2. TUTOR HEMATOLOGI
PENGECATAN SITOKIMIA PADA LEUKEMIA
Oleh :
PANTJARARA B.
Pembimbing
YETTY HERNANINGSIH
LABORATORIUM / INSTALASI PATOLOGI KLINIK
FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA
RSU Dr. SOETOMO SURABAYA
2009
6/13/2011 2
3. •PENDAHULUAN
Pemeriksaan morfologi darah, membantu
diagnosis dan klasifikasi leukimia.
Abnormalitas atau imaturitas dari sel sering sulit
diidentifikasi tipenya dengan tepat.
6/13/2011 3
4. •Pengecatan sitokimia pada leukemia
dapat membantu membedakan tipe
satu sel dengan yang lain, terutama
membedakan antara leukimia Limfoid
dan Mieloid.
6/13/2011 4
5. Pasien dengan tipe laukemia tertentu diklasifikasikan sehubungan
dengan penentuan tindakan pengobatan yang akurat dan
prognosis yang lebih baik.
Klasifikasi FAB membagi leukamia akut menjadi 2 kelompok yaitu:
1. Acute Myeloid Leukemia, di bagi menjadi:
M0 AML, diferensiasi minimal
M1 AML, tanpa maturasi
M2 AML, dengan maturasi
M3 Leukemia Promielositik Akut, hipergranuler
M3v Leukemia Promielositik Akut varian, mikrogranuler
M4 Leukemia Mielomonositik Akut
M4eo Leukemia Mielomonositik Akut, dengan eosinifilia
M5a Leukemia Monoblastik Akut, dengan diferensiasi rendah
M5b Leukemia Monoblastik Akut, dengan diferensiasi baik
M6 Eritroleukimia Akut
M7 Leukemia Megakarioblastik Akut 6/13/2011 5
6. 2. Acut Liymphoblastic Leukemia, dibagi menjadi
3 tipe yaitu:
- L1,
- L2 dan
- L3.
6/13/2011 6
8. Masing-masing metode mempunyai
spesifikasi dan mekanisme terjadinya hasil
positif (+) dan negatif (-).
Pada tugas tutor ini:
Myeloperoxidase,
Sudan black,
Periodic acid-Schiff (PAS),
Leukocyte Alkaline Phosphatase dan
Non Spesific Esterase.
6/13/2011 8
10. Pengecatan Sitokimia
•1 Mieloperoksidase
Prinsip:
Enzim peroksidase mengkatalisis oksidasi
substrat dengan adanya hidrogen peroksida
membentuk presipitat warna coklat.
SH2+H2O2═S+2H2O
Mieloperoksidase terdapat pada:
granula dari sel netrofil, eosinofil dan
monosit.
6/13/2011 10
12. Metode:
•Hapusan difiksasi dalam buffer
formal aseton selama 45 detik.
•Bilas dengan air kran dan keringkan.
•Inkubasi dalam larutan substrat selama10 mnt.
Campur 30 mg DAB dalam 60ml bufer,
tambahkan H2O2 120 µl
•Bilas dengan air kran.
•Counterstain dengan Carazzi`s hematoksilin
1 menit.
•Bilas dengan air kran dan keringkan.
6/13/2011 12
13. Interpretasi:
Pengecatan myeloperoksidase membedakan antara sel-sel
immatur pada leukemia mieloblastik akut (+) dan pada
leukemia limfoblastik akut (-).
Mieloperoksidase terdapat pada netrofil, eosinofil dan monosit.
Sel-sel Limfoid dan eritroid tidak memiliki enzim dengan
aktifitas peroksidase.
Sel eosinofil positif kuat (+).
Sel basofil, limfosit dan seri eritrosit memberi hasil negatif (-).
Pada sel monosit: ada granula halus, tidak begitu terang seperti
granulosit, monosit negatif(-) atau positif (+).
Pada AML (Leukimia mielositik akut) lebih dari 5% sel muda
hasil positif(+).
6/13/2011 13
14. •2 Pengecatan dengan sudan black
Prinsip: Sudan Black mewarnai granula
sitoplasma yang mengandung fosfolipid
intraseluler dan lipid yang ada dalam
lekosit darah, berwarna coklat hitam.
14
6/13/2011
15. Reagen:
• Sudan Black B.
•Bufer fenol.
•Working stain solution. Tambahkan 40 ml buffer ke
dalam 60 ml Sudan Black B.
•Counterstain:May-Grunwald-Giemsa atau Leishman
stain
6/13/2011 15
16. Metode:
• Fiksasi dalam formalin selama15 menit.
