2. • Mục tiêu
• Giới thiệu được các cách định lượng trong phân tích dụng cụ
• Giải thích được một số đặc trưng trong phân tích dụng cụ
• Trình bày được các loại sai số và cách giảm thiểu sai số
• Tài liệu tham khảo:
• Hóa phân tích 1, 2: Đại học Dược Hà Nội• Hóa phân tích 1, 2: Đại học Dược Hà Nội
• Xử lý số liệu trong Hóa phân tích: TS Tạ Thị Thảo – Đại Học
Quốc Gia Hà Nội
• Thẩm định phương pháp hoa học-Viện kiểm nghiệm thực phẩm
Quốc Gia
• János Pogány, pharmacist, PhD, consultant to WHO Pretoria,
South Africa, 28 June 2005
• An Introduction to Quality Assurance in Analytical Science - Dr
Irene Mueller Harvey – UK analytical partnership
3. NỘI DUNG
• 1. Khái niệm – Phân loại
• 2. Hiệu chuẩn – chất chuẩn
• 3. Một số đặc trưng của phân tích dụng cụ
• 4. Các loại sai số
• 5. Ứng dụng
4. 1. Khái niệm - Phân loại
Dựa vào cách tác động lên đối tượng phân tích và quá
trình diễn ra, trong đó có 4 nhóm chính sau:
• Phân tích quang học: Dựa vào hiệu ứng của bức xạ
điện từ
• Phân tích điện hóa: Dựa vào quá trình điện cực xảy ra• Phân tích điện hóa: Dựa vào quá trình điện cực xảy ra
khi cho dòng điện đi qua dung dịch
• Kỹ thuật tách: Dựa vào tương tác của CPT với các pha
• Nhóm hóa học: Dựa vào tín hiệu phân tích
5. 2. Hiệu chuẩn và chất chuẩn2. Hiệu chuẩn và chất chuẩn
2.1. Hiệu chuẩn (calibration)
Khái niệm:
Là quá trình thiết lập đáp ứng của thiết bị đo lường (phân
tích) với nồng độ (lượng chính xác) của chất phân tích
trong điều kiện cụ thể
Là so sánh đại lượng đo được với giá trị đối chiếu
Cách hiệu chỉnh:
Phương pháp đường chuẩn
Phương pháp thêm chuẩn
Thiết bị và dụng cụ dùng cho phân tích: Cân, bước sóng,
độ hấp thụ quang, dụng cụ thủy tinh…
6. Đặc điểm:
Xác lập mối quan hệ giữa khối lượng hay nồng độ của
CPT và tín hiệu phân tích (độ hấp thụ, diện tích, chiều
cao…)
Đánh giá tác động của thành phần nền đến tín hiệu đáp
ứng được biết dưới tên hiệu ứng nền (matrix effect)
7. 2.2. Chuẩn hóa học (chemical standard): Sử dụng các đơn
chất hoặc hợp chất tinh khiết ổn định được dùng phổ biến
trong chuẩn độ thể tích
2.3. Chất đối chiếu (reference material): Được dùng để
chứng minh độ đúng, độ tin cậy của kết quả phân tích.
Chất đối chiếu (CRM,SRM) được cung cấp bởi các tổ
chức đo lường quốc tế như NIST, BAS
Chất đối chiếu phải thỏa mãn: Tinh khiết, có thành phần
nền đã biết (mẫu chuẩn)
Chất đối chiếu dùng để: Thẩm định một phương pháp
mới; Chuẩn hóa các chất đối chiếu khác, khẳng định giá
trị pháp lý của 1 phương pháp đã chuẩn hóa
8. 3. Một số đặc trưng của phân tích dụng cụ
Sensitivity: Độ nhạy
Độ đúng: Trueness Precision: Độ chụm
Accuracy: Độ chính xác Bias: Độ chệchAccuracy: Độ chính xác Bias: Độ chệch
Limit of Detecter: Giới hạn phát hiện: LOD
Selectivity: Độ chọn lọc Linear Range:Khoảng tuyến tính
Dynamic range Concentration range
9. 3.1. Độ đúng và độ chụm
Độ chụm kém Độ chụm tốtĐộ chụm kém
Độ đúng kém Độ đúng kém
Độ đúng tốt
Độ chụm kém
Độ đúng tốt
Độ chụm tốt
10. • Độ chụm: Dùng để chỉ mức độ gần nhau của các giá trị
riêng lẻ xi của các phép đo lặp lại. Nói cách khác, độ
chụm được dùng để chỉ sự sai khác giữa các giá trị xi
so với giá trị trung bình .
Độ chụm (precision)
so với giá trị trung bình .
