8 teza de doctorat final milaciu vasile mircea

ŞCOALA DOCTORALĂ
UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ŞI FARMACIE „IULIU HAŢIEGANU” CLUJ-NAPOCA
CLUJ-NAPOCA, 2020
Dana
Pop
Digitally signed by
Dana Pop
Date: 2020.08.03
14:27:11 +03:00

3
Profilul genetic și variațiile clinico-biologice ale Paraoxonazei 1 la pacienții cu steatohepatită non-alcoolică
TEZĂ DE DOCTORAT
Profilul genetic și variațiile
clinico-biologice ale
Paraoxonazei 1 la pacienții cu
steatohepatită non-alcoolică
Doctorand Milaciu Vasile Mircea
Conducător de doctorat Prof. Dr. Monica Acalovschi

5
”The very first step towards
success in any occupation is
to become interested in it.”
Sir William Osler, 1914

7
LISTA DE PUBLICAŢII
Articole publicate in extenso ca rezultat al cercetării doctorale
1. Milaciu MV, Ciumărnean L, Sâmpelean DP, Bocșan IC, Popa DE, Pașca S,
Acalovschi M. Paraoxonase 1 activities and gene polymorphisms in non-
alcoholic steatohepatitis – preliminary results of a pilot study. HVM Bioflux.
2017;9(4):157-160. Revistă BDI. (articol curpins în Studiul 2)
2. Milaciu M, Ciumarnean L, Sampelean D, Negrean V, Milaciu C, Acalovschi, M.
Non-cardiometabolic comorbidities of non-alcoholic fatty liver disease. Balneo
Res J, 2018;9(2):43-49. Revistă ISI fără factor de impact. (articol curpins în
stadiul actual al cunoașterii)
3. Milaciu MV, Vesa ȘC, Bocșan IC, Ciumărnean L, Sâmpelean D, Negrean V, Pop
RM, Matei DM, Pașca S, Răchișan AL, Buzoianu AD, Acalovschi M. Paraoxonase-
1 Serum Concentration and PON1 Gene Polymorphisms: Relationship with
Non-Alcoholic Fatty Liver Disease. J Clin Med. 2019;8:2200. Revistă ISI (Q1) cu
factor de impact = 5.688. (articol curpins în Studiul 2)

9
CUPRINS
INTRODUCERE 15
STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII
1. Steatohepatita non-alcoolică 19
1.1. Contextul epidemiologic al bolii ficatului gras non-alcoolic și al
steatohepatitei non-alcoolice
19
1.2. Istoria naturală a steatohepatitei non-alcoolice în cadrul bolii ficatului
gras non-alcoolic
20
1.3. Factori de risc/etiologici pentru FGNA și SHNA 21
1.3.1. Sindromul metabolic 21
1.3.2. Factori genetici și epigenetici 22
1.3.3. Sedentarismul, dieta și fumatul 23
1.3.4. Vârsta, sexul, agregarea familială și diferențele etnice 23
1.4. Patogeneza SHNA 23
1.4.1. Acumularea lipidelor, lipotoxicitate și apoptoză hepatocitară 24
1.4.2. Stres oxidativ, citokine, macrofage și inflamație 26
1.4.3. Axa țesut adipos-ficat și axa intestin-ficat 26
1.5. Comorbidități 27
1.5.1. Comorbidități cardiometabolice 27
1.5.2. Comorbidități non-cardiometabolice 28
1.6. Diagnostic și evoluție spre hepatocarcinom 28
1.6.1. Diagnosticul SHNA 28
1.6.2. Evoluția SHNA spre hepatocarcinom 29
1.7. Noi perspective terapeutice 29
2. Paraoxonaza 1 – roluri și modularea lor 31
2.1. Structura Paraoxonazei 1 (PON1) și legarea de HDL 31
2.2. Concentrație enzimatică, activități și efecte antioxidante 31
2.2.1. Concentrația serică a PON1 31
2.2.2. Activitățile serice ale PON1 32
2.2.3. Efecte antioxidante și antiinflamatorii ale PON1 32
2.3. Genetica PON1 33
2.3.1. Gena PON1 33
2.3.2. Polimorfismele PON1 33

10 Mircea Vasile Milaciu
2.3.3. Relația genotip PON1 – fenotip PON1 34
2.4. Factori non-genetici care influențează fenotipul PON1 34
2.4.1. Influența vârstei, a sexului și a stilului de viață 35
2.4.2. Influenţa condițiilor fiziologice și patologice 35
2.4.3. Influența compușilor exogeni 36
2.5. Relevanța clinică a PON1 37
3. Stres-ul oxidativ, inflamația și Paraoxonaza 1 la pacienții
cu FGNA/SHNA
39
3.1. Stresul oxidativ în hepatopatiile cronice 39
3.2. Paraoxonaza 1 în hepatopatiile cronice 39
3.3. Paraoxonaza 1 în FGNA și SHNA 40
3.4. Potențiale direcții de cercetare 41
CONTRIBUŢIA PERSONALĂ
1. Ipoteza de lucru 45
2. Metodologie generală 47
2.1. Material şi metodă 47
2.1.1. Măsurători antropometrice şi examen clinic 47
2.1.2. Eşantioane sangvine 48
2.1.3. Evaluarea ultrasonografică hepatică 48
2.2. Determinări biochimice 49
2.2.1. Determinarea concentrației serice a PON1 49
2.2.2. Determinarea citokinelor și a Hs-CRP 49
2.2.3. Determinarea valorilor Periostinei serice 49
2.3. Determinarea polimorfismelor genetice ale PON1 50
2.3.1. Recoltarea sângelui pentru izolarea ADN 50
2.3.2. Purificarea ADN-ului genomic 50
2.3.3. Măsurarea purităţii și concentrației ADN 51
2.3.4. Genotiparea PON1 Q192R și PON1 L55M 51
2.3.5. Genotiparea PON1 C-108T 52
2.4. Analiza statistică 52
3. Studiul 1. Factori de risc pentru SHNA 55
3.1. Introducere 55
3.2. Ipoteza de lucru 55
3.3.1. Criterii de includere 56
3.3.2. Criterii de excludere 56

11
3.3.3. Variabile măsurate 57
3.3.4. Analiza statistică 57
3.4. Rezultate 57
3.5. Discuţii 63
3.6. Concluzii 66
4. Studiul 2. Concentrația serică a PON1 și polimorfismele
PON1 în SHNA – variabile asociate
67
4.1. Introducere 67
4.3.1. Criterii de includere 68
4.3.2. Criterii de excludere 68
4.3.4. Determinarea concentrației serice a PON1 și genotiparea
polimorfismelor PON1
68
4.4. Rezultate 69
4.5. Discuţii 76
4.6. Concluzii 78
5. Studiul 3. Biomarkeri asociați scorurilor non-invazive de
fibroză și steatoză la pacienții cu SHNA
79
5.1. Introducere 79
5.3.1. Participanţi 80
5.3.2. Criterii de includere și de excludere 80
5.3.3. Eşantioanele sangvine și serice 81
5.3.5. Ecografia abdominală, scorul ecografic de steatoză și scorurile non-
invazive de fibroză
81
5.4. Rezultate 82
5.5. Discuţii 92
5.6. Concluzii 95
6. Concluzii generale 97
7. Originalitatea tezei 99
REFERINŢE 101

13
ABREVIERI UTILIZATE IN TEXT
AGL acizi graşi liberi
ALT alanin-aminotrasferaza
AST aspartat-aminotransferaza
BFGNA Boala ficatului gras non-alcoolic
CAT catalaza
CLB soluţie de liză celulară
DZT2 Diabet zaharat de tip 2
EA ecografia abdominală
EDTA acid etilendiaminotetraacetic
FA Fosfataza alcalină
FGNA ficatul gras non-alcoolic
GCKR glucokinaza
GGT gama-glutamiltransferaza
GWAS Genome wide association study
HCC Hepatocarcinom
HDL lipoproteine cu densitate mare
HTA hipertensiune arterială
Hs-CRP Proteina C reactivă înalt specifică
HSC Celula stelată hepatică
IL-10 interleukina 12
IL-6 interleukina 6
IMC indice de masa corporală
L leucina
LCAT lecitin-colesterol-aciltransferază
LDL lipoproteine cu densitate mică
M metionina
MBOAT7 Proteina Membrane Bound O-Acyltransferase Domain
Containing 7
MCP-1 proteinele monocitelor chemotactice 1

NADPH oxidaza nicotinamid-adenin-dinucleotid-fosfat-oxidaza
NF1 factor nuclear 1
NF-kB factor nuclear KB
NLB soluţie de liză a nucleilor
NO oxid nitric
pb perechi de baze
PCR-RFLP reacție de polimerizare în lanț - polimorfismul lungimii
fragmentelor de restricție
PON1 paraoxonaza 1
PON1 gena paraoxonazei 1
PON2 paraoxonaza 2
PON3 paraoxonaza 3
POSTN Periostina
PNPLA3 Proteina Phospholipase domain-containing protein 3
PPS soluţie de precipitare a proteinelor
ROS Specii reactive ale oxigenului
rpm rotaţii pe minut
TC temperatura camerei
SHNA steatohepatita non-alcoolică
sdLDL particulele mici și dense de LDL-colesterol
SM sindrom metabolic
SNPs polimorfismele unei singure nucleotide
SOD2 superoxid dismutaza 2
Sp1 factor de transcriere 1
Sp3 factor de transcriere 3
SREBP2 Proteina Sterol regulatory element-binding protein-2
SUA Statele Unite ale Americii
TG trigliceride
TM6SF2 Proteina Transmembrane 6 superfamily member 2
TNF-α Factorul de necroză tumorală α
UV radiații ultraviolete

15
INTRODUCERE
Boala ficatului gras non-alcoolică sau ficatul gras non-alcoolic (BFGNA) cuprinde
un spectru de entități clinice distincte, care pornesc de la simpla încărcare cu grăsimi a
ficatului (steatoza hepatică simplă/ficat gras non-alcoolic – FGNA) și merg până la
steatohepatită non-alcoolică (SHNA) și ciroză hepatică. Fiind bine dovedit faptul că este
asociată cu sindromul metabolic, a devenit în ultimii ani o adevărată „epidemie”,
incidența bolii crescând odată cu creșterea prevalenței obezității, a insulinorezistenței
și a diabetului zaharat.
Stresul oxidativ hepatic a fost incriminat în apariția FGNA și în progresia
ulterioară a bolii spre SHNA încă de la primele studii care au urmat anului 1980 – anul
în care Jurgen Ludwig a descris pentru prima dată SHNA. Fiziopatologia SHNA încă nu
este pe deplin înțeleasă, fiind avansate mai multe teorii, care nu pot explica însă pe
deplin apariția și progresia bolii.
Paraoxonaza 1 (PON1) este o enzimă secretată la nivel hepatic, cu proprietăți
antioxidante, datorate în principal asocierii acesteia la particulele de HDL-colesterol și
datorită diverselor sale funcții enzimatice (arilesterazică, paraoxonazică și lactonazică).
Există numeroase studii care au evaluat activitățile PON1 la pacienți cu afecțiuni
hepatice, dar puține dintre acestea au fost conduse pe loturi de pacienți cu FGNA, și mai
puține pe loturi de pacienți cu SHNA. Rezultatele acestor studii au arătat că activitățile
și concentrațiile serice ale PON1 au fost mai scăzute la pacienții cu SHNA comparativ cu
loturile de control, dar au existat și rezultate neconcludente. Acestea pot fi parțial
explicate prin faptul că enzima este influențată atât de factori externi, cât și de
polimorfisme ale genei PON1.
Pornind de la aceste premise, prezenta lucrare și-a propus să evalueze atât
statusul biochimic al PON1, cât și polimorfismele genei PON1, la pacienți cu
steatohepatită non-alcoolică.
O parte din studiile care fac parte din prezenta lucrare au fost realizate cu ajutorul
fondurilor proiectului de cercetare numărul 7690/72/15.04.2016 și
5200/62/01.03.2017 („Profilul genetic și variațiile clinico-biologice ale Paraoxonazei 1
la pacienții cu steatohepatită non-alcoolică”), acordat prin concurs autorului de către
Universitatea de Medicină și Farmacie „Iuliu Haţieganu”, Cluj-Napoca.

