17. Struttura (1) STRUTTURA SECONDARIA Conformazione spaziale delle catene Foglietti Beta Alfa Eliche STRUTTURA PRIMARIA Sequenza lineare dei residui aminoacidici
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19. Struttura (2) STRUTTURA QUATERNARIA Conformazione tridimensionale assunta dalla proteina dopo l’associazione di due o piu’ unita’ polipeptidiche, unite tra loro da legami deboli.
22. Proprieta’ (1) Le proprietà delle proteine si ricollegano a quelle dei loro costituenti, gli amminoacidi: sono elettroliti anfoteri, possono essere sottoposte ad elettroforesi , sono otticamente attive (levogire) e presentano il fenomeno di Tyndall (fenomeno di dispersione della luce dovuto alla presenza di particelle , di dimensioni comparabili a quelle delle lunghezze d'onda della luce incidente). Il punto isoelettrico o PI di una proteina è rappresentato da quella concentrazione di idrogenioni del mezzo, che si comporta in modo da far assumere al protide una forma di anfoione. Per ottenere il peso molecolare o PM delle proteine si deve far ricorso a tecniche e metodologie di non sempre facile attuazione. Tra le tante, quella che fornisce i risultati più precisi è senza dubbio la spettrometria di massa .
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27. Funzione (5) La velocità di una reazione chimica è indipendente d al D G ma è determinata dall’ampiezza della barriera dell’energia di attivazione. I catalizzatori aumentano la velocità di reazione, abbassando questa barriera.
28. Funzione (6) Nel sito attivo, i substrati possono essere orientati correttamente o modificati chimicamente. Ne risulta che il substrato raggiunge rapidamente il proprio stato di transizione e quindi la reazione procede.
29. Anticorpi (1) CATENA LEGGERA Frammento Fab ( antibody binding ) CATENA PESANTE Frammento Fc ( crystallizable ) Regione Cerniera
33. Saggi Immunologici (1) I saggi immunologici sono un gruppo di tecniche analitiche basate su specifiche interazioni anticorpi/antigeni che producono un segnale misurabile che può essere riferito alla concentrazione di un composto in soluzione Gli anticorpi possono essere monoclonali o policlonali e possono essere diretti verso molecole molto specifiche o verso una intera classe di molecole
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36. Saggi Immunologici (4) SAGGI IMMUNOLOGICI COMPETITIVI Basati sulla competizione tra la molecola target (analita) nel campione e una molecola derivativa marcata in un reagente per una quantità limitata di anticorpi
37. Saggi Immunologici (5) SAGGI IMMUNOLOGICI NON COMPETITIVI Nei metodi non competitivi, la mistura di reazione comprende un eccesso di anticorpi marcati, in modo tale che tutti gli analiti vengano riconosciuti e legati. La quantità di complesso antigeni-anticorpi è quindi misurato per determinare la quantità di farmaco presente nel campione.
39. Saggi Immunologici (7) SAGGI IMMUNOLOGICI ETEROGENEI vs OMOGENEI Dopo che la reazione ha avuto luogo i saggi immunologici eterogenei richiedono la separazione dei componenti legati e non legati (p.e. ELISA) Nei saggi immunologici omogenei la reazione legante è misurata "sul posto" senza la separazione dei componenti della reazione.
40. Saggi RadioImmunologici (RIA) (1) RIA usa un marcatore radioattivo (normalmente 125I, 3H o 14C), che emette radiazioni che possono essere misurate da un contatore gamma o beta Negli anni passati la tendenza è stata di allontanarsi dal RIA e muoversi verso tecniche non isotopiche
41. ImmunoFluorescenza (1) L’immunofluorescenza è una delle tecniche più usate tra le reazioni sierologiche, di fondamentale importanza in microbiologia, per rilevare in un certo campione la presenza di specifici Antigeni od Anticorpi ignoti la cui controparte nota (quella a disposizione del ricercatore o laboratorista) è variamente legata ad un marcatore. Il marcatore è un fluorocromo, ovvero un colorante che assorbendo onde ad alta frequenza (UV) emette nel visibile. Il fluorocromo più impiegato è l’isotiocianato di fluorescina (o semplicemente fluorescina) che assorbendo raggi ultravioletti, dunque con l’ausilio di un microscopio illuminato da una fonte adatta, emette luce verde.