• Ba khái niệm thống kê được dùng để mô tả độ chụm
của một tập số liệu là độ lệch chuẩn, phương sai và hệ
số biến thiên
Độ chụm tốt
11. • Độ lệch chuẩn s (standard deviation SD): Đặc trưng
cho độ phân tán các số liệu trong tập hợp với giá trị
trung bình
Với: x là giá trị trung bình; xi là giá trị từng thí nghiệm
( )
1
2
−
−
=
∑
N
xx
s
i
(t p s li u < 30)
( )
N
xx
s
i∑ −
=
2
(t p s li u > 30)
Với: x là giá trị trung bình; xi là giá trị từng thí nghiệm
N là tổng số thí nghiệm; N-1 là số bậc tự do
• Độ lệch chuẩn tương đối RSD: Đánh giá độ lệch
chuẩn chiếm bao nhiêu phần trăm của giá trị trung
bình. RSD = s/x
• Hệ số biến thiên CV: CV = RSD.%
12. Phương sai s2(variance)
• Phương sai: Là giá trị trung bình của tổng bình
phương sự sai khác giữa các giá trị riêng rẽ trong tập
số liệu so với giá trị trung bình. Phương sai là bình
phương của độ lệch chuẩnphương của độ lệch chuẩn
Đ l ch n n
Tín hi u n n
Đ l ch m u
Tín hi u m u
13. 3.2. Độ đúng
• Độ đúng: chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình
của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và giá trị qui chiếu
được chấp nhận.
• Do đó, thước đo độ đúng thường ký hiệu bằng độ chệch.
• Độ đúng được biểu diễn dưới dạng sai số tuyệt đối hoặc
sai số tương đối.
• ISO: Độ chính xác = Độ chụm + Độ đúng
14. Sai số tuyệt đối (EA) Sai số tương đối ER
• Là tỷ số giữa sai số tuyệt đối
và giá trị thật hay giá trị đã
biết trước, được chấp nhận.
Theo phần nghìn
• Là sự sai khác giữa giá trị đo
được (xi) với giá trị thật hay
giá trị qui chiếu được chấp
nhận (kí hiệu là µ).
EA = xi - µ
ER =
µ
µ−ix
hay ER % =
µ
AE
. 100%
• Sai số tương đối cũng có giá
trị âm hoặc dương và không
có thứ nguyên, được dùng để
biểu diễn độ chính xác của
phương pháp phân tích.
EA = xi - µ
• Sai số tuyệt đối có giá trị âm
hoặc dương, cùng thứ nguyên
với đại lượng đo và không
cho biết độ chính xác của
phương pháp.
ER =
µ
AE
. 1000 (ppt)
15. 3.3. Độ nhạy (Sensitivity) và độ chọn lọc (selectivity)
Độ nhạy của một thiết bị hay một phép
đo là khả năng phân biệt được một sự
thay đổi nhỏ của nồng độ chất phân tích
Cách xác định:
Hệ số góc m của đường chuẩn
Assessment of method sensitivity
0
200
400
600
800
1000
1200
0 10 20 30
Signal
dy
dx
Hệ số góc m của đường chuẩn
m = dy/dx
0 10 20 30
Concentration
16. Độ chọn lọc
• Giả sử phân tích chất A trong mẫu phân tích, ngoài tín
hiệu phân tích do chất A tạo ra còn có sự đóng góp của
chất B, C…. Người ta gọi đây là những chất cản trở
• Khi đó mức độ gây ảnh hưởng của B và C đến phép• Khi đó mức độ gây ảnh hưởng của B và C đến phép
xác định A được biểu diễn qua hệ số chọn lọc
kB,A = bB/bA ; kC,A = bC/bA
Trong đó: b là hệ số độ nhay
k là hệ sô chọn lọc
17. Độ chọn lọc (selectivity)
Độ chọn lọc đặc trưng cho mức độ mà nó có thể phát
hiện và xác định rõ ràng một chất phân tích nhất định
trong một hỗn hợp mà không có sự ảnh hưởng từ các
thành phần khác
Độ chọn lọc cho biết ảnh hưởng của các chất gây cản
trở chất phân tích
Hệ số này càng nhỏ thì phép phân tích càng chọn lọc,
độ chính xác càng cao
thành phần khác
18. 3.4. Giới hạn phát hiện và gới hạn định lượng
(Limits of detection LOD and quantity LOQ)
• Giới hạn phát hiện (LOD): Là nồng độ hoặc khối lượng nhỏ
nhất có thể được phát hiện với mức độ tin cậy xác định. Giới
hạn này phụ thuộc vào tỷ số giữa tín hiệu phân tích và mức độ
thăng giáng tín hiệu của mẫu trắng
Phân loại: Giới hạn phát hiện của thiết bị (IDL) và giới hạn
phát hiện của phương pháp (MDL)phát hiện của phương pháp (MDL)
• Giới hạn định lượng (LOQ): Là nồng độ thấp nhất của chất
phân tích trong mẫu có thể định lượng được
