MALDI-TOF: Pricinple and Its Application in Biochemistry and BiotechnologyDevakumar Jain
The document discusses MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) mass spectrometry. It provides a history of the development of mass spectrometry techniques. MALDI-TOF allows for the analysis of intact biomolecules like proteins and is a soft ionization method. It provides high sensitivity and mass accuracy for analyzing proteins, peptides, and other large biomolecules. The document also discusses applications of MALDI-TOF like protein identification and characterization.
ISO ELECTRIC FOCUSING PRESENTATION OF LAB TECHNIQUENooruddin Adil
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This document discusses various protein purification strategies and techniques. It outlines steps for protein isolation, extraction, concentration, and precipitation. It also describes different chromatography methods for purification, including gel filtration, ion exchange, hydrophobic interaction, and affinity chromatography. It provides details on analytical tools like SDS-PAGE for assessing purity and discusses considerations for combining purification techniques.
Global and local alignment in BioinformaticsMahmudul Alam
1. Global alignment finds the optimal alignment over the entire sequence length trying to match as many elements as possible, while local alignment finds the region of highest similarity between two sequences that may be of different lengths.
2. The Needleman-Wunsch algorithm is commonly used for global alignment using dynamic programming to find the optimal full sequence alignment with linear gap costs.
3. The Smith-Waterman algorithm is used for local sequence alignment to identify similar regions by calculating similarity scores and only retaining alignments with scores higher than a threshold.
FindMod is a tool that can predict potential protein post-translational modifications (PTM) and find potential single amino acid substitutions in peptides
Peptide mass fingerprinting is a technology to identify proteins. It is a high throughput protein identification technique in which the mass of an unknown protein can be determined. PMF is always performed with MALDI-TOF mass spectrometry
This document provides information on electrophoresis techniques. It discusses how electrophoresis separates charged molecules like proteins and nucleic acids using an electric current. The key techniques covered are:
1. SDS-PAGE, which uses sodium dodecyl sulfate to denature proteins and give them a uniform negative charge for separation by size in a polyacrylamide gel.
2. Native PAGE, which separates intact proteins by their charge-to-size ratio.
3. Isoelectric focusing, which separates proteins based on their isoelectric point in a pH gradient gel.
It also discusses two-dimensional electrophoresis, which combines isoelectric focusing and SDS-PAGE to better resolve complex protein mixtures. The document
Protein purification is a series of processes to isolate a protein from a complex mixture. It is important to characterize a protein's function, structure, and interactions. The general steps of purification include preparing the source, exploiting differences in protein properties through separation techniques, and monitoring purity with assays. Purification yields a pure protein sample for determining its sequence, structure, and role. Affinity tags and other tags are often used to aid purification. Biopharmaceuticals are medically important proteins produced through biotechnology.
MALDI-TOF: Pricinple and Its Application in Biochemistry and BiotechnologyDevakumar Jain
The document discusses MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight) mass spectrometry. It provides a history of the development of mass spectrometry techniques. MALDI-TOF allows for the analysis of intact biomolecules like proteins and is a soft ionization method. It provides high sensitivity and mass accuracy for analyzing proteins, peptides, and other large biomolecules. The document also discusses applications of MALDI-TOF like protein identification and characterization.
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This document discusses various protein purification strategies and techniques. It outlines steps for protein isolation, extraction, concentration, and precipitation. It also describes different chromatography methods for purification, including gel filtration, ion exchange, hydrophobic interaction, and affinity chromatography. It provides details on analytical tools like SDS-PAGE for assessing purity and discusses considerations for combining purification techniques.
Global and local alignment in BioinformaticsMahmudul Alam
1. Global alignment finds the optimal alignment over the entire sequence length trying to match as many elements as possible, while local alignment finds the region of highest similarity between two sequences that may be of different lengths.
2. The Needleman-Wunsch algorithm is commonly used for global alignment using dynamic programming to find the optimal full sequence alignment with linear gap costs.
3. The Smith-Waterman algorithm is used for local sequence alignment to identify similar regions by calculating similarity scores and only retaining alignments with scores higher than a threshold.
FindMod is a tool that can predict potential protein post-translational modifications (PTM) and find potential single amino acid substitutions in peptides
Peptide mass fingerprinting is a technology to identify proteins. It is a high throughput protein identification technique in which the mass of an unknown protein can be determined. PMF is always performed with MALDI-TOF mass spectrometry
This document provides information on electrophoresis techniques. It discusses how electrophoresis separates charged molecules like proteins and nucleic acids using an electric current. The key techniques covered are:
1. SDS-PAGE, which uses sodium dodecyl sulfate to denature proteins and give them a uniform negative charge for separation by size in a polyacrylamide gel.
2. Native PAGE, which separates intact proteins by their charge-to-size ratio.
3. Isoelectric focusing, which separates proteins based on their isoelectric point in a pH gradient gel.
It also discusses two-dimensional electrophoresis, which combines isoelectric focusing and SDS-PAGE to better resolve complex protein mixtures. The document
Protein purification is a series of processes to isolate a protein from a complex mixture. It is important to characterize a protein's function, structure, and interactions. The general steps of purification include preparing the source, exploiting differences in protein properties through separation techniques, and monitoring purity with assays. Purification yields a pure protein sample for determining its sequence, structure, and role. Affinity tags and other tags are often used to aid purification. Biopharmaceuticals are medically important proteins produced through biotechnology.
This document discusses protein structure and function. It defines different levels of protein structure from primary to quaternary, and describes common secondary structures like alpha helices and beta sheets. Alpha helices are right-handed coils stabilized by hydrogen bonds between amino acids four positions apart in the sequence. Beta sheets consist of beta strands connected laterally by hydrogen bonds to form flat sheets, which can be arranged in parallel or anti-parallel configurations. Tertiary structure refers to the overall three-dimensional shape of a protein formed by the folding and interaction of secondary structures.
Scott Malcolm | Describe About Purpose and Creation Process of Gel Electropho...Scott Malcolm Dallas
Scott Malcolm is a great businessman, who lives in Dallas, Taxes. He explains here about biochemistry and molecular biology to separate a mixed population of DNA and RNA fragments by length and to estimate the size of DNA and RNA fragments.
Introduction
What is Protein Sequencing?
