This document summarizes methods for quantitatively determining serum immunoglobulin A (IgA) concentration, including radial immunodiffusion (RID), nephelometry, and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). RID involves measuring the diameter of precipitation rings formed between serum IgA and antibody-containing agar. Nephelometry measures light scatter from immune complexes formed between serum IgA and anti-IgA antiserum. ELISA uses a capture antibody to bind serum IgA and a labeled secondary antibody for detection. ELISA provides the best sensitivity while nephelometry is most commonly used in clinical labs due to its rapid automation capabilities. Normal IgA levels, deficiencies, and causes of high values are also

1. Pemeriksaan Immunoglobulin A (IgA) dengan metode Radial ImmunodiffusionFerdy,dr/ Endang Retnowati, dr, MS, SpPK(K)TUTOR IMUNOLOGI1

2. 2 subklas: IgA1 dan IgA2Antibodi penting pada imunitas mukosa.IgA3-5 gram/hari disekresi ke lumen intestinal75% Ig total dihasilkan tubuh2Pendahuluan

3. Struktur Ig AGambar 1: Struktur Ig A (Sumber: Siemel, 2006)3

4. Pendahuluan4

5. Arti klinisIg A menurun:Selective IgA deficiencyInfeksi Neisseria gonorrhœae5

6. IgA meningkatIg A nephropathyPenyakit kronis seperti hepatitisSirosis hepatisMyelomaPenyakit autoimun seperti SLE6

7. Pemeriksaan Immunoglobulin AMetode :Radial immunodifusionRadioimmunoassayNefelometriELISA7

8. Presipitasi8

9. 9

10. Kurva PresipitasiGambar2. KurvaPresipitasi. (Sheehan, 1990)10

11. Gambar3. Kompleks Ag – Ab. (Sheehan, 1990)11

12. RADIAL IMMUNODIFFUSION (RID)12Antisera/ AbGel agarosa fase cair (50oC)50 – 80 jam  cincin presipitasiSerum standar1Tes serum28Antisera dalam agarTes serum3dinginkan pdsuhu kamar7Tes serum4Ukur diameter cincin presipitasi, tempatkan pd kurva standar  menentukan kadar imunoglobulin secara kuantitatif65Tes serumTes serum(Handojo, 2003)

13. KECEPATAN DIFUSIUkuran molekulInteraksi matriks gel &reaktanFAKTORViskositas &Hidrasi gelBerat molekul AgTemperatur13(Sheehan, 1990)

14. CARA PEMBACAAN RID METODEMancini, endpoint diffusion.Fahey, kinetic diffusion.14(Sheehan, 1990)

15. CARA PEMBACAAN RIDFaheyMancinidiameter cincinpresipitasidiukurstl 18 jam

16. Grafiksemilogaritmik; sumbuy:kadarygdianalisa;

17. sumbu x :diameter cincinpresipitasi (termasuksumuran)

18. Ag dibiarkanberdifusimencapaipresipitasimaks

19. IgA; inkubasi 48 jam

20. Grafik; sumbu y:kadar Ag & sumbux: cincinpresipitasi.15(Sheehan, 1990)

21. Gambar 4. Grafik Fahey (kinetic diffusion method)16(Sheehan, 1990)

22. Gambar 5. Grafik Mancini (endpoint method) 17(Sheehan, 1990)

23. 18HASILHasil dikali faktor pengenceranHasil kurang dari standar(Sheehan, 1990)

24. mengisi sumuran terlalu sedikit/ banyak menumpahkan serum pasien ke dalam gel agarosa hasiltdkakuratperludiulangmelubangi samping sumuran Waktu&suhu Inkubasitdk tepat KESALAHAN PEMBACAAN RID(Sheehan, 1990)19

25. Gambar6. PolacincinpresipitasipadaRID(Sheehan, 1990)20

26. Pemeriksaan IgA di Instalasi Patologi Klinik RSUD.dr.SoetomoPrinsip pemeriksaan (RID):Ig A serum/plasma manusia membentuk kompleks imun dengan antibodi spesifik pada gel agarose pada cakram PartigenDiameter cincin presipitasi berbanding lurus dengan konsentrasi Ig A dalam sampelHasil dikonversi ke dalam konsentrasi Ig A menggunakan tabel nilai referensi.21

