -Thal và
do đặc điểm bệnh di truyền -Thal có liên quan với đặc điểm dân tộc nên
nghiên cứu chọn mẫu theo tỷ lệ các nhóm dân tộc. Theo kết quả thống kê dân
số khu vực ĐBSCL ngày 01/04/2011, có 4 nhóm dân tộc chính: Kinh, Khmer,
Hoa, Chăm đang sinh sống tại vùng ĐBSCL. Dân tộc Kinh khoảng 90%,
Khmer khoảng 6%, Hoa khoảng 2%, Chăm khoảng 2%. Như vậy, nghiên cứu
sẽ xây dựng: 7 phả hệ dân tộc Kinh, 3 phả hệ dân tộc Khmer, 1 phả hệ dân tộc
Hoa và 1 phả hệ dân tộc Chăm.
Thực tế chúng tôi đã nghiên cứu 12 phả hệ với 263 đối tượng bao gồm cả
12 bệnh nhân là đương sự. Như vậy, theo tỷ lệ có Cụ thể có: 151 đối tượng
dân tộc Kinh; 84 đối tượng dân tộc Khmer; 17 đối tượng dân tộc Hoa; 11 đối
tượng dân tộc Chăm tham gia nghiên cứu phả hệ.
2.3.3. Nội dung nghiên cứu
2.3.3.1. Đặc điểm chung của đối tượng nghiên cứu
- Tuổi đối tượng: tính theo năm sinh.

40
- Giới tính: ghi nhận theo giấy khai sinh gồm 2 nhóm là nam và nữ.
- Dân tộc: xác định dựa theo 3 thế hệ là Kinh, Khmer, Chăm, Hoa.
2.3.3.2. Xây dựng phả hệ, tỷ lệ người mang gen bệnh và kiểu hình
huyết học trong phả hệ (n=263)
* Phả hệ:
- Phả hệ là sơ đồ mô tả mối quan hệ của các thành viên trong gia đình,
phả hệ nghiên cứu gồm 3 thế hệ, bao gồm từ thê hệ ông bà cho đến con cháu.
Phả hệ được xây dựng dựa vào các ký hiệu phả hệ sau khi đã xác định thể
bệnh của từng thành viên trong gia đình.
- Các ký hiệu để xây dựng phả hệ:
Bảng 2.1. Một số ký hiệu sử dụng trong 12 phả hệ nghiên cứu
Các ký hiệu dùng trong 12 phả hệ vẫn đúng theo ký hiệu trong hệ thống
quốc tế (Mục 1.2.4 chương 1). Tuy nhiên, để các thể bệnh β-Thal được thể
hiện rõ ràng và thuận tiện cho quan sát, nghiên cứu sử dụng thêm các nền khác
nhau trong các ký hiệu (Bảng 2.1).
* Tỷ lệ mang gen bệnh
- Mang gen β-Thal: có sự thay đổi của MCV/MCH trong công thức máu
(MCV<80fL, MCH<28pg), điện di Hb có HbA2 ≥3,5% và tìm được một ĐB
trên gen β-globin.

41
- Mang gen HbE: có sự thay đổi của MCV/MCH trong công thức máu
(MCV<80fL, MCH<28pg), điện di có sự xuất hiện của HbE và tìm được ĐB
Cd26 A>A trên gen β-globin.
- Mang gen α-Thal: có sự thay đổi của MCV/MCH trong công thức máu
(MCV<80fL, MCH<28pg), điện di có sự xuất hiện của HbH, HbBart hoặc
không, GAP-PCR tìm được ĐB trên gen α-globin.
- Mang gen phối hợp α/β-Thal: khi có một ĐB trên gen β-globin và ĐB
trên gen α-globin.
2.3.4. Phương pháp thu thập số liệu
2.3.4.1. Công cụ, hóa chất, thiết bị trong nghiên cứu
* Công cụ, hóa chất dùng trong nghiên cứu
- Ống lấy mẫu máu chống đông EDTA, bông băng, kim tiêm.
- Micropipette các loại thể tích và đầu tip (Eppendorf).
- Kit ly trích DNA từ máu QIAamp DNA Blood Mini Kit®và Kit tinh
sạch QIAquick PCR Purification Kit® (Qiagen).
- Kit β-globin StripAssay SEA™ (ViennaLab Diagnostics GmbH,
Vienna, Austria).
- Kit MLPA Probemix P102 HBB cho nhóm gen globin ® (MRC –
Holland).
* Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
- Máy luân nhiệt Mastercycler Pro S® (Eppendorf).
- Hệ thống điện di nằm ngang và máy soi Gel Doc XR® (Bio-Rad).
- Máy ly tâm ống 1,5mL, máy vortex, máy ủ nhiệt nước, máy lắc.
- Máy xét nghiệm công thức máu Cell Dyn 3700® (Abbott).
- Máy điện di Hb Cappilarys 2® (Sebia).
2.3.4.2. Kỹ thuật sinh học tử dùng trong nghiên cứu
* Kỹ thuật điện di Hb
- Nguyên lý: điện di Hemoglobin hay còn được gọi là điện di huyết sắc
tố nhằm đánh giá thành phần và tỷ lệ Hb trong máu. Hiện nay, kỹ thuật này

