Dokumen tersebut memberikan penjelasan tentang pengecatan sitokimia pada leukemia yang dapat membantu diagnosis dan klasifikasi tipe leukemia. Beberapa metode pengecatan yang dijelaskan antara lain mieloperoksidase, sudan black, PAS, LAP, dan nonspesifik esterase, beserta prinsip, reagen, dan interpretasi hasilnya.

1. 09/14/11 TUTOR HEMATOLOGI

2. Pembimbing YETTY HERNANINGSIH LABORATORIUM / INSTALASI PATOLOGI KLINIK FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS AIRLANGGA RSU Dr. SOETOMO SURABAYA 2009 Oleh : PANTJARARA B. TUTOR HEMATOLOGI PENGECATAN SITOKIMIA PADA LEUKEMIA 09/14/11

3. 09/14/11 PENDAHULUAN Pemeriksaan morfologi darah, membantu diagnosis dan klasifikasi leukimia. Abnormalitas atau imaturitas dari sel sering sulit diidentifikasi tipenya dengan tepat.

4. Pengecatan sitokimia pada leukemia dapat membantu membedakan tipe satu sel dengan yang lain, terutama membedakan antara leukimia Limfoid dan Mieloid. 09/14/11

5. Pasien dengan tipe laukemia tertentu diklasifikasikan sehubungan dengan penentuan tindakan pengobatan yang akurat dan prognosis yang lebih baik. Klasifikasi FAB membagi leukamia akut m enjadi 2 kelompok yaitu: 1. Acute Myeloid Leukemia, di bagi menjadi: M0 AML, diferensiasi minimal M1 AML, tanpa maturasi M2 AML, dengan maturasi M3 Leukemia Promielositik Akut, hipergranuler M3v Leukemia Promielositik Akut varian, mikrogranuler M4 Leukemia Mielomonositik Akut M4eo Leukemia Mielomonositik Akut, dengan eosinifilia M5a Leukemia Monoblastik Akut, dengan diferensiasi rendah M5b Leukemia Monoblastik Akut, dengan diferensiasi baik M6 Eritroleukimia Akut M7 Leukemia Megakarioblastik Akut 09/14/11

6. 09/14/11 2. Acut Liymphoblastic Leukemia, dibagi menjadi 3 tipe yaitu: - L1, - L2 dan - L3.

7. Pengecatan sitokimia : Sudan black, Periodic acid-Schiff (PAS), Terminal deoxynucleotidyl tranferase (TdT), Leukocyte alkaline phosphatase (LAP), Tartrate-resistent acid phosphatase (TRAP), Myeloperoxidase, Leukocyte spesific esterase dan Leukocyte nonspecific esterase. 09/14/11

8. Masing-masing metode mempunyai spesifikasi dan mekanisme terjadinya hasil positif (+) dan negatif (-). Pada tugas tutor ini: Myeloperoxidase, Sudan black, Periodic acid-Schiff (PAS), Leukocyte Alkaline Phosphatase dan Non Spesific Esterase. 09/14/11

9. Tujuan Pemeriksaan Sitokimia: -M embedakan antara leukimia Limfoid dan Mieloid, -diagnosis dan klasifikasi Leukemia Mielositik Akut. 09/14/11

10. Pengecatan S itokimia 09/14/11 1 Mieloperoksidase Prinsip: Enzim peroksidase mengkatalisis oksidasi substrat dengan adanya hidrogen peroksida membentuk presipitat warna coklat . SH 2 +H 2 O 2 ═S+2H2O Mieloperoksidase terdapat pada: granula dari sel netrofil, eosinofil dan monosit.