27. Reagen: Tiap plate NOR partigen mempunyai 12 sumuran imunodifusi untuk menentukan Ig A serum/plasma.Komposisi:Cakram NOR partigen mengandung lapisan agarose gel yang mengandung antiserum monospesifik terhadap Ig A dalam plasma. Antisera diperoleh dari kelinci, domba, kuda, kambing yang diimunisasi dari manusia.Cakram NOR Partigen juga mengandung sodium azide (<1 g/l) dan sodium timerfonate (<0.1 g/l) sebagai pengawet.22

28. 23Gambar7. NOR Partigen Plate(Lab. PK, 2011)

29. Penyimpanan dan stabilitasNOR Patigen sebaiknya disimpan pada suhu 2-8°C pada pembungkus yang belum dibuka, stabil sesuai masa berlakuKontrolSebaiknya digunakan kontrol sampel yang tersedia komersial24

30. Spesimenserum maupun plasma segar (24 jam sesudah pengambilan)bila sampel tidak langsung dikerjakan sebaiknya disimpan pada suhu 2-8°C maksimum 8 hari Penyimpanan pada suhu -20°C dapat bertahan hingga 1 tahun.25

31. Prosedur5 µl sampel1Tes serum28Antisera dalam agarTes serum37UKUR DIAMETER CINCIN PRESIPITASI SETELAH 48 JAMTes serum465Tes serumTes serum(Handojo, 2003) 26

32. Gambar8. Meβ Projector, Lab. PK. Dr. Soetomo, 201127

33. 28Gambar9. TabelReferensi(Lab. PK, 2010)

34. Nilai normalIgA : 70 – 350 mg/ dL29

35. TERIMAKASIH30

36. we defined IgA deficiency as plasma samples with less than 100 ngIgA per mL,decreased level of IgA as plasma samples with 100 ng to600 mg IgA per mL, and normal level of IgA as plasmasamples with more than 0.6 mg per mL as determined by the IgA-ELISA31

37. IgA measurement by nephelometryBeckman Coulter, Inc. (Fullerton,Calif.).IgA levels were considered deficient when they were less than thelower limit of established age-dependent reference intervals. These limits:70 mg/dl for teenagers and adults, 23 mg/dl for children 3 to 12 years old, 17mg/dl for children ,3 years old.32

38. Grafik Semilogaritmik33

39. 34NEFELOMETRI Nephelometri : carapengukurankadarzatdenganmengukurpendarancahaya (scattered) yang mengenaipartikeldalamlarutan.Dasarpemeriksaan :reaksipresipitasi antigen-antibodi.Metodeinidigunakanuntukmengetahuikuantitas protein spesifiksecaralebihakuratdanprecise.

40. 35PRINSIP NEPHELOMETRI (1)Prinsip nephelometri : 1. pendaran cahaya, 2. kinetik cairan pada fase presipitasi.

41. 36PRINSIP NEPHELOMETRI (2)PENDARAN CAHAYAPendarancahayadipengaruhi : a. diameter partikel, b. panjanggelombang.Contoh :a. partikelkecil (albumin, Ig.G,Ig.M) : - pendarancahaya Rayleigh semetrisantaraforwarddanbackward. - pendarancahaya minimum dilihatpada90º darisumbercahaya.

42. 37PRINSIP NEPHELOMETRI (3) b. partikellebihbesar (komplek Ag-Ab) : - menghasilkanpendarancahayaRaeyleigh-Debye - pendarandilihatdariforward (sudutmendekatinol) intensitascahayalebihbesar.Sudutuntukmendeteksipendarancahayaikutmenentukansensitivitas, dimanaintensitassumbercahayamakinkuatmakasudut yang dihasilkanmakinkecil

43. 38PRINSIP NEPHELOMETRI (4)

44. 39PRINSIP NEPHELOMETRI (5)