Dokumen ini membahas tentang pemeriksaan hitung jenis lekosit menggunakan berbagai metode, termasuk metode manual dan otomatis serta teknik pewarnaan dan analisis. Kegunaan klinis pemeriksaan ini adalah untuk membantu diagnosis kelainan darah seperti infeksi dan leukemia. Terdapat berbagai metode pengukuran untuk menentukan jenis dan jumlah lekosit, serta analisis morfologi yang penting dalam penilaian klinis.

1. TUTOR HEMATOLOGI PEMERIKSAAN HITUNG JENIS LEKOSIT ( LEUCOCYTE DIFFERENTIAL COUNT) Oleh dr. Faizah Yunianti dr Yetty Hernaningsih, Sp.PK

2. PENDAHULUAN(1) Hitung jenis lekosit : Persentase distribusi dari bermacam-macam lekosit di dalam darah tepi Di darah tepi, sel darah putih dibedakan dari sel darah merah dari adanya inti sel.

3. PENDAHULUAN(2) Kegunaan klinis : Membantu diagnosis beberapa kelainan darah. Mengetahui perubahan distribusi lekosit berkaitan dengan kelainan yang khas seperti infeksi,leukemia

4. Harga Normal (persentase rata-rata)

5. PEMERIKSAAN HITUNG JENIS LEKOSIT manual otomatik Pembuatan hapusan darah Pewarnaan Pemeriksaan hapusan darah Perhitungan jenis lekosit Metode Resistensi Elektronik/ Impedans/ Metode Optikal Kombinasi metode impedans & optikal

6. PEMERIKSAAN OTOMATIK Metode resistensi elektronik/ impedan/ tahanan listrik Metode Optikal Light scatter Light Scatter & Absorbsi Kombinasi impedan & Metode optikal Direct Current & Radio Frequensi Direct Current (DC ) sitokimia fluoresensi

7. Otomatis Metode Alat Impedans Coulter (DC) Sysmex NE-8000 (DC&RF) Light scatter Cell-Dyn 3200 Light Scatter & Absorbsi Sysmex XE 2100 Tehnicon H1 Advia 2120 Kombinasi Impedans & Light Scatering Cobas Helios 5 Diff

8. Metode Resistensi Elektronik/ Impedans/Tahanan Listrik

10. Metode Resistensi Elektronik/ Impedans/Tahanan Listrik Sampel darah diencerkan dengan larutan elektrolit seperti salin Suspensi sel-sel  dialirkan melalui suatu celah (apertura) ke tabung yang vakum. Arus listrik dihasilkan oleh: - elektroda eksternal (suspensi sel darah) - elektroda internal (tabung gelas mempunyai celah/apertura).

11. Metode Resistensi Elektronik/ Impedansi/Tahanan Listrik Tiap sel yang dialirkan melalui apertura )  meningkatkan tahanan listrik dan menghasilkan pulsasi untuk dihitung. Setiap puncak pulsasi sebanding dengan ukuran partikel Dapat terjadi coincidence error : >1 sel melewati apertura bersamaan,

12. Coincidence error dikurangi dengan - mengurangi ukuran apertura, - mengurangi konsentrasi sel - menggunakan cairan selubung (sheath fluid). Metode lain untuk mengurangi coincidence error yaitu hydrodynamic focusing system ,  sel digerakkan dalam satu garis aliran  sel tersebut satu persatu masuk apertura.

15. Metode Resistensi Elektronik/ Impedans/Tahanan Listrik Digunakan reagen pelisis  mengerutkan plasma membran & sitoplasma sel  inti yang diselubungi sitoplasma dlm jumlah minimal & membran sel Jenis lekosit diukur berdasarkan ukuran inti yang telanjang tersebut. Dikelompokkan menjadi 3 bagian - Limfosit (35-90 fl) - Monosit ( 90-160 fl) - Granulosit netrofil ( 160-450 fl)

16. Direct Current & Radio Frequency DC : ukuran/volume sel RF : ukuran inti & kepadatan sel Dibuat scatter gram : RF : ordinat DC : aksis

17. Direct Current & Radio Frequency

18. Direct Current & Radio Frequensi

19. Scattergram Sysmex NE 8000

20. Metode Optikal Light Scatter Light Scatter & Absorbsi - fluoresensi - sitokimia

21. Light Scatter

22. Light Scatter Sel-sel darah melewati suatu flow cell, dimana sinar difokuskan. Sinar  dipencarkan ke segala arah karena sel menghalangi jalannya sinar. Sumber sinar : laser Sinar-sinar yang dipencarkan ditangkap photodetector & dianalisis  dikonversikan