42
được thực hiện dễ dàng nhờ hệ thống điện di mao quản. Hệ thống máy sẽ
phân tích thành phần và % của từng loại Hb dựa trên sự di chuyển khác nhau
của các phân tử chất (mang điện tích) trong cột mao quản dưới ảnh hưởng của
điện trường được tạo bởi điện áp cao thế (15-30kV) đặt vào hai đầu mao quản.
- Các bước chính của kỹ thuật điện di Hb:
+ Kiểm tra thông tin, chất lượng mẫu máu đông bằng EDTA.
+ Quay ly tâm ống máu 5000 vòng trong 5 phút.
+ Hút bỏ tối đa phần thể tích huyết tương, rồi vortex trong 5 giây.
+ Mở máy Capilarrys và chương trình phần mềm để khởi động máy.
+ Đưa ống chứa mẫu máu và ống chứa dung dịch ly giải vào máy.
+ Máy sẽ hút mẫu, xử lý và điện di tự động. Kết quả định lượng tương
đối và tỷ lệ các Hb sẽ được phần mềm phân tích tự động.
Hình 2.1. Biểu đồ biểu hiện kết quả điện di
* Một số kỹ thuật sinh học phân tử dùng trong nghiên cứu
- Ly trích DNA
Các mẫu được ly trích DNA bằng Kit ly trích của Qiagen. Tế bào bị phá
vỡ và ly giải bằng Binding buffer và proteinase K. Dịch ly giải được lọc qua
cột lọc với nồng độ muối cao. Màng gel silica trong cột lọc giữ DNA lại và
cho các chất khác trôi qua. DNA tinh sạch được hoà tan vào dung dịch đệm có
nồng độ muối thấp.

43
Dung dịch DNA tinh sạch được đo nồng độ DNA ở bước sóng
260/280mm trên máy BioMate 3 và phải đảm bảo độ tinh sạch OD260/OD280
1,7 trước khi sử dụng trong PCR.
Hình 2.2. Quy trình tách chiết DNA từ máu ngoại vi bằng Kit QIAGEN
- Kỹ thuật lai dò ngược - Reverse Dot Blot (RDB)
Nguyên lý: Kỹ thuật RDB xác định các ĐB gen β-globin (kiểu phổ biến
ở khu vực Đông Nam Á) dựa trên nguyên lý của phản ứng PCR khuếch đại
các đoạn gen đích với các mồi (primer) có gắn Biotin đặc hiệu cho từng ĐB và
các gen đích này sẽ được gắn với các đầu dò đặc hiệu ASO (Alen-specific
oligonucleotide) đã được tích hợp sẵn trên màng nylon.
Hình 2.3. Các bước chính trong RDB
RDB là một phương pháp không dùng chất phóng xạ, các ĐB sẽ được
phát hiện bằng màu trên cùng một dải màng nylon nhờ các primer có gắn

44
Biotin sẽ kết hợp với Streptavidin alkaline photphat và giải phóng cơ chất tạo
màu (Maggio A, et al, 1993; Giambona A, et al, 1995). (Hình 2.3).
Các bước chính của kỹ thuật:
Có 3 bước chính trong kỹ thuật RDB nhằm phát hiện 22 ĐB phổ biến ở
khu vực Đông Nam Á (Hình 2.4).
Hình 2.4. Strip mang 22 kiểu đột biến và thể bệnh -Thal tương ứng.
+ DNA được ly trích và khuếch đại bằng phản ứng PCR với primer có
gắn Biotin với Amplification Mix với Taq Dilution Buffer theo chu trình
nhiệt:
. 2 phút ở 940C x 1 chu kỳ.
. 15 giây ở 940C, 580C 30 giây và 45 giây ở 720C x 35 chu kỳ.
+ Lai sản phẩm khuếch đại với các ASO probe được gắn sẵn trên màng
lai (Strip) với DNAT và hibridization buffer khoảng 30 phút ở 450C.
+ Rửa Strip đã lai với Wash Solution khoảng 15 phút ở 450C.
+ Phát triển màu trên máy lắc và trong tối với dung dịch Color Developer ở
nhiệt độ phòng tối đa không quá 15 phút.
Kiểu đột biến Thể -Thal

45
+ Đọc kết quả: kiểu ĐB của một mẫu được xác định bằng cách so các
Strip lai với Strip chuẩn trong tờ CollectorTM. Từng ĐB sẽ được xem xét, có 3
trường hợp (Hình 2.5).
. Không có ĐB (bình thường) nếu chỉ xuất hiện một vạch ở băng chứng
mà không có vạch ở băng đột biến.
. Đột biến gen ở dạng dị hợp tử nếu cả hai băng ĐB và băng chứng đều
xuất hiện màu.
. Đột biến gen dạng đồng hợp tử nếu chỉ xuất hiện vạch ở băng ĐB.
Hình 2.5. Đọc kết quả kỹ thuật RDB
(1) Bình thường (2) Dị hợp tử (3) Đồng hợp tử
* Kỹ thuật Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA)
- Nguyên lý: MLPA là kỹ thuật khuếch đại đa đoạn dò (probe), được
mô tả lần đầu tiên năm 2002 bởi Schouten, J.P. et al trên tạp chí Nucleic
Acids Res. MLPA còn được gọi là kỹ thuật bán định lượng dùng để xác định
số lượng bản sao của các trình tự DNA trong một phản ứng PCR. Kỹ thuật
sử dụng nhiều đoạn dò có khả năng lai hóa với phân tử DNA đích đặc hiệu.
Việc thiết kế các đoạn dò rất quan trọng. Mỗi đoạn dò gồm 2 đoạn có bản
chất là oligonucleotide (đoạn dò xuôi và đoạn dò ngược).
+ Đoạn dò xuôi:
Đầu 5’: trình tự giống nhau cho tất cả các đoạn dò, là vị trí gắn mồi Y
(mồi xuôi) để khuếch đại đoạn dò khi tiến hành các phản ứng PCR.
Đầu 3’: có trình tự đặc hiệu với đoạn DNA đích (trình tự lai). Trình tự
này sẽ bắt cặp với DNA đích khi tiến hành phản ứng.
+ Đoạn dò ngược:
Đầu 3’: trình tự giống nhau cho tất cả các đoạn dò, là vị trí gắn với mồi
X (mồi ngược) để khuếch đại đoạn dò khi tiến hành các phản ứng PCR.
Đầu 5’: gắn đặc hiệu với trình tự của DNA đích khi tiến hành phản ứng
lai. Ngoài ra, giữa đầu 5’ với đầu 3’ còn đoạn nối gọi là đoạn đệm được thiết