17
STADIUL
ACTUAL
AL
CUNOAŞTERII

19
1. Steatohepatita non-alcoolică
1.1. Contextul epidemiologic al bolii ficatului gras non-
alcoolic și al steatohepatitei non-alcoolice
Boala ficatului gras non-alcoolic (BFGNA) este în prezent recunoscută ca fiind cea
mai comună cauză de afectare hepatică la nivel mondial1, 2. BFGNA cuprinde un întreg
spectru histopatologic de afectare hepatică în care prezența steatozei și absența
consumului semnificativ de alcool sunt obligatorii și reprezintă elementele definitorii3,
4. În cadrul mai larg al BFGNA este cuprinsă atât steatoza hepatică simplă (ficatul gras
non-alcoolic – FGNA), cât și steatohepatita non-alcoolică (SHNA) și ciroza hepatică
datorată SHNA, cu evoluție posibilă spre hepatocarcinom (HCC)1, 5, 6.
Steatohepatita non-alcoolică a fost descrisă pentru prima dată în anul 1980 de
către Jurgen Ludwig și colab.7, dar a început să fie studiată intens doar în ultimul
deceniu, concomitent cu acumularea dovezilor privind creșterea prevalenței bolii și
asocierea acesteia cu sindromul metabolic1.
Importanța clinică a SHNA a fost subliniată în 1998 de către James și Day, care au
scris o lucrare amplă despre această patologie, în care au reluat ideea lui Ludwig că
afectarea ficatului non-alcoolic este asemănătoare din punct de vedere histopatologic cu
boala alcoolică a ficatului, afirmând totodată că SHNA va deveni un subiect obligatoriu
de a fi cercetat în viitor8.
Incidența și prevalența bolii ficatului gras non-alcoolic și a steatohepatitei non-
alcoolice sunt în creștere la nivel mondial. Primele informații bine documentate au
apărut în ghidul elaborat în 2012 de către Asociația Americană pentru Studiul Bolilor
Hepatice, unde autorii admiteau faptul că vor fi necesare studii ulterioare pentru a
înțelege incidența bolii în funcție de vârstă și factorii de mediu9. Într-un studiu amintit
în acest ghid, efectuat pe 400 de pacienți de vârstă medie, prevalența FGNA definită prin
ultrasonografie hepatică era de 46%, în timp ce prevalența SHNA confirmată histologic
era 12,2%9, 10. Totuși, în 2016, se estima că prevalența FGNA la nivel mondial era situată
între 6-35%, mediana prevalenței din Europa situându-se între 25-26%11. Pentru SHNA,
prevalența pe regiuni ale globului se situează între 1,5% și 6,45%12. Cea mai alarmantă
creștere a prevalenței SHNA este în Statele Unite ale Americii, unde se estimează că, până
în anul 2030, va crește cu 63%. Această prevalență ridicată va antrena creșterea cu
168% a incidenței cazurilor de ciroză datorată SHNA, creșterea cu 137% a incidenței
cazurilor de hepatocarcinom și creșterea ratei de deces prin boală hepatică cu 178%13.
Chiar dacă prevalența FGNA/SHNA în populația generală este înaltă, aceasta este
cu mult mai mare în grupuri populaționale specifice, cum sunt pacienții cu diabet
zaharat de tip 2 (DZT2) sau cei cu obezitate abdominală14. Într-un referat sistematic
publicat în iunie 2019, Younossi și colab. au observat că prevalența globală a BFGNA la
pacienți cu DZT2 era 55,5% (studiile din Europa arătând o prevalență de 68%), în vreme
ce prevalența globală a SHNA la pacienții cu DZT2 era 37,3%15. Creșterea prevalenței

obezității abdominale și a BFGNA a fost observată inclusiv la pacienții pediatrici, la care
evoluția spre SHNA și ulterior, la vârsta adultă, spre ciroză cu necesar de transplant
hepatic se pare că este mai accelerată16, 17.
Chiar dacă există păreri că FGNA/SHNA sunt supradiagnosticate și că se face
actualmente „prea multă medicină” pentru acest spectru de afecțiuni18, este dovedit deja
că evoluția naturală a FGNA este spre SHNA și ulterior spre ciroză hepatică. Astfel,
devine obligatorie evaluarea pacienților la risc pentru a dezvolta FGNA, pentru a-i
identifica ulterior pe cei cu stadii avansate de fibroză hepatică19.
1.2. Istoria naturală a steatohepatitei non-alcoolice în cadrul
bolii ficatului gras non-alcoolic
Deși este bine dovedită secvența evolutivă steatoză hepatică-steatohepatită-
ciroză hepatică, istoria naturală a BFGNA nu este pe deplin cunoscută20. FGNA este o
boală progresivă cu evoluție lentă, iar majoritatea studiilor prospective au un timp de
urmărire al pacienților prea scurt pentru a evalua progresia SHNA și a fibrozei hepatice
și a determina momentul apariției cirozei hepatice21, 22.
În evoluția naturală a steatozei hepatice non-alcoolice simple către
steatohepatită, un rol important îl joacă stresul oxidativ. Alterarea beta-oxidării acizilor
grași duce la o producție crescută de peroxizi ai lipidelor și radicali liberi, la fel ca în
cazul afectării hepatice alcoolice, cauza fiind reprezentată de alterarea formei și funcției
mitocondriilor hepatocitelor. De fapt, se poate spune că toate afecțiunile hepatice
cronice prezintă alterări biochimice comune, indiferent de etiologia lor. Acestea sunt
acompaniate de creșterea stresului oxidativ, cu promovarea, întreținerea și exacerbarea
reacției inflamatorii prin secreția crescută de citokine pro-inflamatorii23, 24, 25. Progresia
ulterioară a inflamației spre fibroză și ciroză se realizează când balanța dintre injuria
hepatocitară și repararea/regenerarea celulară este înclinată spre primul dintre
procese23, 26.
Istoria naturală a SHNA reflectă istoria naturală a sindromul metabolic (SM),
BFGNA (cu toate afecțiunile din spectrul său) fiind considerată de către unii autori
expresia hepatică a acestuia. Cea mai frecventă cauză de deces este boala
cardiovasculară și nu cea hepatică rândul pacienților cu FGNA/SHNA, deși pacienții cu
SHNA prezintă un risc crescut de deces legat de afectarea hepatică comparativ cu cei
care prezintă doar steatoză hepatică simplă11, 27, 28, 29. Pacienții cu SHNA vor dezvolta
eventual ciroză hepatică, dar numai dacă nu vor deceda din cauza unor boli
cardiovasculare mai întâi11, 27. Progresia fibrozei spre ciroză și/sau HCC apare numai la
2,5% dintre pacienții cu SHNA, și este de obicei mai lentă decât în cazul altor boli cronice
ale ficatului11. Progresia spre ciroză hepatică a fost estimată la 57 de ani pentru FGNA și
la 28 de ani pentru SHNA30, comparativ cu o progresie estimată la 20-30 ani pentru
hepatita cronică virală C31.

21
1.3. Factori de risc/etiologici pentru FGNA și SHNA
1.3.1. Sindromul metabolic
Prezența SM este cel mai puternic factor de risc pentru FGNA și SHNA32.
Sindromul metabolic a fost definit de-a lungul timpului în diferite variante, abia în 2009
stabilindu-se de către forurile internaționale competente definiția actuală a acestuia33.
Cele 5 componente ale sindromului metabolic sunt obezitatea abdominală,
hipertensiunea arterială (HTA), prezența prediabetului sau a DZT2 (sau tratament
antidiabetic), creşterea valorilor serice ale trigliceridelor ≥150 mg/dl (sau tratament
specific) și scăderea valorilor serice ale HDL-colesterolului <40 g/dl la bărbaţi şi <50
mg/dl la femei (sau tratament specific). Asocierea dintre FGNA și unele dintre
componentele sindromului metabolic este bidirecțională, ceea ce înseamnă că atât
prezența SM favorizează apariția FGNA, cât și prezența FGNA favorizează apariția sau
agravarea unora dintre parametri definitori ai SM32, 34.
Dintre componentele SM, prezența DZT2 este probabil cel mai important factor
de risc pentru apariția și progresia FGNA 29, 34. Există numeroase studii în literatură, care
au arătat atât faptul că FGNA/SHNA sunt asociate cu DZT2, cât și faptul că prezența
FGNA este un factor de risc independent pentru apariția și progresia DZT2 29, 35, 36. O
metaanaliză din 24 de studii publicată recent a arătat o prevalență de 59,67% a FGNA la
pacienți cu DZT237. Severitatea FGNA (evaluată prin ecografie hepatică) și în special
prezența SHNA par să crească riscul de apariție a DZT229, deși metaanaliza lui Musso și
colab. a arătat că riscul de a dezvolta DZT2 este similar atât pentru pacienți cu steatoză
simplă și SHNA38. Totuși, dacă apare diabetul zaharat la acești pacienți, se pare că
prezența acestuia este cel mai important predictor al progresiei steatozei spre SHNA și
fibroză avansată/ciroză hepatică39, 40. Recent, pe lângă efectele insulinorezistenței și a
lipotoxicității, se discută tot mai mult efectul negativ al glucotoxicității (efectul negativ
al hiperglicemiei cronice) asupra ficatului41. Glucotoxicitatea alterează căile
intracelulare ale glucozei, și interacționează cu lipotoxicitatea la nivel hepatic,
promovând disfuncția hepatocitară, agravând insulinorezistența și scăzând suplimentar
secreția de insulină41.
O altă componentă a sindromului metabolic dovedită a avea implicații în geneza
FGNA și SHNA este obezitatea. Componentă a SM, obezitatea abdominală (măsurată prin
circumferința taliei) se corelează mai bine cu prezența FGNA decât indicele de masă
corporală34, 42. Masa de țesut adipos visceral este crescută la pacienții cu FGNA și este
dovedită ca fiind un factor de risc independent pentru progresia steatozei simple spre
SHNA și fibroză avansată43. Deși adipozitatea viscerală reprezintă 7-15% din totalul
țesutului adipos uman, ea are un rol mai important decât adipozitatea subcutanată în
dezvoltarea insulinorezistenței, în principal prin producerea de acizi grași liberi și
citokine proinflamatorii34, 44. Nu doar obezitatea abdominală reprezintă însă un factor
de risc pentru apariția FGNA și progresia spre SHNA și HCC, ci și obezitatea generală,
cuantificată prin IMC. Un studiu publicat în 2018 a arătat chiar mai mult decât ce se știa

în mod clasic despre relația obezitate-SHNA. Astfel, Grohmann și colab. au dovedit că
obezitatea activează receptorii hepatici STAT1, care promovează infiltrarea ficatului cu
celule T și, consecutiv, agravarea fibrozei și a inflamației hepatice în SHNA. Totodată,
autorii au dovedit că obezitatea induce semnalarea prin receptorii STAT3 și inactivarea
protein tirozin fosfatazei, conducând în timp spre agravarea inflamației și apariția
hepatocarcinomului, independent de gradul fibrozei hepatice45.
Hipertensiunea arterială este asociată cu FGNA, fapt dovedit chiar și prin studii
prospective46. De fapt, se pare că valorile crescute ale tensiunii arteriale, chiar și în
limitele normalului, sunt predictori ai apariției și progresiei FGNA40. Totodată, prezența
FGNA este un predictor al riscului de apariție a HTA. În egală măsură, a fost dovedit prin
studii prospective faptul că HTA este un predictor al agravării fibrozei hepatice, fiind
menționată în ghidul european pentru managementul FGNA. Astfel, se recomandă o
monitorizare mai atentă a pacienților cu SHNA și HTA, deoarece aceștia au un risc mai
mare de boală hepatică progresivă40, 47.
Dislipidemia este de asemenea asociată cu FGNA/SHNA48. Este dovedit că
pacienții cu FGNA au un profil tipic de dislipidemie aterogenă, în care elementele
definitorii sunt creșterea trigliceridelor, a LDL-colesterolului și scăderea HDL-
colesterolului48, 49. Totuși, se pare că mai ales o fracțiune a LDL (particulele mici și dense
– sdLDL) se asociază cu FGNA și mai ales cu SHNA. Acest lucru este avansat ca și posibilă
explicație pentru acumularea de dovezi care susțin că pacienții cu SHNA au un risc
cardiovascular mai mare decât pacienții cu steatoză hepatică simplă48, 50.
1.3.2. Factori genetici și epigenetici
Încă din primele cercetări asupra FGNA/SHNA, s-a considerat că acest spectru de
afectare hepatică are o etiologie multifactorială, în care au un rol probabil și modificările
genetice51. În 2008, au fost publicate rezultatele primului Genome Wide Association Study
(GWAS) pentru FGNA, care a analizat 9229 polimorfisme de la nivelul unei nucleotide
(Single Nucleotide Polymorphysms – SNPs) pe o populație de etnii variate52. Studiul a
dovedit clar că polimorfismul rs738409 I148M al genei Phospholipase domain-
containing protein 3 (PNPLA3 – gena care codifică adiponutrina sau PNPLA3) a fost
puternic asociat cu acumularea de lipide în hepatocite. Interesant, asocierea a rămas
puternică chiar și după ajustări pentru indicele de masă corporală, prezența DZT2 ș.a51.
Studii ulterioare au confirmat de fiecare dată această asociere dintre varianta genei
PNPLA3 și FGNA/SHNA. Astfel, persoanele care prezintă această mutație genetică sunt
mai predispuse să dezvolte FGNA, care să progreseze mai repede spre SHNA și fibroză
avansată, independent de prezența altor factori de risc metabolici51, 53.
Un alt determinant genetic major a fost descris în 2015, și anume polimorfismul
genei care codifică o proteină membranară numită TM6SF2 (transmembrane 6
superfamily member 2 – TM6SF2)54. Varianta rs58542926 C>T predispune la SHNA,
balonizare hepatocitară și activitate necroinflamatorie hepatocitară51. Numeroase alte
polimorfisme genetice au fost descoperite a fi implicate în agravarea SHNA (gena