23. OPTICAL FLOW CELL

24. Pengukuran scatter light 4 sudut ( multi angle polarized scatter separation/MAPPS) Forward angle light scatter  ukuran sel 1 º - 3º  0º 7º-11º  10º Orthogonal(side) light scatter  permukaan sel, struktur internal sel & granularitas 70 º - 110º  90º 70º - 110º  90º Depolarisasi

25. WBC LIGHT SCATTER

26. MONONUCLEAR-POLYMORPHONUCLEAR SCATTER 90 º pada sumbu Y & 10º pada sumbu X Sel-sel MN : sudut kiri bawah Sel-sel PMN : sebelah kanan atas dari sel MN

27. NEUTROPHIL-EOSINOPHIL SCATTER 90 ºD : sumbu Y, 90º : sumbu X Netrofil : di bagian bawah Eosinofil : di bagian atas

28. MONONUCLEAR SCATTER 0 º : sumbu Y, 10º : sumbu X Limfosit : paling bawah & besar Basofil : sebelah kanan atas limfosit (kecil) Monosit : di atas limfosit & basofil

29. Fluoresensi ( Light Scatter & Absorbsi) Prinsip : - absorbsi sinar λ tertentu (sumber sinar yang digunakan) - eksitasi - kembali ke ground state  emisi (fluoresensi) - λ fluoresensi > λ sumber sinar

31. Fluoresensi Prinsip : lekosit diwarnai dengan pewarnaan asam nukleat spesifik (mewarnai DNA/RNA) Intensitas fluoresensi sebanding dengan kandungan DNA/RNA dalam inti Sifat pewarna polymethine - tereksitasi oleh semikonduktor laser warna merah ( λ 633nm) - mengemisikan fluoresensi merah ( λ 660nm atau lebih)

32. Polymethine mengandung reagen pelisis ( STROMATOLYSER-4DL & 4DS)  masuk ke dalam sel & mewarnai asam nukleat & organel sitoplasma seperti retikulum endoplasmik. Pewarna polymethine : 4 jenis lekosit, retikulosit dan eritroblas. Intensitas fluoresensi : - Granulosit immatur > netrofil - Limfosit atifikal > limfosit & monosit

33. Scattergram leukosit

34. Memisahkan Lekosit dari NRBC Sulit untuk membedakan NRBC dari lekosit NRBC mempengaruhi perhitungan lekosit Untuk mengatasi masalah tersebut digunakan pewarnaan polymethine & suatu diluent bersifat asam-hipoosmotk yang mengandung surface active agent (STROMATOLYSER NR)

35. Memisahkan Lekosit dari NRBC STROMATOLYZER NR  mempengaruhi membran lipid  terbentuk lubang pada sel NRBC  meningkatkan permiabilitas pewarnaan Kurang mewarnai asam nukleat, organel & inti

36. Memisahkan Lekosit dari NRBC

37. Scattergram NRBC Sumbu X : intensitas lateral fluorecent light Sumbu Y : intensitas forward scatter light

38. Memisahkan Lekosit dari NRBC

39. Channel Basofil (WBC/BASO Scattergram) Sumbu X : intensitas lateral scatter light Sumbu Y : intensitas forward scatter light Memisahkan basofil dari lekosit lainnya Menggunakan reagen pelisis (Stromatolyser FB)

40. Immatur Granulosit Netrofil Menggunakan reagen pelisis khusus immatur granulosit (co. : Stromatolyser IM pada Sysmex XE 2100). Immatur granulosit dilindungi dari proses lisis oleh asam amino yang melawan……..

41. IMI Channel Memisahkan immatur & matur lekosit

42. IMI Scattergram Sumbu Y : RF, Sumbu X : DC Sel immatur : merah Sel matur : biru

43. Scattergram Lekosit

46. Sitokimia Intensitas pewarnaan : membedakan sel. Limfosit & sel-sel besar peroksidase (-)  tidak terwarnai. Netrofil, eosinofil & monosit mengandung sejumlah peroksidase yang bervariasi. (Netrofil > eosinofil > monosit)

47. Sitokimia Eritrosit lisis, lekosit bentuknya tetap (menggunakan formaldehid). Zat kromogen & substrat hidrogen peroksida ditambahkan  presipitat gelap(coklat) bila peroksidase ada di dalam granula lekosit.