46
kế dài ngắn khác nhau ở các đoạn dò nhằm giúp các đoạn dò có kích thước
khác nhau, có thể tách ra khi điện di. Đoạn đệm và trình tự gắn mồi không đặc
hiệu với trình tự DNA đích nên không gắn vào DNA đích khi lai (Hình 2.6).
Hình 2.6. Cấu tạo đoạn dò trong kỹ thuật MLPA
Các đoạn dò sẽ gắn đặc hiệu vào trình tự của phân tử DNA đích ở vị trí
sát nhau. Kế đó, enzyme ligase được thêm vào để nối hai đoạn dò này lại tạo
thành đoạn dò hoàn chỉnh và DNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR với
chỉ một cặp mồi đặc hiệu (gắn vào vùng Y và X). Nếu DNA đích bị ĐB mất
đoạn thì không có hiện tượng lai đoạn dò. Do đó, khi điện di mao quản sẽ
không thấy hình ảnh đỉnh dò tương ứng với exon bị ĐB mất đoạn.
- Các bước chính của kỹ thuật:
+ Biến tính DNA: ủ 5 phút ở 98oC.
+ Phản ứng lai đoạn dò với DNA đích: bổ sung SALSA
probemix và đệm MLPA và ủ 1 phút ở 95oC + 16 đến 20 giờ ở 60oC.
+ Phản ứng nối các đoạn dò: bổ sung ligase mix và ủ 15 phút ở 54oC, sau
đó ủ để bất hoạt ligase: 5 phút ở 98oC.
+ Phản ứng PCR khuếch đại đoạn dò: bổ sung SALSA PCR primer mix,
và SALSA polymerase; chạy PCR.
+ Điện di mao quản trên hệ thống máy GenomeLab GeXP (Beckman
Coulter). Kết quả sau khi chạy điện di sẽ được phân tích tự động để tìm ĐB
mất đoạn gen β-globin nhờ vào phần mềm GeneMarker version 1.97
(Softgenetics, State College, PA). Kết quả sẽ được hiển thị dưới dạng bảng và
dạng biểu đồ sóng (Hình 2.7).

47
+ Đọc kết quả dựa vào chỉ số DQ (dosage quotient), là số lượng bản sao
của các đoạn dò thể hiện ở chiều cao các đỉnh của mẫu (đỉnh màu xanh) với
đỉnh của mẫu chứng (đỉnh màu đỏ).
Bảng 2.2. Chỉ số DQ đọc kết quả MLPA
Trạng thái số lượng bản sao DQ
Bình thường 0,8< DQ <1,2
Mất đoạn đồng hợp tử DQ = 0
Mất đoạn dị hợp tử 0,4 < DQ < 0,65
Hình 2.7. Kết quả của kỹ thuật MLPA
Màu đỏ (bên trái): mẫu đối chứng. Màu xanh (bên phải): mẫu bệnh nhân
Đỉnh chỉ dấu mũi tên: mang đột biến mất đoạn ở dạng dị hợp tử.
* Kỹ thuật GAP-PCR
- Nguyên lý: kỹ thuật GAP-PCR thường được sử dụng để phát hiện các
ĐB mất đoạn trong bệnh α-globin hay đột biến -619bp của gen β-globin
thường gặp ở người Ấn Độ. Đây là phương pháp PCR sử dụng hai đoạn mồi
bắt cặp với cả chuỗi bình thường và chuỗi ĐB ở vùng gần vị trí bị mất đoạn.
Với các ĐB mất đoạn nhỏ hơn một kilobase, cặp mồi sẽ tạo ra hai sản phẩm
khác nhau, sản phẩm nhỏ hơn là của alen ĐB. Còn các ĐB mất đoạn lớn hơn
khoảng cách giữa hai mồi là alen bình thường và quá xa để khuếch đại nên chỉ
có sản phẩm PCR của alen ĐB. Trong trường hợp này các alen được nhận diện
dựa vào kích thước sản phẩm (Chong et al, 2000).

