Phan tich sac ky chuong 3 sac ky long hieu nang cao hplc

13-Nov-18
1
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM
Chương 3.
SẮC KÝ LỎNG HIỆU
NĂNG CAO

13-Nov-18
2
High Perfomance Liquid ChromatographyHigh Price Liquid ChromatographyHigh Pressure Liquid Chromatography
F: flow rate (mL/min)
T: time (min)
1.7. MỘT SỐ LOẠI SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO THÔNG DỤNG
CƠ SỞ LÝ THUYẾT SẮC KÝ
3.1.1. Sắc ký pha thuận (normal phase mode)
1903,
Tswett
Михаи́л
Семёно-
вич
Цвет
- Sắc ký pha thuận có pha tĩnh phân cực hơn pha động
a Russian-Italian
botanist
Chương 3 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)

13-Nov-18
3
Silic dioxyd (silica)..
3.1.1. Sắc ký pha thuận (normal phase mode) Pha tĩnh
cyano (-CH2 – (CH2)2 – CN);
amino (-CH2 – (CH2)2 – NH2);
diol (-CH2CH2 – CH(OH)CH2OH)
R là các nhánh có các nhóm chức phân cực
Độ phân cực tăng dần từ -cyano đến diol.
Silica trên nền mạch Cacbon.
R
3.1.1. Sắc ký pha thuận (normal phase mode) Pha tĩnh

13-Nov-18
4
3.1.1. Sắc ký pha thuận (normal phase mode) Pha động
Thành
phần
Dung môi chủ
yếu
(làm pha động )
Dung môi phụ
Thay đổi tR
Không phân cực Phân cực hoặc hơi
phân cực.
Các dung môi thường không hấp thu trong vùng UV
3.1.1. Sắc ký pha thuận (normal phase mode)
Cơ chế lưu giữ: sắc kí hấp phụ
Cơ chế lưu giữ: Chất phân tích cạnh tranh với
các phân tử của pha động được hấp phụ ở các
tâm hoạt động của pha tĩnh. Lực liên kết giữa
pha tĩnh và chất phân tích chủ yếu là lực tương
tác lưỡng cực – lưỡng cực, liên kết hidrogen.

13-Nov-18
5
3.1.1. Sắc ký pha đảo (Reverse phase mode)
Sắc ký pha đảo có pha tĩnh kém phân cực hơn pha động. Áp dụng
cho các chất ít phân cực (háo dầu). Chất tan càng kỵ nước càng bị
giữ lại mạnh.
Pha tĩnh Chế tạo từ silica, tác dụng với clorosilan tạo ra dẫn xuất
siloxan như cột ở pha thuận nhưng điều khác biệt là R
là các gốc HC no không phân cực, hoặc gốc phenyl
- CH2 – (CH2)16- CH3 : gốc octadecyl . Cột C18 (ODS)
- CH2 – (CH2) 6- CH3 : gốc ocyl . Cột C8
- CH2 – (CH2) 2- CH3 : gốc butyl Cột C4
- CH2 – (CH2) 2- C6H5 : gốc phenyl propyl . Cột phenyl.
3.1.1. Sắc ký pha đảo (Reverse phase mode)
Pha động Dung môi hữu cơ, dung mội hữu cơ và nước, hoặc
dung môi hưu cơ và đệm
Các dung môi hữu cơ thường sử dụng là Methanol (MeOH),
acetonitrile (ACN) hay THF (Tetrahydrofuran (CH2)4O ). Thành phân
nước trong pha động tăng thì lực rửa giải giảm.
Khi sử dụng dung dịch đệm, những thông số quan trọng: nồng độ
đệm và pH ; Thành phần dung dịch đệm và dung môi hữu cơ

13-Nov-18
6
3.1.1. Sắc ký pha đảo (Reverse phase mode) Cơ chế lưu giữ
Pha tĩnh không phân cực , Liên kết giữa pha tĩnh và chất tan là
liên kết kị nước: phần ít phân cực của chất phân tích được gắn trên
pha tĩnh
Nếu phân tử chất tan có
nhiều dây Cacbon, nhóm
thơm. tính kỵ nước mạnh
hơn, Chất tan sẽ bi lưu giữ
mạnh trong cột
Nếu mẫu có nhiểu nhóm cacboxyl, nhóm amino, nhóm hydroxyl
tính kỵ nước yếu hơn. Chất tan sẽ ít bị lưu giữ và ra nhanh hơn.
3.1.3. Sắc ký trao đổi ion a.Khái niệm
Dựa vào lực hút trái dấu của ion chất tan và vị trí mang điện tích trên
pha tĩnh.
Chất trao đổi cation và chất trao
đổi anion là polymer không tan
trong nước mang các nhóm trao đổi
ion được gọi là chất trao đổi ion
(ion exchangers) hoặc nhựa trao đổi
(ion exchange resins)
Tương tác giữa nhựa trao đổi
ion và ion tích điện trái dấu

13-Nov-18
7
3.1.3. Sắc ký trao đổi ion b. Pha tĩnh và pha động
Pha tĩnh
- Nhựa trao đổi
cation
Loại acid
mạnh
Loại acid
yếu
Nhựa trao đổi
anion
Base
mạnh
Base yếu
AXIT
MẠNH
• Mang nhóm acid sulfonic (R-SO3
- H+) . phân ly hoàn
toàn , không phụ thuộc pH
• R- C6H5-SO3
-H+ → R- C6H5-SO3
- + H+.
AXIT
YẾU
• mang nhóm R-COOH
• chỉ hoạt động trong một khoảng pH>PKa để tồn tại
dưới dạng anion mới có thể tham gia trao đổi ion .
KHÁC
NHAU
• ở pH nào cationit mạnh cũng có thể tồn tại dưới
dạng anion, còn cationit yếu chỉ mang điện tích ở
pH>pKa và lúc đó mới hoạt động được
Pha
Tĩnh
Nhựa
trao
đổi
Cation

13-Nov-18
8
Nhựa trao đổi Anion có nhóm base amin liên kết
với phân tử polymer
Chất trao đổi base mạnh có nhóm amin
bậc bốn [RN(CH3)3
+ OH- ].
Dạng base yếu có nhóm amin bậc hai
hoặc bậc ba
R có thể là nền silica hay nền Polimer hữu cơ
Nhựa trao đổi cation trên
nền silica Nhựa trao đổi cation trên
nền polymer