48. Lyse RBC Fix WBC Stain peroxidase = positive WBC anionic surfactant Formaldehyde Buffer pH 7,2 Chromogen (4-chloro-1naphtol) Substrat (H 2 O 2 ) Blood 12 μ L H 2 O 2 + 4-chloro-1-napthol --------------------  presipitat warna gelap dalam sel Peroksidase seluler

50. Sitokimia Detektor darkfield sensitif terhadap cahaya yang dipencarkan, detektor brightfield sensitif terhadap derajat pewarnaan. Masing-masing sel digambarkan pada suatu sitogram sebagai suatu titik tertentu dengan kadar sinar yang dipencarkan dan di absorpsi. Dikelompokan menjadi 6 jenis sel yaitu neutrofil, eosinofil, monosit, limfosit dan basofil dan LUC(Large Unstained Cell) .

51. Sitogram WBC/ Peroxidase Channel Intensitas pewarnaan U K U R A N

52. Sitokimia Basofil Basofil : basofil tidak lisis  dihitung ukuran sel Menggunakan sinar Helium-Neon Laser Low Angle scatter (2-3 º) : ukuran High Angle Scatter (5-15º):bentuk inti & densitas

54. Sitokimia Basofil Lyse RBC, platelets Strip cytoplasma from WBC, Except basophils Non ionic surfactant Buffer (pH 1,9) Blood 12 μ L

55. Large unstained Cell (LUC) Tidak mengandung peroksidase sehingga tidak terwarnai Yang termasuk LUC  Atipikal Limfosit  Blast

58. terima kasih terima kasih

59. PERBANDINGAN HITUNG JENIS LEKOSIT SECARA MANUAL DAN OTOMATIK CARA KEUNTUNGAN KERUGIAN MANUAL Dapat melihat morfologi sel-sel dgn lebih jelas Dapat membedakan 6 populasi memakan waktu kurang realibilitas tergantung kemampu- an pemeriksa OTOMATIK Lebih cepat & ekonomis jumlah sampel besar, realibilitas dan akurasi lebih tinggi digunakan sebagai skrining belum bisa meng- gambarkan morfologi sel perlu konfirmasi manual belum bisa meng- gambarkan stab & segmen netrofil

60. Scattergram Coulter STKS (DC)

61. Scatergram metode impedans

62. Scattergram Sysmex NE 8000

65. Sheath fluid berfungsi : - mencegah flow cell terlapisi oleh bahan yang akan membelokkan sinar, - membuat aliran yang laminar, - membuat hydrodinamic focusing

66. Fluoresensi Aktifitas antibodi Limfosit B mengandung konsentrasi tinggi dari ribosomal RNA dan memisahkan limfosit ( high fluorescence lymphocyte count =HPLC ). Pembedaan secara kuantitatif dari granulosit immatur dan perbandingan dari HPLC  implamasi & sepsis memperkirakan stadium penyakit

67. Fluoresensi Channel pengukuran yang lain adalah IMI channel : eritrosit lisis, semua bentuk lekosit matur lisis  spesifik untuk kandungan fosfolipid yang tinggi. Mieloid immatur diukur dengan dibantu oleh sinyal elektronik High Frequency (HF) dan Dirrect Current (DC) .

68. Manual Pembuatan hapusan darah Pewarnaan Pemeriksaan hapusan darah Perhitungan jenis lekosit

69. Gambar 1. Prosedur (a-d) pembuatan hapusan darah tepi untuk hitung jenis lekosit

70. a. Pembuatan hapusan darah METODE WEDGE 1. Teteskan darah pada slide 2. Slide diletakan pada meja datar(tetesan darah di kanan). 3. Buat hapusan 4. Keringkan hapusan, 5. Identifikasi hapusan darah,

71. b. Pewarnaan Pewarnaan Romanowsky : Leishman’s, Wright’s, Giemsa’s, May-Grunwald’s dan Jenner’s Hapusan idealnya diwarnai segera Karakteristik pewarnaan Romanowsky (Methilen B & Eosin) Hasil pewarnaan : waktu, konsentrasi pewarna Cara

72. c. Pemeriksaan hapusan darah Pertama : memakai pembesaran kecil yaitu lensa objektif 10x untuk skrining  lihat keseluruhan hapusan. Hapusan ideal akan tampak 3 zona yaitu : - zona tebal(kepala) - badan - ujung tipis(ekor)

74. d. Perhitungan jenis lekosit Lekosit yang dilihat, mula-mula dicatat pada kolom 1 hingga berjumlah 10, kemudian pindah ke kolom 2 dst. Bila 10 kolom sudah terisi  sudah mendapat 100 sel, masing-masing sel dihitung dan dijumlahkan.

82. NRBC FLAG

87. Perbedaan Pewarnaan WBC

88. Metode Peroksidase

89. Metode Analisis Basofil/ Lobularitas Inti

90. Reaksi Basofil

94. IG : WBC/NRBC screen

97. Atipikal Limfosit Flag