History
Determination of amino acid composition
Sequencing methods
N terminal sequencing
C terminal sequencing
Mass spectrometer
Application
Reference
Frederick Sanger developed two important methods for protein sequencing: 1) using fluorodinitrobenzene to determine the N-terminal amino acid, and 2) cleaving proteins into fragments and piecing their sequences together. The standard strategy involves separating chains, identifying terminal residues, cleaving the protein, sequencing fragments, and reconstructing the full sequence. The Edman degradation method allows sequential removal of residues from the N-terminus. Mass spectrometry techniques like peptide mass fingerprinting and tandem mass spectrometry now dominate protein sequencing.
This document discusses various methods for separating proteins, including based on solubility, ionic charge, polarity, molecular size, and binding specificity. Key separation methods mentioned include salting in/out based on solubility, ion exchange chromatography and electrophoresis based on charge, and adsorption chromatography, paper chromatography, and affinity chromatography based on other properties. The document provides details on how each of these techniques works to separate proteins in a mixture based on their distinguishing physical characteristics.
Standard test that used to determine the charged molecules, mainly proteins and nucleic acids.
Widely used in biochemistry, forensics, genetics and molecular biology.
Laemmli system of SDS-PAGE was first introduced in 1970s
This document discusses the structures, functions, and nomenclature of nucleotides and nucleic acids. It describes how nucleotides are composed of a nitrogenous base, pentose sugar, and phosphate group. Nucleotides function as energy carriers like ATP, cofactors like NAD+, and signal molecules like cAMP. Nucleic acids like DNA and RNA store and transmit genetic information through their roles in protein synthesis. The document outlines the four main types of RNA and their functions, and discusses the properties of nucleotide bases that allow nucleic acids to form specific three-dimensional structures.
Monosaccharides are simple sugars with multiple OH groups classified based on carbon number as trioses, tetroses, pentoses or hexoses. Disaccharides consist of two covalently linked monosaccharides, while oligosaccharides have a few linked monosaccharides and polysaccharides are polymers of monosaccharide or disaccharide units. Common monosaccharides include glucose and fructose, while examples of disaccharides are sucrose, lactose and maltose formed by glycosidic bonds between the monosaccharides. Polysaccharides in plants include starch and cellulose consisting of glucose polymers.
This document discusses various methods for determining the amino acid sequence of proteins, including:
- Edman degradation, which sequentially removes amino acids from the N-terminus. Up to 60 amino acids can typically be determined.
- Mass spectrometry techniques like MALDI that help determine the mass and sequence of protein fragments.
- Enzymatic cleavage techniques using enzymes like trypsin to break proteins into smaller fragments that can then be sequenced.
Mass Spectrometry: Protein Identification StrategiesMichel Dumontier
The document discusses protein identification strategies using mass spectrometry, including peptide mass fingerprinting (PMF) and tandem mass spectrometry. PMF involves comparing observed peptide masses from an unknown protein to theoretical masses in a database to identify matches, while tandem mass spectrometry fragments peptides and matches the fragmentation pattern to sequences in the database. The document provides details on how each technique works and their relative advantages and limitations.
Quantitative estimation of carbohydrates Likhith KLIKHITHK1
Carbohydrates are one of the three macronutrients in the human diet, along with protein and fat. These molecules contain carbon, hydrogen, and oxygen atoms. Carbohydrates play an important role in the human body. They act as an energy source, help control blood glucose and insulin metabolism, participate in cholesterol and triglyceride metabolism, and help with fermentation. The digestive tract begins to break down carbohydrates into glucose, which is used for energy, upon consumption. Any extra glucose in the bloodstream is stored in the liver and muscle tissue until further energy is needed. Carbohydrates is an umbrella term that encompasses sugar, fruits, vegetables, fibers, and legumes. While there are numerous divisions of carbohydrates, the human diet benefits mostly from a certain subset.
Determination of protein concentration by Bradford method.pptxVijay Hemmadi
Bradford uses Coomasie Blue which is a dye that binds specifically to proteins. It is very accurate and sensitive, compatible with most buffers, sugars, and chaotropic agents but high concentrations of detergent interfere in the assay
Isoelectric focusing is a technique that separates molecules like proteins based on their isoelectric point, which is the pH at which the molecule has no net charge. It was developed in the 1960s and allows for much better resolution than older techniques. The process involves creating an immobilized pH gradient using carrier ampholytes, loading protein samples, and applying an electric field to cause proteins to migrate to the point in the gradient matching their isoelectric point. The separated proteins can then be visualized through staining. Isoelectric focusing is useful for applications like identifying serum proteins and aiding in proteomics research.
Fast protein liquid chromatography (FPLC) is a type of liquid chromatography used to analyze or purify proteins. It introduces samples onto a column containing resin beads, then uses buffers to differentially elute bound protein. FPLC allows separation of heat-labile biomolecules like proteins under mild conditions like 4°C. It has advantages like simple reproducible separation, efficient resolution, and support for a wide range of columns and procedures under low pressure. Limitations include needing glass columns and inability to handle high pressures.
TAP-tagging is a protein purification technique that involves creating a fusion protein with a TAP tag to study protein-protein interactions. The TAP tag contains protein A and a calmodulin binding peptide separated by a TEV protease site. This allows two-step affinity purification of associated protein complexes under physiological conditions. TAP-tagging was developed in the 1990s and has been widely used to map protein interaction networks in yeast and identify new protein complexes involved in processes like pre-mRNA splicing.
Protein fractionation is a process used to isolate individual protein components from a complex protein mixture. It involves separating the mixture into fractions based on differences in physical properties like charge, size, or affinity for specific ligands. Various techniques can be used for fractionation including precipitation, centrifugation, chromatography, electrophoresis, and ultrafiltration. The document provides details on these techniques and how they utilize differences in properties like solubility, isoelectric point, or molecular weight to separate protein mixtures into purer fractions.
This document provides an overview of carbohydrates, including their biochemical and medical importance, classification, structure, properties, and reactions. It defines carbohydrates as substances that yield polyhydroxy aldehyde or ketones upon hydrolysis. Carbohydrates are classified as monosaccharides, oligosaccharides, or polysaccharides depending on their size. Monosaccharides can further be classified based on the number of carbons. Carbohydrates have important roles as energy sources and structural components in living organisms.