23
reglatorului glucokinazei – GCKR, gena superoxid dismutazei 2 – SOD2 ș.a.) și în
progresia FGNA spre HCC (gena Membrane Bound O-Acyltransferase Domain Containing
7 – MBOAT7)51.
Dintre modificările epigenetice incriminate în geneza FGNA sau agravarea SHNA,
sunt de menționat alterarea histonelor, expresia aberantă a micro-ARN-urilor sau
metilarea anormală a ADN-ului51, 55.
1.3.3. Sedentarismul, dieta și fumatul
Factorii legați de stilul de viață al pacienților cu FGNA au fost incriminați ca având
un rol important în geneza considerată multifactorială a bolii56. Sedentarismul și lipsa
exercițiului fizic regulat reprezintă mediatori-cheie al acumulării de grăsime la nivel
hepatic56, 57, 58. Exercițiul fizic regulat previne apariția FGNA și reprezintă unul dintre
pilonii managementului bolii deja apărute, fiind recomandat în funcție de caracteristicile
clinice ale pacientului58. Referitor la dietă, actualmente se pare că aceasta are un rol în
geneza FGNA în principal prin excesul de calorii în general, mai mult decât prin diferitele
tipare alimentare (excesul de zaharuri, carbohidrați sau grăsimi)59. Totuși, se
recunoaște faptul că, dintre macronutrienți, zaharurile simple (ex. fructoza), grăsimile
saturate și proteinele animale au un efect dăunător asupra ficatului, favorizând geneza
FGNA60. Consumul unor cantități mici de alcool (1-70 g/săptămână, în special vin), a fost
dovedit recent a fi asociat cu un grad mai redus al fibrozei hepatice61. În schimb, fumatul
este actualmente dovedit a fi asociat cu severitatea fibrozei hepatice62.
1.3.4. Vârsta, sexul, agregarea familială și diferențele etnice
Boala apare la toate grupele de vârstă, fiind alarmantă creșterea incidenței
acesteia la pacienții pediatrici63. Cea mai înaltă prevalență a FGNA/SHNA se întâlnește
însă la grupa de vârstă 40-60 de ani5, 64.
FGNA are o prevalență mai mare la bărbați și la femei postmenopauză,
comparativ cu femeile premenopauză, în principal din cauza acumulării de grăsime
viscerală65. Femeile cu FGNA sunt în medie cu 10 ani mai în vârstă decât bărbații, iar la
acestea, statusul premenopauză și cel de utilizator de hormoni sintetici au fost dovedite
că favorizează apariția unei forme mai agresive de SHNA. Totodată, au fost raportate
diferențe între sexe în ceea ce privește riscul de apariție a comorbidităților FGNA. De
exemplu, a fost raportată o creștere a riscului de apariție a polipilor adenomatoși
colonici doar la bărbați, nu și la femei65, 66, 67.
Și în ceea ce privește diferențele etnice, s-au observat variații în distribuția
FGNA/SHNA. Astfel, s-a observat că prevalenţa bolii este mai mare în populaţiile
hispanice și asiatice, comparativ cu cea caucaziană sau populația neagră55.
1.4. Patogeneza SHNA
Deși este o afecțiune studiată intens în ultimii ani, patogeneza SHNA încă este
incomplet elucidată68. Totuși, descoperirile recente ale mecanismelor care stau la baza

patogenezei bolii vor duce în sfârșit spre descoperirea unor medicamente cu adevărat
eficiente69. Astfel, în prezent a început să fie înlocuit modelul patogenetic „two-hit”
propus în 1998 de către Christopher Day și Oliver James (în care prima „lovitură” o
reprezintă apariția steatozei, iar a doua „lovitură” este reprezentată de agravarea
stresului oxidativ), cu un model mai complex, „multiple-parallel hit”. Acest ultim model
este considerat mai adecvat pentru o înțelegere mai bună a apariției FGNA și dezvoltării
spre SHNA70.
Astfel, tot mai multe studii sugerează că SHNA se dezvoltă prin multiple
evenimente intracelulare și extracelulare în diferite celule ale ficatului (hepatocite,
celule stelate hepatice – HSCs, celule Kupffer și macrofage) și prin interacțiuni între ficat
și alte țesuturi, în special cu țesutul adipos și intestinul69, 70, 71. Verigile patogenetice cu
elementele implicate în noua teorie „multiple-parallel hit” sunt reprezentate în figura de
mai jos (Figura 1), adaptată după imaginile din lucrările lui Kim KH70 și Dongiovanni P71.
Figura 1. Teoria „multiple-parralel hit” în patogeneza SHNA70, 71
AGL = acizi grași liberi; ROS = specii reactive ale oxigenului; PAMPs = pathogen-associated
molecular patterns; LPS = lipopolizaharide; ATP = adenozin trifosfat; HMGB1 = high mobility group
box 1; DNA = acid dezoxiribonucleic mitocondrial
1.4.1. Acumularea lipidelor, lipotoxicitate și apoptoză hepatocitară
Steatohepatita non-alcoolică se dezvoltă doar la o parte a pacienților cu
afecțiunile spectrului BFGNA, majoritatea dintre aceștia având doar „steatoză simplă”
(FGNA)72. Steatoza hepatică reprezintă acumularea de trigliceride sub formă de

25
macrovacuole în citoplasma hepatocitelor. În SHNA apare, pe lângă steatoză, injurie
hepatocitară datorată în principal lipotoxicității, cu infiltrat inflamator lobular
(ocazional portal) și apoptoză. În plus, alterarea funcțiilor și formei mitocondriale,
stresul oxidativ de la nivelul reticulului endoplasmic, dar și diverse nivele de fibroză
hepatică, sunt frecvent întâlnite. Astfel, SHNA va fi caracterizată prin combinația
steatozei macroveziculare cu inflamația și fibroza, balonizația hepatocitelor fiind injuria
tipică identificată microscopic70, 73, 74.
Steatoza hepatică se devoltă din interacțiunea factorilor genetici, metabolici și de
mediu. Factorii de risc amintiți în capitolul anterior sunt promoteri ai apariției și
dezvoltării steatozei hepatice. O dietă bogată în zaharuri provoacă în ficat o sinteză de
novo a acizilor grași liberi (AGL) și ulterior de trigliceride, iar o dietă bogată în grăsimi
duce la o absorbție crescută de acizi grași cu lanț scurt la nivel intestinal, care sunt
transportați la ficat prin intermediul proteinei transportoare a acizilor grași (FATP),
împreună cu AGL creați prin hidroliza chilomicronilor. Pe altă cale, hidroliza
trigliceridelor din țesutul adipos (în special cel visceral), determinată în principal de
insulinorezistență, generează suplimentar AGL68, 69, 70. Hiperglicemia, element al
insulinorezistenței, prin alterarea β-oxidării hepatice și alte mecanisme, stimulează
suplimentar sinteza de AGL, promovând în continuare dezvoltarea steatozei hepatice70.
Această revărsare hepatică de acizi grași, concomitent cu alte lipide (trigliceride,
colesterol liber, lisofosfatidil-colină, acizi biliari și ceramide) generează așa-numita
lipotoxicitate hepatică68, 75. Actualmente, se consideră că lipotoxicitatea, combinată cu
disfuncția mitocondrială, reprezintă principalii promotori ai injuriei hepatocitare și ai
apoptozei68. De exemplu, este dovedit pe studii celulare că acidul palmitic (un AGL
saturat) activează receptorul alfa activat de proliferare a peroxizomilor (proliferator-
activated receptor alpha – PPARα) și cauzează o disfuncție mitocondrială dependentă de
kinaza c-Jun-N-terminal (c-Jun N-terminal kinase – JNK) care, combinate cu activarea
caspazelor, cauzează apoptoza hepatocitului68, 76.
După cum am amintit anterior, factorii genetici au de asemenea o implicare în
apariția și progresia mai accelerată a steatozei hepatice. Largi studii genomice au
identificat cei doi determinanți majori ai variabilității interindividuale în evoluția
steatozei hepatice. Aceștia sunt polimorfismul I148M al genei care codifică adiponutrina
(sau PNPLA3) și polimorfismul E167K al genei care codifică proteina membranară
TM6SF268, 70. PNPLA3 este o triacilglicerol lipază, care în ficat ajută la scoaterea acizilor
grași din picăturile de lipide din citoplasma hepatocitului. Acumularea unei variante
mutante PNPLA3-I148M îi alterează funcția și promovează acumularea de lipide în
hepatocit54, 77. TM6SF2 este o proteină transmembranară care realizează transferul
acizilor grași în aparatul Golgi, pentru a fi excretați sub formă de VLDL. Varianta mutantă
a acestei proteine predispune la excreție scăzută a lipidelor din hepatocit, acumulare
lipidică și balonizare hepatocitară54, 55.

1.4.2. Stres oxidativ, citokine, macrofage, inflamație și fibroză
Adăugat stresului mitocondrial amintit anterior, lipotoxicitatea favorizează și un
stres al reticulului endoplasmatic (RE). Acest stres cronic crește producția de specii
reactive ale oxigenului (ROS), care activează calea kinazei JNK, promovând inflamația
hepatică (similar acțiunii acidului palmitic)70. Stresul RE determină activarea unei căi de
semnalare numită unfolded protein response (UPR), care încearcă să restabilească
homeostazia RE consumând suplimentar energie, activând multiple alte sisteme de
semnalare celulară și formând în final noi ROS78. Acest sistem UPR acționează și prin
scăderea mecanismelor antioxidante, scăzând nivelele glutationului și activitatea
catalazei și a superoxid dismutazei. Activitatea glutation peroxidazei și a superoxid
dismutazei sunt reduse suplimentar la pacienții cu SHNA și din cauza disfuncției
mitocondriale, disfuncție care generează în egală măsură activarea citocromului P450
2E1 (CYP2E1), care va produce în exces radicali liberi78, 79.
Rolul citokinelor și chemokinelor în geneza SHNA este bine stabilit. Dintre
citokinele proinflamatorii, au o implicare dovedită factorul de necroză tumorală α
(TNFα), interleukina-6 (IL-6) și interleukina 1β (IL-1β). Dintre chemokine, cea mai
studiată în SHNA este chemokina (C-C motif) ligand 2 (CCL2)70, 80. Răspunsul inflamator
datorat lipotoxicității va fi declanșat și în țesutul adipos, nu doar în ficat, producând o
creștere a nivelurilor de citokine și chemokine proinflamatorii72. În final, producția
crescută a acestor citokine și chemokine va induce infiltrarea macrofagelor în ficat și
activarea celulelor hepatice stelate și a celulelor Kupffer70, 81. Activarea celulelor Kupffer
spre statusul lor proinflamator M1 este contrabalansată de către macrofagele M2, care,
activate de factorul de transcripție PPAR-δ și adiponectină, vor produce citokine
antiinflamatorii, în special interleukina 10 (IL-10). Actualmente, dereglarea balanței
M1/M2 este considerată un mecanism central al progresiei FGNA72, 82. Alte verigi
patogenetice implicate în progresia bolii sunt receptorii toll-like (ex. TLR4),
inflamazomii, limfocitele, veziculele extracelulare sau sistemul endocanabinoid68, 69, 70,
71, 72.
În final, semnalele provocate prin injuria hepatocitară și activarea macrofagelor
vor duce la activarea celulelor stelate hepatice în miofibroblaști, care vor produce
proteine de matrice extracelulară mai repede decât vor putea fi degradate, conducând
la agravarea în timp a fibrozei hepatice32.
1.4.3. Axa țesut adipos-ficat și axa intestin-ficat
Țesutul adipos joacă un rol important în progresia FGNA, prin eliberarea de
adipokine (adiponectină și leptină) și citokine (mai ales TNFα și IL-6)69. Nivele crescute
ale leptinei vor duce în timp la promovarea inflamației și a fibrogenezei, o metaanaliză
recentă arătând că atât pacienții cu FGNA, cât și cei cu SHNA au concentrații serice
crescute ale leptinei83. Țesutul adipos va genera o scădere a adiponectinei (adipokina
„hepatoprotectoare”) și o creștere a sintezei de TNFα, IL-6, CCL2, rezistină și visfatină,