13-Nov-18
9
Pha động là Dung dịch có ion rửa giải pha trong nước hoặc đệm
Ion rửa giải là ion có thể đẩy các ion bị giữ trên pha tĩnh ra
Dung dịch đệm giữ cho PH của dung dịch rửa giải có giá trị ổn định
để cho chất phân tích tồn tại dạng ion và nếu là cột yếu thì cột hoạt
động được (tồn tại nhóm chức mang điện tích)
1.7.3. Sắc ký trao đổi ion c. Cơ chế lưu giữ
Bản chất lực tương tác : Lực tĩnh điện
Đầu tiên các ion trong pha động tương tác với pha tĩnh bị giữ lại trên pha
tĩnh.
Sau đó khi cho chất phân tích qua cột, các ion cần phân tích có lực tương
tác tĩnh điện mạnh hơn sẽ đẩy các ion pha động ra khỏi pha tĩnh

13-Nov-18
10
1.7.4. Sắc ký trao đổi ion c. Cơ chế lưu giữ
Sắc ký đồ phân tích nước bằng sắc ký trao đổi ion
1.7.4. Sắc ký ghép cặp ion (Reversed phase ion pairing)
a. Khái niệm
Điều khác biệt trong sắc ký ghép cặp ion phải tạo điều kiện để chất
phân tích phải ở dạng ion hóa hoàn toàn (bằng cách điều chỉnh pH)
Nếu chất phân tích là acid yếu HA thì HA phải phân ly hoàn toàn thành
H+ và A-. Nếu chất phân tích là baz yếu B thì B phải tác dụng với H+
để tạo thành BH+
.
Thêm 1 chất đối ion Q+, A- + Q+  [A-,Q+ ]
hay Q- BH+ + Q-  [BH+, Q- ]
là một biến thể của sắc ký pha đảo
Cặp ion có tính kỵ nước cao bị pha tĩnh giữ lại giống như một phân
tử không điện tích
Đuôi kỵ nước

13-Nov-18
11
b. Cơ chế lưu giữ.
Cặp ion [ A-,Q+],
[ BH+,Q- ] được
hình thành trong
pha động như
một hợp chất
trung hòa được
lưu giữ theo cơ
chế như sắc kí
pha đảo.
c. Pha tĩnh và pha động
Pha tĩnh giống như pha tĩnh trong pha đảo
Pha động : Pha động cũng là những dung môi như
trong sắc ký pha đảo .
CÁC THÔNG SỐ QUAN TRỌNG
-Loại chất ghép cặp
- Nồng độ chất ghép cặp
-pH của pha động
-Nồng độ dung môi hữu cơ trong pha động

13-Nov-18
12
Sắc ký loại kích thước (SEC)
23
1. Ph©n t¸ch çc cÊu tö dùa trªn kÝch thíc ph©n tö
2. Bao gåm 2 lo¹i:
– SEC trong dung dÞch kþ nưíc: S¾c ký thÊm gel (GPC)
– SEC trong dung dÞch nưíc : S¾c ký läc gel (GFC)
3. Kh«ng cã tư¬ng t¸c s¾c ký gi÷a çc cÊu tö ph©n tÝch vµ pha
tÜnh cña cét
– Çc ph©n tö mÉu khuyÕch t¸n vµo çc lç xèp cña h¹t nhåi
– Çc ph©n tö ®ưîc t¸ch lo¹i dùa vµo sù kh¸c biÖt kÝch thư-
íc cña chóng tư¬ng ®èi so víi kÝch thưíc çc lç xèp : çc
ph©n tö lín h¬n lç xèp kh«ng khuyÕch t¸n ®îc vµo , cßn
çc ph©n tö nhá h¬n khuyÕch t¸n ®ưîc
– Çc ph©n tö lín sÏ röa gi¶i trưíc, çc ph©n tö cµng nhá,
cµng röa gi¶i chËm h¬n
4. Pha ®éng ®ưîc lùa chän chñ yÕu dùa trªn kh¶ n¨ng hßa tan
çc cÊu tö ph©n tÝch
5. §ưîc sö dông chñ yÕu trong ph©n tÝch polymer vµ çc protein
C¬ chÕ t¸ch trong s¾c ký lo¹i kÝch thưíc
24

13-Nov-18
13
S¾c ký HILIC
(Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography)
25
1. Pha nh rất phân cực : Silica , NH2, Diol.. (tương tự NP-LC), nhưng pha
động vẫn sử dụng nước trong thành phần. Bởi vậy HILIC còn được gọi là:
‘sắc ký lỏng pha thường trong dung dịch nước (aqueous normal phase
HPLC)’.
2. Pha động thường bao gồm thành phần nước (đệm) chiếm từ 2 – 40 %.
Dung môi hữu cơ thường là acetonitrile.
3. Thứ tự rửa giải : ngược với RP-LC: càng phân cực, càng lưu giữ
4. Cơ chế:
§ Dựa trên phân bố giữa lớp nước hấp phụ trên bề mặt pha nh với
pha động
§ Dựa trên tương tác của các chất phân ch phân cực với các nhóm
phân cực của pha nh
5. Tăng hàm lượng nước trong pha động à giảm khả năng lưu giữ
6. Ứng dụng với các chất rất phân cực, là một kỹ thuật bổ sung cho RP-LC.
Kết hợp tốt với LC/MS.
Trong HILIC, nước là một dung môi mạnh !
26

13-Nov-18
14
27
Các chÕ ®é ph©n tÝch HPLC vµ c¸c d¹ng mÉu t-
ương ứng
28

13-Nov-18
15
B.) Low- and High-performance Liquid Chromatography:
Many types of liquid chromatography are available, based on different stationary
phase and mobile phase combinations.
- each type may be further characterized based on its overall efficiency or
performance
Molecularmass
Các chÕ ®é ph©n tÝch HPLC vµ c¸c d¹ng mÉu tương ứng
30
Loại HPLC Pha tĩnh Pha động Dạng chất
được tách
Pha đảo
Ghép cặp ion
Pha thuận
Trao đổi ion
Loại kích cỡ