Mass Spectrometry-Based Proteomics Quantification: iTRAQ Creative Proteomics
This document discusses iTRAQ (isobaric tag for relative and absolute quantitation), a method for determining the amount of proteins from different sources in a single experiment. It describes the basic structure of iTRAQ reagents, which consist of a unique reporter group, peptide reactive group, and neutral balance group. The principle and workflow of iTRAQ is explained, involving labeling samples with iTRAQ tags, combining samples, performing MS/MS for identification and quantitation. Factors affecting iTRAQ results and its advantages/disadvantages are briefly covered. An example application of iTRAQ to identify tyrosine phosphorylation sites is provided.
This document discusses protein structure and function. It defines different levels of protein structure from primary to quaternary, and describes common secondary structures like alpha helices and beta sheets. Alpha helices are right-handed coils stabilized by hydrogen bonds between amino acids four positions apart in the sequence. Beta sheets consist of beta strands connected laterally by hydrogen bonds to form flat sheets, which can be arranged in parallel or anti-parallel configurations. Tertiary structure refers to the overall three-dimensional shape of a protein formed by the folding and interaction of secondary structures.
Scott Malcolm | Describe About Purpose and Creation Process of Gel Electropho...Scott Malcolm Dallas
Scott Malcolm is a great businessman, who lives in Dallas, Taxes. He explains here about biochemistry and molecular biology to separate a mixed population of DNA and RNA fragments by length and to estimate the size of DNA and RNA fragments.
Introduction
What is Protein Sequencing?
History
Determination of amino acid composition
Sequencing methods
N terminal sequencing
C terminal sequencing
Mass spectrometer
Application
Reference
Frederick Sanger developed two important methods for protein sequencing: 1) using fluorodinitrobenzene to determine the N-terminal amino acid, and 2) cleaving proteins into fragments and piecing their sequences together. The standard strategy involves separating chains, identifying terminal residues, cleaving the protein, sequencing fragments, and reconstructing the full sequence. The Edman degradation method allows sequential removal of residues from the N-terminus. Mass spectrometry techniques like peptide mass fingerprinting and tandem mass spectrometry now dominate protein sequencing.
This document discusses various methods for separating proteins, including based on solubility, ionic charge, polarity, molecular size, and binding specificity. Key separation methods mentioned include salting in/out based on solubility, ion exchange chromatography and electrophoresis based on charge, and adsorption chromatography, paper chromatography, and affinity chromatography based on other properties. The document provides details on how each of these techniques works to separate proteins in a mixture based on their distinguishing physical characteristics.
Standard test that used to determine the charged molecules, mainly proteins and nucleic acids.
Widely used in biochemistry, forensics, genetics and molecular biology.
Laemmli system of SDS-PAGE was first introduced in 1970s
This document discusses the structures, functions, and nomenclature of nucleotides and nucleic acids. It describes how nucleotides are composed of a nitrogenous base, pentose sugar, and phosphate group. Nucleotides function as energy carriers like ATP, cofactors like NAD+, and signal molecules like cAMP. Nucleic acids like DNA and RNA store and transmit genetic information through their roles in protein synthesis. The document outlines the four main types of RNA and their functions, and discusses the properties of nucleotide bases that allow nucleic acids to form specific three-dimensional structures.
Monosaccharides are simple sugars with multiple OH groups classified based on carbon number as trioses, tetroses, pentoses or hexoses. Disaccharides consist of two covalently linked monosaccharides, while oligosaccharides have a few linked monosaccharides and polysaccharides are polymers of monosaccharide or disaccharide units. Common monosaccharides include glucose and fructose, while examples of disaccharides are sucrose, lactose and maltose formed by glycosidic bonds between the monosaccharides. Polysaccharides in plants include starch and cellulose consisting of glucose polymers.
This document discusses various methods for determining the amino acid sequence of proteins, including:
- Edman degradation, which sequentially removes amino acids from the N-terminus. Up to 60 amino acids can typically be determined.
- Mass spectrometry techniques like MALDI that help determine the mass and sequence of protein fragments.
- Enzymatic cleavage techniques using enzymes like trypsin to break proteins into smaller fragments that can then be sequenced.
Mass Spectrometry: Protein Identification StrategiesMichel Dumontier
The document discusses protein identification strategies using mass spectrometry, including peptide mass fingerprinting (PMF) and tandem mass spectrometry. PMF involves comparing observed peptide masses from an unknown protein to theoretical masses in a database to identify matches, while tandem mass spectrometry fragments peptides and matches the fragmentation pattern to sequences in the database. The document provides details on how each technique works and their relative advantages and limitations.
Quantitative estimation of carbohydrates Likhith KLIKHITHK1
Carbohydrates are one of the three macronutrients in the human diet, along with protein and fat. These molecules contain carbon, hydrogen, and oxygen atoms. Carbohydrates play an important role in the human body. They act as an energy source, help control blood glucose and insulin metabolism, participate in cholesterol and triglyceride metabolism, and help with fermentation. The digestive tract begins to break down carbohydrates into glucose, which is used for energy, upon consumption. Any extra glucose in the bloodstream is stored in the liver and muscle tissue until further energy is needed. Carbohydrates is an umbrella term that encompasses sugar, fruits, vegetables, fibers, and legumes. While there are numerous divisions of carbohydrates, the human diet benefits mostly from a certain subset.
Determination of protein concentration by Bradford method.pptxVijay Hemmadi
Bradford uses Coomasie Blue which is a dye that binds specifically to proteins. It is very accurate and sensitive, compatible with most buffers, sugars, and chaotropic agents but high concentrations of detergent interfere in the assay
Isoelectric focusing is a technique that separates molecules like proteins based on their isoelectric point, which is the pH at which the molecule has no net charge. It was developed in the 1960s and allows for much better resolution than older techniques. The process involves creating an immobilized pH gradient using carrier ampholytes, loading protein samples, and applying an electric field to cause proteins to migrate to the point in the gradient matching their isoelectric point. The separated proteins can then be visualized through staining. Isoelectric focusing is useful for applications like identifying serum proteins and aiding in proteomics research.
Fast protein liquid chromatography (FPLC) is a type of liquid chromatography used to analyze or purify proteins. It introduces samples onto a column containing resin beads, then uses buffers to differentially elute bound protein. FPLC allows separation of heat-labile biomolecules like proteins under mild conditions like 4°C. It has advantages like simple reproducible separation, efficient resolution, and support for a wide range of columns and procedures under low pressure. Limitations include needing glass columns and inability to handle high pressures.