11. Reagen: Fiksasi: Formal aseton bufer. BFA (Buffered Formal Aceton) Substrat: 3,3` diaminobenzidine tetrachloride (DAB) H 2 O 2 ( Hidrogen peroksida, 30% w/v). Bufer: Sorensen’s phosphate buffer pH 7,3 Counterstain: Aquous haematoxylin 09/14/11

12. Metode: Hapusan difiksasi dalam buffer formal aseton selama 45 detik. Bilas dengan air kran dan keringkan. Inkubasi dalam larutan substrat selama10 mnt. Campur 30 mg DAB dalam 60ml bufer, tambahkan H 2 O 2 120 µl Bilas dengan air kran. Counterstain dengan Carazzi`s hematoksilin 1 menit. Bilas dengan air kran dan keringkan. 09/14/11

13. Interpretasi: Pengecatan myeloperoksidase membedakan antara sel-sel immatur pada leukemia mieloblastik akut (+) dan pada leukemia limfoblastik akut (-). Mieloperoksidase terdapat pada netrofil, eosinofil dan monosit. Sel-sel Limfoid dan eritroid tidak memiliki enzim dengan aktifitas peroksidase. Sel eosinofil positif kuat (+). Sel basofil, limfosit dan seri eritrosit memberi hasil negatif (-). Pada sel monosit: ada granula halus, tidak begitu terang seperti granulosit, monosit negatif(-) atau positif (+). Pada AML (Leukimia mielositik akut) lebih dari 5% sel muda hasil positif(+). 09/14/11

14. 2 Pengecatan dengan sudan black Prinsip: Sudan Black mewarnai granula sitoplasma yang mengandung fosfolipid intraseluler dan lipid yang ada dalam lekosit darah, berwarna coklat hitam. 09/14/11

15. Reagen: Sudan Black B. Bufer fenol. Working stain solution. Tambahkan 40 ml buffer ke dalam 60 ml Sudan Black B. Counterstain: May-Grunwald-Giemsa atau Leishman stain 09/14/11

16. Metode: Fiksasi dalam formalin selama15 menit. Bilas dengan cepat dengan air kran dan keringkan. Celupkan dalam working stain selama satu jam. Cuci dengan etanol 70%. Counterstain dengan Leishman`s atau MGG (May -Grunwald-Giemsa) 09/14/11

17. Interpretasi: Hasil reaksi: granuler berwarna hitam. Membedakan antara leukemia limfoblastik akut (-) dan leukemia myeloblastik akut (+). Umumnya sel dengan peroksidase positif (+) memberi reaksi positif (+) pada pewarnaan Sudan black. Seri mielosit stadium muda granula sitolplasma berwarna hitam coklat (agak pucat). Stadium matang netrofil mempunyai granula coklat hitam (yang jelas). Monosit (+) lemah, berwarna hitam coklat. Limfosit dan Limfoblas negatif (-). Basofil (-)/ bright red/purple metakromasi. Megakariosit, eritroblas, normoblas dan trombosit (-). 09/14/11

18. 09/14/11 Kelebihan sudan black kdibanding mieloperoksidase: dapat menggunakan hapusan darah atau sumsum tulang yang lebih lama dan hasilnya lebih awet.

19. 3 Periodic-Acid Schiff (PAS) Prinsip: Pewarnaan PAS ( periodic acid-schiff ) untuk mendeteksi glikogen dan mukopolisakarida intraseluler. Reaksi yang terjadi adalah oksidasi glikogen oleh periodic acid menjadi dialdehida, kemudian dialdehida bereaksi dengan reagen schiff membentuk warna merah . 09/14/11

20. 09/14/11 Reagen: Fiksasi: Metanol Periodic-acid solution. Reagen schiff : basic fuchsin Caunterstain:aqueous Haemtoxylin.