48
* Các bước chính của kỹ thuật:
+ DNA đã ly trích được thực hiện phản ứng mutiplex PCR với 13 primer
đặt hiệu (LIS1-R và LIS1-F là primer chứng dương) nhằm phát hiện 6 loại ĐB
gây bệnh α-Thal phổ biến tại Việt Nam: α3.7, α2, α4.2, SEA, FIL, THAI (Bảng
2.3) theo chu trình nhiệt:
. 10 giây ở 980C, 600C 1 phút và 2,5 phút ở 720C x 30 chu kỳ.
Bảng 2.3. Trình tự các primer trong phản ứng GAP-PCR
Mồi Trình tự (5’ đến 3’) Vị trí trên GenBank
LIS1-F GTCGTCACTGGCAGCGTAGATC HSLIS10: 407-428
LIS1-R GATTCCAGGTTGTAGCGGACTG HSLIS10: 2909-2887
α2/α3.7-F CCCCTCGCCAAGTCCACCC HUMHBA4: 5676-5694
α3.7-R AAAGCACTCTAGGGTCCAGCG HUMHBA4: 11514-11494
α2-R AGACCAGGAAGGGCCGGTG HUMHBA4: 7475-7457
α4.2-F GGTTTACCCATGTGGTGCCTC HUMHBA4: 3064-3084
α4.2-R CCCGTTGGATCTTCTCATTTCCC HUMHBA4: 8942-8920
SEA-F CGATCTGGGCTCTGTGTTCTC HSGG1: 26120-26140
SEA-R AGCCCACGTTGTGTTCATGGC HSCOS12: 3817-3797
FIL-F TGCAAATATGTTTCTCTCATTCTGTG HSGG1: 11684-11709
FIL-R ATAACCTTTATCTGCCACATGTAGC HSCOS12: 570-546
THAI-F GGCACTGAGAGCCCTTCACG HSGG1: 9723-9742
THAI-R CAAGTGGGCTGAGCCCTTGAG HSCOS12: 1241-1221
+ Đọc kết quả dựa vào kích thước sản phẩm (Bảng 2.4) so với thang
chuẩn 1kp-Plus khi chạy điện di trên gel agarose (Hình 2.8).
Bảng 2.4. Kích thước các loại đột biến
Đột biến LIS1 α3.7 α2 α4.2 SEA FIL THAI
Kích thước sản phẩm (bp) 2503 2022 1800 1628 1349 1166 1024

49
Hình 2.8. Hình điện di sản phẩm PCR phát hiện đột biến α-Thal trên gel
2.3.4.3. Các bước tiến hành thu thập số liệu
- 12 bệnh nhân và người có quan hệ huyết thống 3 thế hệ đồng ý tham
gia nghiên cứu, lấy thông tin theo phụ lục 3 và 2mL máu tĩnh mạch, chống
đông bằng EDTA làm công thức máu 18 thông số tại Khoa Huyết học, bệnh
viện Trường Đại học Y Dược Cần Thơ.
- Người nhà tham gia nghiên cứu có kết quả dương tính với chỉ số MCV
và/hoặc MCH sẽ được thực hiện kỹ thuật điện di Hb tại Trung tâm chẩn đoán
Y khoa Medic, thành phố Hồ Chí Minh để tìm người mang gen bệnh.
- Người mang gen bệnh sẽ được ly trích DNA và thực hiện xác định 22
kiểu ĐB phổ biến bằng kỹ thuật RDB để xác định thể bệnh β-Thal và GAP-
PCR tìm ĐB gây α-Thal.
- Tổng kết vẽ phả hệ theo quy ước quốc tế, xác định tỷ lệ mang gen bệnh
và tỷ lệ các thể bệnh trong các phả hệ nghiên cứu.

50
2.3.4.4. Sơ đồ nghiên cứu
Sơ đồ 2.1. Các bước chính trong nghiên cứu
2.3.5. Phương pháp hạn chế sai số
Những người tham gia nghiên cứu được tập huấn thành thạo và thống
nhất nhau, có làm thử để rút kinh nghiệm. Mỗi thông số nghiên cứu được thực
hiện bởi một vài người nhất định.
Các máy móc, dụng cụ, hóa chất xét nghiệm được hiệu chuẩn đúng quy
định và sử dụng thống nhất trong suốt quá trình nghiên cứu. Các xét nghiệm
được xác định hệ số biến thiên của kỹ thuật trước khi tiến hành và phải đảm
bảo theo tiêu chuẩn kỹ thuật của nhà sản xuất.
Sử dụng người giám sát thu thập thông tin, kiểm tra tính đầy đủ, chính
xác của thông tin thu thập được.
12 bệnh nhân và
gia đình
Công thức
máu 18 thông số
Dương tính MCV, MCH
Điện di
Hb
Xây dựng
12 phả hệ
Xác định ĐB α
bằng GAP-PCR
PCR
Xác định ĐB β bằng
RDB hoặc MLPA
Xác định
các thể bệnh
Xác định
tỷ lệ mang gen
KẾT QUẢ