• Bilas dengan cepat dengan air kran dan
keringkan.
• Celupkan dalam working stain selama satu jam.
• Cuci dengan etanol 70%.
• Counterstain dengan Leishman`s atau MGG
(May-Grunwald-Giemsa)
6/13/2011 16
17. Interpretasi:
Hasil reaksi: granuler berwarna hitam.
Membedakan antara leukemia limfoblastik akut (-) dan
leukemia myeloblastik akut (+).
Umumnya sel dengan peroksidase positif (+) memberi
reaksi positif (+) pada pewarnaan Sudan black.
Seri mielosit stadium muda granula sitolplasma berwarna
hitam coklat (agak pucat).
Stadium matang netrofil mempunyai granula coklat hitam
(yang jelas).
Monosit (+) lemah, berwarna hitam coklat.
Limfosit dan Limfoblas negatif (-).
Basofil (-)/ bright red/purple metakromasi.
Megakariosit, eritroblas, normoblas dan trombosit (-).
6/13/2011 17
18. Kelebihan sudan black kdibanding
mieloperoksidase:
dapat menggunakan hapusan darah atau
sumsum tulang yang lebih lama
dan hasilnya lebih awet.
6/13/2011 18
19. •3 Periodic-Acid Schiff (PAS)
Prinsip:
Pewarnaan PAS (periodic acid-schiff) untuk
mendeteksi glikogen dan mukopolisakarida
intraseluler. Reaksi yang terjadi adalah oksidasi
glikogen oleh periodic acid menjadi dialdehida,
kemudian dialdehida bereaksi dengan reagen
schiff membentuk warna merah.
6/13/2011 19
21. Metode:
1.Fiksasi selama15 mnt dalam metanol.
2.Bilas dengan cepat dengan air kran.
3.Tambahkan Periodic-acid solution selama10 mnt.
4.Cuci dengan air kran dan keringkan.
5. Celupkan dalam reagen Schiff`s basic fuchsin
selama 30 mnt.
6. Cuci gengan air kran.
7. Counterstain Carazzi`s aqueous Haematoxylin
selama 5-10 mnt.
6/13/2011 21
22. Interpretasi:
Hasil reaksi adalah mulai dari pink sampai dengan merah
terang.
Pengecatan PAS dapat digunakan pada identifikasi
eritroleukimia, suatu leukemia dengan sel darah
merah yang immatur.→(+) kuat
Granulosit prekursor positif lemah, lebih nyata pada stadium
matang.
Pengecatan PAS tampak pada sel-sel muda pada akut
limfoblastik maupun akut mielogenik leukimia.
6/13/2011 22
23. Leukosit Alkalin Fosfatase (LAP)
Prinsip: Pada granula neutrofilik terdapat enzim fosfatase yang
mampu menghidrolisis substrat yang megandung naptol fosfat
menjadi produk yang berikatan dengan zat wana membentuk
komplek warna biru.
Substrat mengandung naptolfosfat
→hidrolisis→naptol+azodye
6/13/2011 23
24. Aktifitas Alkalin fosfatase ditemukan dalam
sitoplasma:
Netrofil, osteoblas, sel endotelial
vaskuler, dan limfosit.
Kadar alkalin fosfatase netrofil dalam darah
perifer dihitung sebagai skor LAP
(Leukocyte Alkaline Phosphatase).
Leukocyte Alkaline Phosphatase
merupakan enzim yang terdapat
dalam granula sekunder dari sel
Polimorfonuklear.
6/13/2011 24
25. Reagen :
Fiksasi : Metanolformalin 4%
Substrat : Naphtol AS phosphate
Buffer : Tris buffer 0,2 mol/L pH 9,0
Stock substrate solution :
Larutkan naphtol AS phosphate dalam N,N-
dimethylformaldehide. Tambahkan Tris
buffer 100 ml 0,2 mol/l, pH 9,1.
Coupling azo-dye: garam Fast Blue BB
Counterstain : Aqueous Netral red 0,02%.
6/13/2011 25
26. Metode:
•Fiksasi hapusan darah selama 30 detik
dalam formalin metanol 4%
•Bilas dengan air kran dan keringkan
•Siapkan larutan working substrat:
stock substrate solution 40ml.
Tambahkan Fast Blue BB 24mg.
Inkubasi selama 15 menit.
•Bilas dengan air kran dan keringkan.
•Counterstain selama 3 menit dalam
Aqueous neutral red, bilas dengan
cepat dan keringkan.