27
care vor întreține inflamația hepatică, în timp ce agravarea insulinorezistenței va
continua să trimită un exces de AGL spre ficat, întreținând lipotoxicitatea72.
Tot mai multe studii sugerează că axa intestin-ficat joacă un rol important în
menținerea homeostaziei metabolice, alterarea acesteia fiind implicit un factor
important în geneza FGNA și progresia spre SHNA70. Disbioza microbiotei poate conduce
la transportarea spre ficat a unor bacterii sau a unor produși bacterieni – în special
lipopolizaharide84. Aceștia sunt recunoscuți în ficat de către receptorii toll-like sau NOD-
like, care vor declanșa inflamație și fibroză prin căile descrise anterior. Pe lângă acest
mecanism, microbiota se pare că influențează apariția FGNA/SHNA și prin alterarea
permeabilității intestinale, afectarea inflamazomilor, și chiar prin producere de etanol,
care va fi livrat spre ficat69.
1.5. Comorbidități
1.5.1. Comorbidități cardiometabolice
FGNA/SHNA au fost în multiple rânduri propuse ca și manifestări hepatice a
sindromului metabolic85. Totuși, încărcarea grasă a ficatului este semnificativ crescută
la pacienții cu SM, și totodată prezența FGNA este un predictor puternic al SM, ceea ce
înseamnă că relația dintre acestea este bidirecțională32, 34, 85.
Comorbiditățile metabolice ale FGNA sunt reprezentate de unele dintre
componentele sindromului metabolic (dislipidemia și DZT2), iar mecanismele intricării
acestora au fost descrise în capitolul dedicat factorilor de risc pentru SHNA.
Comorbiditățile cardiovasculare reprezintă principala cauză de deces a
bolnavilor cu FGNA, justificat prin faptul că aceștia prezintă frecvent multiplii factori de
risc cardiovasculari dovediți (obezitate, dislipidemie, HTAE ș.a.) sau care încă sunt în
curs de investigare (citokinele proinflamatorii, factorii procoagulanți sau
hiperuricemia)86. De fapt, este dovedit că prezența FGNA se asociază cu evenimentele
vasculare ischemice chiar dacă respectivul pacient nu prezintă nici unul dintre factorii
de risc cardiovasculari bine dovediți86, 87. Multiple studii au asociat FGNA cu creșteri în
grosimea intimă-medie carotidiană, a indexului gleznă-braț și a scorului CT de calciu
coronarian, parametrii care evaluează ateroscleroza și rigiditatea arterială86. Pacienții
cu FGNA/SHNA au o prevalență mai mare atât a comorbidităților macrovasculare (boală
coronariană ischemică, boală cerebrovasculară sau arteriopatie cronică obliterantă
periferică), cât și a celor microvasculare (nefropatie, retinopatie sau neuropatie),
comparativ cu subiecți fără steatoză88. Suplimentar, se pare că FGNA se asociază chiar și
cu aritmiile cardiace și cardiomiopatii86. Principalele mecanisme prin care FGNA/SHNA
promovează ateroscleroza și disfuncția cardiacă sunt creșterea producției hepatice de
trigliceride, VLDL și lipoproteine aterogene, concomitent cu creșterea ROS, a factorilor
procoagulanți (ex. inhibitorul activatorului plasminogenului – PAI-1) și a citokinelor
proinflamatorii85, 88.

1.5.2. Comorbidități non-cardiometabolice
În ultimii ani, multiple implicații extrahepatice ale FGNA au fost fost dovedite.
Interesant, au fost găsite asocieri între FGNA/SHNA și afecțiuni care nu au o asociere
puternică cu sindromul metabolic, de exemplu psoriazisul. De fapt, o pletoră de organe
ar putea suferi din cauza apariției și progresiei FGNA86. Într-un referat publicat în 2018,
am făcut o trecere în revistă a celor mai studiate comorbidități non-cardiometabolice ale
FGNA: boala cronică de rinichi (BCR), osteoporoza, psoriazisul și artrita psoriazică,
neoplaziile extrahepatice (și mai ales cancerul colorectal) și apneea obstructivă de
somn89. Pentru relația BCR-FGNA, există actualmente cel mai înalt grad al evidențelor.
Astfel, o metaanaliză din 2014 a arătat că prezența FGNA crește de aproximativ 2 ori atât
incidența, cât și prevalența BCR, în relație directă cu progresia FGNA spre SHNA și
fibroză avansată90. Printre mecanismele incriminate în apariția BCR ca și comorbiditate
a SHNA, se numără alterarea sistemului renină-angiotensină, scăderea mecanismelor
antioxidante și a adiponectinei și creșterea nivelurilor unor citokine și chemokine
proinflamatorii89. De fapt, pentru toate comorbiditățile asociate SHNA, principala
explicație a cercetătorilor este aceea că acești pacienți prezintă un status inflamator
cronic, suprapus de obicei fenomenului de insulinorezistență. În acest mod este
explicată și relația FGNA – cancer colorectal (colorectal cancer – CRC)85, 89, 91. Alte
cancere dovedite a fi asociate FGNA/SHNA sunt, pe lângă HCC (care va fi discutat în
capitolele următoare), cancerul de esofag, cel de stomac, pancreas și cancerul de sân la
femei și cel de rinichi la bărbați89.
1.6. Diagnostic și evoluție spre hepatocarcinom
1.6.1. Diagnosticul SHNA
Conform celui mai recent ghid de diagnostic și tratament al FGNA, elaborat de
Asociația Americană pentru studiul bolilor de ficat (AASLD) și publicat în 2018,
diagnosticul FGNA se stabilește prin prezența steatozei hepatice dovedită imagistic sau
histologic, excluderea consumului semnificativ de alcool și a altor posibile cauze ale
steatozei hepatice, și lipsa unei alte cauze de afectare hepatică cronică92. Conform
aceluiași ghid, SHNA este definit ca prezența a >5% steatoză hepatică (din greutatea
ficatului), cu inflamație și injurie hepatocitară (balonizare), cu sau fără fibroză
hepatică92.
Studiile care vor fi rezultatul prezentei teze au fost aprobate de către membrii
Comisiei de Etică a Universității de Medicină și Farmacie „Iuliu Hațieganu” în 2015, iar
protocolul de studiu a fost redactat în perioada 2014-2015. La acel moment, cel mai
recent ghid clinic cu referire la FGNA/SHNA a fost publicat de către World Health
Organisation (WHO) în iulie 2014. În acea lucrare se sublinia că nu există criterii
uniforme de diagnostic și stadializare pentru SHNA93. Biopsia hepatică a fost considerată
și rămâne și actualmente privită drept „gold standard” pentru diagnosticul SHNA. Totuși,
ghidurile actuale lasă în continuare loc de interpretări, autorii folosind exprimarea

29
„biopsia trebuie luată în calcul” la pacienți cu posibilă SHNA sau la cei la care există o
suspiciune rezonabilă că afectarea ficatului are o altă etiologie92. În ghidul american din
2012 era subliniat că NAFLD Fibrosis Score (NFS), un scor non-invaziv de evaluare a
fibrozei hepatice, este un instrument util în identificarea pacienților cu FGNA care au cu
o probabilitate mai mare fibroză avansată și/sau ciroză94. În ghidul din 2018, AASLD
recomandă să fie luate în calcul în caz de risc pentru SHNA următoarele: prezența
sindromului metabolic, a scorurilor non-invazive de fibroză (NFS și Fibrosis-4 Index –
FIB-4) sau rigiditatea hepatică măsurată prin elastografie prin rezonanță magnetică sau
elastografie hepatică tip FibroScan92. Dacă în bine-cunoscutul lui studiu din 2006,
Ekstedt numea simplu SHNA ca fiind „FGNA cu transaminaze elevate”95, viitorul va stabili
un panel ideal de biomarkeri, capabil să diagnosticheze cu precizie SHNA.
1.6.2. Evoluția SHNA spre hepatocarcinom
Actualmente, în Statele Unite ale Americii, FGNA este a 3-a cauză de apariție a
HCC, iar incidența HCC la pacienții cu FGNA crește anual cu 9%92. Recent, a fost publicată
o metaanaliză care a arătat că, dintre pacienții cu afecțiuni hepatice cronice în stadiu
non-cirotic, cei cu SHNA au un risc semnificativ mai mare de a dezvolta HCC comparativ
cu cei care au alt substrat al afectării hepatice96. Acest studiu arată faptul că evoluția
SHNA spre HCC nu are nevoie obligatoriu de un grad avansat al fibrozei hepatice,
sugerând existența unor alte căi patogenetice în proliferarea malignă. O posibilă ipoteză
propusă pentru a explica acest fenomen a fost aceea că, în prezența SM, adenoamele
hepatice benigne se transformă malign97. Recent, s-a dovedit că există o susceptibilitate
genetică în apariția HCC la FGNA non-cirotic. Astfel, polimorfismul rs641738 al genei
MBOAT7 duce la o scădere a expresiei enzimei MBOAT7, provomând steatoza și
favorizând apariția HCC98.
1.7. Noi perspective terapeutice
Deși în ultimii ani s-au făcut progrese remarcabile în descoperirea mecanismelor
patogenetice care stau la baza FGNA/SHNA, cercetările care au avut ca obiect terapia
SHNA nu au descoperit nici un medicament care să aibă o indicație țintită pentru această
afecțiune99. Totuși, management-ul steatohepatitei non-alcoolice cuprinde principii
terapeutice non-farmacologice (legate de dietă și activitatea fizică) și unele mijloace
farmacologice100. Cea mai importantă intervenție o reprezintă modificarea stilului de
viață, în principal prin scăderea susținută din greutate și exercițiu fizic regulat.
Căutarea unui medicament „ideal” care să devină pilonul principal al
tratamentului SHNA a luat amploare în ultimii ani. În mai 2019, în baza de date US
Clinical Trials Database, existau peste 120 de studii active pe SHNA, dintre care mai mult
de 40 erau trialuri de fază II-III101. Medicamentele acceptate în acest moment pentru
SHNA, dar care nu sunt recomandate oficial de către organizațiile de administrare a
medicamentelor, sunt vitamina E (efect antioxidant), pioglitazona (efect de scădere a

insulinorezistenței prin acțiune pe receptorii PPAR-γ)102 și liraglutida (un agonist de
glucagon-like peptide – GLP-1)103.
Agenții farmacologici evaluați în studiile clinice actualmente în derulare, care ar
putea avea un impact favorabil în tratamentul FGNA/SHNA, cât și mecanismele prin care
aceștia ar putea acționa benefic, sunt reprezentați în tabelul de mai jos (Tabelul I).
Nu în cele din urmă, SHNA și mai ales ciroza indusă de SHNA poate beneficia de
transplantul hepatic, iar pacienții cu obezitate pot beneficia de aportul chirurgiei
bariatrice, uneori cu rezultate spectaculoase103.
Tabelul I. Tratamentele testate în trialurile clinice actuale 101, 102, 103
Clasa de
medicamente
Molecule utilizate Dovezi din studii, mecanism de
acțiune
Modulatori ai
metabolismului
energetic
Agoniști de GLP-1
(Liraglutid, Semaglutid)
Efecte metabolice multiple;
Liraglutida a vindecat SHNA la 39%
dintre pacienți
Activator al receptorului β
al hormonului tiroidian
(THR β) – MGL-3196
Fază I; rezultate promițătoare
Inhibitori ai
lipogenezei „de
novo” /
antifibrotice
Agonist al receptorului
Farnesoid X (FXR) – acidul
obeticholic (OCA)
Cel mai avansat (Fază III); antifibrotic,
antisteatozic, antiinflamator; probabil
va fi primul medicament aprobat
pentru SHNA
Inhibitori ai Acetil-
Coenzima A Carboxilaza –
ACC 1
Fază II; Scad eficient lipogeneza, cu
hipertrigliceridemie; studii actuale în
combinație cu Selonsertib
Acid colic + acid eicosanoic
- Aramchol
Fază II; Inhibă lipogeneza, diminuă
steatoza
Blocanți ai receptorului
canabinoid 1 - CB1
Primul trial la oameni a fost întrerupt
(efect advers disforie)
Modulatori ai
inflamației /
antifibrotice
Liganzi PPAR- α și δ –
Elafibranor, Ianifibranor
Fază III; rezultate promițătoare în
multiple trialuri
Inhibitori Apoptosis Signal-
Regulating Kinase 1 - ASK1
- Selonsertib
Fază III; reduce fibroza hepatică la 6
luni de administrare; folosit deja și în
combinații cu OCA
Inhibitori CCR2/5
(antagoniști receptor de
chemokine)- Cenicriviroc
Alterarea proliferării celulelor stelate;
efect antifibrotic; în studiu de fază III;
rezultate promițătoare
Blocanți ai
apoptozei
Inhibitori ai caspazei -
Emricasan
Fază II; bine tolerat; a fost evaluat în
ciroză-SHNA – nu a atins end-point
Alte clase Inhibitorii SGLT2 -
Empagliflozin
Medicamente antidiabetice, care
produc glucozurie; limitează
glucotoxicitatea; efect antisteatozic
Inhibitorii factorului de
creștere 19, 21 a
fibroblaștilor – FGF19/21
Hormon peptidic pegylat; rezultate
inițiale promițătoare (reduce steatoza
și transaminazele)
Probioticele Multiple studii pe multiple tulpini,
rezultate inconstante

