Luận văn Phát hiện đột biến gen gây bệnh p-thalassemia bằng kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR.Thalassemia là tên gọi một bệnh thiếu máu tan máu di truyền, do giảm hoặc mất hoàn toàn sự tổng hợp của một loại chuỗi globin trong phân tử hemoglobin và P-thalassemia là một thể bệnh trong số đó. Đây là một trong những bệnh huyết sắc tố phổ biến nhất, phân bố trên toàn thế giới cũng như khu vực châu Á [1]. Theo thống kê của WHO (1981) có khoảng 241 triệu người trên thế giới mắc bệnh. Cũng theo ước tính của WHO (2008) hàng năm có khoảng 300.000 trẻ mới đẻ bị các thể nặng của thalassemia

1. LUANVANYHOC.COM TẢI LUẬN VĂN,LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC,
TÌM TÀI LIỆU Y HỌC THEO YÊU CẦU LH 0915.558.890
Luận văn Phát hiện đột biến gen gây bệnh p-thalassemia bằng kỹ thuật
Multiplex ARMS-PCR.Thalassemia là tên gọi một bệnh thiếu máu tan máu di
truyền, do giảm hoặc mất hoàn toàn sự tổng hợp của một loại chuỗi globin trong
phân tử hemoglobin và P-thalassemia là một thể bệnh trong số đó. Đây là một
trong những bệnh huyết sắc tố phổ biến nhất, phân bố trên toàn thế giới cũng như
khu vực châu Á [1]. Theo thống kê của WHO (1981) có khoảng 241 triệu người
trên thế giới mắc bệnh. Cũng theo ước tính của WHO (2008) hàng năm có khoảng
300.000 trẻ mới đẻ bị các thể nặng của thalassemia [2].
MÃ TÀI LIỆU THS.00107
Giá : 50.000đ
Liên Hệ 0915.558.890
Ở Việt Nam, theo Nguyễn Công Khanh, bệnh P- thalassemia là nguyên nhân hàng
đầu gây thiếu máu, tan máu nặng ở trẻ em [3].P-thalassemia thể nặng và thể trung
bình thường biểu hiện thiếu máu mức độ từ trung bình đến nặng, cuộc sống phụ
thuộc vào việc truyền máu và thải sắt suốt đời, người bệnh có chất lượng cuộc sống
thấp đồng thời cũng là gánh nặng cho gia đình và xã hội. Thể nhẹ dị hợp tử với
một độtbiến trên gen P-globin thường không có biểu hiện lâm sàng, cơ thể phát
triển bình thường, có thiếu máu nhược sắc trên công thức máu. Những người này
có thể kết hôn và truyền gen bệnh cho con, đây chính là nguồn phát tán gen bệnh
chủ yếu trong cộng đồng. Hiện nay chưa có phương pháp điều trị bệnh triệt để, liệu
pháp gen và ghép tế bào nguồn đã có những bước đầu thành công, tuy nhiên liệu
pháp này khá tốn kém và không phải lúc nào cũng thực hiện được. Chính vì vậy,
phát hiện những người lành mang gen bệnh để tư vấn tiền hôn nhân, chẩn đoán
trước sinh nhằm hạn chế những thai nhi bị bệnh là một biện pháp hữu hiệu nhằm
giảm tỷ lệ mắc bệnh trong cộng đồng.
Các xét nghiệm di truyền phân tử xác định các đột biến trên gen P- globin là điều
kiện thiết yếu khẳng định thể bệnh, thực hiện chẩn đoán trước sinh và tư vấn tiền
hôn nhân về bệnh p-thalassemia. Các kỹ thuật xác định đột biến gen như giải trình
tự gen, Realtime PCR, Multiplex ARMS- PCR, RFLP-PCR, ASO … đang từng
bước được áp dụng trong chẩn đoán bệnh, trong đó phương pháp Multiplex
ARMS-PCR đã được nhiều tác giả trên thế giới sử dụng để phát hiện đột biến gen
gây bệnh P-thalassemia và đã đưa ra kết luận đây là phương pháp có hiệu quả cao,
dễ xác định độtbiến và giá thành rẻ [5], [6]. Ở Việt Nam các kỹ thuật sinh học