51
2.3.6. Phương pháp xử lý số liệu
- Số liệu được xử lý thống kê trên phần mềm Excell, Stata 8.0.
- Thống kê mô tả:
+ Tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của các biến định lượng.
+ Tính tần số, tỷ lệ với các biến định tính.
- Thống kê phân tích:
+ So sánh sự khác biệt giữa hai tỷ lệ bằng kiểm định 2.
+ Đánh giá sự khác biệt có ý nghĩa khi p<0,05.
- Trình bày các kết quả bằng: bảng, biểu đồ và sơ đồ.
2.4. Đạo đức trong nghiên cứu
Thực hiện nghiên cứu này không vi phạm vấn đề y đức vì được
thực hiện dựa trên sự tự nguyện tham gia của các đối tượng thông qua
phiếu đồng thuận nghiên cứu.
Tất cả thông tin của đối tượng được giữ hoàn toàn bí mật và chỉ sử
dụng cho mục đích nghiên cứu. Các báo cáo kết quả không ghi nhận tên
hay những thông tin liên quan đến bệnh nhân và người nhà.
Các đối tượng được chọn có quyền từ chối tham gia nghiên cứu bất
cứ khi nào. Nếu từ chối tham gia, họ vẫn được hướng dẫn theo dõi và điều
trị bình thường như những người khác.
Đề cương nghiên cứu đã được Hội đồng khoa học, trường Đại học Y
Dược Cần Thơ thông qua.

52
Chương 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Trong thời gian 2016 đến 2018, có 12 gia đình bệnh nhân với 263 thành
viên đồng ý tham gia nghiên cứu sự di truyền bệnh qua phả hệ. Các kết quả
khảo sát được mô tả bằng bảng số liệu, biểu đồ và sơ đồ.
3.1. Đặc điểm của đối tượng nghiên cứu
Bảng 4.1. Phân bố độ tuổi, giới tính theo các dân tộc của đối tượng xây dựng
phả hệ
Dân tộc
Tuổi trung
bình
Nam Nữ Tỷ số
Nam:nữ
n % n %
Kinh (n=151) 31,3±18 70 46,4 81 53,6 1:1,2
Khmer (n=84) 31,6±18,1 38 45,2 46 54,8 1:1,2
Chăm (n=11) 34,4±17,8 5 45,5 6 54,5 1:1,2
Hoa (n=17) 25,6±21,1 9 52,9 8 47,1 1,1:1
Tổng (n=263) 31,2±18,3 122 50,6 141 49,4 1:1,2
Nhận xét:
Tỷ số nam:nữ phân bố khác nhau ở từng dân tộc. Dân tộc Hoa, tỷ lệ nam
cao hơn nữ 1,1 lần, dân tộc Kinh, Khmer, Chăm, tỷ lệ nữ cao hơn nam 1,2 lần.
Tuổi trung bình của nhóm nghiên cứu là 31,2±18,3.
Có 122/263 (50,6%) đối tượng là nam và 141/263 (49,4%) là nữ. Tỷ số
nam:nữ chung trong nghiên cứu là 1:1,2.
3.2. Phả hệ di truyền của một số bệnh nhân Beta thalassemia (n=263)
gen và các đột biến trong phả hệ nghiên cứu
Người nhà của 12 đương sự (251/263 đối tượng) tham gia nghiên cứu
trong phả hệ được làm xét nghiệm và nhiều kỹ thuật để sàng lọc tìm người
mang gen cũng như xác định kiểu ĐB (Sơ đồ 4.1).

53
* Công thức máu
251 người nhà được sàng lọc ông thức máu 18 thông số.
146/251 (58,2%) đối tượng có kết quả dương tính với chỉ số MCV/MCH
(MCV<80fL, MCH<28pg).
* Điện di Hb
146 người nhà dương tính qua sàng lọc công thức máu được thực hiện
điện di Hb để tìm thể bệnh và xác định người mang gen bệnh, kết quả:
Có 103/146 (70,5%) người nhà có kết quả dương tính với bệnh β-Thal: 9
thể phối hợp HbE/β-Thal (HbE và HbF cao), 2 thể HbEE (HbE cao>90%), 59
thể dị hợp tử β-Thal (HbA2 >3,5), 33 thể dị hợp HbE (HbE tăng cao).
Sơ đồ 3.1. Các bước sàng lọc, xác định người mang gen và các đột biến trong
12 phả hệ nghiên cứu
* Kỹ thuật RDB tìm đột biến gây bệnh β-Thal
103 bệnh nhân có kết quả điện di dương tính với bệnh β-Thal được thực
hiện RDB tìm đột biến, kết quả:
- 101/103 (98,1%) bệnh nhân tìm được ĐB trên gen β-globin.
- 2 bệnh nhân không tìm được ĐB tiếp tục tìm ĐB bằng kỹ thuật MLPA.
- Có 4/22 kiểu ĐB được phát hiện trên các mẫu bệnh nhân: -28 A>G,
Cd17 A>T, Cd26 G>A và Cd41/42 –TTCT.
(-)
(+)
(+) β
(+)
251 người nhà
BN beta
KẾT
QUẢ
CÁC
KIỂU
ĐB
Ngừng XN
103 RDB
tìm ĐB
(-)
Công thức
máu
146 BN
điện di Hb
GAP-PCR 2 MLPA

54
4 3 2 1
Hình 3.1. Kết quả một số mẫu bệnh nhân phát hiện đột biến bằng RDB
(1). Bệnh nhân HbE /β-Thal Cd26 G>A và Cd41/42 –TTCT; (2). Bệnh nhân dị hợp
tử kép Cd17 A>T và Cd41/42 –TTCT; (3). Bệnh nhân HbE /β-Thal Cd26 G>A và
Cd17 A>T; (5). Bệnh nhân dị hợp tử kép -28 A>G và Cd41/42 –TTCT.
* Kỹ thuật GAP-PCR tìm đột biến gây bệnh α-Thal
146 bệnh nhân có kết quả dương tính với công thức máu được thực hiện
GAP-PCR. Kết quả 8/8 bệnh nhân có đột biến -SEA.
8 bệnh nhân mang có đột biến -SEA có: 6/8 bệnh nhân là người chỉ mang
gen gây bệnh α-Thal và 2/8 bệnh nhân là người mang gen phối hợp α và β-
Thal (thể dị hợp tử phối hợp ĐB của α/β-Thal ) do cả 2 bệnh nhân này ngoài
đột biến –SEA, kỹ thuật RDB cũng tìm được ĐB gây bệnh β-Thal.