31
2. Paraoxonaza 1 – roluri și modularea lor
2.1. Structura Paraoxonazei 1 și legarea de HDL
Paraoxonaza 1 (PON1) este o enzimă cu potențial antioxidant, fiind cea mai
studiată dintre enzimele familiei paraoxonazelor (care cuprinde 3 membri: PON1, PON2,
PON3). Enzima este caracterizată prin capacitatea de a acționa pe o varietate de
substraturi, printr-un spectru larg de activități, dintre care cele mai importante sunt cea
paraoxonazică, lactonazică și arilesterazică104, 105, 106. PON 1 a fost dovedită a avea
implicare într-un spectru larg de afecțiuni apărute sau evoluate pe seama creșterii
stresului oxidativ: patologii cardiovasculare, elemente ale sindromului metabolic, boli
hepatice cronice, boli renale cronice, afecțiuni tiroidiene, unele malignități ș.a.107, 108.
Enzima este codificată de gena PON1, fiind de fapt o glicopeptidă constituită din
354 de aminoacizi și având o masă moleculară de 43 kDa105. PON1 este produsă la nivel
hepatic, regăsindu-se în principal la nivelul hepatocitelor, dar și în ser. Metionina N-
terminală din lanțul polipeptidic reprezintă situl de legare al acesteia la particulele de
HDL-colesterol (care sunt de asemenea secretate la nivel hepatic). Astfel, se realizează
un complex PON1-HDL, cu proprietăți antioxidante și antiaterogenice bine dovedite104,
106, 107. Pe lângă efectul antioxidant prin legarea de HDL, efectul antioxidant enzimatic
direct este susținut printr-o ipoteză lansată în 2001, când s-au făcut primele observații
referitoare la expresia hepatică a PON1109. Astfel, se pare că aceasta se manifestă în
principal în regiunea centrolobulară109, cea care conține microzomii hepatici
(principalul sediu al catabolismului compușilor xenobiotici)110.
2.2. Concentrație enzimatică, activități și efecte antioxidante
2.2.1. Concentrația serică a PON1
Concentrația serică și activitățile enzimei pot varia foarte mult (de până la 13 ori)
între indivizi111. Acestea pot fi modificate de către factori genetici (polimorfisme ale
genei PON1) și dobândiți (dietă, stil de viață, afecțiuni cronice). Pentru studiile clinice
care implică determinarea statusului PON1, este esențială determinarea concentrației
enzimei și/sau a activităților acesteia111. Clasic, măsurarea nivelurilor totale ale PON1 în
ser implica utilizarea unei metode complexe, care presupune sinteza 7-O-diethyl
phosphoryl 3-cyano 4-methyl 7-hydroxycoumarin (DEPCyMC)112. Metoda fiind elaborată,
dificil de condus și insuficient validată, în practica de cercetare s-au măsurat în schimb
activitățile enzimei, pentru a descrie statusul acesteia. În plus, s-a dovedit că rezultatele
tehnicii vechi se corelează slab cu rezultatele obținute utilizând noile kituri automate
care utilizează tehnica ELISA113. Într-un studiu publicat recent, atât concentrația PON1
(măsurată cu ajutorul kiturilor ELISA) cât și activitățile enzimei au fost scăzute la
pacienți cu pancreatită acută, studiul aducând dovezi suplimentare în validarea metodei
moderne de măsurare a concentrației serice a PON1114.

2.2.2. Activitățile serice ale PON1
În ciuda faptului că enzima posedă o mulțime de funcții, realizate prin cele 3
activități menționate anterior, aceasta a fost denumită după capacitatea de a hidroliza
substratul paraoxon (primul care a fost studiat dintre compușii organofosforici)115.
Astfel, activitatea paraoxonazică (P-ase) îi conferă enzimei capacitatea de a hidroliza
metaboliți activi ai pesticidelor (ex. paraoxon, diazoxon) și ai gazelor de luptă (soman,
sarin)107, 116, iar activitatea arilesterazică (A-ase) ajută PON1 să hidrolizeze fenilacetatul
și alți esteri aromatici, intervenind totodată în metabolizarea unor medicamente105, 106,
107, 116. Fiind o enzimă cu multiple activități, multă vreme nu s-a cunoscut activitatea
nativă a PON1. Se pare că aceasta este cea de lactonază, mai exact lipolactonază117. Astfel,
enzima este capabilă să descompună atât lactone exogene (ex. γ-lactone sau unele
medicamente, cele mai comune fiind statinele) cât și endogene (ex. homocistein-
tiolactona – HTL), care vor fi descompuse în lisofosfatidil-colină și δ-valerolactonă110, 117,
118. Toate aceste activități îi conferă PON1 statutul unei adevărate enzime
„detoxifiante”118, cu rol protectiv împotriva stresului oxidativ și inflamației, detaliat în
cele ce urmează.
2.2.3. Efecte antioxidante și antiinflamatorii ale PON1
Enzimă Calciu-dependentă, PON1 se leagă de HDL după ce este secretată în
plasmă, formând un complex cu multiple roluri funcționale. Pe lângă activitatea de
hidrolizare a metaboliților activi ai pesticidelor, enzima va modula în principal
metabolismul lipidic, atât în plasmă cât și în țesutul adipos115, 119, 120. Astfel, aceasta are
un rol protector împotriva peroxidării lipidelor și inhibă captarea de colesterol în
macrofage (în același timp crescând efluxul de colesterol din acestea)115.
Macrofagele joacă un rol foarte important în devoltarea aterosclerozei prin
captarea de colesterol modificat (în special LDL oxidat – oxLDL), secreția de citokine
proinflamatorii și transformarea lor în celule spumoase („foam cells”)121. Aceste celule
spumoase au o capacitate migratorie alterată și o capacitate redusă de a elimina excesul
de colesterol acumulat în interior; astfel, vor deveni ușor captive în placa de aterom,
ducând la progresia aterosclerozei121, 122. PON1 reduce practic formarea acestor celule
spumoase, dar reduce totodată și abilitatea macrofagelor de a elibera ROS123.
PON1 reglează de asemenea activitatea altor două enzime cu potențial
antiaterogen: lecitin-colesterol aciltransferaza (LCAT) și mieloperoxidaza (MPO).
Astfel, PON1 este capabilă să inhibe inactivarea oxidativă a LCAT (promovând practic
efectul ei antiaterogen) și să inhibe direct activitatea MPO, blocând practic debutul
peroxidării lipidelor123. Complexul PON1-HDL este frecvent asociat altor două
lipoproteine, apolipoproteina A-I (apoA-I) și apolipoproteina J (apoAJ). Aceasta din
urmă (numită și clusterina), a fost dovedită ca fiind un stabilizator al relației PON1-HDL,
dar și cu un important rol citoprotectiv pentru alte enzime antioxidante, având astfel un
rol-cheie în medierea inflamației118.

33
Un alt efect benefic antiaterogen al PON1 este legat de capacitatea enzimei de a
cataboliza HTL, un metabolit toxic al homocisteinei. HTL este implicat în disfuncția
endotelială prin N-homocisteinilare, iar PON1 a fost dovedită că scade acumularea
proteinei N-homocisteina (având astfel un rol suplimentar în protecția
cardiovasculară)123.
2.3. Genetica PON1
2.3.1. Gena PON1
Gena PON1 se află situată pe brațul scurt al cromozomului 7, conține aproximativ
26 KB și prezintă două regiuni distincte, regiunea codificatoare și cea reglatoare105, 116,
124. Există multiple dovezi care au dovedit existența a peste 160 de polimorfisme ale
PON1, datorate unor mutații punctiforme la nivelul acesteia (single nucleotid
polymorphisms – SNPs). Aceste polimorfisme genetice pot influența semnificativ
concentrația serică și activitățile PON1124, 125.
2.3.2. Polimorfismele PON1
Polimorfismele genetice ale genei PON1 au fost studiate pentru prima dată în
1993 de către Steve Adkins sub îndrumarea lui Bert La Du126, punând astfel bazele unor
studii ulterioare125. Mutațiile punctiforme de la nivelul genei pot influența concentrația
și activitățile PON1 plasmatice127, exprimarea fenotipului ducând la formarea de 3 grupe
în populația generală (cu activitate PON1 scăzută, intermediară sau crescută)125.
2.3.2.1. Polimorfismele regiunii codificatoare a PON1
Regiunea codificatoare a genei conține cei 2 determinanți majori ai variației
genetice a activităților PON1. Cel mai cunoscut și studiat polimorfism este reprezentat
de substituţia glutamină (Q)/arginină (R) la nivelul codonului 192 (Q192R – rs662).
Celălalt polimorfism este reprezentat de substituţia leucină (L)/metionină (M) în poziţia
55 (L55M – rs854560)107, 111, 125, 128. Alloenzima PON1 192R este mai puțin eficientă
comparativ cu varianta 192Q în inhibarea oxidării LDL-C, deoarece hidrolizează într-o
mai mică măsură peroxizii lipidici129. Alloenzima PON1 192Q hidrolizează paraoxonul
mai puțin eficient decât PON1 192R, în schimb este mai eficientă în hidrolizarea LDL
oxidat sau HDL oxidat105, 107, 129. De fapt, a fost dovedit că eficiența PON1 de protejare a
LDL-colesterolului împotriva oxidării scade cu cât activitatea paraoxonazică a enzimei
crește125. În același timp, s-a observat că polimorfismul Q192R are o influență minimă
asupra concentrației plasmatice a PON1, deși influențează activitățile enzimei116. În ceea
ce privește polimorfismul L55M, s-a dovedit că alela PON1 55L se asociază cu activități
mai crescute ale PON1, dar și cu o expresie mai înaltă a mARN-ului. Alloenzima PON1
55M are o stabilitate mai redusă, explicându-se astfel activitatea mai scăzută a
acesteia130. Interesant, unele studii au legat polimorfismul L55M de apariția
evenimentelor cardiovasculare (în special boala coronariană ischemică), în timp ce
polimorfismul Q192R este considerat actualmente cel mai important biomarker al
statusului antioxidant al PON1131. În mod practic, într-o metaanaliză publicată în 2019,

s-a dovedit clar că ambele polimorfisme se asociază în mod semnificativ statistic cu
bolile cardiovasculare induse de ateroscleroză132.
2.3.2.2. Polimorfismele regiunii promotoare
În această regiune a genei PON1, s-au descris multiple polimorfisme, dar se pare
că 3 dintre acestea au cea mai mare influență în transcrierea acesteia: G-907C, A-162G,
și C-108T131. Aceste mutații sunt frecvente și explică până la 30% dintre diferențele
interindividuale în ceea ce privește activitățile și concentrația plasmatică a PON1133, 134.
Dintre aceste polimorfisme, se pare că -108 (rs705379) este principalul contribuitor al
reglării expresiei clinice a PON1 (cel puțin 12% dintre variațiile enzimei putând fi
atribuite acestui SNP)135. Importanța acestei zone de reglare a fost observată atunci când
s-a eliminat complet activitatea de promoter a genei după deleția SNPs-urilor -108 și -
162 (rs705381). Aceste două polimorfisme reprezintă de fapt site-urile de legare a
factorului de transcripție Sp1 (-108), respectiv a factorului nuclear 1 (-162)134. Capătul
proximal al promoter-ului, care conține SNP-ul -108, este esențial în reglarea genei prin
transcripția factorului Sterol regulatory element-binding protein-2 – SREBP2 (sub
acțiunea co-activatorului Sp1)111, 134, care este de fapt unul dintre reglatorii
homeostaziei colesterolului136. Astfel, polimorfismele din pozițiile -108 și -162, dar și
polimorfismul -907, s-au corelat și ele cu activități/concentrații crescute ale PON1, chiar
dacă există un dezechilibru de înlănțuire genetică (linkage) între aceste polimorfisme
ale promotorului și cele din regiunea codificatoare105, 107, 131, 134.
2.3.3. Relația genotip PON1 – fenotip PON1
Chiar dacă s-au descoperit de-a lungul timpului multipli factori legați de stilul de
viață, dietă sau medicamente care modulează fenotipul PON1, se pare că cel mai mare
impact asupra activităților enzimei îl au polimorfismele genei PON1. Deși am prezentat
dovezi care leagă SNPs-urile PON1 de bolile cardiovasculare aterosclerotice132, acestea
nu pot cuantifica cu precizie riscul cardiovascular137. Fenotipul PON1, care se referă la
concentrația serică și activitățile enzimei, este un mai bun predictor al bolilor
cardiovasculare decât variațiile genotipului PON1 (mutațiile punctiforme descrise
anterior)137, 138, 139. Totuși, multiple studii arată că activitățile PON1 sunt influențate de
polimorfismele PON1, chiar dacă nu se ia în considerare prezența altor factori de risc
cardiovasculari (de exemplu prezența sindromului metabolic)140.
2.4. Factori non-genetici care influențează fenotipul PON1
Într-un referat publicat în 2014, am trecut în revistă factorii non-genetici care
influențează concentrația serică/activitățile a PON1141. Pentru o mai bună înțelegere a
implicării acestora în modularea PON1, aceștia vor fi clasificați în factori endogeni (de
ex. vârsta, sexul sau comorbiditățile pacienților) și factori exogeni (compuși toxici sau
medicamente).