TAP-tagging is a protein purification technique that involves creating a fusion protein with a TAP tag to study protein-protein interactions. The TAP tag contains protein A and a calmodulin binding peptide separated by a TEV protease site. This allows two-step affinity purification of associated protein complexes under physiological conditions. TAP-tagging was developed in the 1990s and has been widely used to map protein interaction networks in yeast and identify new protein complexes involved in processes like pre-mRNA splicing.
Protein fractionation is a process used to isolate individual protein components from a complex protein mixture. It involves separating the mixture into fractions based on differences in physical properties like charge, size, or affinity for specific ligands. Various techniques can be used for fractionation including precipitation, centrifugation, chromatography, electrophoresis, and ultrafiltration. The document provides details on these techniques and how they utilize differences in properties like solubility, isoelectric point, or molecular weight to separate protein mixtures into purer fractions.
This document provides an overview of carbohydrates, including their biochemical and medical importance, classification, structure, properties, and reactions. It defines carbohydrates as substances that yield polyhydroxy aldehyde or ketones upon hydrolysis. Carbohydrates are classified as monosaccharides, oligosaccharides, or polysaccharides depending on their size. Monosaccharides can further be classified based on the number of carbons. Carbohydrates have important roles as energy sources and structural components in living organisms.
Mass Spectrometry-Based Proteomics Quantification: iTRAQ Creative Proteomics
This document discusses iTRAQ (isobaric tag for relative and absolute quantitation), a method for determining the amount of proteins from different sources in a single experiment. It describes the basic structure of iTRAQ reagents, which consist of a unique reporter group, peptide reactive group, and neutral balance group. The principle and workflow of iTRAQ is explained, involving labeling samples with iTRAQ tags, combining samples, performing MS/MS for identification and quantitation. Factors affecting iTRAQ results and its advantages/disadvantages are briefly covered. An example application of iTRAQ to identify tyrosine phosphorylation sites is provided.
4° lezione di Biologia Applicata tenuta dal Prof. Falone in data 28/10/2013 per il corso di Scienze psicologiche Applicate.
Argomenti trattati: proteine, aminoacidi, legame peptidico, struttura primaria, struttura secondaria, struttura terziaria, livelli organizzazioni proteine, Dogma centrale biologia molecolare, acidi nucleici,
1. Le proteine
sono polimeri lineari di aa. Si identificano 4 livelli strutturali, di complessità
crescente.
La struttura primaria è la sequenza degli aa. uniti dai legami peptidici
(covalenti), che si instaurano tra gruppo carbossilico e gruppo amminico
di due aa. contigui.
La struttura secondaria può essere ad -elica (elica destrogira con circa 4
aa per giro) o a -struttura (anse che giacciono su un piano) ed è
stabilizzata da ponti H tra gruppi peptidici lontani nella struttura primaria,
ma che si vengono a trovare di fronte quando tratti discreti della proteina
acquistano una struttura tridimensionale (cosa che succede già durante la
sintesi proteica sui ribosomi).
2. DIMENSIONI
Minimo: almeno 40 residui (<40 peptide). Tale limite sembra costituire la
dimensione minima per ripiegarsi in una forma stabile e specifica, quindi per avere
una funzione!!!
Massimo: TITINA (269326 residui, 2990 kDa). Il limite massimo potrebbe essere
imposto dall’efficienza del macchinario della sintesi proteica. Più grande è la
proteina maggiore è la probabilità di introdurre errori durante la trascrizione e
traduzione.
COMPOSIZIONE
Gli amminoacidi non sono presenti nelle proteine tutti con la stessa frequenza:
Abbondanti: Leu, Ala, Gly, Ser, Val, Glu Rari: Trp, Cys, Met, His
Ogni amminoacido ha specifiche proprietà chimiche e fisiche, quindi la sua
presenza in una particolare regione influenza la struttura tridimensionale e le
proprietà/funzioni della proteina.
Per una proteina di n residui, esistono 20n sequenze possibili!!!!!
Le caratteristiche di una proteina non dipendono solamente dalla
composizione degli amminoacidi, ma in particolare modo dalla loro
sequenza.
3. Estrazione DELLE PROTEINE dalle CELLULE
Variando la composizione dei tamponi utilizzati per lisare le cellule
si possono effettuare:
Lisati citosolici: si utilizzano lysis
buffers contenenti dei detergenti (NP-40,
Triton X-100, Tween-20) che consentono
la rottura della membrane.
Lisati nucleari: Si sfruttano elevate
concentrazioni saline per aprire i pori
nucleari e consentire così alle proteine
nucleari di uscire e ritrovarle nel
surnatante.
CELLULE
ADERENTI/SOSPENSIONE
Estratto totale:
proteine citosoliche e
nucleari in sospensione
Estratto citosolico:
proteine citosoliche in
sospensione
I nuclei sono integri
nel pellet.
Estratto nucleare:
proteine nucleari in
sospensione
4. Di norma si utilizzano tamponi di estrazione con forza ionica pari a
0.1-0.2 M e pH da 7.0 a 8.0 (tampone Tris o fosfato) addizionati con:
Tampone di estrazione
5. Sodio azide: agente batteriostatico.
4. EDTA: per rimuovere ioni metallici che possono reagire con gruppi tiolici
R-SH + Me++ R-S-Me+ + H+
3. Substrati enzimatici e cofattori: substrato può stabilizzare l’enzima,
cofattori andrebbero persi durante la purificazione.
2. Inibitori di enzimi: rilascio di enzimi proteolitici (dai lisosomi ad es.)
Per rallentare la proteolisi 4°C, inibitori di proteasi;
serin proteasi: PMSF (fenil metil sulfonil fluoruro)
tioloproteasi: iodoacetato e cistatina
asparticoproteasi: pepstatina
metalloproteasi: EDTA e 1,10 - fenantrolina
esopeptidasi: amastatina e bestatina
1. Antiossidante: DTT, beta-ME, glutatione ridotto. L’interno della cellula è un
ambiente riducente.
5. STABILIZZAZIONE DELLE PROTEINE
• COCKTAILS DI INIBITORI DELLE PROTEASI/FOSFATASI:
Durante la preparazione degli estratti proteici da tessuti e/o cellule vengono rilasciati numerosi
enzimi digestivi (proteasi) e delle fosfatasi che possono indurre la parziale
degradazione/inattivazione della proteina.