13-Nov-18
16
Các chÕ ®é ph©n tÝch HPLC vµ c¸c d¹ng mÉu tương ứng
31
Loại HPLC Pha tĩnh Pha động Dạng chất
được tách
Pha đảo C18; C8; C4,
C2
Nước/dm hữu
cơ
Trung tính; Các
Acid (base) yếu
Ghép cặp ion C18; C8 Nước/dm hữu
cơ; Hóa chất
ghép cặp
Các Ion, base,
acid
Pha thuận Silica; Amino,
Cyano Diol
Hữu cơ kém
phân cực
Các chất ko tan
trong nước;
các đồng phân
hữu cơ
Trao đổi ion Nhựa trao đổi
Cation; Anion
Nước/Đệm; Ion
trái dấu
Ion; các Ion vô
cơ
Loại kích cỡ Polystyrene
Silica
Nước (GFC);
Hữu cơ (GPC)
Các hợp chất
polymer cao
phân tử
3.2.1. SƠ ĐỒ KHỐI MÁY HPLC
3.2. HỆ THỐNG MÁY HPLC

13-Nov-18
17
33
Chương 2 HỆ THỐNG MÁY HPLC
2.2. HỆ THỐNG CẤP PHA ĐỘNG
2.2.1. Khái niệm
Là hệ thống chứa pha động để cung cấp cho hệ thống HPLC.
Hệ thống này có thể có từ 1 đến 4 kênh (tương ứng với 1 đến 4 bình
chứa thủy tinh ).
Pha động trong sắc ký lỏng thường là 2 dung môi hòa tan vào nhau
để có khả năng tách với độ phân giải phù hợp

13-Nov-18
18
2.2.1. Khái niệm
- Pha động phải tan lẫn vào nhau tốt .
- Phải lọc qua màng lọc 0.45 μm để không làm nghẹt cột
- Phải được khử khí hòa tan trong pha động. Khí hòa tan có thể
làm biến dạng pic, giảm hiệu lực cột, làm nhiễu đường nền, có thể
loại khí hòa tan bằng cách đánh siêu âm.
Điều kiện pha động
2.2.1. Khái niệm Điều kiện pha động
Bộ phận lọc đầu vào bằng
thủy tinh hoặc thép không rỉ
có lỗ xốp 10 μm,

13-Nov-18
19
3.2.2. Cách dùng pha động rửa giải
Những nhược điểm của của kỹ thuật
đẳng dòng (isocratic)
Độ phân giải thấp đối với những peak có hệ• Độ phân giải thấp đối với những peak có hệ
số lưu giữ k nhỏ (rửa giải sớm)
• Độ phân giải thấp đối với những peak ra
muộn: do peak bành rộng.
• Với những dung dịch mẫu có nhiều cấu tử có k
khác nhau, thời gian phân tích bị kéo dài
• Cột hay bị ô nhiễm bởi những cấu tử có độ
lưu giữ cao
38

13-Nov-18
20
Những ưu điểm của kỹ thuật
gradient dung môi
• Tăng cường độ phân giải
• Tăng độ nhậy với những peak ra muộn (k lớn)
• Có khả năng phân tích những mẫu phức tạp (các hệ số k khác
biệt lớn)
• Cải thiện dạng peak sắc ký
• Giảm được thời gian phân tích, nhất là những mẫu có nhiều
cấu tử có độ phân cực khác nhau
• Tăng độ bền của cột do loại bỏ được các cấu tử có độ lưu giữ
mạnh.
39
… và những nhược điểm
• Thiết bị HPLC phức tạp hơn, giá thành cao hơn
• Thời gian phân tích thực tế tăng thêm do phải cộng thêm thời
gian cân bằng cột. Với chế độ cặp đôi ion, thời gian cân bằng
cột có thể kéo dài.
• Các hệ thiết bị LC khác nhau có thể tích trễ khác nhau làm ảnh
hưởng tới sự chuyển giao phương pháp giữa các thiết bị
• Một số detector hoặc ứng dụng không thể áp dụng gradient
dung môi.
• Nếu sử dụng van tỷ lệ, khả năng bị kết tủa muối ở van cao (cần
gia tăng quá trình rửa)
40

13-Nov-18
21
So sánh isocratic và gradient
41
Trường hợp A, isocratic: dạng peak không cân xứng, nhất là các peak rửa giải sauTrường hợp A, isocratic: dạng peak không cân xứng, nhất là các peak rửa giải sau
khoảng10 phút.
Trường hợp B, gradient, Các peak tách đồng đều và có dạng peak hẹp, cân đối.
Chú ý: các cặp peak tại các điểm 1 và 2 trong trường hợp isocratic không tách đựơc
như trong trường hợp rửa giải gradient.
Biểu đồ thay đổi thành phần dung môi hữu cơ trong kỹ
thuật gradient (%B)
42
• Isocratic hold time: thời gian chờ ban đầu
• Gradient time tG: thời gian gradient diễn ra
• Purging: giai đoạn đuổi các cấu tử có độ lưu giữ cao
• Conditioning: ổn định lại cột, trở về thành phần ban đầu
• Equilibrium: cân bằng cột

13-Nov-18
22
Hệ số lưu giữ tương đối trong
kỹ thuật gradient
43
Do bản chất pha động thay đổi liên tục trong quá trình phân tích, do đó hệ số lưu giữ của các
cấu tử cũng thay đổi, bỏi vậy ta không thể sử dụng hệ số lưu giữ k như trong rửa giải isocratics.
Thay vào đó, ta sử dụng hệ số lưu giữ tương đối k* được xác định theo phương trình dưới
đây:
Trong đó:
tG: thời gian gradient (phút)
F: tốc độ dòng (ml/ph)
S: lấy bằng 4 (đại lượng này phụ thuộc vào bản chất các cấu
tử phân tích, với các phân tử nhỏ, S có giá trị khoảng từ 4-6. Với protein hay
peptide, S = 10 – 1000.
ΔΦ : sự thay đổi thành phần của dung môi B
Vm: Thể tích rỗng của cột phân tích (~0.68πr2L)
44
Values of 2 < k* < 10 are desired. A good starting value for k* is 5.