6/13/2011 26
27. Hapusan darah harus segera dibuat
sebelum 30 menit, sebab aktifitas
lekosit alkali fosfatase menurun
dengan cepat pada pengunaan
EDTA. Hapusan harus segera dicat
dalam waktu 6 jam.
6/13/2011 27
28. Interpretasi:
Leukocyte Alkaline Phosphatase (LAP) dapat diukur
secara kasar dengan menentukan skor ukuran dan intensitas
granula yang terwarnai.
Normal :15-130, nilai yang mungkin mulai 0 maksimal 400
Penghitungan pada 100 sel netrofil
Intensitas pewarnaan: 0 (tanpa pewarnaan) sampai dengan 4
(pewarnaan kuat dan dalam).
0 Negatif, tanpa granula, sitoplasma tidak tercat.
1 Positif lemah, granula jarang.
2 Positif lemah, jumlah granula sedang.
3 Positif kuat, granula banyak.
4 Positif sangat kuat dengan banyak granula kasar dalam
sitoplasma, sering menutupi nukleus.
6/13/2011 28
29. Kondisi yang berhubungan dengan skor abnormal
Leukosit Alkalin Fosfatase
Skor LAP < 15
CML
Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria
Hematologic neoplasms
Myelodysplastic syndromes
Infeksi atau keracunan
Skor LAP >130
Infeksi
Growth factor theraphy
Myeloproliferative disorder selain CML
Inflammatory disorders
Kehamilan, kontrasepsi oral
Stress
obat (lithium, korticosteroid, estrogen)
6/13/2011 29
30. Nonspesific (alpha-naphthyl butirate or
alpha-naphthyl acetate) Esterase
Pengecatan non spesific esterase digunakan
untuk identifikasi sel monosit tetapi tidak
untuk granulosit atau eosinofil. Limfosit T
matur yang tercat dengan karakteristik fokal,
dotlike pattern.
6/13/2011 30
31. Prinsip:
Lekosit esterase merupakan kelompok enzim yang menghidrolisis
acyl atau chloroacyl ester dari α- naphtol atau naphtol AS.
Perbedaan pemeriksaan antara alpha-naphthyl butirate dan
alpha-naphthyl acetate Esterase : pada substrat spesifik dan pH.
6/13/2011 31
32. α- Naphtyl butyrate esterase
Reagen:
Fiksasi: Buffered Formalin aseton
Bufer: Bufer fosfat 100 mmol/L pH 8,0
Substrat: α- Naphtyl butyrate 100µL dalam 5ml aseton
Coupling reagent: Fast garnet GBC 15 mg atau Fast Blue BB
Counterstain: aqueous haematoxylin
6/13/2011 32
33. Metode:
1. Fiksasi: formalin aseton 30 detik
2. Bilas dgn air kran dan keringkan
3. Tambahkan Fast Garnet GBC pada bufer
4. Tambahkan 0,5 ml α- naphtol butyrate atau larutan
aseton
5. Inkubasi selama 20-40 mnt
6. Bilas dengan air kran.
7. Counterstain: Aqueous haematoksilin selama 1-5
mnt
6/13/2011 33
34. Interpretasi:
Hasil reaksi granuler coklat
Mayoritas monosit (>80%) tercat kuat.
Netrofil, eosinofil, basofil dan platelet negatif (-)
Limfosit B (-), T tidak tercat.
Pada bone marrow : monosit dan makrofag teracat kuat.
α – Naphtol butyrate lebih spesifik untuk identifikasi
komponen monosit dalam AML dari pada α- Naphtol
acetate.
6/13/2011 34
36. Metode:
1. Fiksasi: formalin aseton 30 detik
2. Bilas dgn air kran dan keringkan
3. Celupkan slide dalam medium inkubasi selama
30-60 mnt.
4. Bilas dengan air kran dan keringkan.
5. Counterstain: Aqueous haematoksilin selama
2-5 mnt
6/13/2011 36
37. Interpretasi
Hasil reaksi: warna merah/coklat rata.
Monosit normal dan lekemik tercat kuat
Granulosit normal negatif (-)
Mielodisplasi atau AML positif (+).
Megakarioblas lekemik (+)
Limfosit, Limfoblas T (+) dotlike
Leukaemic eritroblast (+)
6/13/2011 37
38. NORMAL HEMOPOIETIC CELLS IN CYTOCHEMICAL STAINS
Peroxidase reaction
Peroxidase reaction
Sudan black B reaction
Internet atlas of hemayology
6/13/2011 38
39. PAS reaction PAS reaction
AS-D-chloroacetate esterase reaction Butyrate esterase reaction
Internet atlas of hematology
6/13/2011 39
40. MPO (-) Sudan Black (-)
PAS (-) PAS (+) Data pasien40
6/13/2011
41. CONTOH HASIL POSITIF
Reaksi Peroksidase. Granulosit positif kuat pada sel leukemia. Pembesaran 1000X
Reaksi Peroksidase pada sumsum tulang. Pembesaran 1000X.