21. Metode: Fiksasi selama15 mnt dalam metanol. Bilas dengan cepat dengan air kran. Tambahkan Periodic-acid solution selama10 mnt. Cuci dengan air kran dan keringkan. Celupkan dalam reagen Schiff`s basic fuchsin selama 30 mnt. 6. Cuci gengan air kran. 7. Counterstain Carazzi`s aqueous Haematoxylin selama 5-10 mnt. 09/14/11

22. Interpretasi: Hasil reaksi adalah mulai dari pink sampai dengan merah terang. Pengecatan PAS dapat digunakan pada identifikasi eritroleukimia, suatu leukemia dengan sel darah merah yang immatur.->(+) kuat Granulosit prekursor positif lemah, lebih nyata pada stadium matang. Pengecatan PAS tampak pada sel-sel muda pada akut limfoblastik maupun akut mielogenik leukimia. 09/14/11

23. Leukosit Alkalin Fosfatase (LAP) Prinsip: Pada granula neutrofilik terdapat enzim fosfatase yang mampu menghidrolisis substrat yang megandung naptol fosfat menjadi produk yang berikatan dengan zat wana membentuk komplek warna biru. Substrat mengandung naptolfosfat -> hidrolisis->naptol+ azodye 09/14/11

24. 09/14/11 Aktifitas Alkalin fosfatase ditemukan dalam sitoplasma: Netrofil, osteoblas, sel endotelial vaskuler, dan limfosit. Kadar alkalin fosfatase netrofil dalam darah perifer dihitung sebagai skor LAP (Leukocyte Alkaline Phosphatase). Leukocyte Alkaline Phosphatase merupakan enzim yang terdapat dalam granula sekunder dari sel Polimorfonuklear.

25. Reagen : Fiksasi : Metanolformalin 4% Substrat : Naphtol AS phosphate Buffer : Tris buffer 0,2 mol/L pH 9,0 Stock substrate solution : Larutkan naphtol AS phosphate dalam N,N- dimethylformaldehide. Tambahkan Tris buffer 100 ml 0,2 mol/l, pH 9,1. Coupling azo-dye : garam Fast Blue BB Counterstain : Aqueous Netral red 0,02%. 09/14/11

26. Metode: Fiksasi hapusan darah selama 30 detik dalam formalin metanol 4% Bilas dengan air kran dan keringkan Siapkan larutan working substrat: stock substrate solution 40ml. Tambahkan Fast Blue BB 24mg. Inkubasi selama 15 menit. Bilas dengan air kran dan keringkan. Counterstain selama 3 menit dalam Aqueous neutral red , bilas dengan cepat dan keringkan. 09/14/11

27. 09/14/11 Hapusan darah harus segera dibuat sebelum 30 menit, sebab aktifitas lekosit alkali fosfatase menurun dengan cepat pada pengunaan EDTA. Hapusan harus segera dicat dalam waktu 6 jam.

28. Interpretasi: Leukocyte Alkaline Phosphatase (LAP) dapat diukur secara kasar dengan menentukan skor ukuran dan intensitas granula yang terwarnai. Normal :15-130, nilai yang mungkin mulai 0 maksimal 400 Penghitungan pada 100 sel netrofil Intensitas pewarnaan: 0 (tanpa pewarnaan) sampai dengan 4 (pewarnaan kuat dan dalam). 0 Negatif, tanpa granula, sitoplasma tidak tercat. 1 Positif lemah, granula jarang. 2 Positif lemah, jumlah granula sedang. 3 Positif kuat, granula banyak. 4 Positif sangat kuat dengan banyak granula kasar dalam sitoplasma, sering menutupi nukleus. 09/14/11

29. 09/14/11 Kondisi yang berhubungan dengan skor abnormal Leukosit Alkalin Fosfatase Skor LAP < 15 CML Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria Hematologic neoplasms Myelodysplastic syndromes Infeksi atau keracunan Skor LAP >130 Infeksi Growth factor theraphy Myeloproliferative disorder selain CML Inflammatory disorders Kehamilan, kontrasepsi oral Stress obat (lithium, korticosteroid, estrogen)

30. Nonspesific (alpha-naphthyl butirate or alpha-naphthyl acetate) Esterase Pengecatan non spesific esterase digunakan untuk identifikasi sel monosit tetapi tidak untuk granulosit atau eosinofil. Limfosit T matur yang tercat dengan karakteristik fokal, dotlike pattern . 09/14/11

31. 09/14/11 Prinsip: Lekosit esterase merupakan kelompok enzim yang menghidrolisis acyl atau chloroacyl ester dari α - naphtol atau naphtol AS. Perbedaan pemeriksaan antara alpha-naphthyl butirate dan alpha-naphthyl acetate Esterase : pada substrat spesifik dan pH.