44. Saggi Immuno Enzimatici (EIA) Per fornire un segnale misurabile, i saggi immunoenzimatici utilizzano marcatori ad enzimi quali il glucosio-6-fosfato deidrogenasi (G6PD) e galattosidasi-B. Le reazioni sono osservate per via fotometrica come cambiamento di assorbimento, formazione di substrato colorato …
45. Saggi Immuno Enzimatici (1) L’analita nel campione ed l’analita marcato con G6PD competono per siti peptidilici dello specifico anticorpo Il legame inibisce l'attività dell'enzima, mentre enzimi liberi restano liberi di interagire con il substrato. SAGGI EMIT L'attività/assorbimento dell'enzima è direttamente proporzionale alla concentrazione di farmaco
46. Saggi Immuno Enzimatici (2) SAGGI CEDIA Frammenti di enzima dell'enzima galattosidasi-B realizzati in laboratorio si riuniscono spontaneamente in soluzione per formare un enzima attivo Il farmaco del campione compete per siti peptidilici di anticorpi La concentrazione del farmaco è direttamente proporzionale all'attività dell'enzima
52. Biosensori - DEFINIZIONE Definizione IUPAC: "un biosensore è un dispositivo di misura che utilizza molecole biologicamente attive, o tessuti, o cellule (o parti di essi) quali superfici sensibili di un biotrasduttore che trasformi l'informazione chimica data dalla concentrazione di un componente specifico del campione in analisi, in un segnale utile analiticamente. L'interazione specifica fra (macro)molecole (bioriconoscimento) è alla base del corretto funzionamento di un biosensore".
54. Biosensori Vantaggi (rispetto ai sensori chimici)? • un’ alta selettività , frutto di miliardi di anni di evoluzione naturale, basata sul riconoscimento di forma specifica • un’ alta sensibilità , fino alle parti per miliardo (ppb)
55. Biosensori Svantaggi • Perdita delle funzionalità nel tempo; • Il tessuto biologico è fortemente influenzato dalla temperatura e dal pH (forza ionica, parti acide/basiche); • La forza ionica modifica il sito recettore; • Il tempo di vita del sensore è breve • Il tempo di risposta è determinato da meccanismi di trasporto e di diffusione (lento).
57. Biosensori – ELEMENTI BIO-SENSIBILI Vi sono due classi di processi bioricognitivi, che si differenziano per il metodo generale in cui sono avvertiti dal trasduttore: • Riconoscimento bioaffine: il trasduttore percepisce il legame fra recettore e ligando per dimensione / forma (es.: reazioni anticorpo-antigene); • Riconoscimento biometabolico: il trasduttore percepisce le alterazioni chimiche dovute alla reazione, come cambi della concentrazione dei prodotti e dei reagenti, o come calore specifico di reazione (es.: reazioni enzima-substrato).
60. Biosensori - SETTORI DI APPLICAZIONE Microbiology Nanotechnology Microelectronic processing Pubblicazioni (%) Clinico Ambientale Altri Difesa Alimentare
61. Biosensori – PRINCIPI DI RILEVAMENTO DIAGNOSTICA BIOMEDICA Doctors increasingly rely on testing Needs: rapid, cheap, and “low tech” Done by technicians or patients Some needs for in-vivo operation, with feedback Glucose-based on glucose oxidase Cholesterol - based on cholesterol oxidase Antigen-antibody sensors - toxic substances, pathogenic bacteria Small molecules and ions in living things: H+, K+, Na+, NO, CO2, H2O2 DNA hybridization, sequencing, mutants and damage
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63. Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE 1) Intrappolamento (separazione) con una membrana semipermeabile
64. Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE 2) Intrappolamento tramite matrice La specie (B) viene intrappolata in una matrice solida (gel). Questa tecnica comporta un tempo di risposta lento per il trasduttore, per via dell’interazione con la matrice, ed un tempo di vita utile di 3/4 settimane.
65. Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE 3) Intrappolamento per adsorbimento Si basa sull’interazione fra la specie attiva (B) ed il trasduttore mediante forze di Van der Waals, legami idrogeno e legami ionici. Essendo queste interazioni deboli è difficile quantificare la risposta, e il tempo di vita utile è di solo un giorno. Inoltre il sistema risulta sensibile a gli effetti della temperatura, del pH e della concentrazione ionica.
66. Biosensori - FUNZIONALIZZAZIONE 4) Intrappolamento mediante legami covalenti Si basa su un legame chimico molto forte e diretto col trasduttore, che gli donna una lunga durata nel tempo (vita utile:3/14 mesi). Ovviamente il legame modifica la struttura della specie attiva e la sua funzionalità.