55
* Kỹ thuật MLPA
Kỹ thuật được thực hiện trên 2 bệnh nhân dương tính với β-Thal nhưng
chưa phát hiện được ĐB bằng kỹ thuật RDB. Kết quả: 2 bệnh nhân đều mang
cùng 1 đột biến (δβ)del, mất đoạn từ exon 3 thuộc gen Delta (HbD) đến 0,5kb
sau của exon 3 thuộc gen β-globin.
Hình 3.2. Đột biến (δβ)del được phát hiện bằng MLPA
(Dấu mũi tên chỉ vùng bị mất đoạn)
Nhận xét chung:
Xét nghiệm công thức máu và các kỹ thuật đã xác định được tất cả các
thể bệnh và các kiểu ĐB trong 12 phả hệ.
Có 103/146 (70,5%) bệnh nhân bất thường công thức máu được chẩn
đoán qua điện di là mắc bệnh thalassemia.
100% bệnh nhân có bất thường điện di đều tìm được đột biến.
Điện di Hb xác định chính xác các thể bệnh β-Thal, nhưng nếu không sử
dụng kỹ thuật RDB và GAP-PCR để tìm kiểu ĐB sẽ có 2/103 (1,9%) bệnh
nhân dị hợp tử phối hợp ĐB của α/β-Thal không được phát hiện.
3.2.2. Xây dựng phả hệ di truyền
Có tổng 12 bệnh nhân β-Thal và 251 người nhà tham gia trong 12 phả
hệ. Trong đó có 141 nữ và 122 nam, ngoài ra các phả hệ còn có 2 thai nhi bị
sảy, 1 thai đang phát triển và 1 bị chấm dứt thai kỳ do kết quả chẩn đoán trước
sinh thai nhi ở thể bệnh β-Thal đồng hợp tử βCd41/42.
3.2.2.1. Phả hệ di truyền của bệnh nhân β–Thal dân tộc Kinh

56
* Phả hệ gia đình Kinh 01
Bệnh nhân: N. T. P – Sinh năm 1995.
Địa chỉ: huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre.
Kiểu gen: β0/β+
Kiểu phối hợp đột biến: βCd17/βHbE
Thể bệnh: HbE/β-Thal.
Biểu đồ 3.1. Tần số mắc bệnh trong phả hệ Kinh 01
Sơ đồ 3.2. Phả hệ gia đình Kinh 01
Nhận xét:
Có 4 kiểu phối hợp ĐB cho 3 thể bệnh trong phả hệ: HbE/β-Thal, dị hợp
tử β-Thal và HbE. Trong đó thể HbE/β-Thal có 2 kiểu: βCd41/42/HbE và
βCd17/HbE
Đương sự III.1 và em trai III.2 đều thuộc thể HbE/β-Thal do nhận ĐB
HbE từ bố II.2 và βCd17 từ mẹ II.1.
Em họ III.7 có kiểu phối hợp đột biến βCd41/42/HbE khác với đương sự do
được nhận đột biến βCd41/42 từ bố II.7.
Các ĐB thế hệ sau có được là do di truyền. Chưa ghi nhận sự xuất hiện
ĐB mới qua phả hệ.
Bệnh nhân: P. B. A - Sinh năm 2004.

57
Địa chỉ: thành phố Bến Tre, tỉnh Bến tre.
Kiểu gen: β0/β+
Kiểu phối hợp đột biến: βCd41/42/βHbE
Thể bệnh: HbE/β-Thal.
Nhận xét:
tử β-Thal và HbE.
Đương sự III.1 mang thể HbE/β-Thal do nhận đột biến HbE từ bố II.1 và
βCd41/42 từ mẹ II.2.
Bệnh nhân: T. V. N - Sinh năm: 2012.
Địa chỉ: huyện Vĩnh Lợi, tỉnh Bạc Liêu
Kiểu gen: β0/β0
Kiểu phối hợp đột biến: βCd41/42/βCd41/42
Thể bệnh: đồng hợp tử.