35
2.4.1. Influența vârstei, a sexului și a stilului de viață
Activitățile PON1 sunt scăzute în primii ani ai vieții, cresc în timp, rămân stabile
la vârsta de adult și scad progresiv la vârstnici142. Concentrația serică a enzimei are
tendința de a nu prezenta aceste variații semnificative143. Cel mai important declin în
relație cu procesul de îmbătrânire s-a observat pentru activitatea paraoxonazică și
pentru funcțiile complexului PON1-HDL, probabil prin accentuarea de-a lungul vieții a
stresului oxidativ142, 144. Pe lângă alterarea activităților enzimei, a fost avansată ideea că
PON1 ar putea fi una dintre genele longevității, SNP-ul codonului 192 fiind cel mai
frecvent asociat cu longevitatea. Interesant, într-o metaanaliză pe 11 studii publicată în
2009, s-a arătat că subiecții purtători ai genotipurilor RR sau QR erau semnificativ
statistic mai favorizați să ajungă la vârste extreme145. În 2010 însă, într-o metaanaliză
mai mare, pe 9580 de subiecți, acest lucru nu a putut fi confirmat, deși autorii nu au
putut exclude o asociere a polimorfismului Q192R cu longevitatea pe anumite populații,
subliniind încă o dată impactul unor posibili alți factori genetici și de mediu146.
Deși se considera că sexul nu are un impact asupra PON1, în 2019 s-a demonstrat
că există diferențe legate de sex, femeile având niveluri mai înalte ale activităților
lactonazice și paraoxonazice a PON1, comparativ cu bărbații. Această asociere a fost
chiar mai evidentă pentru grupa de vârstă <45 de ani147.
Multiple studii au evaluat influența dietei asupra expresiei PON1. Rezultatele au
fost inconstante, deși au fost evaluate diferite diete bogate în vitamine din fructe și
legume, uleiuri vegetale, sau compuși fenolici (și mai ales resveratrolul și flavonoizii)148,
149. Se pare că cel mai bun efect protector și potențiator pentru PON1 îl are dieta
mediteraneană, care conține nutrienți din toate clasele amintite mai sus150. Exemplul
sucului de rodie, care pare să aibă cel mai bun efect de creștere a activității PON1, este
urmat actualmente prin studierea unei game largi de produse vegetale, flavonoizi și alte
suplimente alimentare, în speranța descoperirii unui „aliment funcțional” care să fie
capabil să crească semnificativ activitatea acestei enzime151.
Deși numeroase studii au sugerat efectul pozitiv al consumului de alcool asupra
activităților PON1 (și în special al vinului roșu, bogat în resveratrol), doar recent a fost
publicat un studiu pe 8224 de subiecți, care a demonstrat clar faptul că un consum
moderat de alcool (maxim 30 grame/zi) crește nivelul activității arilesterazice a
PON1152. În schimb, fumatul a fost asociat evident cu o scădere a activităților PON1, și se
pare că polimorfismul L55M predispune fumătorii la a avea activități mai scăzute ale
PON1153.
2.4.2. Influenţa condițiilor fiziologice și patologice
Anumite condiții fiziologice, dar mai ales multiple condiții patologice, au fost
evaluate de-a lungul timpului pentru a se stabili dacă acestea au legătură cu fenotipul
sau genotipul PON1.
Referitor la condițiile fiziologice, au fost studiate sarcina și menopauza. În sarcină,
activitățile PON1 scad, dar nu există studii ample care să susțină o asociere clară105.

Statusul postmenopauză prezintă interes actualmente în cercetare, dar nu se pot face
încă asocieri clare menopauză-activități scăzute ale PON1154.
În ceea ce privește relația PON1-condiții patologice, există multiple studii care
leagă activitățile scăzute ale PON1 cu boala coronariană ischemică și elementele
sindromului metabolic (în special diabetul zaharat și obezitatea abdominală)107, 125.
Despre relația PON1-boală coronariană ischemică există cele mai multe dovezi155,
implicarea complexului PON1-HDL în blocarea progresiei aterosclerozei fiind deja
discutată anterior. Au fost publicate chiar și studii care au dovedit că activitatea PON1
ar putea fi un biomarker pentru severitatea bolii coronariene ischemice156. Încă din
2003 s-a arătat că activitatea PON1 este scăzută la pacienții cu SM, sugerându-se astfel
o relaţie negativă între stresul oxidativ şi activițile enzimatice ale PON1157. Au fost și
articole în care s-a subliniat faptul că, deşi pacienții obezi cu SM prezentau status
inflamator elevat și status antioxidant diminuat, nu au fost identificate modificări ale
activităților PON1158.
La persoanele cu obezitate abdominală, activitatea sistemului HDL-PON1 este
semnificativ mai scăzută, din cauza faptului că este modificată structura lipoproteinei,
prin creşterea nivelului de colesterol și scăderea nivelului proteic al particulei1.
Complexul HDL-PON1 se va transforma într-un complex instabil, tocmai prin astfel de
alterări ale raportului de trigliceride/colesterol și proteine1105, 107.
Multiple alte patologii au fost asociate cu valori scăzute ale activităților sau a
concentrației PON1. Astfel, acestea sunt scăzute în boli inflamatorii cronice (ex.
poliartrita reumatoidă), diferite neoplazii, afecțiuni hepatice și renale cronice, afecțiuni
tiroidiene, afecțiuni psihiatrice, boala Alzheimer etc.107, 137, 141.
2.4.3. Influența compușilor exogeni
După cum am notat anterior, PON1 este o enzimă Calciu-dependentă, astfel s-a
observat că, concomitent cu complexarea ionilor de calciu cu acid
etilendiaminotetraacetic (EDTA), enzima își inhibă activitatea125. În studii efectuate pe
șobolani, s-a realizat inhibiția marcată a activității PON1 utilizând tetraclorura de
carbon, care este cunoscută pentru efectul hepatotoxic și de alterare a ADN-ului159.
Numeroși agenți farmacologici au fost testați pentru efectele lor asupra
activităților PON1, în special medicamente utilizate în bolile cardiovasculare și
metabolice160. Rolul statinelor în variațiile PON1 a fost poate cel mai atractiv subiect de
studiu. Rezultatele au fost însă inconstante, deși majoritatea arată o creștere ușoară a
activităților PON1 în urma tratamentului cu statine (simvastatină, atorvastatină),
variind între 5-23%125, 160. Totuși, există studii care nu demonstrează o legătură între
tratamentul cu statine și activitatea PON1161. Același tipar al rezultatelor a fost observat
și în diferite studii care au evaluat acțiunea fibraților asupra PON1160, 162. Antibioticele
în general inhibă activitatea PON1, în timp ce unele medicamente antitumorale (ex.
ciclofosfamida) o cresc, probabil printr-un mecanism de apărare împotriva stresului
oxidativ125, 160,162.

37
2.5. Relevanța clinică a PON1
După peste 3 decade de cercetare a PON1, se poate afirma că această enzimă
posedă cateva activități esențiale pentru buna funcționare a organismului uman.
Protecția împotriva toxicității organofosforicelor, dar mai ales capacitatea anti-stres
oxidativ (și implicit anti-afecțiuni care evoluează datorită acestuia), fac din PON1 o
posibilă țintă a unor strategii de creștere a activității sale131, 137, 151, 162. Multitudinea de
studii care au avut ca obiectiv evaluarea importanței HDL-colesterolului în reducerea
riscului cardiovascular au arătat un paradox, acela că „mai mult HDL nu e neapărat mai
bine”137. Astfel, actualmente se insistă pe studierea calității și nu a cantității HDL-
colesterolului, iar PON1 are un loc important în validarea calității HDL. În plus, prin
multiplele sale funcții, enzima și-a câștigat o potențială includere în evaluarea
prognostică a aterosclerozei și implicit a bolilor cardiovasculare137, 163. Studii recent
publicate sugerează că statusul PON1 ar putea fi biomarker precoce de predicție a
potențialului evolutiv al bolilor cardiovasculare164, 165. Mai mult decât această potențială
relevanță clinică, se pare că toată familia paraoxonazelor ar putea avea implicații în
cancerogeneză. Studii recente sugerează chiar un potențial rol pentru paraoxonaze (și
în special PON1) ca și ținte ale unor potențiale medicamente antitumorale166.

39
3. Stres-ul oxidativ și Paraoxonaza 1 la pacienții cu
FGNA/SHNA
3.1. Stresul oxidativ în hepatopatiile cronice
Termenul „stres oxidativ” este de cele mai multe ori folosit pentru a descrie
alterarea oxidativă a unor molecule (cum ar fi unele proteine, lipide sau acizi nucleici)167,
168. Speciile reactive ale oxigenului (reactive oxygen species – ROS) și ale azotului
(reactive nitrogen species – NRS) sunt radicali liberi de obicei instabili, care sunt capabili
să inițieze peroxidarea lipidelor, oxidând totodată și alte molecule din membranele
celulare și chiar alterând ADN-ul. Toate aceste efecte nefavorabile ale acestora vor
provoca astfel injurie tisulară169. Capacitatea organismului uman de a elimina acești
radicali este datorată sistemelor antioxidante. Ficatul este un exemplu de organ care și-
a dezvoltat un sistem sofisticat antioxidant pentru a-și menține homeostazia redox. De
fapt, se pare că tocmai un dezechilibru al acestui sistem duce la progresia afecțiunilor
hepatice cronice169, 170. Generarea de ROS prin acțiunea NADPH-oxidazei, a
lipooxigenazei, a stresului reticulului endoplasmic sau a mitocondriei este
contrabalansată prin acțiunea vitaminelor C și E, a glutationului, a catalazei, a superoxid
dismutazei, a erythroid 2-related factor 2 (Nrf2)168, 169, 170 și, mai puțin descrisă în
referatele pe această temă, a Paraoxonazei-1171. Când balanța dintre producerea ROS și
eliminarea acestora este înclinată mai mult spre formarea acestora, modificările
moleculare vor duce la apariția și evoluția fibrozei hepatice172.
3.2. Paraoxonaza 1 în hepatopatiile cronice
Există studii care au încercat realizarea unei cuantificări cât mai complexe a
funcției hepatice în legătură cu activitățile PON1110. În general, activitatea/concentrația
PON1 scade în hepatopatiile cronice. S-a demonstrat că există corelații semnificative
între activitatea PON1 serică și proteinele totale, albumina și concentrațiile bilirubinei
la pacienții cu boli hepatice cronice, cu sau fără corelații cu grupurile de control173, 174,
175. Totodată, a fost demonstrat faptul că activitatea scăzută a PON1 a fost influențată
atât de statusul de boală hepatică cronică174, 175 (fiind uneori dovedită asocierea cu
alterarea particulelor HDL)176, cât și de către polimorfismele L55M și Q192R, fără a fi
influențate de vârstă sau sex173, 177. În hepatopatiile cronice cauzate de alcool, PON1 s-a
dovedit capabilă inclusiv în diferențierea bolnavilor de sănătoși, fiind legată totodată de
severitatea bolii178. Nu în ultimul rând, studii recente au arătat că activitățile și
concentrația PON1 au fost superioare alfa-fetoproteinei în detecția hepatocarcinomului
la pacienți cu ciroză hepatică179, sau chiar că enzima este un predictor al supraviețuirii
pacienților cu hepatocarcinom180.
Explicația fiziopatologică a acestor modificări ale statusului PON1 în
hepatopatiile cronice a fost propusă de către Judit Marsillach și colab. încă din 2009,

când aceștia au observat că PON1 are un efect hepatoprotector împotriva inflamației și
fibrozei hepatice (modificând expresia CCL2 și PPAR-δ)181. Afecțiunile hepatice care
evoluează cronic cu acumulare de ROS și/sau un status inflamator hepatic elevat (de ex.
niveluri crescute ale TNF-α sau IL-6) scad în timp expresia hepatică a PON1182.
3.3. Paraoxonaza 1 în FGNA și SHNA
În îndepărtarea ROS joacă un rol important complexul HDL-PON1, în special prin
capacitatea enzimei de a hidroliza peroxizii lipidici171, 183. Catabolismul acizilor grași din
hepatocit prin beta-oxidare mitocondrială este unul dintre cei mai mari generatori de
ROS la nivel mitocondrial, în special la pacienți cu FGNA (și mai ales cu varianta agresivă
SHNA). Îndepărtarea produșilor de oxidare lipidică hepatocitară de către PON1
protejează indirect împotriva inflamației184 prin scăderea activării celulelor Kupffer de
către ROS și scăderea producerii de către acestea a citokinelor proinflamatorii71. În
continuare, nivelele crescute ale citokinelor pro-inflamatorii vor activa celulele stelate
hepatice, promovând fibroza hepatică69, 70, 71. Studiul lui Baskol din 2005 a fost primul
care a evaluat activitatea PON1 la pacienți cu SHNA, semnalând că enzima poate fi
considerată un marker nou de peroxidare lipidică la acești pacienți184. Practic, rolul
PON1 împotriva apariției și progresiei steatozei hepatice simple spre SHNA/fibroză
avansată este mult mai complex, deoarece enzima intervine și în reglarea lipotoxicității
și a glucotoxicității hepatice118.
Figura 2. Implicarea PON1 în limitarea producerii de ROS și implicit de limitare a inflamației
hepatice (Adaptat după Dongiovanni, 2013)71