32. 09/14/11 α- Naphtyl butyrate esterase Reagen: Fiksasi: Buffered Formalin aseton Bufer: Bufer fosfat 100 mmol/L pH 8,0 Substrat: α - Naphtyl butyrate 100µL dalam 5ml aseton Coupling reagent: Fast garnet GBC 15 mg atau Fast Blue BB Counterstain: aqueous haematoxylin

33. 09/14/11 Metode: 1. Fiksasi: formalin aseton 30 detik 2. Bilas dgn air kran dan keringkan 3. Tambahkan Fast Garnet GBC pada bufer 4. Tambahkan 0,5 ml α - naphtol butyrate atau larutan aseton 5. Inkubasi selama 20-40 mnt 6. Bilas dengan air kran. 7 . Counterstain: Aqueous haematoksilin selama 1-5 mnt

34. 09/14/11 Interpretasi: Hasil reaksi granuler coklat Mayoritas monosit (>80%) tercat kuat. Netrofil, eosinofil, basofil dan platelet negatif (-) Limfosit B (-), T tidak tercat. Pada bone marrow : monosit dan makrofag teracat kuat. α – Naphtol butyrate lebih spesifik untuk identifikasi komponen monosit dalam AML dari pada α - Naphtol acetate.

35. 09/14/11 α- Naphtyl acetate esterase Reagen : Fiksasi : Buffered Formalin aseton Bufer : Bufer fosfat 66 mmol/L pH 6,3 Substrat : α - Naphtyl acetate 100µL dalam 5ml etilen monometil eter. Medium inkubasi. Coupling reagent: pararosaniline Counterstain: aqueous haematoxylin

36. 09/14/11 Metode: 1. Fiksasi: formalin aseton 30 detik 2. Bilas dgn air kran dan keringkan 3. Celupkan slide dalam medium inkubasi selama 30-60 mnt. 4. Bilas dengan air kran dan keringkan. 5. Counterstain: Aqueous haematoksilin selama 2-5 mnt

37. 09/14/11 Interpretasi Hasil reaksi: warna merah/coklat rata. Monosit normal dan lekemik tercat kuat Granulosit normal negatif (-) Mielodisplasi atau AML positif (+). Megakarioblas lekemik (+) Limfosit, Limfoblas T (+) dotlike Leukaemic eritroblast (+)

38. 09/14/11 Internet atlas of hemayology NORMAL HEMOPOIETIC CELLS IN CYTOCHEMICAL STAINS Peroxidase reaction Peroxidase reaction S udan black B reaction

39. 09/14/11 PAS reaction PAS reaction AS-D-chloroacetate esterase reaction Butyrate esterase reaction Internet atlas of hematology

40. 09/14/11 MPO (-) Sudan Black (-) PAS (-) PAS (+) Data pasien

41. CONTOH HASIL POSITIF Reaksi Peroksidase. Granulosit positif kuat pada sel leukemia. Pembesaran 1000X Reaksi Peroksidase pada sumsum tulang. Pembesaran 1000X. 09/14/11 Internet atlas Leukemia library

42. Sudan Black B pada sumsum tulang (Leukemia Mielositik akut) (FAB M1) 09/14/11 Sudan Black B (Leukemia Promielositk Akut) Internet atlas Leukemia library

43. 09/14/11 Granula kasar, PAS positif pada sitoplasma. Pembesaran 1000X. Granula kasar, PAS positif dalam sitoplasma limfoblas sumsum tulang. Pembesaran 1000X. Internet atlas Leukemia library

44. Reaksi Alpha- Naphthylacetae esterase pada sumsum tulang. Limfoblas negatif. Pembesaran 500X. 09/14/11 Neutrophyl Alkaline Phosphatase. Positif kuat ( 4+) dan positif sedang (3+ dan 2+) Internet atlas Leukemia library

