Dokumen ini membahas tentang radial immunodiffusion (RID) sebagai teknik untuk menentukan kadar antigen dan antibodi melalui reaksi presipitasi. Selain menjelaskan mekanisme dan berbagai teknik presipitasi, dokumen ini juga mencakup langkah-langkah dan prosedur praktis dalam melakukan uji RID, serta interpretasi hasil untuk penentuan imunoglobulin dan protein serum lainnya. Manfaat klinis dari RID dijelaskan, termasuk penentuan kadar imunoglobulin dan komplemen serta penggunaannya dalam diagnosis berbagai penyakit.

1. RADIAL IMMUNODIFFUSION (RID) MEITI MULJANTI, dr SITI ROCHMATOEN HARMADJI, dr, SpPK (K) TUTOR IMUNOLOGI

2. PENDAHULUAN RADIAL IMMUNODIFFUSION (RID) Penentuan antigen – antibodi berdasarkan reaksi presipitasi.

3. REAKSI PRESIPITASI Merupakan reaksi yg terjadi antara Ag yg larut & Ab. Reaksi Presipitasi memerlukan Ag yg mempunyai min 2 determinan Ag (epitop) atau bivalen Saat Ab bivalen bergabung dg Ag bivalen  lattice Jika Ag hanya mempunyai 1 epitop  lattice tdk terbentuk  perlu metode lain Waktu beberapa jam atau hari Presipitasi maksimal terjadi saat kadar Ag & Ab berada pd zone of equivalence . (Sheehan, 1990)

4. Gambar 1. Kurva Presipitasi. (Sheehan, 1990)

5. Gambar 2. Kompleks Ag – Ab. (Sheehan, 1990)

6. Tabel 1. Macam Tehnik Reaksi Presipitasi (Sheehan, 1990)

7. Tabel 2. Keuntungan & Kerugian Uji Presipitasi (Sheehan, 1990) TEHNIK KEUNTUNGAN KERUGIAN Capillary tube precipitation Mudah Tidak sensitif Waktu reaksi lama Semikuantitatif Radial immunodiffusion (RID) Sensitif Kuantitatif Waktu reaksi (kinetik : 18 jam; Endpoint : 48 jam) Hanya menentukan 1 Ag/ plate Double diffusion (Ouchterlony) Dapat mendeteksi Ag yg sama Semikuantitatif Waktu reaksi lama Counter immunoelectro phoresis (CIEP) Lebih cepat dibanding tes lainnya Semikuantitatif Immunoelectro phoresis (IEP) Sensitif Sedikit masalah dgn rasio Ag/ Ab Semikuatitatif Immunofixation electrophoresis (IFE) Sensitif Dapat mendeteksi variasi genetik dari Ag Semikuantitatif Rasio Ag/ Ab penting Rocket Technique (Laurell) Waktu reaksi cepat Kuantitatif Hanya menentukan 1 Ag / plate

8. FAKTOR YG MEMPENGARUHI Reaksi Presipitasi Mekanisme daya tahan tdk spesifik Sifat Ag Waktu & suhu (Handojo, 2003) Ratio Ag-Ab Elektrolit & pH

9. RADIAL IMMUNODIFFUSION (RID) dinginkan pd suhu kamar Antisera dalam agar 1 2 3 4 5 6 7 8 Tes serum Tes serum Tes serum Tes serum Tes serum Serum standar 50 – 80 jam  cincin presipitasi (Handojo, 2003) Ukur diameter cincin presipitasi, tempatkan pd kurva standar  menentukan kadar imunoglobulin secara kuantitatif Gel agarosa fase cair (50 o C) Antisera/ Ab

10. KECEPATAN DIFUSI Viskositas & Hidrasi gel Interaksi matriks gel & reaktan Ukuran molekul Berat molekul Ag Temperatur FAKTOR (Sheehan, 1990)

11. CARA PEMBACAAN RID Fahey, or kinetic diffusion. METODE Mancini, or endpoint diffusion. (Sheehan, 1990)

12. CARA PEMBACAAN RID (Sheehan, 1990) Fahey diameter cincin presipitasi diukur stl 18 jam Grafik semilogaritmik; sumbu y adalah kadar yg dianalisa; sumbu x adalah diameter cincin presipitasi (termasuk sumuran) Mancini Ag dibiarkan berdifusi mencapai presipitasi maks Ig G ; inkubasi 48 jam Ig M; inkubasi 72 jam Ig M lbh lama krn BM> Grafik; sumbu y adalah kadar Ag & sumbu x adalah cincin presipitasi.