13-Nov-18
23
Độ dốc gradient ảnh hưởng lên
khả năng tách.
45
Tăng thời gian gradient từ 10 phút lên 60 phút làm giảm độ dốc gradient. Kết quả hai cặp
peak 1,2 và 6,7 đã tách được hoàn toàn.
Tính hệ số lưu giữ k* trong
sắc ký lỏng gradient
46
Với các giá trị đã cho, ta tính được hệ só lưu giữ tương đối k* :
k* = 25x2/(1.15x4x0.9x1.7) = 7,10
Với các cấu tử có phân tử lượng nhỏ, giá trị k* xấp xỉ 5 là được,
vậy giá trị k*=7,1 ở trên là có thể chấp nhận được

13-Nov-18
24
2.3 BỘ KHỬ KHÍ ON LINE
Mục đích : nhằm loại trừ các bọt khí nhỏ còn sót lại trong dung môi
pha động ngay trong quá trình chạy máy sắc ký
Hoạt động : cho hai dung môi
A và B . Dung môi đi vào ống
polymer bên trong máy hút
chân không, chân không sẽ
kéo khí hòa tan đi xuyên qua
thành ống , chất lỏng ở lại
bên trong thành ống
Läc dung m«i vµ b¶o vÖ cét
48

13-Nov-18
25
2.4 HỆ THỐNG BƠM
Mục đích để bơm pha động vào cột thực hiện
quá trình chia tách sắc ký Yêu cầu
Pump phải tạo được áp suất cao khoảng 3000-6000 PSI hoặc 250 at
đến - 500 at ( 1at =0.98 Bar)
pump phải tạo dòng liên tục Lưu lượng bơm từ 0.1 đến
9.999 ml/phú
Tương hợp với các loại dung môi
hữu cơ thông dụng, đệm, muối. Vận hành ổn định,
lặp lại
Khả năng cấp và trộn dung môi
chính xác trong gradien (với pump
đa kênh)
Dễ bảo trì và sửa chữa
2.4 HỆ THỐNG BƠM
- Tốc độ bơm là hằng định theo thông số đã
được cài đặt . Trong quá trình chạy sắc ký áp suất
hiển thị là thông số vô cùng quan trọng biểu thị
sự ổn định của hệ thống .

13-Nov-18
26
51
Các loại bơm:
• Bơm piston dạng song song
• Bơm piston dạng nối tiếp
• Bơm màng
B¬m piston d¹ng song song
52
Bơm gồm 2
piston giống nhau
Làm việc luôn
phiên: piston A đẩy
thì piston B hút
Đảm bảo liên tục
có dòng dung môi
đi vào hệ thống

13-Nov-18
27
B¬m piston d¹ng nèi tiÕp
53
Bơm gồm 2
piston bố trí nối
tiếp, piston A lớn
gấp đôi piston B
Đảm bảo tạo dòng
và áp suất ổn định
cho hệ HPLC
54
Bé dËp xung (damper)
Chứa một chất lỏng có độ nén ép và ngăn với pha
động bằng một màng ngăn
Đảm bảo dập xung của bơm cao áp đạt thấp hơn 2%
giá trị ban đầu
Thường được gắn sensor áp suất

13-Nov-18
28
2.5 HỆ TIÊM MẪU
Mẫu lỏng hoặc dung dịch được tiêm thẳng vào pha động cao áp ngay ở
đầu cột mà không cần dừng dòng bằng một van tiêm 6 cổng có vòng
chứa mẩu (sample loop). Vòng chứa mẫu có dung tích khác nhau :
Thường dùng loại 0.50÷20 μl.
Tiêm bằng tay với
Vòng mẫu có thể tích
xác định or dùng
micro xy lanh
Hệ bơm mẫu tự động
theo chương trình
định sẵn
56
Bộ phận tiêm mẫu bằng tay
Thao tác xoay van một cách dứt khoát
Đường ống thải phải bố trí thấp hơn vòng loop và
luôn hướng xuống dưới

13-Nov-18
29
57
ThiÕt bÞ b¬m mÉu tù ®éng

13-Nov-18
30
2.6. CỘT
Cột là nơi thực hiện quá trình tách sắc ký.
Vật liệu : Trước đây cột được làm bằng
thủy tinh , nhưng do nhu cầu hoạt động
ở áp suất cao nên hiện nay đa số sử
dụng cột làm bằng kim loại .
Kích cỡ :
Với thời gian cột trở nên ngắn hơn và
hạt nhồi nhỏ hơn. Chiều dài cột thường
sử dụng hiện nay 30 ÷ 250mm, với hạt
nhồi đường kính 1.5 ÷ 5 μm .

13-Nov-18
31
Cột trong HPLC
61
 Phù hợp với chế độ phân tích
 Khoảng pH làm việc
 Khoảng nhiệt độ làm việc
 Áp suất làm việc (có thể tới 1000
bar hoặc hơn).
 Kích thước cột (L, ID)
 Loại hạt nhồi: Silica hay Polymer
 Kích thước và hình dạng hạt nhồi
 Độ xốp (diện tích bề mặt/gram)
 Kích thước lỗ xốp
 Kiểu ốc đầu cột
 ...
Các tiêu chí cơ bản của cột HPLC
2.6. CỘT
Cột gồm một ống hình trụ được nhồi đầy
những hạt nhỏ hình cầu (thường có đường
kính từ 1.5 – 5 μm )
Những hạt này hầu hết được làm bằng silica
xốp, có những pore (khoảng trống ) riêng rẽ
hình trụ có đường kính khoảng chừng 10nm
phù hợp với những mẫu có phân tử nhỏ (M
< 1000Da)
Bên trong mỗi pore được bao phủ bởi lớp pha tĩnh, nhóm C18
được gắn vào các tiểu phân silica (Nếu là cột C18)

13-Nov-18
32
2.6. CỘT
Hạt được hình thành bằng cách kết tụ
(aggregating) các tiểu phân hình cầu . Hạt
tạo thành có kích thước lớn hơn và đường
kính đều nhau.
Các pore được hình thành do các khoảng
trống giữa các tiểu phân.
Bề mặt bên trong pore chiếm hơn 99%
tổng diện tích bề mặt của hạt,
Pha động bao quanh mỗi hạt khi nó chảy xuyên qua cột và các
phân tử mẫu đi vào các pore bởi sự khuếch tán
2.6. CỘT
Để tăng tuổi thọ của cột người ta dùng cột bảo vệ (guard
columns). Cột bảo vệ được lắp phía trước cột phân tích để lọc các
tạp chất, không cho các tạp chất qua cột phân tích, tránh nhiễm
bẩn cột , kéo dài thời gian sống của cột phân tích.Cột bảo vệ ngắn
hơn cột sắc ký, được nhồi hạt cùng loại
Trong sắc ký lỏng thường vận hành thiết bị ở nhiệt độ phòng
không cần điều nhiệt cột. Tuy nhiên các máy sắc ký lỏng hiện đại
thường được trang bị thêm hệ thống điều nhiệt cột có thể đến
1500C chính xác đến ± 0.10C
581325-U Ascentis® C18 HPLC Column
25 cm × 4.6 mm , 5 μm 1,240.85 SGD
(1 SGD = 0.8021 USD)