Internet atlas
6/13/2011 Leukemia library 41
42. Sudan Black B pada sumsum tulang (Leukemia Mielositik akut) (FAB M1)
Sudan Black B (Leukemia Promielositk Akut) Internet atlas
6/13/2011 Leukemia library 42
43. Granula kasar, PAS positif pada sitoplasma. Pembesaran 1000X.
Granula kasar, PAS positif dalam sitoplasma limfoblas sumsum tulang.
Pembesaran 1000X.
Internet atlas
6/13/2011 Leukemia library 43
44. Neutrophyl Alkaline Phosphatase. Positif kuat ( 4+) dan positif sedang (3+ dan 2+)
Reaksi Alpha- Naphthylacetae esterase pada sumsum tulang.
Limfoblas negatif. Pembesaran 500X.
Internet atlas
6/13/2011 Leukemia library 44
45. Reaksi Alpha- Napthylacetate esterase pada darah perifer, sel leukemia positif kuat.
Pembesaran 1000X.
Dengan aktifitas yang sangat tinnggi pada sel leukemia. Pembesaran 1000X. Internet atlas
6/13/2011 Leukemia library 45
48. G= PAS, granula positif pada malignant
lymphoid cell (sezary syndrom)
H= PAS, sel ALL dengan granula kasar
6/13/2011 48
Wintrobe’s
49. I= Peroksidase, Granula biru
dari sitoplasma mieloblas pada pasien
acute myeloblastic leukemia
J= Peroksidase, Granula matur
warna biru
6/13/2011 Wintrobe’s 49
50. K= Sudan Black
L= Non spesifik esterase, monosit
dan monoblas dengan sitoplasma
warna coklat orange
6/13/2011 Wintrobe’s 50
51. M= Chloroasetate esterase, promielosit
dengan sitoplasma warna maroon,
pada pasien AML
6/13/2011 Wintrobe’s51
52. Histochemical Features of AML
FAB HISTOCHEMISTRY
M1 Occasional peroxidate+ granules, PAS-
M2 Strongly peroxidase+, PAS-
M3 Strongly peroxidase+, PAS-
M4 Strongly peroxidase+, some cells may be PAS+
M5 Many be peroxidase+ and PAS+, nonspecific esterase
stains are strongly + .
M6 Red cell precursors are PAS+, ringed sideroblasts are seen
with iron stains
M7 Variable, platelet peroxidase can be demonstrated by
electron microscopy
Color atlas hematologi
Harald Theml dkk
6/13/2011 52
53. Hasil tes sitokimia pada AML dan ALL
Jenis tes sitokimia AML Klasifikasi FAB
M0 M1-3 M4 M5 M6 M7 ALL
Mieloperoksidase - + + - - - -
Chloroacetate - + + +/- - - -
α - naphtol acetate - - + + - +/- -
Sudan Black B - + + - - - -
PAS - - +/- +/- + - +
E.N Kosasih
6/13/2011 53
55. 2. Acut Liymphoblastic Leukemia, dibagi menjadi
3 tipe yaitu:
L1: ALL dengan sel limfoblas kecil-kecil dan
merupakan 84% dari ALL.
L2: ALL sel lebih besar, inti ireguler, kromatin
bergumpal, nukleoli prominen dan
sitoplasma agak banyak. Merupakan 14%
dari ALL.
L3: ALL mirip dengan limfoma burkitt, yaitu
sitoplasma basofil dengan banyak vakuola,
1% dari ALL.
6/13/2011 55
56. Pengecatan sitokimia:
Merupakan suatu metode yang digunakan dalam
pengecatan pada sampel darah dengan berdasarkan
reaksi dan menggunakan bahan-bahan kimia
6/13/2011 56
57. Metode: Non spesifik esterase
1, Hapusan difiksasi dengan udara kering dalam paparan
formalin →4 menit
2. Bilas dengan air suling dan keringkan
3. Inkubasi dalam chloroacetate substrate solution →
5-15menit →suhu kamar.
4. Bilas dengan air suling dan keringkan.
5.Inkubasi dalam butyrate substrate solution →
15-30menit→ suhu ruangan dan hindari sinar.