La stabilità di una proteina può essere assicurata mediante:
Proteasi: scindono i legami peptidici delle proteine.
Fosfatasi: determinano la rimozione di gruppi fosfato dalle proteine.
• pH: la proteine sono generalmente stabili in soluzioni tampone con valori di
pH vicini alla neutralità.
pH alterato: si ha la DENATURAZIONE della proteina (modificazione
della conformzione tridimesionale).
• TEMPERATURA: la stabilità termica delle proteine è molto variabile.
PROTOCOLLO suggerito: Per evitare denaturazione delle proteine effettuare l’estrazione e la
purificazione a 0-4 °C; mantenere gli estratti cellulari a –20°C o a –80°C.
6. Purificazione/separazione delle proteine
GRADO DI PUREZZA UTILIZZO
Molto alto >99% Uso terapeutico e studi in vivo;
Alto 95-99% Cristallografia, caratterizzazione biochimica;
Medio <95% Produzione di anticorpi, sequenziamento N-terminale,
spettrometria di massa.
Si utilizzano metodi che sfruttano le diverse caratteristiche
chimico-fisiche delle proteine:
CARICA DIMENSIONI
SOLUBILITA’
AFFINITA’ DI LEGAME
CON ALTRE MOLECOLE
IDROFOBICITA’
7. Determinazione quali/quantitativa delle proteine
Si utilizzano metodi che sfruttano le diverse caratteristiche
chimico-fisiche delle proteine:
Assorbanza UV/Vis
diretta, indiretta
Fluorescenza
intrinseca, estrinseca
Attività biochimica
anticorpi, enzimi
8. METODI DIRETTI: Assorbanza UV/vis
Cromofori di una proteina:
legame peptidico
ci si riferisce all’ aminoacido libero
Il legame
peptidico (210
nm)
Ponte disolfuro
(250 nm)
Centrato a 280 nm
max a 256-260 nm
9. ➢Bisogna valutare il contributo di ogni singolo AA all’Assorbanza totale
➢C’è solo un problema di interazione fra anelli aromatici diversi
➢Se ci sono più Tyr e non è dato dalla somma, dipende dalla posizione che occupano sulla
catena.
Le proteine assorbono a 280 nm (aa aromatici) ma anche il DNA assorbe a 280.
➢Si misura la A della proteina in soluzione a 280 nm e a 260 nm.
➢Si calcola il rapporto di A e si considera il valore di F appropriato nella equazione:
Concentrazione (mg/ml)= F x 1/d x A280
Intervallo 50-500mg/ml
10.
11. METODI INDIRETTI
metodo riproducibile e sensibile per valutare la quantità di proteina in maniera relativa
(rispetto ad uno standard).
Si lega un colorante alle proteine e si misura l’assorbanza del composto
formato
P + C PC
Requisiti:
L’equilibrio deve essere tutto spostato a destra
Deve essere completa, bisogna usare cioè un largo eccesso di colorante.
Quindi:
➢la quantità che si lega deve essere la stessa per tutte le proteine;
➢ la reazione deve essere completa;
➢ il colorante libero non deve assorbire.
12. Metodo Bradford: Blu di Comassie legato alla proteina è blu se non è legato è
marroncino.
A 595 nm si misura l’Assorbanza del complesso PD e non D.
13. Metodo di Lowry
Alla soluzione proteica si unisce
➢il reagente di Folin (tungstato, molibdato e fosfato di sodio)
➢una soluzione di solfato di rame
si sviluppa un colore blu-porpora che può essere letto a 750 nm. I legami peptidici
reagiscono con Cu++. Il colore sviluppato dipende dal contenuto di tirosina e
triptofano.
Tris e tamponi zwitterionici (PIPES, HEPES) interferiscono.
sensibilità: qtà inferiori a 10 mg/ml
14. Misure di Fluorescenza
➢fluorescenza intrinseca: pochi composti manifestano questo fenomeno.
➢fluorescenza estrinseca: i può legare un composto non fluerescente ad un probe
fluorescente.
Esempi
➢aa legati tramite il gruppo -NH2 a cloruro di dansile
➢acridina orange dà coniugati diversi con DNA ss e ds.
L’utilizzo maggiore è la determinazione di sostanze presenti in scarsa quantità:
vitamina B1 nel cibo, NADH, ormoni, droghe, pesticidi, carcinogeni,…..
15.
16.
17. Luminometria
Luminescenza: emissione di radiazione elettromagnetica nella regione visibile come
risultato di una reazione chimica.
Luminometria: la tecnica usata per misurare la luminescenza.
Chemioluminescenza: come risultato di una reazione chimica (ad es. luminolo reagisce
con ossigeno e dà chemioluminescenza).
Bioluminescenza: viene emessa della luce in seguito ad una reazione catalizzata da un
enzima (di solito luciferasi). La lunghezza d’onda emessa dipende dal substrato usato e
varia da 560 nm (giallo verde) a 620 nm (rosso). Il metodo e’ estremamente sensibile.
Esempio
Il sistema della luciferasi della lucciola.
luciferina + ATP + O2 ossiluciferina + AMP + PPi + CO2 + luce
1. Misurazione dell’ATP
2. Utilizzo del luminolo (e derivati) come substrati di reazioni.
3. Misurazione della luciferasi come gene “reporter”.
19. Separazioni LC
• In questo metodo cromatografico (che è quello originale) le molecole sono
adsorbite (legate non covalentemente) sulla superficie di materiali insolubili
➢ La cromatografia su idrossiapatite (Ca5[PO4]3OH) è usata per la separazione
di miscele proteiche o di acidi nucleici (ssDNA e dsDNA) e viene eluita con
gradienti di sali di fosfato.
➢ La cromatografia per interazioni idrofobiche. Si basa sulle interazioni tra le
regioni idrofobiche delle proteine e gruppi non polari immobilizzati su una
matrice solida (ottil o fenil-sefarosio). Le interazioni idrofobiche vengono
favorite aggiungendo alla fase mobile sali come il (NH4)2SO4. L’eluizione
avviene tramite un gradiente decrescente di (NH4)2SO4.