2. LUANVANYHOC.COM TẢI LUẬN VĂN,LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC,
TÌM TÀI LIỆU Y HỌC THEO YÊU CẦU LH 0915.558.890
phân tử cũng đã bước đầu được áp dụng trong chẩn đoán trước sinh bệnh P-
thalassemia, tuy nhiên hiện nay vẫn chưa được phổ biến và triển khai rộng rãi. Để
có thể áp dụng kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR trong phát hiện đột
biến gen gây bệnh P-thalassemia ở người lành mang gen bệnh, cần đảm bảo độ
chính xác của kỹ thuật bằng cách tiến hành trên những bệnh nhân đã xác định chắc
chắn bị bệnh.
Xuất phát từ thực tế trên, đề tài “Pháthiện đột biến gen gây bệnh p-thalassemia
bằng kỹ thuật Multiplex ARMS-PCR”được tiến hành với mục tiêu:
1. Xác định một số đột biến phổ biến trên gen p-globin và kiểu gen ở bệnh nhân bị
bệnh p-thalassemia bằng phương pháp Multiplex ARMS- PCR.
2. Nhận xét mối liên quan giữa một số chỉ số cận lâm sàng với các dạng độtbiến
gen p-globin phát hiện được.
MỤC LỤC Phát hiện đột biến gen gâybệnh p-thalassemia bằng kỹ thuật
Multiplex ARMS-PCR
ĐẶT VẤN ĐỀ
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 3
1.1. Sơ lược về hemoglobin 3
1.1.1. Hemoglobin bình thường 3
1.1.2. Các loại Hemoglobin sinh lý 4
1.1.3. Phân loại bệnh hemoglobin 6
1.2. Bệnh P-thalassemia 7
1.2.1. Lịch sử bệnh P-thalassemia 7
1.2.2. Đặc điểm dịch tễ 9
1.2.3. Cơ chế bệnh sinh bệnh P-thalassemia 12
1.2.4. Cơ chế di truyền 16
1.2.5. Biểu hiện lâm sàng 17
1.2.6. Điều trị bệnh P-thalassemia 19
1.2.7. Bệnh học phân tử bệnh P- thalassemia 20
1.3. Một số ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử trong phát hiện độtbiến gen … 25
1.3.1. Kỹ thuật PCR 26
1.3.2. Kỹ thuật ARMS 28
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 31
2.1. Đốitượng nghiên cứu 31
2.1.1. Nhóm bệnh 31
2.1.2. Nhóm chứng 31
2.1.3. Phương pháp lấy mẫu 32
2.2. Thời gian và địa điểm nghiên cứu 32
2.3. Phương pháp nghiên cứu 32

3. LUANVANYHOC.COM TẢI LUẬN VĂN,LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC,
TÌM TÀI LIỆU Y HỌC THEO YÊU CẦU LH 0915.558.890
2.4. Phương tiện nghiên cứu 32
2.4.1. Hóa chất 32
2.4.2. Dụng cụ và máy móc 33
2.5. Quy trình nghiên cứu 34
2.6. Kỹ thuật nghiên cứu 35
2.6.1. Tách chiết DNA 35
2.6.2. Kỹ thuật Multiplex ARMS – PCR/ARMS-PCR 35
2.7. Phân tíchkết quả 42
2.8. Vấn đề đạo đức của đề tài 42
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 43
3.1. Kết quả xác định đột biến gen P-globin ở bệnh nhân P-thalassemia bằng
kỹ thuật Multiplex ARMS PCR 43
3.1.1 Kết quả tách chiết DNA 43
3.1.2. Kết quả Multiplex ARMS-PCR 44
3.1.3. Kết quả Multiplex ARMS-PCR trên bệnh nhân 48
3.2. Kết quả phân tích mối liên quan giữa một số thông số lâm sàng, cận
lâm sàng với các dạng đột biến trên các mẫu bệnh nhân 55
3.2.1. Liên quan giữa kiểu gen với độ tuổi của mẫu nghiên cứu 55
3.2.2. Mối liên quan giữa kiểu gen phát hiện được với mức độ thiếu máu
trên lâm sàng 56
3.2.3. Liên quan giữa các dạng độtbiến và một số chỉ số huyết học 58
3.2.4. Mối liên quan giữa kiểu gen và mức HbF 60
3.2.5. Mối liên quan giữa kiểu gen với chỉ số Feritin huyết thanh 61
CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 63
4.1. Về kết quả xác định độtbiến gen trên bệnh nhân bằng kỹ thuật
Multiplex ARMS-PCR 63
4.1.1. Về kết quả tách chiết DNA 63
4.1.2. Về kết quả kiểm tra mồi và quy trình kỹ thuật 64
4.1.3. Về kết quả Multiplex ARMS-PCR trên bệnh nhân 65
4.2. Mối liên quan giữa kiểu gen đột biến và một số thông số lâm sàng, cận
lâm sàng 69
4.2.1. Liên quan giữa kiểu gen và độ tuổi 69
4.2.2. Liên quan giữa kiểu gen phát hiện được với mức độ thiếu máu
trên lâm sàng 71
4.2.3. Mối liên hệ giữa một số chỉ số cận lâm sàng với các dạng độtbiến73
4.2.4. Về mối liên quan giữa kiểu gen và mức HbF 75
4.2.5. Về mối liên quan giữa kiểu gen với chỉ số Feritin huyết thanh 75
KẾT LUẬN 76