13-Nov-18
33
Cột có pha tĩnh silica
65
 Cột Silica: pha thường
hoặc HILIC
 Cột C18, C8, C4 ,
phenyl: RPC
 Cột NH2, CN, Diol..: pha
ngược, HILIC
 Cột cho UHPLC (P
>1000bar)
 Chịu pH kém, thường từ
2 - 8
Cột silica có đặc điểm chịu áp suất cao tốt, dễ gắn các
ligand để tạo thành các pha tĩnh khác nhau
Cột polymer
66
 Những pha tĩnh phổ biến là
Polystyrene divinylbenzene,
polyarcrylate, polyvinyl
alcohol..
 Người ta có thể gắn các
nhóm chức khác nhau để
tạo tính phân cực cho cột.
 Với kích thước lỗ xốp lớn
và có thể khống chế, được
áp dụng nhiều trong GPC
Cột HPLC polymer có đặc điểm chịu pH tốt, áp dụng nhiều
trong sắc ký trao đổi ion, HILIC và GPC

13-Nov-18
34
Kích thước và hình dạng hạt nhồi
67
Với các ứng dụng HPLC thông thường, ta thường sử dụng
cột có hạt nhồi từ 3 – 5m. Các pha tĩnh có kích thước hạt
nhỏ hơn thường áp dụng cho UHPLC.
Cột polymer thường có kích thước hạt lớn do khả năng
chịu áp suất kém.
Kích thước hạt nhồi càng nhỏ, hiệu năng tách hay số đĩa lý
thuyết của cột càng cao. Tuy nhiên áp suất cột cũng tăng
theo
Ảnh hưởng kích thước hạt nhồi lên
hiệu quả tách của cột
68

13-Nov-18
35
Ảnh hưởng của hình dạng hạt nhồi
và kỹ thuật nhồi cột
69
- Hạt nhồi hình cầu và nhồi đồng đều sẽ cho độ doãng peak nhỏ
hơn
- Khi cột bị sốc (rơi, va đập mạnh), hoặc frit cột bị nghẹt (một phần)
hay cột bị nhiễm tạp, hiện tượng dòng chảy rối cũng làm giảm
hiệu quả tách.
1
2
3
4
5
6
Thể tích ngoài cột
ống dây mao quản và ốc nối

13-Nov-18
36
Phân tán do dòng chảy
Độ phân tán phụ thuộc vào kích thước mao
quản và tốc độ dòng

13-Nov-18
37
Lắp đầu ferrule đúng quy cách

13-Nov-18
38
2.7. ĐẦU DÒ
2.7.1. Yêu cầu của detector
Đáp ứng nhanh và lặp lại
Độ nhạy cao
Khoảng hoạt động tuyến tính rộng
Ít thay đổi theo nhiệt độ và tốc độ dòng
Vận hành ổn định , sử dụng dễ dàng.
Một số detector sử dụng trong HPLC
1. Detector UV - Vis (Fixed UV, VWD, MWD, DAD)
2. Detector huỳnh quang FLD
3. Detector ánh sáng tán xạ (ELSD)
4. Detector chỉ số khúc xạ (RID)
5. Detector điện hóa
6. Detector khối phổ (MSD)
76

13-Nov-18
39
Các đặc tính của detector trong HPLC
Nhiễu đường nền: là tín hiệu của detector khi
không có mẫu. Một chỉ số quan trọng trong phân
tích sắc ký là tỷ lệ tín hiệu/ nhiễu. Một peak được
coi là peak tín hiệu nếu có tỷ lệ S/N >=2 (hoặc
>=3).
77
Độ nhậy (sensitivity)
• Độ nhậy S của detector được định nghĩa là tỷ số giữa
chiều cao peak (E) và lượng chất (với detector nhậy khối
lượng) hoặc nồng độ với detector nhậy nồng độ.
Với detector nhậy khối lượng:
Với detector nhậy nồng độ:
78
E
S
M

E
S
C


13-Nov-18
40
Giới hạn phát hiện dưới LOD
Giới hạn định lượng nhỏ nhất MDQ
UNPAC đã định nghĩa giới hạn phát hiện dưới của một
detector D theo công thức:
• Với N là nhiễu đường nền, S là độ nhậy của
detector Wh là độ rộng của peak tớn hiệu tớnh bằng
giây
Giới hạn định lượng nhỏ nhất MDQ thường có giá
trị gấp 3 lần giới hạn phát hiện dưới LOD.
MDQ ~ 3 D79
2
h
N
D
SW

Khoảng động học và khoảng tuyến tính
80

13-Nov-18
41
2.7. ĐẦU DÒ
2.7.2. Detector UV
Đây là detector được dùng phổ biến nhất trong sắc ký lỏng dựa
trên sự hấp thu bưc xạ UV-VIS của chất phân tích (190nm-
600nm).
from column
to waste
Ảnh hưởng của thể tích flowcell lên độ
phân giải sắc ký

13-Nov-18
42
Detector UV (UV-Vis)
Định luật Beer :
Gọi T = ( IT/Io ) là độ truyền qua
Gọi A = lg( Io/IT ) là hệ số hấp thụ
Ta có A = cl Độ nhạy của detector UV phụ
thuộc vào chiều dài flowcell và
hằng, số  trong đó  phụ thuộc
vào cường độ cực đại hấp thụ
của cấu tử nghiên cứu. Lựa chọn
đúng bước sóng cực đại hấp thụ
của cấu tử phân tích sẽ cho độ
nhậy lớn nhất.
Với :
IT = Độ hấp thụ khi có mẫu
Io = độ hấp thụ khi không có mẫu
l = chiều dài flowcell
c = nồng độ cấu tử phân tích
= hệ số hấp thụ
Các nhóm chức có đáp ứng UV-Vis