6. Bilas dengan air suling
7. Caunterstain dalam aqueous haematoxylin →5 menit
8. Bilas dengan air suling keringkan dan periksa.
6/13/2011 57
58. Isoenzim dibagi dalam 2 kelompok:
1. Bands 1,2,7,8 dan 9 berhubungan dengan sterase spesifik
dai netrofil khususnya pengecatan dengan naphtol AS-D
chloroacetate sterase (chloroacetate esterase, CAE).
2. Bands 3, 4, 5 dan 6 berhubungan dngan non spesifik esterase
(NSE) pengecatan dengan α- naphtyl acetae esterase (ANAE) dan
α- naphtyl butirat esterase.
MPO terdapat pada granula primer dan sekunder dari netrofil,
dan prekursornya di granula eosinofil dan di granula azurofilik
dari monosit.
MPO pada granula eosinofil, resiste terhdap sianida, dimana
pada netrofil dan monosit sensitif.
6/13/2011 58
59. Interpretasi:
Pengecatan non spesific esterase →identifikasi sel
monosit tidak untuk granulosit atau eosinofil.
Pengecatan limfosit T matur →karakteristik fokal,
dotlike pattern.
Selain pada monosit, reaksi juga terjadi pada :
makrofag, histiosit, megakariosit, dan beberapa
sel karsinoma.
Pengecatan alpha naphthyl butyrate →lebih
spesifik →kurang sensitif, dari pada alpha-
naphthyl acetate.
Perbedaan pengecatan dengan esterase: pada
megakarioblas, yang tidak tercat dengan alpha
naphthyl butyrate tetapi tercat dengan substrat
alpha- naphthyl acetate.
6/13/2011 59
60. Sel-sel dengan granula primer →
promielosit→azurofilik →netrofil,
eosinofil, basofil dapat dilihat hanya degan
Elektron mikroskop.
Granula sekunder→mielosit
Granula sekunder→alkali fosfatase
Granula tersier→tampak pada akhir
mielosit→ pada human netrofil
6/13/2011 60
63. Keterangan gambar:
LAP:
A= 0, B=1+, C=2+, D=3+, E=4+
G= PAS+ (Sezary syndrome)
H= PAS, ALL, granulakasar
I= Peroksidase, granula biru, AML
J = Cat biru pada granula matur
K= Sudan Blak
L= Non spesifik esterase, monosit dan monoblas dengan
sitoplasma warna coklat orange
M= Cloroasetat esterase, promielosit dengan sitoplasma
warna maroon, ada pasien AML
N= Tartrat-resistent acid phosphat, granula sitoplama warna
gelap.
6/13/2011 63
64. M= Cloroasetat esterase, promielosit
dengan sitoplasma warna maroon,
pada pasien AML
6/13/2011 64
65. MPO (-) Sudan Black (-)
PAS (-) PAS (+)
6/13/2011 65
66. Perbedaan ALL dan AML
Sitokimia ALL AML
Mieloperoksidase - +
Sudan black - +
Esterase non spesifik - +
PAS (kasar) + (monositik)
Hematologi klinik ringkas, EGC
6/13/2011 66
67. •1 Mieloperoksidase
Prinsip:
Enzim peroksidase mengkatalisis oksidasi substrat
dengan adanya hidrogen peroksida membentuk
presipitat warna coklat.
SH2+H2O2═S+2H2O
Mieloperoksidase terdapat pada:
-granula primer dari sel promielosit.
-granula sekunder dari sel mielosit
6/13/2011 67
68. • MPO Tidak dihambat EDTA, oxalat ataupun
heparin, slide bisa dikerjakan 12jam
setelah pengambilan darah.
•Pengecatan masih bisa dilakukan pada slide
yang disimpan selama 1 minggu, pada suhu kamar
•Kekurangan MPO:
- Sensitif dengan cahaya, panas dan metanol
- Pengecatan pada hapusan darah harus
dilakukan segera, tidak boleh lebih
dari 3 minggu.
6/13/2011 68
69. Interpretasi:
Pengecatan PAS digunakan paling awal pada identifikasi
eritroleukimia, suatu leukemia dengan sel darah
merah yang immatur.
Reaksi positif (+) →adanya glikogen atau polisakarida
setelah penambahan diastase.
Sel netrofil: semua stadium hasil positif (+), lebih nyata
pada stadium matang. Glikogen berada dalam
sitoplasma tidak dalam granula.
Eosinofil: Hasil positif (+).
Mieloblas: Bervariasi antara negatif (-) dan hanya beberapa
butir granula halus.
Monosit: Pewarnaan samar-samar.
Limfosit : Dapat mengandung granula kecil atau besar.
6/13/2011 69