58
Nhận xét:
Có 2 kiểu phối hợp ĐB cho 2 thể bệnh trong phả hệ: đồng hợp tử
βHomoCd41/42, dị hợp tử β-Thal.
Đương sự III.4 thuộc thể đồng hợp tử do cùng nhận đột biến βHomoCd41/42
từ bố II.6 và mẹ II.5.
Em của đương sự bị chấm dứt thai kỳ ở 24 tuần do mang ĐB đồng hợp
tử βHomoCd41/42 như đương sự.
Bệnh nhân: M. T. A. N - Sinh năm 2012.
Địa chỉ: huyện Phụng Hiệp, tỉnh Hậu Giang
Kiểu gen: β0/β+
Kiểu phối hợp đột biến: β-28/βCd41/42
Thể bệnh: dị hợp tử kép

59
Nhận xét:
Có 5 kiểu phối hợp ĐB cho 4 thể bệnh trong phả hệ: dị hợp tử kép
β-28/βCd41/42, dị hợp tử β-Thal có 2 kiểu β-28; βCd41/42, dị hợp tử α-Thal do đột
biến -SEA và dị hợp tử phối hợp α/β-Thal (I.5 và II.5).
Đương sự III.01 thuộc thể dị hợp tử kép β-28/βCd41/42 do nhận đột biến β-28
từ bố II.4 và βCd41/42 từ mẹ II.5.
Có sự xuất hiện giống nhau cả đột biến -SEA và βCd41/42 trong hai gia
đình bên ông ngoại I.6 và bà ngoại I.5 của đương sự.
Bệnh nhân: L. T. T. T - Sinh năm 1995.
Địa chỉ: huyện Châu Thành, tỉnh Kiên Giang.
Kiểu gen: β0/β+
Thể bệnh: HbE/β-Thal

60
Nhận xét:
tử β-Thal và HbE trong phả hệ. Trong đó thể dị hợp tử kép có 2 kiểu:
βCd17/HbE và βCd17/HbE.
Đương sự II.11 và 4 anh chị em khác: II.8, II.9, II.10, II.12 đều thuộc thể
HbE/β-Thal do nhận đột biến HbE kết hợp với βCd17 từ mẹ.
Hai thai nhi bị sảy do được mang thai từ người mẹ II.8 mắc bệnh β-Thal
thể HbE/β-Thal.
Cặp vợ chồng I.9 và I.10 đều mang gen bệnh nhưng các con II.17 và
II.18 không ai mắc bệnh β-Thal thể nặng do sự tổ hợp 2 ĐB của bố và mẹ.
Bệnh nhân: T. P. T - Sinh năm 2012.
Địa chỉ: huyện Cù Lao Dung, tỉnh Sóc Trăng.
Kiểu gen: β0/β+
Kiểu phối hợp đột biến: β-28/βCd17

61
Nhận xét:
Có 3 kiểu phối hợp ĐB cho 2 thể bệnh trong phả hệ: dị hợp tử kép β-
28/βCd17, dị hợp tử β-Thal với 2 kiểu β-28 và βCd17.
Đương sự IV.4 thuộc thể dị hợp tử kép do nhận đột biến β-28 từ bố III.4
và βCd17 từ mẹ III.3.
Phả hệ có 4 thế hệ, các ĐB thế hệ sau có được là do di truyền. Chưa ghi
nhận sự xuất hiện ĐB mới qua phả hệ.
Bệnh nhân: V. T. H. N - Sinh năm 2003.
Địa chỉ: huyện Kế Sách, tỉnh Sóc Trăng
Kiểu gen: β0/β+

62
Nhận xét:
Đương sự III.08 thuộc thể HbE/β-Thal do nhận đột biến HbE từ bố II.10
và βCd17 từ mẹ II.9.
3.2.2.2. Phả hệ di truyền của bệnh nhân β–Thal dân tộc Khmer
* Phả hệ gia đình Khmer 01
Bệnh nhân: D. D - Sinh năm 2012.
Địa chỉ: huyện Giồng Riềng, tỉnh Kiên Giang
Kiểu gen: β0/β+

63
Biểu đồ 3.8. Tần số mắc bệnh trong phả hệ Khmer 01
Sơ đồ 3.9. Phả hệ gia đình Khmer 01
Nhận xét:
tử β-Thal và đồng hợp tử HbEE và dị hợp tử HbE.
Đương sự III.8 thuộc thể HbE/β-Thal do nhận đột biến HbE từ mẹ II.12
và βCd41/42 từ bố II.11.
Bệnh nhân: T. Q. T – Sinh năm 2004.
Địa chỉ: huyện Hòn Đất, tỉnh Kiên Giang
Kiểu gen: β0/β+

64
Nhận xét:
Có 3 kiểu phối hợp ĐB cho 3 thể bệnh trong phả hệ: dị hợp tử kép, dị
hợp tử β-Thal và HbE.
và βCd41/42 từ bố II.1.
2 người chú ruột II.15, II.16 cũng có kiểu phối hợp ĐB tương tự như
đương sự.
Bệnh nhân: D. K. D - Sinh năm 2012.
Địa chỉ: huyện Ngã 5, tỉnh Sóc Trăng.
Kiểu gen: β0/β+

65
Nhận xét:
tử β-Thal, đồng hợp tử HbEE và dị hợp tử HbE.
và βCd17 từ bố II.2.
3.2.2.3. Phả hệ di truyền của bệnh nhân β–Thal dân tộc Hoa
Bệnh nhân: K. V. C - Sinh năm 2012.
Địa chỉ: huyện Vĩnh Châu, tỉnh Sóc Trăng
Kiểu gen: β0/β+
Biểu đồ 3.11. Tần số mắc bệnh trong phả hệ gia đình Hoa

66
Sơ đồ 3.12. Phả hệ gia đình Hoa
Nhận xét:
Đương sự III.4 thuộc thể HbE/β-Thal do nhận đột biến HbE từ mẹ II.3 và
βCd41/42 từ bố II.4.
3.2.2.4. Phả hệ di truyền của bệnh nhân β–Thal dân tộc Chăm
Bệnh nhân: M. A - Sinh năm 2012.
Địa chỉ: huyện Châu Đốc, tỉnh An Giang
Kiểu gen: β0/β+
Kiểu phối hợp đột biến: (δβ)del
Biểu đồ 3.12. Tần số mắc bệnh trong phả hệ gia đình Chăm

