Il documento descrive la progettazione e sintesi di azopeptidi con potenziali proprietà antimicrobiche, evidenziando l'importanza degli AMP come alternativa agli antibiotici tradizionali. Viene presentata l'introduzione di un gruppo azobenzene per migliorare la stabilità e la biodisponibilità dei peptidi, con risultati promettenti ottenuti dalla sintesi e caratterizzazione di nuovi peptidi modificati. Infine, sono discussi gli studi di docking che suggeriscono un'interazione variabile con le proteasi, influenzata dalla conformazione dell'azo-aminoacido.

1. Progettazione e sintesi di azopeptidi con potenziali proprietà antimicrobiche UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI SALERNO Facoltà di Farmacia Corso di Laurea in Chimica e tecnologia farmaceutiche A.A. 2009/2010 Giovanna Napolitano 073/0200033 Prof. Simona Concilio

3. Introduzione La rapida diffusione di microrganismi patogeni resistenti ai classici antibiotici ha stimolato la ricerca di AMP (antimicrobial peptides) da impiegare come agenti terapeutici anti-infezioni. Sono presenti in tutti gli organismi, rappresentano la prima linea di difesa contro molti patogeni. Ad oggi ne sono stati isolati oltre 1000. VANTAGGI: ampio spettro di attività, azione rapida, ridotta insorgenza di resistenza batterica, sinergia con altri antibiotici e attivi contro ceppi antibiotico-resistenti.

4. Usare aminoacidi della serie -D- Forme farmaceutiche a rilascio controllato Modifiche strutturali Svantaggi AMP naturali Bassa biodisponibilità Scarsa stabilità in condizioni fisiologiche Elevati costi di produzione Sensibilità agli enzimi proteolitici Strategie Risolutive

5. PER AUMENTARE LA BIODISPONIBILITA’ SINTESI DI PEPTIDI CON PROPRIETÀ ANTIMICROBICHE PIÙ RESISTENTI AGLI ENZIMI PROTEOLITICI Perché ? Come? INTRODUZIONE DI UN AZO-AMINOACIDO NELLA SEQUENZA DI UN AMP BIOLOGICAMENTE ATTIVO

6. L’aminoacido modificato è la L-Tirosina Abbondanza di aminoacidi aromatici (Tyr-Phe-Trp) nei peptidi antimicrobici; Unico aminoacido aromatico presente nella sequenza dell’ AMP scelto da sintetizzare Modifica introdotta: gruppo azobenzene sull’anello aromatico 2 HN - ALYLAIRKR - COOH

7. PROPRIETA’ GRUPPO AZOBENZENE Il gruppo azobenzene può assumere due conformazioni: cis e trans . Si può indurre un processo di foto-isomerizzazione irraggiando la molecola con particolari lunghezze d’onda. Si parla di “ switch molecolare ” ed è un processo reversibile. L’introduzione del gruppo azobenzene nel peptide lo rende FOTORESPONSIVO λ 360 nm Δ o λ ’ 488 nm

8. Valutare l’influenza dell’isomerizzazione trans-cis sulla RESISTENZA ALLA DEGRADAZIONE del peptide e sull’ ATTIVITÀ MICROBICA Valutare la variazione della ATTIVITÀ MICROBICA dovuta a modifiche strutturali: gruppo metile sull’anello azobenzenico Azo-Fmoc-Tyr CH 3 -AzoFmocTyr

9. L-Fmoc-tirosina-3’-azobenzene (Azo-Fmoc-Tyr) SINTESI pH 9-10 NaOH 15°C (acq) Resa 70%

10. L-Fmoc-tirosina-3’azo-(p)-metilbenzene (CH 3 -AzoFmocTyr) SINTESI pH 9-10 (acq) (acq) Resa 90%

12. 2 HN -A-L-Y-L-A-I-R-K-R- COOH MOLECULAR DOCKING OBIETTIVO : Studio dell’interazione tra gli azo-peptidi e una proteasi Tabella 1 Proteasi attive su PG Struttura cristallografica Termolisina (4TMN)

13. Strutture 3D degli azo-peptidi APG1 trans APG2 trans Sito Attivo His 142 His 146 Glu 166 APG1 cis APG2 cis ZF P LA

14. Peptide wild type PG alloggiato nel sito attivo della Termolisina 4TMN

15. PG APG1 trans APG1 cis APG2 trans APG2 cis

16. Tabella 2 Binding Energy dei sistemi di interazione tra la Termolisina (4TMN) e i Peptidi sintetizzati APG1 trans < APG2 trans < APG1 cis < PG < APG2 cis kJ/mol kcal/mol 4TMN + PG -329.23 -78.76 4TMN + APG1 cis -316.34 -75.68 4TMN + APG2 cis -339.84 -81.30 4TMN + APG1 trans -130.40 -31.20 4TMN + APG2 trans -139.85 -33.46

17. Tabella 3 Valori di RMSD della proteasi CALCOLO RMSD root mean square deviation Superpose RMSD Molecule 4TMN & ZF P LA 1.4391 4TMN & PG 1.3154 4TMN & APG1 cis 1.8005 4TMN & APG2 cis 1.6726 4TMN & APG1 trans 0.9192 4TMN & APG2 trans 0.9509

19. PEPTIDI SINTETIZZATI Ala-Leu-(AZO-Tyr)-Leu-Ala-Ile-Arg-Lys-Arg Ala-Leu-(CH 3 -AZO-Tyr)-Leu-Ala-Ile-Arg-Lys-Arg

20. Filtrazione Precipitazione del peptide in etere etilico Purificazione mediante HPLC Liofilizzazione Caratterizzazione mediante spettrometria di massa ESI

21. Test microbiologici Per valutare l’attività degli azo-peptidi. Studi di docking su altri enzimi e su membrane microbiche Per estendere i risultati sperimentali ottenuti. Studi in corso

22. La reazione di diazocopulazione è risultata essere una buona via sintetica per la formazione dell’azo-aminoacido, mi ha permesso di ottenere il prodotto ad un costo contenuto, velocemente e con buone rese. Dagli studi di docking è emerso che l’introduzione dell’azo-aminoacido rende il peptide meno affine al legame con la proteasi, soprattutto quando presenta l’isomero trans dell’aminoacido modificato. Sono stati ottenuti, con tecnica di sintesi in fase solida, due nuovi peptidi azo-modificati, con buone rese di reazione.

23. Ringrazio I Professori Simona Concilio e Stefano Piotto Il Prof. Campiglia Pietro e i dottori Marina Sala e Giacomo Pepe per la disponibilità e l’aiuto che mi hanno offerto Voi tutti per l’attenzione