4. LUANVANYHOC.COM TẢI LUẬN VĂN,LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC,
TÌM TÀI LIỆU Y HỌC THEO YÊU CẦU LH 0915.558.890
KIẾN NGHỊ 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Anchalee Thedsawad, Sumalee jindadamrongwech, Suporn Chuncharunee,
Punnee Butthep (2012). Multiplex ARMS-PCR Analysis for Nineteen β –
Thalassemia Mutation, Journal of Hematology and Tranfusion Medicine vol. 22
No. 1 January – March 2012: 1-38.
2. Nguyễn Anh Trí, Nguyễn Thị Thu Hà (2010) “Cập nhật chẩn đoán và
điều trị Thalassemia”, “Những ứng dụng về di truyền và sinh học phân tử trong
một số bệnh lý huyết học”, Một số chuyên đề huyết học truyền máu,(tập 3),Nhà
xuất bản Y học: 203-212, 242-258
3. Nguyễn Công Khanh (1993). Tần suất bệnh hemoglobin ở Việt Nam. Y học Việt
Nam,(tập 174, số) 8:11-16.;
10. Hà Thị Anh, Bùi Thị Mai An, Trần Văn Bình, Nguyễn Hà Thanh (2009).
Huyết học – truyền máu, Nhà Xuất Bản Y học 2009.
11. Bạch Quốc Tuyên (1978). Huyết học tập một, Nxb Y học Hà Nội
12. Nguồn: suckhoedoisong.com.vn
13. Nguyễn Công Khanh (2008) “Bệnh hemoglobin”, Huyết học lâm sàng nhi
khoa, Nhà xuất bản Y học:127-146.
16. Vullo, A.C.-V.G.-G.M.-B.M.-G.s.-C. (1992), “Điều trị thải sắt”, Chuyên đề
thalasemia, y học Việt Nam (người dịch Tạ Thu HòaNguyễn Công Khanh), tr. 95-
100.
17. Bạch Quốc Tuyên, P.N.T., Đặng Đức Quý, Nguyễn Đình Lượng (1974), “Một
số trường hợp huyết sắc tố bình thường phát hiện ở bệnh viện Bạch Mai”, Công
trình nghiên cứu huyết học và truyền máu 1963-1974, Nxb Y học 1974, Hà Nội.
1974.0

5. LUANVANYHOC.COM TẢI LUẬN VĂN,LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC,
TÌM TÀI LIỆU Y HỌC THEO YÊU CẦU LH 0915.558.890
19. C., B.E. (1982), Huyết sắc tố và bệnh huyết sắc tố, Huyết học (tài liệu dịch của
Viện Huyết học truyền máu), Nxb Harwal, tr. 125-138
33. Dương Bá Trực (1997), “Một số kiểu gen beta-Thalassemia ở người miền
Bắc”, Hội nghị chuyên đề những tiến bộ mới về Thalassemia (Bản dịch của Dương
Bá Trực), tr.36-42. 1997.
34. Bùi Văn Viên, Dương Bá Trực, Nguyễn Công Khanh (1999). “Nhận xét bước
đầu cơ sở di truyền phân tử và mối quan hệ giữa kiểu gen với mức độ thiếu máu và
thể tích hồng cầu trong bệnh HbE/b Thalassemia”.
35. Nguyễn Công Khanh, Dương Bá Trực, Lý Tuyết Minh, Lương Công Sĩ,(1987),
“Sự lưu hành bệnh sắc tố ở một số người dân tộc miền Bắc”, Y họcViệt Nam, 4, tr.
9-15.
36. Nguyễn Công Khanh (1985), “Một số đặc điểm lâm sàng và huyết học bệnh
beta-thalassemia ở người Việt Nam”, Luận án Phó tiến sỹ khoa học Y dược,
Trường Đại học Y Hà Nội.
37. Tạ Thành Văn (2010). PCR và một số kỹ thuật sinh học phân tử, Nhà xuất bản
y học: 28-119
45. Lê Thị Hảo (2001), “Nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật di truyền phân tử phát hiện
đột biến gen gây bệnh beta-Thalassemia tại Việt Nam” , Báo cáo khoa học, Trường
Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh, TPHCM
46. Nguyễn Khắc Hân Hoan (2007). Chẩn đoán di truyền phân tử bệnh beta-
thalassemia tại bệnh viện Từ Dũ: 121 -127
48. Dương bá Trực, Nguyễn Thanh Liêm và cộng sự: Áp dụng kỹ thuật ARMS-
PCR trong chẩn đoán trước và sau sinh bệnh beta-thalassemia tại bệnh viện nhi
Trung Ương.
51. Phạm Quang Vinh “Thiếu máu và thiếu máu thiếu sắt”. Bài giảng huyết học
truyền máu 6, tr.82