20. Separazione HPLC
• HPLC analitica
➢ Analisi di tutti i tipi di molecole
biologiche
➢ Analisi composizione aminoacidica
➢ Separazione oligopeptidi
➢ Separazione di proteine
• HPLC preparativa
➢ Purificazione di tutti i tipi di molecole
biologiche
➢ Purificazione proteine
[Fast Protein Liquid Chrom. (FPLC)]
21. CROMATOGRAFIA PER AFFINITA’
1) Attivazione dell’agarosio con bromuro di cianogeno
2) Reazione del ligando con l’agarosio attivato
22. Accoppiamento di un
ligando all’agarosio
tramite un
“gruppo spaziatore”
flessibile
Anche gli anticorpi monoclonali possono essere legati ad opportune
matrici solide (CROMATOGRAFIA PER IMMUNOAFFINITA’)
23.
24.
25. CROMATOGRAFIA AD ESCLUSIONE MOLECOLARE
Gel filtrazione: le molecole vengono separate in base alle dimensioni e alla forma
26.
27.
28. Esempio di purificazione
Per purificare una proteina bisogna
misurare la sua concentrazione:
es. attività enzimatica di enzima esterasi
30. ELETTROFORESI
Una molecola con una carica netta non nulla posta tra due elettrodi di segno opposto migra verso
l’elettrodo con segno opposto alla sua carica netta
+ -
-
ddp (V)
d
ddp (V): differenza di potenziale applicata tra gli elettrodi
d: distanza tra gli elettrodi
q: carica della molecola
E (campo elettrico) = V/d
La molecola si muove verso l’elettrodo di segno opposto con una velocità(v) che è proporzionale
all’entità del campo elettrico (V) e della sua carica (q) e inversamente proporzionale all’attrito che
incontra nel muoversi (f – coefficiente d’attrito)
v = Eq/f
q
v
31. Proteine presentano gruppi acidici o basici che sono quindi ionizzabili
Per essere analizzata in elettroforesi una molecola deve avere una carica non nulla
pH del mezzo in cui sono in soluzione le molecole deve condizionare la loro carica
(soluzione tampone)
Applicare una ddp (V) in un mezzo che contiene ioni equivale a generare una corrente (I) che è
inversamente proporzionale alla resistenza (R) del mezzo stesso
V=RI (legge di Ohm) => I = V/R
ELETTROFORESI di proteine
32. La velocità di migrazione dipende da:
➢forza del campo elettrico
➢carica, dimensione, massa, forma della molecola
➢viscosità, forza ionica della soluzione in cui avviene la migrazione
➢temperatura
v = m ×E = m V/L
v: velocità di migrazione (cm·s-1) V: campo elettrico (V·cm-1)
m: mobilità elettroforetica (cm2·V·s) dipende dalla carica netta e dalle forze
di attrito (dimensione/peso molecolare della molecola)
Molecole piccole/grande carica: + velocità
- forza ionica - effetto schermante: + velocità
Elettroforesi
E’ un metodo di separazione/analisi che si basa su migrazione di soluti carichi
o particelle in un mezzo liquido sotto l’influenza di un campo elettrico generato
fra 2 elettrodi.
33. Per la legge di Joule in un sistema elettrico caratterizzato da una resistenza R e nel quale viene fatta
passare una corrente I si sviluppa sotto forma di calore una potenza che è data da
W = VI = I2R
ELETTROFORESI – principi generali
+ -
-
ddp (V)
d
q
v
Cosa provoca il calore in un sistema del genere?
a) Moti convettivi nel sistema
b) Aumento diffusione molecole
c) …
Effetto negativo sulla
separazione delle molecole
– Risoluzione -
Strategie
Rimozione estremamente
efficiente del calore attraverso
la riduzione delle dimensioni
del sistema elettroforetico
=>
ELETTROFORESI
CAPILLARE
(Free Flow Electrophoresis)
Elettroforesi condotta in un
mezzo che contrasta/minimizza i
moti convettivi e la diffusione
delle molecole
=>
ELETTROFORESI su
SUPPORTO SOLIDO
34. Campo elettrico:forza che spinge lo ione + verso catodo o – verso anodo
Si oppone una forza di resistenza del soluzione in cui avviene la migrazione.
Alta efficienza di separazione.
Vantaggio: alta efficienza
35. Superficie del mezzo di supporto ha carica – per presenza OH-
·Ioni + si affollano attorno alla superficie nuvola di carica + in prossimità
superficie
· Potenziale z (potenziale elettrocinetico) = potenziale tra ioni fissi – e nuvola +
· Applicando potenziale esterno la nuvola di carica + si muove verso polo –
endosmosi: gli ioni sono trascinati dal solvente (ioni molto idratati)
Problema: flusso elettrosmotico
36.
37. molecole possono restare ferme o tornare indietro verso il polo opposto
· endosmosi elevata per acetato cellulosa, agarosio (γ globuline tornano
indietro dal punto applicazione)
· endosmosi minima per amido e poliacrilammide (minime cariche superficiali)
38. Elettroforesi planare
Strato piano poroso di lunghezza 2-10 cm
❖carta, acetato di cellulosa, gel di polimeri, Gel di agarosio (AGE)
❖Bagnato da tampone
❖Metodo semplice, difficile da automatizzate
❖Grande quantità di campione 0.6-3ml;
❖Lento: 30-90 min
❖Trasparenza dopo colorazione AGE rivelazione densitometrica.
❖Scarsa quantificazione
❖Separazione di proteine del siero, varianti dell’emoglobina,
isoenzimi, frazioni di lipoproteine.
39. Elettroforesi su supporti solidi
Carta
Acetato di cellulosa
Strati sottili di silice, cellulosa:
TLE Thin Layer Electrophoresis
Su fogli sottili In Gel
Gel di agarosio
Gel di poliacrilamide
L’elettroforesi su acetato di cellulosa:
-non raggiunge le risoluzioni ottenibili con i più
moderni gel di poliacrilamide ed agarosio,
-molto usata riveste ancora in ambito clinico per la
valutazione delle proteine del siero ed altre
specifiche applicazioni.
-metodiche relativamente veloci =>
test rapidi in campo diagnostico/clinico.
L’elettroforesi su gel di agarosio e su gel di
poliacrilamide:
-buona risoluzione,
-comunemente impiegati nei laboratori di
ricerca per l’analisi di DNA e delle proteine.
- richiedono molto tempo per effettuare una
corsa: poco impiegati per diagnostica ad alta
processività.