67
Sơ đồ 3.13. Phả hệ gia đình Chăm
Nhận xét:
Có 2 kiểu phối hợp ĐB cho 2 thể bệnh trong phả hệ: dị hợp tử β-Thal và
HbE.
Đương sự III.1 thuộc thể dị hợp tử do nhận ĐB (δβ)del từ bố II.1
Cặp vợ chồng I.1 và I.2 đều mang gen bệnh nhưng không có thành viên
nào ở thế hệ thứ 2 mắc bệnh nặng do 2 đột biến tạo ra.
ĐB mới qua phả hệ và phả hệ không có ai mắc bệnh thể nặng.
Nhận xét chung:
11/12 phả hệ có 3 thế hệ, chỉ có duy nhất một phả hệ có 4 thế hệ tham gia
nghiên cứu và số người trung bình trong mỗi phả hệ khoảng 22 người.
8/12 phả hệ gia đình bệnh nhân là dạng phối hợp HbE/β-Thal: 4 dân tộc
Kinh, 03 dân tộc Khmer và 1 dân tộc Hoa.
1/12 phả hệ gia đình bệnh nhân dân tộc Kinh là dạng dị hợp kép.
1/12 phả hệ gia đình bệnh nhân dân tộc Kinh là dạng đồng hợp tử.
1/12 phả hệ gia đình bệnh nhân dân tộc Kinh là dạng đồng hợp tử và có
thêm ĐB gây bệnh α-Thal.
1/12 phả hệ gia đình bệnh nhân dân tộc Chăm mang HbE và ĐB gây
bệnh beta hiếm gặp là (δβ)del.
Tất cả các bệnh nhân β-Thal (có hai ĐB) và người mang gen bệnh (có 1
đột biến) trong phả hệ đều được di truyền và tổ hợp các ĐB từ bố mẹ, ông bà ở
thế thệ thứ I và thứ II.
100% phả hệ mang đặc điểm di truyền gen lặn trên NST thường theo quy
luật của Mendel.

68
3.3. Tỷ lệ mang gen bệnh, tỷ lệ các kiểu đột biến và các thể bệnh
trong phả hệ nghiên cứu
3.3.1. Tỷ lệ mang gen bệnh trong phả hệ nghiên cứu
Bảng 3.2. Tỷ lệ mang gen bệnh trong 12 phả hệ
Phả hệ
β-Thal HbE α-Thal α/β-Thal
n % n % n % n %
Kinh 01 (n=24) 3 12,5 9 37,5 - - - -
Kinh 02 (n=12) 6 50 1 8,3 - - - -
Kinh 03 (n=15) 5 33,3 - - - - - -
Kinh 04 (n=26) 6 23,1 - - 6 23,1 2 7,7
Kinh 05 (n=32) 3 9,4 7 21,9 - - - -
Kinh 06 (n=21) 5 23,8 - - - - - -
Kinh 07 (n=21) 5 23,8 1 4,8 - - - -
Khmer 01 (n=40) 6 15 1 2,5 - - - -
Khmer 02 (n=34) 11 32,4 4 11,7 - - - -
Khmer 03 (n=10) 3 30 2 20 - - - -
Hoa (n=17) 4 23,5 3 17,6 - - - -
Chăm (n=11) 3 27,3 3 27,3 - - - -
Tổng (n=263) 60 22,8 31 11,8 6 2,3 2 0,8
Nhận xét:
Tỷ lệ mang gen β và HbE chung cho 12 phả hệ khá cao 34,6% và là
35,4% nếu tính cả người mang gen phối hợp α/β-Thal. Tỷ lệ xuất hiện của các
thể bệnh β-Thal thể nặng cũng thay đổi theo từng phả hệ: 4,8%-15,6%.
Bên cạnh các gen gây bệnh β-Thal, ở phả hệ Kinh 04 còn thấy sự xuất
hiện của người mang gen α và người dị hợp tử phối hợp α/β-Thal.
Ở mỗi phả hệ tỷ lệ mang gen bệnh β và HbE đều ≤50%. Tỷ lệ mang gen
β khác nhau từ 9,4%-50%, tỷ lệ mang gen HbE từ 0-37,5%.

2. Nghiên cứu sự di truyền bệnh Beta-Thalassemia trong một số gia đình bệnh nhân khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long-PHạm Thi NGọc NGa.docx

2. Nghiên cứu sự di truyền bệnh Beta-Thalassemia trong một số gia đình bệnh nhân khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long-PHạm Thi NGọc NGa.docx

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to 2. Nghiên cứu sự di truyền bệnh Beta-Thalassemia trong một số gia đình bệnh nhân khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long-PHạm Thi NGọc NGa.docx

Similar to 2. Nghiên cứu sự di truyền bệnh Beta-Thalassemia trong một số gia đình bệnh nhân khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long-PHạm Thi NGọc NGa.docx (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (20)

2. Nghiên cứu sự di truyền bệnh Beta-Thalassemia trong một số gia đình bệnh nhân khu vực Đồng bằng Sông Cửu Long-PHạm Thi NGọc NGa.docx