với độ chụm và đúng chấp nhận được trong
điều kiện tiến hành phân tích
Phân loại: Giới hạn định lượng của thiết bị (IQL)
và giới hạn định lượng của phương pháp (MQL)
19. • Limit of Quantitation (LOQ)
• Limit of Detection (LOD)
• Signal to Noise Ratio (SNR) Peak B
LOQ
LOD, LOQLOD, LOQ,, SNRSNR (nhiễu)(nhiễu)
• Signal to Noise Ratio (SNR)
Nhiễu
SNR
Peak A
LOD
LOQ
Nền
20. Công thức tính LOD
• Tín hiệu chất phân tích Sm
Sm = So + k.SD
• Nồng độ: Cm
Công thức tính LOQ
• Khi biết độ lệch chuẩn
của mẫu trắng SDo, nồng
độ chất phân tích bằng
Cm = (Sm – So)/m
• m là độ nhạy đường chuẩn
• Thực tế: LOD = 3,3.SDo
không
LOQ = 10.SDo
• Nếu có dữ liệu LOD
LOQ = 3.LOD
21. 3.5.3.5. KhoảngKhoảng tuyếntuyến tínhtính vàvà khoảngkhoảng làmlàm việcviệc
(linearity and working range)(linearity and working range)
Khoảng tuyến tính (LOL): Là khoảng nồng độ của chất phân tích mà
phương pháp phân tích cho kết quả phân tích tỷ lệ thuận với nồng độ chất
phân tích
Khoảng làm việc (WR): Khoảng nồng độ của chất phân tích mà thiết bị
cho tín hiệu đáp ứng tốt. Khoảng này bắt đầu ở nồng độ thấp nhất có thể
định lượng được (LOQ)định lượng được (LOQ)
Tính toán độ tuyến tính và khoảng làm việc
Phân tích các mẫu chuẩn đã biết nồng độ
Tối thiểu phân tích tại 5 cấp nồng độ
Vẽ đồ thị từ các kết quả thu được
• Đánh giá độ tuyến tính (r2 > 0,99)
• Xác định khoảng tuyến tính tương đối
22.
23. 4. Các loại sai số (error)
• Khái niệm:
Sai số là sự sai khác giữa các giá trị thực nghiệm thu
được so với giá trị mong muốn. Tất cả các số liệu phân
tích thu được từ thực nghiệm đều mắc sai số. Sai số
phép đo dẫn đến độ không chắc chắn (độ không đảmphép đo dẫn đến độ không chắc chắn (độ không đảm
bảo đo) của số liệu phân tích.
• Phân loại:
Sai số hệ thống
Sai số ngẫu nhiên
Sai số thô, sai số tích lũy…
24. Sai số hệ thống
• Khái niệm: Là loại sai số do những nguyên nhân cố
định gây ra, làm cho kết quả phân tích cao hơn giá trị
thực (sai số hệ thống dương -positive bias) hoặc thấp
hơn giá trị thật (sai số hệ thống âm–negative bias).
• Phân loại:
Sai số hệ thống không đổi
Sai số hệ thống biến đổi ( sai số tỷ lệ)
25. Khối
lượng chất
phân tích
Sai số hệ
thống
biến đổi
Sai số hệ
thống
không đổi
Giá trị
đúng
(mg)
Khối lượng mẫu (g)
Biểu diễn sai số hệ thống không đổi và biến đổi
26. Nguồn gốc sai số hệ thống
Do dụng cụ phân tích
Do phương pháp phân tích
Do người phân tích
Phát hiện và loại trừ sai số
Phân tích mẫu chuẩn
Phân tích độc lập
Phân tích mẫu trắng
Thay đổi lượng mẫu
27. Sai số ngẫu nhiên
• Khái niệm: Là những sai số gây nên bởi những nguyên
nhân không cố định, không biết trước.
• Nguyên nhân:
Khách quan: nhiệt độ tăng đột ngột, thay đổi khí quyển,
đại lượng đo có độ chính xác giới hạn…
Chủ quan: thao tác thí nghiệm không chuẩn xác (có thể
gây ra giá trị bất thường); thành phần chất nghiên cứu
không đồng nhất…
• Do sai số ngẫu nhiên không thể biết trước được nên để
loại trừ nó cần phải làm nhiều thí nghiệm và tiến hành xử
lý thống kê số liệu phân tích
28. Sai số hệ thống và sai số ngẫu nhiên
Ý nghĩa
Ý nghĩa
Sai số hệ thống
Sai số ngẫu nhiên
29. Độ đúng và độ chụm
Inaccurate &
imprecise
Không đúng và
imprecise
Inaccurate but
precise
Accurate but
imprecise
không chụm
Chụm và
không đúng
Đúng và
không chụm
Đúng và chụm
30. Ví dụ: Kết quả đo mẫu amoxilin bằng HPLC thu
được kết quả sau
Tín hiệu nền So = 4
Độ lệch chuẩn đường nền SDo=12
Tại nồng độ 500ppb cho tín hiệu hấp thụ 2000
Xác định LOD, LOQ của chất phân tích biết k = 3
Tín hiệu chất phân tích: STín hiệu chất phân tích: Sm
Sm = So + k.SDo
= 4 + 3(12) = 40
Nồng độ xác định được:
LOD = [40/2000] x 500 ppb = 10 ppb
LOQ = 3,3.LOD