41
Adaptând o figură din lucrarea lui Dongiovanni din 201371, în imaginea
prezentată anterior am subliniat rolul PON1 în protecția împotriva progresiei FGNA spre
SHNA/fibroză hepatică avansată (Figura 2).
Există foarte puține studii care au asociat PON1 și FGNA/SHNA. Continuând
studiul din 2005184, Baskol și colab. au confirmat că nivelele serice ale PON1 la pacienți
cu SHNA au fost scăzute semnificativ față de grupul de control185. Aceleași rezultate au
fost obținute în 2011 pe un lot de 50 de pacienți cu FGNA186. Un alt grup de cercetători
a arătat însă, într-un studiu efectuat pe o populație din Iran, că nu au existat diferențe
semnificative în ceea ce privește activitățile PON1 la pacienții cu FGNA față de grupul de
control187. Pe un lot de pacienți pediatrici cu SHNA, în 2014 s-a demonstrat prezența
unor nivele ridicate ale concentrației PON1 la nivel hepatic, fără a decela concentrații
sau activități serice crescute ale enzimei188. Alte studii au confirmat că activitatea PON1
este redusă la pacienți cu SHNA189, în timp ce în studiul care a cuprins cel mai mare
număr de pacienți cu FGNA (peste 2000; însă diagnosticați printr-un surogat al
steatozei, Fatty Liver Index - FLI, nu ecografic) s-a observat că activitatea PON1 este
paradoxal menținută sau chiar crescută la pacienți cu FLI elevat190.
3.4. Potențiale direcții de cercetare
Se estimează faptul că, în decada următoare, SHNA va ajunge să fie, cel puțin în
Statele Unite ale Americii, principala indicație pentru transplant hepatic2, 5. De aici reiese
nevoia stringentă de a se continua cercetările actuale în vederea descoperirii unei
abordări terapeutice eficiente, care nu există în prezent. Strategii de îmbunătățire a
statusului inflamator (prin diminuarea citokinelor inflamatorii) promit să reducă
nivelul de fibroză și să producă reversia stadiilor avansate ale SHNA și a altor
hepatopatii cronice191. Principalele arii de cercetare în domeniul FGNA/SHNA sunt
descoperirea de agenți care au drept țintă lipotoxicitatea și stresul oxidativ, modularea
metabolismului celular, a răspunsului inflamator și modularea factorilor de transcripție
nucleară191, 192.
Se pare că viitorul apropiat trebuie să ne aducă primele mijloace medicamentoase
de tratament a SHNA. În imaginea următoare, adaptată după Sanyal (2019)2, sunt notate
evenimentele-cheie din istoricul SHNA2. Între timp, au fost prezentate primele rezultate
ale trialului REGENERATE193, care au arătat că acidul obeticolic ameliorează fibroza și
probele biochimice în SHNA.

Figura 3. Istoricul celor mai importante evenimente în cercetarea SHNA2
Pe lângă descoperirea unor mijloace de tratament țintit pentru SHNA, o altă
chestiune problematică este diagnosticul corect al acestei afecțiuni. Biopsia hepatică
este încă golden-standard94, însă este o metodă care are unele limitări, riscuri, este
costisitoare și operator-dependentă. În momentul în care se va realiza cuantificarea
exactă a tuturor biomarkerilor SHNA într-un scor cu sensibilitate și specificitate
apropiat de ideal, acesta va putea înlocui cu succes biopsia hepatică în diagnosticul de
certitudine.
Având în vedere numeroasele căi patogenetice de dezvoltare a FGNA și mai apoi
de evoluție a acestuia spre SHNA și fibroză avansată, este necesară în primul rând o
înțelegere corectă și completă a patogenezei SHNA, pentru a putea fi ulterior discutată
abordarea diagnostică și terapeutică ideală.
Enzimele antioxidante joacă un rol important în geneza inflamației și consecutiv
în transformarea FGNA în forma agresivă a acesteia, SHNA. Rolul de esterază/lactonază
al PON1 este important pentru înlăturarea excesului de specii reactive ale oxigenului și,
practic, în diminuarea inflamației118, 182, 183. După cum am menționat anterior, există
foarte puține studii care au evaluat PON1 și SHNA. Aceste studii au ajuns în marea lor
majoritate la concluzia că activitățile PON1 sunt diminuate în SHNA. Nu au existat însă
studii care să evalueze polimorfismele genei PON1 la acești pacienți, pentru a dovedi
faptul că probabil există anumite „constelații genetice” care predispun la apariția bolii,
independent de ceilalți factori implicați în patogeneza afecțiunii.
Un studiu care să analizeze relația între PON1 și SHNA ar putea fi util pentru
identificarea pacienților cu steatohepatită cu risc mai mare de progresie a bolii spre
fibroză și ciroză hepatică. De asemenea, o analiză în detaliu a factorilor genetici și de
mediu legați de PON1 care influențează riscul de instalare și de progresie a SHNA, ar
facilita identificarea unor potențiale ținte terapeutice.

43
CONTRIBUŢIA
PERSONALĂ

45
1. Ipoteza de lucru
Steatohepatita non-alcoolică (SHNA), parte a bolii ficatului gras non-alcoolic
(FGNA), a devenit una dintre cele mai frecvente maladii hepatice la nivel mondial, având
o prevalenţă în creştere, în paralel cu creșterea prevalenței obezității. Nici până în
prezent nu există un tratament aprobat specific pentru SHNA. Mai mult decât atât, „gold
standard”-ul diagnostic, biopsia hepatică, este o procedură cu potențiale riscuri, dificil
de utilizat în practica curentă. Experții din domeniu susțin că trebuie descoperit un
mijloc non-invaziv eficient pentru diagnosticul SHNA, în vederea depistării precoce a
acestor pacienți și instituirii unui management mai agresiv, care să întârzie progresia
bolii spre ciroză avansată sau hepatocarcinom.
Paraoxonaza 1 (PON1), enzimă antioxidantă membră a familiei paraoxonazelor,
are numeroase acțiuni benefice sistemic (prin legarea în plasmă de HLD-colesterol) și
hepatic (prin îndepărtarea peroxizilor lipidici, printre altele). Enzima posedă 3 activități
(paraoxonazică, arilesterazică și lactonazică), care sunt însă influențate de factori de
mediu și de polimorfisme ale genei care o codifică. Concentrația serică a PON1 este utilă
pentru a verifica statusul enzimei, însă nu a fost evaluată niciodată la pacienți cu FGNA
sau SHNA.
Puține studii au evaluat statusul PON1 la pacienți cu FGNA și/sau SHNA. Studii pe
diverse loturi de pacienți cu afecțiuni hepatice cronice (inclusiv FGNA) au arătat că
activitățile serice ale PON1 sunt scăzute la acești pacienți, făcându-i predispuși la
acumularea de peroxizi lipidici și agravându-le astfel afectarea hepatică prin stres
oxidativ.
Cele trei studii care fac obiectul prezentei cercetări sunt efectuate pe diferite
cohorte de pacienți cu SHNA. Scopul acestora a fost de a evalua concentrația serică a
PON1 și profilul genetic (polimorfismele PON1), pentru a stabili dacă acestea sunt
modificate la pacienții cu SHNA comparativ cu subiecți sănătoși. Totodată, am căutat
posibile asocieri între concentrația serică a PON1 și scoruri non-invazive de fibroză și
steatoză hepatică. În ultimul studiu am evaluat și posibila asociere între un marker de
fibroză hepatică (periostina) și aceste scoruri.
Evidențierea unei posibile relații între PON1 și SHNA ar putea deschide noi
direcții de cercetare, care ar putea ulterior dovedi faptul că PON1 poate fi un marker al
prezenței SHNA. Astfel, alături de alți markeri biochimici/genetici, PON1 ar ajuta la
conceperea unui scor cu o sensibilitate cât mai aproape de 100%, capabil să stabilească
în mod non-invaziv diagnosticul SHNA, cu o acuratețe cel puțin la fel de bună ca biopsia
hepatică.

47
2. Metodologie generală
2.1. Material şi metodă
Studiile care fac parte din acest capitol au avut un design de tip analitic,
observaţional, prospectiv, transversal, de tip caz-control sau de cohortă.
Studiul a fost inițiat cu aprobarea Comisiei de Etică a Universității de Medicină și
Farmacie „Iuliu Hațieganu” Cluj-Napoca, Nr. 404/02.07.2015.
Subiecţii incluși în studii au fost informați asupra beneficiilor și riscurilor
includerii lor în studiu, fiecare semnând un formular de consimţământ informat, creat
în concordanță cu Declarația de la Helsinki. Aceștia erau internați la momentul includerii
în studiu în Spitalul Clinic Căi Ferate Cluj-Napoca pentru evaluare multidisciplinară.
Cercetările au fost conduse pe loturi de pacienți diagnosticați clinic și ecografic
cu FGNA, la care s-a stabilit diagnosticul de SHNA fie prin biopsie hepatică, fie prin
excluderea sistematică a unor alte potențiale cauze de hepatocitoliză persistentă (timp
de peste 6 luni, la minim 2 măsurători diferite cu distanță de 6 luni între ele).
Deși diagnosticul de certitudine al SHNA a rămas chiar și la momentul redactării
acestei lucrări biopsia hepatică, aceasta nu a putut fi realizată pentru toți pacienții care
au fost incluși în studiu, în principal din cauza reticenței acestora față de această
procedură diagnostică invazivă.
În redactarea din 2015 a proiectului de cercetare, am hotărât să nu definesc SHNA
doar prin biopsie hepatică, deoarece încă din 2012 procedura era menționată ca fiind
nefezabilă în practica clinică, susceptibilă unor erori în prelevare sau interpretare,
potențial cauzatoare de complicații, scumpă și dificil de evaluat în dinamică194. Astfel,
excluzând sistematic pentru toți pacienții consumul semnificativ de alcool (≥30 g/zi
pentru bărbați și ≥20 g/zi pentru femei, după cum era descris în lucrarea Asociației
Europene pentru Studiul Ficatului195), expunerea la substanțe potențial toxice hepatice
(inclusiv unele medicamente cunoscute hepatotoxice) și dovedind absența celorlalți
markeri de afectare hepatică (virală, autoimună, pentru boala Wilson, hemocromatoză,
colangită biliară primitivă/colangită sclerozantă primară etc.), am considerat prin
excludere SHNA ca fiind etiologia responsabilă de sindromul de hepatocitoliză
persistent al pacienților noștri.
2.1.1. Măsurătorile antropometrice şi examenul clinic
Fiecare subiect inclus în cele 3 studii a fost evaluat anamnestic și prin examen
obiectiv complet. Au fost înregistrați o serie de parametri și au fost notate sexul, vârsta,
prezența sau absența antecedentelor familiale de boli cardiovasculare (rudă de gradul I
cu infarct miocardic înainte de 55 de ani pentru bărbați și înainte de 65 de ani pentru
femei; rudă de gradul I cu accident vascular cerebral), statusul de fumător. De asemenea,
pentru fiecare subiect s-a notat înălțimea și greutatea, și s-a calculat indicele de masă
corporală (IMC), aplicând formula greutate (exprimată în kilograme) raportată la
înălţime (exprimată în metri pătraţi).