40. Gel di Agarosio
Polimero di D-galattosio
e
3,6 anidro L-galattosio
Transizione di stato
(macroreticolo sulla base di
legami idrogeno)
Transizione gel-sol tramite
riscaldamento
Agarosio modificato mediante
aggiunta di gruppi CH3 sui
gruppi OH ha temperature di
transizione minori (low melting
agarose)
Reticolo di agarosio polimerizzato
“setaccio molecolare”
41. Acrilamide
E’ il polimero piu’ utilizzato per la elettroforesi di proteine e di molecole di DNA o
RNA con PM tra 5.000 e 200.00.
Vantaggi:
➢notevole resistenza meccanica;
➢completa trasparenza sia nel visibile che nell’UV, la trasparenza resta anche
quando sono seccati.
➢aderisce bene al vetro evitando che si creino vie preferenziali
➢porosita’ puo’ essere controllata (setaccio molecolare)
➢utilizzabile per la elettroforesi sia nativa che denaturante
il monomero e’ una potente neurotossina, ma il polimero non e’ tossico
44. Albumin
Globuline
1
2
1 2 g
-
+
Ddp (V)
Buffer Buffer
Striscia di acetato di cellulosa
pH ≈ 8.5
Elettroferogramma
Elettroforesi
Elettroforesi (schema)
Analisi condotta in circa 15 minuti
Campione viene deposto sulla superficie del supporto di
acetato di cellulosa che è imbibito del tampone di corsa e
successivamente viene applicata la ddp. Il pH del tampone
determina la carica delle molecole che si separano secondo il
loro rapporto m/z e l’attrito che incontrano nel muoversi.
Elettroforesi su acetato di cellulosa
45. Il tracciato è interpretato e quantizzato da specifici programmi informatici, con funzioni
matematiche, che elaborando l’intensità di colore, la posizione delle bande e la loro larghezza.
47. Alterazioni del profilo elettroforetico delle proteine del siero permettono di
identificare alcune patologie:
Sono in commercio
anche kit per la
valutazione di proteine
urinarie, lipoproteine,
emoglobine, etc.
48. ISOENZIMI
• Gli enzimi non hanno una struttura omogenea
Isoenzimi: proteine che catalizzano la stessa reazione e presentano
diverse proprietà molecolari (diversa carica elettrica,
diversa solubilità, diversa resistenza ad agenti chimici e fisici) e/o diverse
proprietà funzionali presentano differenze in termini di pH ottimale,
affinità per substrato e coenzima…..
Isoenzimi della lattato deidrogenasi LDH:
LDH1 4 subunità H
LDH2 3 subunità H e da una M (H3M) (miocardio, eritrociti, rene e polmone)
LDH3 (H2M2) (milza, pancreas, tiroide, linfonodi)
LDH4 (HM3)
LDH5 (M4) (fegato e muscoli scheletrici)
50. Elettroforesi capillare ad alta risoluzione (“High Performance Capillary
Electrophoresis” o HPCE
L’elettroforesi capillare è una separazione elettroforetica che avviene in un
capillare di diametro variabile tra 25 e 100 μm.
Permette di limitare i problemi legati allo sviluppo di calore che viene facilmente
disperso essendo molto alto il rapporto tra la superficie e il volume.
Strumento
• capillare di silice fusa (25-75 mm diametro) , lunghezza 40-100 cm
• serbatoi separati contenenti due elettrodi
• generatore di voltaggio
• sistema di rivelazione
• sistema di acquisizione dei dati (computer)
Modi di iniezione del campione (pocli nl)
• elettromigrazione
• iniezione idrostatica
Elettroforesi capillare
51. Sistemi di rivelazione
• detector UV-vis
• detector a fluorescenza
• detector a conducibilità
• detector elettrochimico
• spettrometri di massa
• detector radioattivo
52. Electroferogramma
tempo di migrazione analogo al tempo di ritenzione
Ordine di Eluizione
(detector at catodo):
Cationi con alta mobilità
Cationi con bassa mobilità
Tutti composti neutri (veo)
Anioni con bassa mobilità
Anioni con alta mobilità
❖veloce
❖Metodo complesso, facile da automatizzate
❖Piccole quantità di campione nl
❖buona quantificazione
53.
54. Tipi di molecole separabili con CE
• amminoacidi
• peptidi
• proteine
• acidi nucleici
• ioni inorganici
• acidi e basi organiche
• intere cellule
Vantaggi dell’elettroforesi capillare
☺ alta efficienza di separazione (circa 100 piatti teorici)
☺ piccola quantità di campione (1-10 µl)
☺ separazione rapida (da 1 a 45 min)
☺ selettività
☺ automazione
☺ possibilità di quantificazione
☺ riproducibilità
☺ possibilità di accoppiamento con spettrometro di massa
55. Elettroforesi planare:
Scarsa lunghezza
bassa resistenza elettrica, alta corrente
Riscaldamento del campione, Vmax=500 V
N=100-1000 bassa risoluzione
Elettroforesi capillare
grande lunghezza
alta resistenza elettrica, bassa corrente
Non riscaldamento del campione, Vmax=20-100 kV
N=100,000-10,000,000 alta resoluzione
(HPLC N=1,000-20,000)
56. Si definisce come punto isoelettrico (PI) di una proteina quel valore di pH al quale
la somma algebrica delle cariche e’ zero.