13-Nov-18
43
Detector UV bước sóng cố định
Ưu điểm:
• Giá thành hạ
• Sử dụng đơn giản
• Có thể đạt độ nhậy khá
• Áp dụng cho các phân tích
đơn giản, thường nhật
Nhược điểm:
• Bước sóng cố định không
phù hợp với nhiều loại cấu tử
• Không phát triển hoặc tối ưu
được các phương pháp phân
tích
Detector bước sóng biến đổi (VWD)
UV Lamp
Grating
Flow cell
Reference diode
Sample
diode
Cut-off filter
Holmium oxide filter
Slit
Mirror 2
Mirror 1

13-Nov-18
44
Detector mảng diode (DAD)
và detector đa bước sóng (MWD)
Tungsten
lamp
Lens
Deuterium
lamp
Lens
system
Holmium
filter
Detector
cell
Optical
slit Grating
Diode Array
• Có độ nhậy cao
• Có thể chạy nhiều
bước sóng cùng một lúc
(up to 8 channels)
• Có thể lấy phổ online
của các peak, giúp cho
quá trình phân tích định
tính.
•Lập biểu đồ 3D
• Ứng dụng tốt cho phát
triển phương pháp mới.
• Có thể lập thư viện phổ
UV-Vis
• …
2.7. ĐẦU DÒ
2.7.2. Detector UV
Nếu đầu dò là diode array, có thể biểu diễn sắc ký đồ theo 3 trục
toạ độ , A=f(tR, λ) (hình 2.18)

13-Nov-18
45
DAD
2.7. ĐẦU DÒ
2.7.2. Detector UV

13-Nov-18
46
Sơ đồ nguyên lý detector huỳnh quang
2.7. ĐẦU DÒ
2.7.3. Đầu dò huỳnh quang
-Nhạy và chọn lọc.
-Việc làm sạch mẫu có
thể đơn giản hóa.
- Buớc sóng ánh sáng
kích thích chiếu vào
mẫu khi đi qua flow
cell. Các phân tử phát
huỳnh quang
-Khi một hợp chất phát huỳnh quang, bước sóng phát xạ mong
muốn sẽ được tách ra bằng kính lọc hoặc bộ đơn sắc và chiếu
vào tế bào quang điện

13-Nov-18
47
2.7. ĐẦU DÒ
2.7.3. Đầu dò huỳnh quang Ở đây tín hiệu quang được
chuyển thành tín hiệu điện
và ghi nhận bởi bộ phận ghi
dữ liệu.
Do sự phát huỳnh quang là
phát ra tất cả các hướng
nên ánh sáng phát xạ
thường được bố trí vuông
góc với ánh sáng kích thích
để làm giảm nhiễu nền.
Quá trình phát huỳnh quang có một phần năng lượng bị mất nên
bước sóng phát xạ luôn dài hơn hơn bước sóng kích thích.
Detector huỳnh quang
• Cường độ tia phát xạ huỳnh quang được tính theo công
thức:
• Với:
• f = tỷ lệ phát xạ/hấp thụ
• Io = Cường độ tia kích thích
• l = độ dài flowcell
• c = nồng độ cấu tử phân tích
• k = hệ số hấp thụ

13-Nov-18
48
Các nhóm chức và các tác nhân tương ứng để
tạo dẫn xuất huỳnh quang
Detector chỉ số khúc xạ (RID)
• Dựa trên chỉ số khúc xạ
khác nhau giữa chất phân
tích và pha động
• Phân tích được những
cấu tử không mang nhóm
mang mầu hoặc không
phát huỳnh quang
(đường)
• Rất ảnh hưởng bởi nhiệt
độ, thậm chí nhiệt độ sinh
ra trong quá trình hấp
phụ/giải hấp trong cột
phân tích cũng có thể gây
tác động
• Không chạy được chế
độ gradient dung môi

13-Nov-18
49
DETECTOR MS
3.3. CÁCH THỨC TIẾN HÀNH SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
3.3.1. Các đặc điểm của dung môi
3.3.1.1. UV cutoff
Khái niệm : UV cutoff là bước sóng mà tại đó độ hấp thu của dung môi
trong cell đo 1cm là bằng 1 (so với không khí )
Một dung môi có UV cutoff cao hơn bước sóng làm việc có thể gây ra
độ hấp thu nền cao .

13-Nov-18
50
3.3.1.1. UV cutoff sắc ký pha đảo
sắc ký pha thuận
3.3.1.1. UV cutoff

13-Nov-18
51
Tính chất một số dung môi thường sử dụng trong hplc
101
Dung môi Độ nhớt
(cP, 20 oC)
Độ phân cực
(Snyder)
Điểm sôi
( oC)
UV cut off
(nm)
RI
n-hexane 0.313 0.0 68.9 195 1.375
Iso octane 0.5 0.4 99.2 197 – 210 1.404
Triethylamine (TEA) 0.38 1.8 89.5 1.401
Toluene 0.65 2.3 101.6 285 1.496
Benzene 0.65 3 80.1 280 1.501
Dichloromethane(CH2Cl2) 0.44 3.4 40 232
Chloroform (CHCl3) 0.57 3.4 – 4.4 61.2 245 1.443
CCl4 0.97 1.7 76.5 265 1.466
THF 0.55 4.2 66 212 – 230 1.408
Ethanol 1.2 5.2 78.3 205 – 210 1.361
Isopropanol 2.35 4.3 82.4-
117.7
210+ 1.380
Acetone 0.32 5.4 56.3 330 1.359
Acetonitrile 0.37 6.2 81.6 190 1.344
Methanol 0.6 6.6 64.7 205 1.329
Nước 1.0 9.0 100 180 1.333
Biểu đồ độ trộn lẫn của các dung môi
102

13-Nov-18
52
Acetonitril 190
Nước 190
Cyclohexane 195
Hexane 200
Methanol 210
Ethanol 210
Dietyl Ether 220
Dichloromethane 220
Chloroform 240
Carbon Tet 265
Tetrahydrofuran 280 (220)
Toluene 285
3.3.1. Các đặc điểm của dung môi 3.3.1.1. UV cutoff
Ảnh hưởng bản chất dung môi hữu cơ tới độ lưu
giữ và độ chọn lọc
104