Circumferinţa abdominală a fost apreciată cu ajutorul unui taliometru, subiecţii
fiind în poziţie de ortostatism. Măsurarea s-a făcut prin aplicarea benzii gradate la
mijlocul distanţei între spina iliacă antero-superioară și rebordul costal ipsilateral,
pacienţii fiind în expir maxim. Obezitatea abdominală a fost notată pentru subiecţii care
aveau circumferinţa taliei >94 cm (bărbaţi) şi >80 cm (femei), conform ghidului pentru
sindrom metabolic din 200933. Am măsurat tensiunea arterială şi frecvenţa cardiacă
după un repaus de 3 minute al subiecților în poziţie şezândă.
2.1.2. Eşantioanele sangvine
Pentru fiecare subiect, s-au recoltat mostre de sânge dimineaţa, după minim 12
ore de repaus alimentar. S-au utilizat vacutainere specifice (fără anticoagulant) pentru
determinarea parametrilor de biochimie, și vacutainere pentru prepararea mostrelor de
ser (prin centrifugarea sângelui proaspăt timp de 3 minute la 3000 rpm). Acestea au fost
imediat îngheţate la -20°C, ulterior fiind depozitate la -80°C, până în momentul în care
au fost prelucrate pentru analize specifice. Extracția ADN-ului genomic din sânge
proaspăt va fi detaliată la secțiunea care descrie determinările genetice ale PON1.
Extracția ADN și determinările genetice au fost efectuate în cadrul Laboratorului
Disciplinei de Farmacologie, Toxicologie și Farmacologie Clinică al UMF „Iuliu
Hațieganu” Cluj-Napoca și în cadrul Departamentului Explorări Genetice al Institutului
Oncologic „Prof. Dr. Ion Chiricuță” Cluj-Napoca. Parametri clasici de biochimie și
hemoleucogramă au fost dozaţi utilizând diferite kit-uri comerciale pentru analizorul
Konelab Prime 60i (ThermoScientific, SUA), din cadrul Laboratorului Spitalului Clinic
Căi Ferate Cluj-Napoca. Concentrația PON1, a hs-CRP, a citokinelor și a periostinei au
fost determinate în Laboratorul Disciplinei de Farmacologie, Toxicologie și
Farmacologie Clinică al UMF „Iuliu Hațieganu” Cluj-Napoca.
2.1.3. Evaluarea ultrasonografică hepatică
Diagnosticul ultrasonografic al steatozei hepatice sau a absenței acesteia s-a
efectuat de către același medic experimentat în ecografie abdominală. Subiecții au fost
evaluați dimineața, aflându-se în status à jeun. A fost utilizat un transductor convex
pentru un aparat de ultrasonografie Aloka Prosound Alpha 7 Premier, din cadrul
Spitalului Clinic Căi Ferate Cluj-Napoca. Prezența steatozei a fost validată prin aspectul
ecografic hiperecogen al ficatului (bright liver echo pattern – BLEP), descris în 2015 în
Hepatology de către Petta și colab196. Gradul de severitate al steatozei hepatice a fost
apreciat utilizând descrierea din același studiu. Astfel, steatoza ușoară a fost
recunoscută printr-o ușoară creștere a ecogenității hepatice, o ușoară exagerare a
discrepanței ecografice hepatice și renale și păstrarea relativă a ecourilor din pereții
venei porte. Steatoza moderată a fost acompaniată de pierderea ecourilor din pereții
venei porte, și în special din ramurile periferice, rezultând un aspect fără caracteristici
particulare al ficatului. În plus, s-a constatat o mai mare atenuare posterioară, precum
și o mai mare discrepanță între aspectul ecografic al parenchimului hepatic și renal.
Steatoza severă a fost recunoscută printr-o reducere mai mare a penetrării fasciculului,

49
pierderea ecourilor din cea mai mare parte a peretelui venei porte, inclusiv din ramurile
principale ale acesteia și o mai importantă discrepanță între aspectul ecografic hepatic
versus renal196.
2.2. Determinări biochimice
2.2.1. Determinarea concentrației serice a PON1
Deoarece PON1 prezintă 3 activități principale (paraoxonazică, arilesterazică și
lactonazică) care sunt relativ dificil sau chiar periculos de evaluat în laborator (de
exemplu pentru evaluarea activității paraoxonazice se măsoară rata hidrolizei
paraoxonului – substanță toxică)110, am optat pentru aprecierea funcției serice a enzimei
prin determinarea concentrației ei serice. Aceasa se poate face actualmente utilizând
tehnici moderne semi-automate (utilizând tehnica ELISA), care încep să înlocuiască kit-
urile non-ELISA utilizate în ultimele două decade113. Astfel, în prezentele studii,
concentrația serică a PON1 a fost determinată utilizând kit-uri ELISA (Abbexa, SUA),
care utilizează o tehnologie de testare imuno-sorbent legată de enzimă sandwich.
Conform indicațiilor producătorului, au fost pregătite plăcile (care erau pre-acoperite
cu anticorpi specifici) cu serul subiecților și incubate. Din adăugarea reactivilor se obține
o reacție de culoare, intensitatea culorii galbene fiind direct proporțională cu cantitatea
de PON1 din fiecare sondă a plăcii. Densitatea optică a fost ulterior măsurată
spectrofotometric la 450 nm într-un cititor de microplăci (Multiskan Sky, Thermo
Scientific, SUA), permițând calcularea concentrației PON1.
2.2.2. Determinarea citokinelor și a hs-CRP
Pentru studiul 3, am determinat atât concentrația serică a proteinei C-reactive
înalt specifice (hs-CRP) și concentrațiile serice ale unor citokine pro-inflamatorii (IL-6,
TNF-α) și a citokinei anti-inflamatorii IL-10. Acestea au fost evaluate utilizând kituri
ELISA (Abbexa, SUA), respectând indicațiile de utilizare furnizate de către producător
pentru fiecare dintre acestea.
2.2.3. Determinarea valorilor Periostinei serice
În studiul 3 al tezei, am efectuat determinarea unui potențial marker de fibroză
hepatică, Periostina (POSTN). Aceasta este o proteină a matricei extracelulare secretată
predominant de către osteoblaști, cu roluri în formarea osoasă, remodelare tisulară,
proliferare, inflamație ș.a. Unele studii au arătat asocieri ale acestei proteine cu diverse
afecțiuni, inclusiv cu hepatopatii care evoluează cu inflamație și fibroză197. Deoarece
unele studii au indicat că POSTN poate fi un nou mediator al progresiei fibrozei
hepatice198, am inclus această proteină alături de PON1 pentru a efectua corelații între
nivelurile serice ale acestora și gradul de fibroză hepatică evaluat prin scoruri non-
invazive pentru FGNA.
Nivelurile serice ale POSTN au fost determinate utilizând kit-uri ELISA (Abbexa,
SUA), care utilizează o tehnologie de testare imuno-sorbent legată de enzimă sandwich,

concentrația POSTN fiind calculată din densitatea optică măsurată spectrofotometric la
450 nm într-un cititor de plăci ELISA.
2.3. Determinarea polimorfismelor genetice ale PON1
2.3.1. Recoltarea sângelui pentru izolarea ADN
Pentru fiecare subiect inclus în studiu, s-au recoltat 300μl de sânge venos, în
vacutainere care conțineau EDTA. Probele de sânge proaspăt au fost lucrate în aceeași
zi sau în maxim 48 de ore de la recoltare (timp în care eprubetele au fost ținute la frigider
la temperatura de 4°C), pentru a nu se altera ADN-ul și a se obține rezultate cât mai bune
în timpul procesului de izolare a ADN-ului. Astfel, am asigurat o calitate optimă a ADN-
ului rezultat, utilizat ulterior pentru testările genetice.
2.3.2. Purificarea ADN-ului genomic
Izolarea și purificarea ADN-ului subiecților a fost efectuată utilizând kit-uri
Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega, SUA). Într-un prim moment, atât
probele de sânge integral cât şi reactivii de utilizat au fost aduși la temperatura camerei
(TC), temperatură la care au fost efectuate ulterior toate centrifugările.
În fiecare tub steril de tip Eppendorf s-au introdus 300 μl sânge integral recoltat
pe EDTA, peste care s-au adăugat 900 μl soluţie de liză celulară (Cell Lysis Buffer, CLB).
Omogenizarea s-a efectuat printr-o centrifugare de durată scurtă, după care probele au
fost incubate timp de 10 minute la TC. Ulterior, s-au centrifugat timp de 20 secunde, iar
supernatantul s-a îndepărtat. Peletul a fost vortexat alte 20 de secunde pentru a obţine
un aspect complet alb; dacă părea că mai conţine hematii, s-a repetat operațiunea de mai
sus, adăugându-se CLB și centrifugând, până la obţinerea unui pelet alb. Apoi, s-au
adăugat 300 μl de soluţie de liză a nucleilor (Nuclei Lysis Buffer, NLB) și soluția s-a
amestecat până a devenit vâscoasă. Dacă aspectul sugera prezența de coaguli, soluția era
incubată la 37°C până la dezintegrarea respectivelor cheaguri. Dacă aceştia persistau
după 1 oră de la inițierea incubației, s-a adăugat alți 100 μl NLB, repetând procedura;
peste soluția rezultată s-au adăugat apoi 100 μl de soluţie de precipitare a proteinelor
(Protein Precipitation Solution, PPS). Amestecul era ulterior vortexat timp de 20
secunde, și mai apoi centrifugat timp de 10 minute, până la apariţia unui pelet brun
(fragmentele proteice).
În alte tuburi Eppendorf sterile de 1,5 ml (conţinând 300 μl de izopropanol rece)
s-a transferat ulterior supernatantul. Acestea s-au amestecat cu atenție și s-au
centrifugat timp de 10 minute. Astfel, s-a obţinut ADN, vizibil sub forma unui pelet alb.
După îndepărtarea supernatantului, s-a adăugat un volum de 300 μl de etanol 70%,
centrifugând ulterior din nou timp de 10 minute şi aspirând ulterior etanolul cu ajutorul
unei pipete. Peletul de ADN a fost ulterior uscat la TC timp de aproximativ 30 de minute,
în același tub cu capacul deschis.
În cele din urmă, s-au adăugat 100 μl de soluţie pentru rehidratarea ADN-ului
(Rehydration Solution, RS) şi s-au incubat probele timp de 24 ore la 4°C. ADN-ul astfel

51
rezultat (între 5-15 μg) a fost păstrat ulterior pe termen lung la -20°C, până la utilizarea
probelor pentru analiza genetică.
2.3.3. Măsurarea purităţii şi concentraţiei ADN
Utilizând un spectrofotometru Nanodrop1000 (ThermoFisher Scientific, SUA), s-
au citit extincțiile din câte 2 μl din probele de ADN. S-au citit extincţiile la 260 nm
(lungimea de undă care corespunde maximului de absorbție pentru acizii nucleici) şi
280 nm (lungimea de undă care corespunde maximului de absorbţie pentru proteine şi
compuşi aromatici), notând raportul dintre acestea (afişat pe ecranul
spectrofotometrului, un raport ≥1,80 indicând un ADN pur).
Citind concentraţiile probelor de ADN afișate pe spectrofotometru, s-a constatat
că din fiecare probă exista o cantitate suficientă de ADN pur (≥50 ng/μl), necesară
ulterior pentru genotipare.
2.3.4. Genotiparea PON1 Q192R și PON1 L55M
Principiul metodei a fost adaptat după tehnica utilizată de către Akkiz și colab. în
2013, pe un lot de pacienți cu hepatocarcinom199. Aceștia au utilizat metoda descrisă în
detaliu în lucrarea din 2011 a lui Rajkovic și colab105. Genotiparea a presupus analiza
probelor utilizând tehnica Polymerase chain reaction-restriction fragment length
polymorphism (PCR-RFLP) și ulterior electroforeza pe gel de agaroză a fragmentelor
rezultate.
Tehnica de lucru a presupus la început aducerea ADN-ului la TC și prepararea
amestecului pentru PCR. Pentru Q192R, acesta a fost compus din DNA Master Mix
(DreamTaq PCR MasterMix, Thermo Fisher Scientific, SUA), primer forward - 5'-TAT-
TGT-TGC-TGT-GGG-ACC-TGA-G-3' și reverse - 5'-CCT-GAG-AAT-CTG-AGT-AAA-TCC-
ACT-3' (Eurogentec, Belgia) şi bovine serum albumin (BSA, Thermo Scientific, SUA).
Pentru L55M, acesta a fost compus din DNA Master Mix (DreamTaq PCR MasterMix,
Thermo Fisher Scientific, SUA), primer forward 5'-GAA-GAG-TGA-TGT-ATA-GCC-CCA-3'
și reverse 5'-TGA-AAG-CCA-GTC-CAT-TAG-GC-3' (Eurogentec, Belgia) şi BSA (Thermo
Scientific, SUA).
Preparatul a fost împărțit în tuburi PCR de 0,2 ml, peste care s-a adăugat 1 l ADN
(în fiecare tub). Ulterior, tuburile au fost introduse în aparatul de amplificare PCR
GeneAmp PCR System 9700 thermocycler (Applied Biosystems, SUA), urmând a începe un
protocol de amplificare în mai multe etape. Astfel, după denaturarea inițială de câte 3
minute la 94°C, s-a efectuat amplificarea prin 35 de cicluri succesive (30 de secunde la
95°C, 20 de secunde la 60°C și 50 de secunde la 72°C), în final realizându-se elongarea
finală (10 minute la 72°C) și ulterior răcirea (20 minute la 4°C).
Fiecare produs PCR a fost lăsat peste noapte pentru digestie enzimatică (la 37°C),
utilizând 5U Alwl endonuclează de restricție (Thermo Scientific, SUA) în 1,1l buffer
Tango (pentru 192R) și 5U NlaIII endonuclează de restricție (Thermo Scientific, SUA) în
1,1l buffer G (pentru L55M). Ulterior, s-a realizat electroforeza pe gel de agaroză 2%

8 teza de doctorat final milaciu vasile mircea

8 teza de doctorat final milaciu vasile mircea

Recommended

Recommended

More Related Content

What's hot

What's hot (8)

Similar to 8 teza de doctorat final milaciu vasile mircea

Similar to 8 teza de doctorat final milaciu vasile mircea (20)

More from PopescuAnca8

More from PopescuAnca8 (20)

8 teza de doctorat final milaciu vasile mircea