Quindi al PI la proteina non avra’ carica netta, mentre a qualunque altro valore di
pH avra’ una carica proporzionale al valore di pH stesso:
Isoelettrofocusing
58. ISOELETTROFOCALIZZAZIONE
➢ E’ una metodica di separazione delle proteine che vengono discriminate in
base al loro punto isoelettrico
➢ Ha un’alta definizione, questa tecnica riesce a separare proteine con punti
isoelettrici che differiscono di 0.01 unità di pH
➢ La proteina migra fino a quando raggiunge un punto di pH uguale al suo pI
dove essendo priva di carica netta, si ferma
➢ Viene normalmente eseguita su gel di acrilammide
al 4% per evitare qualsiasi effetto dovuto alle
dimensione
➢ Il gradiente di pH viene a formarsi grazie
all’introduzione nel gel di conposti chiamati anfoliti:
sono miscele di acidi poliammino-policarbossilici
sintetici (Bio-lyte, Pharmalyte)
➢ Ci sono streep pronte all’uso con range di pH
desiderati (es: pH 3-10)
59. C
H3 CH3
A
B
A
B
B
B
B
A
A
B
B
C
H3 CH3
B
B
A
B
B
B
B
A
A
B
B
C
H3 CH3
A
A
A
B
A
B
B
A
A
B
B
Anodo (+) Catodo (-)
Anf1
Anf2
Anf3
A: pKa = 4
B: pKa = 9
Condizioni iniziali: pH = 7
neutro
positivo
negativo
C
H3 CH3
A
B
A
B
B
B
B
A
A
B
B
C
H3 CH3
B
B
A
B
B
B
B
A
A
B
B
C
H3 CH3
A
A
A
B
A
B
B
A
A
B
B
Anf1
Anf2
Anf3
Anodo (+) Catodo (-)
Applicata ddp => molecole cariche si spostano
migrazione anodica
migrazione catodica
66. Elettroforesi bidimensionale (2-DE)
Principi della 2-D
elettroforesi
• I dimensione
Isoelettrofocusing in
condizioni denaturanti:
separazione in base al
punto isoelettrico
• II dimensione
SDS elettroforesi:
separazione in base al
peso molecolare
68. Vantaggi
• Possibilità di caricare campioni non purificati
• Risoluzione estremamente alta
• I gel 2 –DE sono collettori di frazioni
proteiche molto efficienti
• Proteine sono protette all’interno della
matrice del gel
Problematiche
• Gradiente di pH
• Limiti nel determinare proteine poco
rappresentate
• Capacità di caricare campione
• Proteine idrofobiche
• Proteine ad alto peso molecolare
Elettroforesi bidimensionale (2-DE)
69. Visualizzazione degli spots proteici
+++
1 pg
Radioactive labeling
++++
10 – 100 pg
Fluorescent staining
++
200 pg
Silver staining
+++
100 ng
Comassie blue
Quantificazione
Limiti di Sensibilità
Elettroforesi bidimensionale (2-DE)
70. PERCHE’ LA 2D
Si possono seguire contemporaneamente i cambiamenti dell’espressione di
una proporzione significativa di proteine di un dato tipo cellulare invece di
una o due.
•Confronto fra tessuti sano e malati
•Analizzare l’effetto di farmaci
•Osservare cambiamenti del pattern proteico in una cellula in via di
differenziazione
•Confronto di ceppi batterici patogeni e non
•Confrontare profili proteici da sieri di pazienti al fin di individuare marker
diagnostici o prognostici per una certa patologia
➢Sono disponibili software consentono l’analisi quali/quantitativa dei gel 2D
mettendo a confronto anche pattern di due gel diversi
71. Le proteine di un tessuto tumorale e del relativo tessuto controllo: dopo colorazione
(Sypro-Ruby stain) si effettua il “matching” dei due gel e si evidenziano gli spot la
cui espressione è diversa nel campione e nel controllo.
Proteomica: analisi differenziale
72. Dopo SDS-PAGE le proteine sono inaccessibili su gel, perciò sono trasferite su
un supporto più manipolabile:
• nitrocellulosa
• PVDF, polividenedifluoruro
Si deve scegliere:
1. Tampone di trasferimento
2. Tecnica di trasferimento:
• diffusione semplice
• vacuumblotting
• elettroblotting
(si applica ad analisi di sequenze; analisi con anticorpi, analisi proteina-proteina)
Blotting
73. Trasferimento
Tamponi più comuni:
➢1.Tris 25 mM, glicina192 mM, metanolo 20%, SDS 0.01%
➢2.CAPS (ciclesilaminopropansulfonato(Goodbuffer) e metanolo: aiuta la
rimozione dell’SDS dalle proteine, stabilizza il gel durante il trasferimento, facilita il
binding su NC
1. Blotting per diffusione semplice
trasferisce 25-50% delle proteine rispetto all’elettroblotting
74. 2. Blotting sotto vuoto
3. Elettroblotting: la tecnica più diffusa poiché garantisce maggio
completezza di trasferimento.
In genere 1 mA/cm2 per 90 min oppure 100V x 90 min o 20V a 4°C overnigh
75. Western Blot
Si aggiunge un substrato
che permette una reazione
che produce un prodotto
che assorbe nel Vis
Anticorpo primario aggiunto
a diluizione opprtuna ed
incubato sulla membrana
76. Immuno-blotting :
1. separazione del campione tramite
PAGE (Poliacrilammide gel
elettroforesi)
2. Western blotting: trasferimento delle
proteine separate
elettroforeticamente su membrana
3. Rivelazione con anticorpi:
▪ Primari: riconoscono e legano la
proteina specifica di interesse
▪ secondari: riconoscono
specificamente le IgG del primario
Proteina
legata alla membrana
Anticorpo
primario
Membrana
Fluoroforo o
Fosfatasi alcalina AF
perossidasi di rafano HRP
Anticorpo secondario
Coniugato a:
77. Eastern blot
Easternblotting sfrutta la cosiddetta elettroforesi cationica:
procedura a simile all’SDS-PAGE ma il detergente è CTAB,
cetiltrimetilammoniobromuro con carica +
C16H33NH3
+ Br-
▪ Tampone di corsa = acido acetico, β-alanina, CTAB
▪ Corsa elettroforetica = polarità invertita
78. Southern blot
Southern (nome da Mr.Southern) Utilizzato per analizzare i pattern genetici del
DNA
➢ Si isola DNA dal materiale cellulare presente nel nucleo:
• Si utilizza un detergente
• Si applica una grande pressione per “premere fuori” il DNA.
➢ Si taglia DNA in parti di diverse dimensioni utilizzando uno o più enzimi di
restrizione
➢ Si separano i frammenti di DNA a seconda della loro dimensione con gel
electrophoresis
➢ Si denatura il DNA per riscaldamento o trattamento chimico sul gel per separare
i filamenti complementari
➢ Frammenti di DNA sono rivelati con una reazione di ibridazione con una sonda
marcata
• Con isotopo radioattivo ed analisi a raggi X per rivelazione
• Con Ab per dosaggio immunochimico (dosaggio colorimetrico o fluorimetrico).
79. Northern blot
Per misurare quantitativamente (quanto viene espresso) e valutare la dimensione di
un RNA messaggero di un gene.
RNA messaggero estratto da RNA totale della cellula per lisi, centrifugazione,
DNasi;
separato per cromatografia per affinità
spostato su un foglio di nitrocellulosa
scaldato per farlo aderire permanentemente al foglio
visualizzato per ibridazione con sonda radiottiva fatta con il gene in studio