45. Reaksi Alpha- Napthylacetate esterase pada darah perifer, sel leukemia positif kuat. Pembesaran 1000X. Dengan aktifitas yang sangat tinnggi pada sel leukemia. Pembesaran 1000X. 09/14/11 Internet atlas Leukemia library

46. 09/14/11 LAP, A=0 LAP, B=1+ LAP, C=2+ Wintrobe’s

47. 09/14/11 LAP, D=3+ LAP, E=4+ Wintrobe’s

48. 09/14/11 G= PAS, granula positif pada malignant lymphoid cell (sezary syndrom) H= PAS, sel ALL dengan granula kasar Wintrobe’s

49. 09/14/11 I= Peroksidase, Granula biru dari sitoplasma mieloblas pada pasien acute myeloblastic leukemia J= Peroksidase, Granula matur warna biru Wintrobe’s

50. 09/14/11 K= Sudan Black L= Non spesifik esterase, monosit dan monoblas dengan sitoplasma warna coklat orange Wintrobe’s

51. 09/14/11 M= Chloroasetate esterase , promielosit dengan sitoplasma warna maroon, pada pasien AML Wintrobe’s

52. 09/14/11 Color atlas hematologi Harald Theml dkk Histochemical Features of AML FAB HISTOCHEMISTRY M1 Occasional peroxidate+ granules, PAS- M2 Strongly peroxidase+, PAS- M3 Strongly peroxidase+, PAS- M4 Strongly peroxidase+, some cells may be PAS+ M5 Many be peroxidase+ and PAS+, nonspecific esterase stains are strongly + . M6 Red cell precursors are PAS+, ringed sideroblasts are seen with iron stains M7 Variable, platelet peroxidase can be demonstrated by electron microscopy

53. 09/14/11 E.N Kosasih H asil tes sitokimia pada AML dan ALL Jenis tes sitokimia AML Klasifikasi FAB M0 M1-3 M4 M5 M6 M7 ALL Mieloperoksidase - + + - - - - Chloroacetate - + + +/- - - - α - naphtol acetate - - + + - +/- - Sudan Black B - + + - - - - PAS - - +/- +/- + - +

54. 09/14/11

55. 09/14/11 2. Acut Liymphoblastic Leukemia, dibagi menjadi 3 tipe yaitu: L1: ALL dengan sel limfoblas kecil-kecil dan merupakan 84% dari ALL. L2: ALL sel lebih besar, inti ireguler, kromatin bergumpal, nukleoli prominen dan sitoplasma agak banyak. Merupakan 14% dari ALL. L3: ALL mirip dengan limfoma burkitt, yaitu sitoplasma basofil dengan banyak vakuola, 1% dari ALL.

56. 09/14/11 Pengecatan sitokimia: Merupakan suatu metode yang digunakan dalam pengecatan pada sampel darah dengan berdasarkan reaksi dan menggunakan bahan-bahan kimia

57. 09/14/11 Metode: Non spesifik esterase 1, Hapusan difiksasi dengan udara kering dalam paparan formalin ->4 menit 2 . Bilas dengan air suling dan keringkan 3. Inkubasi dalam chloroacetate substrate solution -> 5-15menit ->suhu kamar. 4. Bilas dengan air suling dan keringkan. 5.Inkubasi dalam butyrate substrate solution -> 15-30menit-> suhu ruangan dan hindari sinar. 6 . Bilas dengan air suling 7. Caunterstain dalam aqueous haematoxylin -> 5 menit 8. Bilas dengan air suling keringkan dan periksa.