13. Gambar 4. Grafik Fahey ( kinetic diffusion method) (Sheehan, 1990)

14. Gambar 5. Grafik Mancini ( endpoint method) (Sheehan, 1990)

15. HASIL Hasil dikali faktor pengenceran Hasil kurang dari standar (Sheehan, 1990)

16. KESALAHAN PEMBACAAN RID mengisi sumuran terlalu sedikit/ banyak menumpahkan serum pasien ke dalam gel agarosa melubangi samping sumuran Waktu&suhu Inkubasi tdk tepat hasil tdk akurat  perlu diulang (Sheehan, 1990)

17. Gambar 7. Pola cincin presipitasi pada RID (Sheehan, 1990)

18. MANFAAT KLINIS RID Penentuan imunoglobulin secara kuantitatif dan protein serum lain, termasuk komponen komplemen. (Sheehan, 1990) Penentuan kadar immunoglobulin (IgM, IgG, IgA) Penentuan kadar komplemen C3 & C4. Dapat untuk penentuan HBs Ag &Ab thd parasit, mekanisme belum dijelaskan. (Handojo, 2003)

19. Tabel 3. Penentuan klinis menggunakan uji presipitasi (Sheehan, 1990) Uji Metode C-reactive protein Capillary tube precipitation Immunoglobulin quantitation IgG, total dan subklas IgA; IgM; IgD RID Protein komplemen C3; C4 RID Antigen mikroba CIEP Protein monoklonal (Serum, urine, & cairan serebrospinal) IEP dan IFE

20. RID di Instalasi PK dr. Soetomo Contoh : Menentukan Ig G Bahan dan alat: NOR Partigen Plate . 1 plate dengan 12 sumuran. Reagen mengandung sodium azide <1 g/L N/T kontrol protein SL (manusia), Level H Microdispenser 5 µL (Microliter pipette) Alat pengukuran : garis kalibrasi, kaca pembesar dengan skala pengukuran. Serum sampel segar jika mungkin (disimpan pada 2-8 o C maksimal 8 hari).

21. Gambar 8. NOR Partigen Plate (Lab. PK, 2010)

22. RID di Instalasi PK dr. Soetomo Prosedur : NOR Partigen Plate dibuka pd suhu ruangan (15-25 o C) 5 menit sebelum diisi sampel. Masukkan 5µL sampel kedalam sumuran kosong. Setelah sampel berdifusi ke dalam gel agarosa, tutup cover & simpan pd suhu ruangan (15 – 25 o C). Diameter cincin presipitasi diukur setelah 2 hari. Evaluasi setelah berdifusi dua hari. Kadar IgG dapat dilihat pada tabel referensi.

23. Gambar 9. Meβ Projector (Lab. PK, 2010)

24. Gambar 10. Tabel Referensi (Lab. PK, 2010)

25. NILAI NORMAL RID IgG : 700 – 1700 mg/ dL IgM : 70 – 210 mg/ dL IgA : 70 – 350 mg/ dL C3 : 50 – 120 mg/ dL C4 : 20 – 50 mg/ dL

27. Terimakasih

28. Immunoelectrophoresis ELEKTROFORESIS Countercurrent electrophoresis

30. REAKSI AGLUTINASI & PRESIPITASI (Sheehan, 1990) AGLUTINASI PRESIPITASI Partikel Ag tidak larut Ag larut Ag memp 2 antigenic determinants Ag memp 2 antigenic determinants Hsl Ag excess pd postzone Hsl Ag excess pd postzone Hsl Ab excess pd prozone Hsl Ab excess pd prozone Waktu reaksi : menit - jam Waktu reaksi : jam - hari Hsl : kualitatif/ semikuantitatif Hsl : kualitatif, semikuantitatif/ kuantitatif

31. Cross-reactivity Ag homolog menstimulasi produksi Ab & bereaksi dg Ab Ab yg sama bereaksi dg Ag lain yg strukturnya similar Ab yg sama tdk dpt bereaksi dg Ag yg dissimilar (Sheehan, 1990)

32. Double Diffusion Ag a&b identik. Grs presipitasi membentuk kurva yg halus Ag a&b tdk sama. 2 Ag bereaksi dg Ab. Grs presipitasi bentuk silang. Ag a&b similar tp tdk identik. Grs presipitasi menyebar ke Ag yg dissimilar (Sheehan, 1990)

33. Aktivasi komplemen jalur klasik, lectin & jalur alternatif. 3 jalur bertemu pd pemecahan C3 & pembentukan C5 convertase, penyebab jalur ahir lisis. MASP, mannose-binding lectin-associated serine protease; MBL, mannose-binding lectin. David, 2005

35. Ig G Ig G ↙ : primary/ secondary immune deficiency Malignant tumors Lymphatic leukemia Multiple myeloma Waldenstrom macroglobulinemia Ig G ↗ : polyclonal/ oligoclonal Ig production Liver diseases (hepatitis, cirrhosis) Acute & chronic infection Autoimmune disease Umbilical cord blood of newborn in intrauterine & perinatal infection Monoclonal Ig production: Plasmacytomas Waldenstrom macroglobulinemia Heavy chain disease

36. Ig A Ig A ↗ : chronic infectious disease Chronic hepatitis Hepatic cirrhosis Toxic Inflamatory condition Active alcoholic cirrhosis Myeloma Ig A ↙: autoimmune disease Lupus erythematosus Rheumatoid arthritis

37. C3c & C4 C3 & C4 ↙ : Systemic lupus erythematosus (SLE) Membrane proliferative glomerulonephritis Immune complex diseases (serum sickness) C4 ↙: Lupus erythematosus Hereditary angioneurotic edema