13-Nov-18
53
Độ nhớt của dung mội ảnh hưởng đến áp suất cột.
Độ nhớt tăng  áp suất cột tăng
 đến hiệu năng tách của cột giảm
Nguyên nhân :
Khi độ nhớt tăng
quá trình truyền khối giữa pha tĩnh và pha động bị chậm lại
 peak bị bành rộng ra
 hiệu năng tách giảm .
3.3.1.2. Độ nhớt
Khi gradient dung môi sẽ có 1 giá trị tỷ lệ mà độ nhớt lớn nhất. Để
tăng hiệu năng tách cần tránh những hổn hợp như thế.
ACN : độ nhớt thấp và UV cutoff bé nhất làm cho ACN là thành
phần dung môi tốt nhất trong sắc ký pha đảo
3.3.1. Các đặc điểm của dung môi 3.3.1.2. Độ nhớt

13-Nov-18
54
Ảnh hưởng của nhiệt độ lên độ nhớt của
dung môi
107
Trộn lẫn (Miscible)
Hai thành phần có thể
trộn lẫn vào nhau ở tất cả
các tỷ lệ mà không tạo
thành hai pha riêng biệt
Hòa tan ( Soluble)
Một thành phần có mặt
trong một dung môi ở
một mức độ nào đó thì
gọi là tan (Soluble) trong
dung môi đó
3.3.1.3. Sự trộn lẫn dung môi

13-Nov-18
55
3.3.1. Các đặc điểm của dung môi 3.3.1.1. UV cutoff
Phương trình Darcy
110
Ảnh hưởng của kích thước hạt, chiều dài cột, độ
nhớt dung môi .. lên áp suất cột

13-Nov-18
56
Ảnh hưởng của pH pha động lên độ lưu giữ trong RP-HPLC
111
Pha động phải trơ với pha tĩnh đang sử dụng.
Chất phân tích trong mẫu phải tan được trong pha động
Pha động phải bền vững theo thời gian
các dung mội khác nhau trong các pha động khác nhau phải tan lẫn
vào nhau Khi thay đổi pha động
Pha động phải có độ tinh khiết cao
Phải nhanh đạt cân bằng trong quá trình sắc ký
Phải phù hợp với loại Detector
càng rẻ càng tốt, và càng thân thiện với môi trường càng tốt
3.3.2. CHUẨN BỊ PHA ĐỘNG 3.3.2.1. Yêu cầu của pha động

13-Nov-18
57
3.3.2.2. Làm sạch dung môi
a/ Các điều cần lưu ý
b/ Các loại màng lọc.
c/ Lọc :
3.3.2. CHUẨN BỊ PHA ĐỘNG
a/ Các điều cần lưu ý
Luôn luôn sử dụng dung môi loại HPLC
Mua từ nhà cung cấp tin cậy
Lọc dung môi
3.3.2. CHUẨN BỊ PHA ĐỘNG 3.3.2.2. Làm sach dung môi

13-Nov-18
58
c/ Lọc : Thường dùng hệ thống lọc áp suất thấp
3.3.2. CHUẨN BỊ PHA ĐỘNG 3.3.2.2. Làm sach dung môi
Cellulose Acetate
Membrane Filters
are suitable for
aqueous and
many alcoholic
media, low
protein binding
capacity,
thermally stable
up to 180℃.

13-Nov-18
59
Whatman 7404-
001 Nylon
Membrane Circle,
0.45 um pore size,
13 mm,
Whatman® PTFE
membrane filters
TE36 sheets, pore
size 0.45 μm, ...

13-Nov-18
60
Chế độ đẳng dòng 1 kênh
-Phối trộn pha động theo
đúng tỷ lệ và thành phần
mong muốn,
- lọc bằng hệ thống lọc
chân không với màng lọc
có pore size thường là
0.45µm
chế độ chế độ đẳng dòng nhiều
kênh hoặc gradient
lọc riêng từng loại dung môi
Các loại dung mội này khi phối trộn
vẫn có khả năng sẽ tủa (đặc biệt là
đệm phốt phát trong môi trường
hữu cơ) .  phải phối trộn với tỷ lệ
muối đệm cao nhất (theo chương
trình gradient đã nghiên cứu)
trước ít nhất một ngày để quan sát
3.3.2. CHUẨN BỊ PHA ĐỘNG 3.3.2.2. Làm sạch dung môi
Nguyên nhân : Trong dung mội sau khi lọc sẽ còn khí . Các bọt khí
này khi chạy vào cột sẽ tạo ra các hạt khí làm ảnh hưởng đến quá
trình sắc ký (peak bị bành rộng ).
Cách làm: đặt chai chứa pha động vào trong bể siêu âm khoảng 15
phút (đối với dung mội hữu cơ) và 35 ‘ ( đối với dung mội nước) .
3.3.2. CHUẨN BỊ PHA ĐỘNG 3.3.2.3. Đuổi khí

13-Nov-18
61
Lưu ý:
không nên đánh siêu âm quá lâu nếu trong thành phần pha động
có chất dễ bay hơi (ví dụ như trifluoroacetic)
Ảnh hưởng của việc khử khí
lên peak sắc ký . Peak của
một chuẩn amin sử dụng :
a/ Pha động mới chuẩn bị
xong 50H2O – 50MeOH -0.1
trifluoroacetic
b/ sau 3 h sục khí c/ sau 8h
sục khí
3.3.2. CHUẨN BỊ PHA ĐỘNG 3.3.2.3. Đuổi khí
Yêu cầu của bình chứa pha động
-Luôn luôn đậy kín cả khi đang dùng hoặc khi đang chứa dung môi
-Không được chứa trong chai plastic , vì chất plastic và những hợp
chất có khối lượng phân tử thấp sẽ khuếch tán vào chất lỏng.
-Trong suốt để có thể kiểm soát mực chất lỏng trong bình thường
xuyên (nên dùng chai thủy tinh trong )
- Nếu là bình chứa nước , cần kiểm soát thướng xuyên tránh vi
khuẩn phát triển là nhiễm bẩn nước
3.3.3. Chuẩn bị hệ thống HPLC trước khi tiêm mẫu vào
3.3.3.1. Lắp pha động vào hệ thống

13-Nov-18
62
Marvin C. McMaster tác giả cuốn “ HPLC A Practical User’s Guide” xuất
bản năm 2007 do nhà xuất bản A John Wiley & Sons, Inc., Publication đã
thống kê
-80% các quá trình tách được thực hiện trên cột pha đảo
- 10% là sắc ký loại cở (hầu hết là cho mẫu polymer và protein) ,
- 8% là sắc ký trao đổi ion,
- 2% sắc ký pha thuận trên silica hoặc zirconium và alumina.
3.3.3.2. Lắp cột vào hệ thống
a. Một số lưu ý khi sử dụng cột
Duy trì pH của cột silica pha liên kết giữa 2 -8 (tốt hơn pH 2.5 ÷ 7.5)
Luôn luôn rửa cột với dung mội mới hoặc dung môi trung gian
(bridging solvent) nếu hai dung môi mới và cũ không trộn lẫn)
Không chuyển từ dm hữu cơ sang dung dịch đệm hoặc ngược lại
. Không làm shock cột
Vấn đề tăng áp suất
Bảo quản cột
Duy trì tuổi thọ cột