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68. Biosensori – SPR Surface Plasmon Resonance (SPR) Principio: Alla base vi e’ il riconoscimento specifico tra due macromolecole (es. Ab-Ag). Il legame tra le due molecole provoca un cambiamento dell’indice di rifrazione del mezzo su cui e’ legato l’elemento sensibile. Questo cambiamento e’ valutabile dalla variazione dell’indice di rifrazione del mezzo
72. Detection of Angiogenic Growth Factor by Microcantilever Biosensors Riccardo Castagna LATEMAR Unit - Politecnico di Torino Italy
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75. Biological Background Angiogenesis is a complex multistep process regulated by several different Growth Factors and their associated Tyrosine Kinase Receptors (TKRs) . Among these, vascular endothelial ( VEGF-A 165 ) and angiopoietin-1 ( ANG-1 ) associated with activated TKR have been recognized as the system at the heart of network which governs differentiation, survival, proliferation and migration of EC Development of cantilever biosensors to measure in a quantitative and specific way proteins stimulated in angiopoietin-1 system In the same cell type the same receptor induces different responces. To explain this phenomenon one hypotesis is based on quantitative differences in protein recruited downstream the receptor The low concentration marker released during such kind of phenomena is not detectable with conventional biological analysis techniques. So, there is a demand of quantitative data
76. MC beam dynamics in vacuum To calculate the MC resonance frequency one has to solve the general eq. of motion : Mass adsorption effect : Q factor k constant and “small” dm: Different contributions: Q i : ambient, TED, clamping, internal friction, surface, etc…
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79. Surface Activation Condensation: T=60°C, 1% v/v in anhydrous toluene, t =7’ Dry, 1100°C, t = 3 h, thickness 190 nm; then dipping in “piranha” solution to obtain OH groups on the surface Stabilization of the imine (Shiff’s base) formed through sodium cyanoborohydride buffer (NaBH 3 CN); RT, t = 45’ Si thermal oxidation Si/SiO 2 Si silanization (APTES) ( CH 2 ) 3 NH 2 + Si (CH 2 ) 3 N= CH-(CH 2 ) 3 -CHO Si (CH 2 ) 3 NH- CH 2 -(CH 2 ) 3 -CHO Glutaraldehyde (1% v/v, pH = 8.5; RT, t =15’) OCH-(CH 2 ) 3 -CHO Reduced specie NaBH 3 CN
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81. “ Proof of concept” and “real” strategies “ Real system” Probe : Mouse Anti Ang-1 (150 kDa) (Monoclonal antibody) Target : Ang-1 (56 kDa) An approach to be used for different Ab/Ag “ Proof” system Probe :Tie2-Fc (165 kDa) (fusion protein) Target : angiopoietin human protein (56 kDa) Very high affinity and specificity for receptor-ligand binding
82. Ligand mass as low as some tens of picograms were detected Using different cantilever geometries and operation modes, it is possible to detect different quantity of adsorbed masses, always keeping a similar surface density of the species. Thus, a good reproducibility of all experimental steps is achieved “ Proof of concept” experimental results (1) M1 600x100x2 μm 3 Frequency shift for each experimental step
83. Frequency shift of control sample lower than experimental error estimation In order to test the system specificity, cantilever has been dipped in solution without the specific binding molecule only non-specific binding can be present in such experiment M1 800x100x2 μm 3 “ Proof of concept” experimental results (2) Buffer effect
84. Frequency shift for each experimental step Anti-ANG-1 Surf. Density: 2x10 12 molecules/cm 2 ANG-1 Surf. Density: 14x10 12 molecules/cm 2 [Gupta et al. PNAS 2006: 1,2x10 12 molec/cm 2 ] “ Real strategy” experimental results (1) M1 670x70x1.9 μm 3 M2 670x70x1.9 μm 3
85. “ Real strategy” experimental results (2) Selectivity tests VEGF-A 165 is chosen as a false antigen to check the chemical and physical interaction of the cantilever-based platform with different antigens Nearly perfect selectivity M1 470x50x2.31 μm 3 M1 470x60x2.31 μm 3
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87. E.B. Eq in conjunction with N.S. Eq under the hp of fluid incompressibility and smalll deflections (convective term neglected): [Maali JAP 2005]; [Sader JAP 98] Liquid Measurements: MC beam dynamics From theoretical model and FE analysis: SOI device Layer: 7 μ m Aspect ratio: 1.5-3 is the added mass per unit length is damping coefficient per unit length
88. Liquid Measurements: Preliminary results Liquid priliminary measurements are performed in PBS. Real time detection: 4 min after the injection of Ang 1 (Ag) the frequency begin to decrese. The binding reaction is very fast (less than 5 min) accordingly to letterature results ( Carl A. K. Borrebaeck, Bio/Technology 1992)
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90. IP1 IP2 70 140 210 280 Depletion of ImmunoGlobulin G (Ig G) Component P PtG1 PtG2 PtG3 IP1 IP2 70 140 210 Depletion of Albumin and ImmunoGlobulin DO NOT remove putative Target (ANG1) 75 KDa 50 KDa Depletion of Albumin Component (DAC) MW Plasma1X 2X 1 2 3 [ Colantonio Proteomics 2005 ] IP1 IP2 70 140 210 280 PLASMA depleted + ANG1 SAMPLE PREPARATION: clarification of PLASMA (Murin Model) Albumin (ug) PLASMA + ANG1 rh - ANG1 (ng) rh - ANG1 (ng) rh - ANG1 (ng) Future works: measurements in plasma
91. Acknowledgments L. Napione, F. Bussolino Institute for Cancer Research and Treatment, Candiolo Torino C. Ricciardi, G. Canavese, G.Digregorio, I.Ferrante, S.Fiorilli, S.Marasso, A.Ricci, F. Pirri LATEMAR Unit - Politecnico di Torino