58. 09/14/11 Isoenzim dibagi dalam 2 kelompok: Bands 1,2,7,8 dan 9 berhubungan dengan sterase spesifik dai netrofil khususnya pengecatan dengan naphtol AS-D chloroacetate sterase (chloroacetate esterase, CAE). Bands 3, 4, 5 dan 6 berhubungan dngan non spesifik esterase (NSE) pengecatan dengan α - naphtyl acetae esterase (ANAE) dan α - naphtyl butirat esterase. MPO terdapat pada granula primer dan sekunder dari netrofil, dan prekursornya di granula eosinofil dan di granula azurofilik dari monosit. MPO pada granula eosinofil, resiste terhdap sianida, dimana pada netrofil dan monosit sensitif.

59. Interpretasi: Pengecatan non spesific esterase ->identifikasi sel monosit tidak untuk granulosit atau eosinofil. Pengecatan limfosit T matur ->karakteristik fokal, dotlike pattern . Selain pada monosit, reaksi juga terjadi pada : makrofag, histiosit, megakariosit, dan beberapa sel karsinoma. Pengecatan alpha naphthyl butyrate -> lebih spesifik ->kurang sensitif, dari pada alpha- naphthyl acetate . Perbedaan pengecatan dengan esterase: pada megakarioblas, yang tidak tercat dengan alpha naphthyl butyrate tetapi tercat dengan substrat alpha- naphthyl acetate. 09/14/11

60. 09/14/11 Sel-sel dengan granula primer -> promielosit->azurofilik ->netrofil, eosinofil, basofil dapat dilihat hanya degan Elektron mikroskop. Granula sekunder->mielosit Granula sekunder->alkali fosfatase Granula tersier->tampak pada akhir mielosit-> pada human netrofil

61. 09/14/11

62. 09/14/11

63. 09/14/11 Keterangan gambar: LAP: A= 0, B=1+, C=2+, D=3+, E=4+ G= PAS+ ( Sezary syndrome ) H= PAS, ALL, granulakasar I= Peroksidase, granula biru, AML J = Cat biru pada granula matur K= Sudan Blak L= Non spesifik esterase, monosit dan monoblas dengan sitoplasma warna coklat orange M= Cloroasetat esterase, promielosit dengan sitoplasma warna maroon, ada pasien AML N= Tartrat-resistent acid phosphat, granula sitoplama warna gelap.

64. 09/14/11 M= Cloroasetat esterase, promielosit dengan sitoplasma warna maroon, pada pasien AML

65. 09/14/11 MPO (-) Sudan Black (-) PAS (-) PAS (+)

66. 09/14/11 Perbedaan ALL dan AML Hematologi klinik ringkas, EGC Sitokimia ALL AML Mieloperoksidase - + Sudan black - + Esterase non spesifik - + PAS (kasar) + (monositik)

67. 09/14/11 1 Mieloperoksidase Prinsip: Enzim peroksidase mengkatalisis oksidasi substrat dengan adanya hidrogen peroksida membentuk presipitat warna coklat . SH 2 +H 2 O 2 ═S+2H2O Mieloperoksidase terdapat pada: granula primer dari sel promielosit. granula sekunder dari sel mielosit

68. 09/14/11 MPO Tidak dihambat EDTA, oxalat ataupun heparin, slide bisa dikerjakan 12jam setelah pengambilan darah. Pengecatan masih bisa dilakukan pada slide yang disimpan selama 1 minggu, pada suhu kamar Kekurangan MPO: - Sensitif dengan cahaya, panas dan metanol - Pengecatan pada hapusan darah harus dilakukan segera, tidak boleh lebih dari 3 minggu.

69. 09/14/11 Interpretasi: Pengecatan PAS digunakan paling awal pada identifikasi eritroleukimia, suatu leukemia dengan sel darah merah yang immatur. Reaksi positif (+) ->adanya glikogen atau polisakarida setelah penambahan diastase. Sel netrofil: semua stadium hasil positif (+), lebih nyata pada stadium matang. Glikogen berada dalam sitoplasma tidak dalam granula. Eosinofil: Hasil positif (+). Mieloblas: Bervariasi antara negatif (-) dan hanya beberapa butir granula halus. Monosit: Pewarnaan samar-samar. Limfosit : Dapat mengandung granula kecil atau besar.