13-Nov-18
63
Mội cột có mũi tên chỉ hướng của dòng chảy đi qua, khi lắp cột
vào hệ thống phải lắp đúng hướng mũi tên trùng với hướng của
dòng chảy pha động, Nếu lắp ngược sẽ làm giảm hiệu năng tách
của cột. Trước cột chính nên có một cột bảo vệ
3.3.3.2. Lắp cột vào hệ thống b. lắp cột
c. Cân bằng cột
Trước khi tiêm mẫu vào hệ thống sắc ký phải cân bằng
cột
Cân bằng cột đến khi tín hiệu đường nền ổn định. Thời
gian cân bằng cột tùy thuộc nhiều vào bản chất pha động

13-Nov-18
64
Ảnh hưởng của thành phần dung môi pha mẫu lên dạng peak.
Mẫu được hoà tan trong pha động với (a) 0%, (b) 30%, (c) 50%,
(d) 70% ACN
Pha động: đệm pH3.5 – ACN (92-8) , pha đảo, đầu dò UV
210nm
3.3.4. Chuẩn bị mẫu tiêm vào vào hệ thống HPLC
phenylalanine
Caffeine at 0.75 mg ml 1, 4 μl injection volume.
Column: Luna 3 μm C18(2) 50×2.0 mm.
Mobile phase: gradient 5 to 95% acetonitrile (with 0.1% formic acid) in 7.5
min at a flow-rate of 1 ml min 1
In 33% ACN
In 66% ACN
In 100% ACN

13-Nov-18
65
Lương mẫu quá lớn peak sẽ bị bành rộng và không đối xứng,
thời gian lưu sẽ thay đổi .
Tiêm 2µg acetophenone (peak đầu tiên ) và
Veratrole .
tiêm 2mg acetophenone (peak đầu tiên ) và
Veratrole .
Điều kiện sắc ký cột 25cm, 3.2mm i.d.; pha tĩnh
LiChrosorb SI 60 5 mm; Pha động : hexane–
diethyl ether 9 : 1, tốc độ dòng 1 ml/min Đầu dò
UV, 290 nm,
Effect of sample injection volume for a given injection solvent
composition.
Caffeine 0.75 mg/ml in
100% ACN.
Column: Luna 3 μm
C18(2) 50x2.0 mm.
Mobile phase: gradient 5
to 95% ACN (0.1%
formic acid) in 7.5 min
Flow-rate: 1 ml/min

13-Nov-18
66
Sample Solvent Strength Maximum Injection Volume
100% Strong Solvent ≤ 10 µL
Stronger than mobile Phase ≤ 25 µL
Mobile Phase ≤ 15% of Peak Volume
Weaker than Mobile Phase Large
Peak volume
Baseline peak width (min.) x F mL/min
Mẫu trước khi tiêm vào hệ thống HPLC phải lọc qua màng lọc
0.45µm hoặc nhỏ hơn để tránh làm nghẹt cột .
Sau khi tiêm mẫu vào ta sẽ có sắc ký đồ. Từ sắc ký đồ có thể định
lượng và định tính

13-Nov-18
67
3.3.5.1. Rửa giải isocractic
Quá trình tách
sắc ký lỏng mà
thành phần
pha động
không thay đổi
được gọi là rửa
giải đẳng dòng
(isocractic)
3.3.5. Chương trình isoractic và gradient pha động, gradient bước
sóng
3. 3.5.2. Rửa giải gradient pha động
Rửa giải gragient là thay đổi
liên tục thành phân pha động
trong suốt quá trình tách sao
cho sự lưu giữ của peak sau
là giảm liện tục tức là pha
động có độ mạnh tăng đều
đều trong suốt quá trình tách.
sóng

13-Nov-18
68
12.8 21.2
Isocratic analysis possible when scouting gradient:
ΔtG < 0.25tG
8.4 min. > 0.25*20 = 5 min.
%B/min = (100-5)/20 = 4.75 %B/min
136
Values of 2 < k* < 10 are desired. A good starting value for k* is 5.

13-Nov-18
69
Đầu dò UV
Nếu như mẫu phân tích gồm nhiều chất khác nhau và một số chất có
hấp thu bước sóng khác nhau thì ứng với một nhóm chất phải cài đặt
bước sóng tương ứng để tăng độ nhạy của chất phân tích.
Đầu dò DAD : Có thể chọn nhiều bước sóng để chạy mẫu cùng một lúc
3. 3.5.2. Rửa giải gradient bước sóng
sóng
Đầu dò huỳnh quang
Nếu là chất phát huỳnh quang thì có bước sóng phát xạ kích thích khác
nhau thì ứng với một nhóm chất phải cài đặt bước sóng tương ứng để
tăng độ nhạy của chất phân tích.
Chương trình 2 : -------
Thời
gian
Bước sóng
kích thích
(nm)
Bước sóng
phát xạ
(nm)
00.00 263 (OXO) 380
10.00 312 (NaL) 366
16.00 263 380
16.10 Stop
Chương trình 1 ex/em:
324/366nm
(OXO, NAL,FLU : ---)
3. 3.5.2. Rửa giải gradient bước sóng
sóng

13-Nov-18
70
Quinolone NOR CIP ENRO SARA OXO FLU
tR (phút) 5,925 6,726 7,892 8,707 10,396 14,054
Norfloxacin
Ciprofloxacin
Enrofloxacin
Sarafloxacin
Oxolinic
Flumequine

Phan tich sac ky chuong 3 sac ky long hieu nang cao hplc

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (20)

Similar to Phan tich sac ky chuong 3 sac ky long hieu nang cao hplc

Similar to Phan tich sac ky chuong 3 sac ky long hieu nang cao hplc (10)

More from Nguyen Thanh Tu Collection

More from Nguyen Thanh Tu Collection (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (15)

Phan tich sac ky chuong 3 sac ky long hieu nang cao hplc