1. Western Blot dan RIBA merupakan tes konfirmasi untuk infeksi HIV yang mendeteksi antibodi terhadap protein inti, polimerase, dan envelope virus HIV. 2. Terdapat perbedaan antara Western Blot dan RIBA dalam hal protein yang digunakan sebagai antigen. 3. Hasil tes dapat negatif palsu, indeterminate, atau positif tergantung pola protein HIV yang terdeteksi.

1. Western Blot Sebagai Tes Konfirmasi HIV Diah Puspita Rini Siswanto Darmadi

2. PENDAHULUAN

3. AIDS Disebabkan oleh HIV HIV-1, virus pertama yang diidentifikasi tahun 1983 HIV-2, tahun 1984 yang diisolasi dari pasien di Afrika Barat HIV : famili retrovirus, termasuk virus RNA BM 9,7 kb Khas : enzim reverse transkriptase

4. STRUKTUR HIV

5. PEMERIKSAAN LAB HIV Salah satu cara penentuan serologi HIV yang dianjurkan adalah ELISA , mempunyai sensitivitas 93-98% dan spesifisitas 98-99%. Pemeriksaan serologi HIV sebaiknya dilakukan dengan 3 metode berbeda. Dapat dilanjutkan dengan pemeriksaan yang lebih spesifik Western Blot.

6. Tes diagnostik untuk infeksi HIV Skrening Enzyme-linked immunoassay (EIA, ELISA), HIV-1/2 Aglutinasi latek untuk HIV-1 Konfirmasi Western Blot (WB) , HIV-1 dan HIV-2 Indirect immunofluorescence antibody assay (IFA),HIV-1 Radioimmunoprecipitation antibody assay (RIPA),HIV-1 Lain-lain ELISA untuk HIV-1 p24 antigen Polymerase chain reaction (PCR), HIV-1

7. Algoritma Pemeriksaan Tes Serologi HIV Diambil dari Manual of Clinical Laboratory Immunology

8. Prinsip Pemeriksaan WESTERN BLOT

9. WESTERN BLOT Modifikasi dari prinsip imunoelektroforesis Menggabungkan selektivitas elektroforesis gel dengan spesifisitas immunoassay

10. PRINSIP PEMERIKSAAN Fraksi protein dipisahkan dengan elektroforesis pd gel poliakrilamida Fraksi protein dipindah ke membran, menggambarkan replika pola fraksi-fraksi protein Membran disaturasikan untuk menghindari pengikatan antibodi non spesifik

11. PRINSIP PEMERIKSAAN 4. Membran direaksikan dengan antibodi primer 5. Membran direaksikan dengan antibodi sekunder spesifik terhadap antibodi primer, sebelumnya antibodi sekunder dikonjugasikan dengan enzim 6. Pita protein yang berlabel enzim direaksikan dg substrat kromogen yang akan menghasilkan produk berwarna

12. PROSEDUR PEMERIKSAAN

13. PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN Lakukan elektroforesis dalam SDS-PAGE ( sodium dodecyl sulfate-polyacrilamide gel electrophoresis ), setelah selesai dicuci dengan buffer 25mM Tris-Cl pH 8.3/20% methanol (atau pH 7.0 - 8.8) Membran nitoselulosa dipotong dan direndam dalam larutan buffer selama 15 menit

14. PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN 3. Alat transfer dipasang dengan membran menghadap anode dan gel menghadap katode . Pastikan tidak ada gelembung, elektrotransfer dilakukan dengan menjalankan unit selama 1 jam dengan voltase 500mA

15. PEMISAHAN & TRANSFER PROTEIN Setelah selesai, membran dicuci selama 15 menit dalam larutan penyangga TBS (0,02 M Tris-Cl, 0,5 M NaCl pH 7,5)

16. BLOKING DAN DETEKSI ANTIBODI Pada tahap bloking ini membran disaturasikan / dijenuhkan untuk menghindari pengikatan antibodi non spesifik Digunakan antibodi primer dan sekunder untuk mendeteksi protein spesifik yang dicari

17. Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi Memblok membran larutan bloking 10 mM Tris-Cl/150 mM NaCl 1-5% Protea non- fat milk powder dan 0.05% Tween-20 30-60 menit pada suhu 37 0 C atau 2 hari pada suhu kamar Cuci membran 2 x 5 menit larutan pencuci 10 mM Tris-Cl/150 mM NaCl pH 7.4 (atau saline ) yang mengandung 0,05% Tween-20 (TTBS) Membran diinkubasi dengan antibodi primer selama 1-2 jam pada suhu kamar

18. Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi Cuci membran 3x, 5 menit dengan larutan pencuci untuk membuang antibodi primer Membran diinkubasi pada antibodi sekunder konjugasi alkali fosfatase ,1-2 jam suhu kamar Cuci membran 2 x 5 menit dengan TTBS

19. Tahapan Bloking dan Deteksi Antibodi Cuci membran dengan TBS menghilangkan Tween Inkubasi dengan substrat selama 1 jam, cuci dengan air Inkubasi membran 20 menit dengan TBS mengandung 0,3 % Tween 20, cuci dengan air 5 menit Masukkan membran ke dalam zat warna emas koloid/ Amido Black/ India ink/ Ponceau S selama 4 jam.

20. INTERPRETASI WESTERN BLOT

21. INTERPRETASI WESTERN BLOT Berdasarkan United States Centers for Disease Control (CDC) NEGATIF : tidak terbentuk pita POSITIF : terdeteksi dua pita dari gp 120/160 dan gp41 atau gp 24 INDETERMINATE : terdapat satu pita saja yang positif yaitu p24, gp41, gp120/160, p66, p55, p51, p31 atau p17

23. RIBA (Recombinant Immunoblot Assay) Tes konfirmasi HIV komersial dengan menggunakan prinsip indirect solid phase-enzyme immunoassay (EIA) . Fase solidnya adalah kartu dengan 12 tonjolan (“gigi” ). Masing-masing kartu memiliki enam pasang gigi, dengan enam titik antigen (3 titik pada masing-masing gigi).

24. RIBA (Recombinant Immunoblot Assay) Pada bagian kiri dari tiap pasang gigi secara berurutan dari atas ke bawah terdapat internal control , dan dua protein marker p24 (gag) dan p 31 (pol). Pada bagian kanan terdapat tiga protein dari bagian env virus yaitu gp41, gp 120 dan gp 36.

25. PRINSIP REAKSI RIBA

26. INTERPRETASI HASIL Negative No spot No spot gp41 or gp120 ang/or gp36 No spot Indeterminate 1 No spot or gp120 gp24 and/or p31 HIV-2 only, or coinfection with HIV-1 gp36 and gp41 and gp 120 gp24 and/or p31 HIV- 2 gp36 only or with gp 41 gp24 and/or p31 gp41 and gp120 No spot HIV- 1 gp41 p24 and/or p31 Positive for Right tooth Left tooth Interpretation Pattern of HIV spots present on

27. PERBEDAAN WB dan RIBA WESTERN BLOT Inti : p17,p24,p55 Polimerase : p21, p51, p66 Envelope : gp41, gp120, gp 160 RIBA Inti : p24 Polimerase : p31 Envelope : gp 120 gp 41

28. FOR YOUR ATTENTION Thank You !

29. RIBA TEST INSTRUCTION 1. Antigen-antibody reaction (row A) 2. First wash (row B) 3. Binding of conjugate (row C) 4. Second wash (row D) 5. Third wash (row E) 6. Color reaction / chromogenic substrate containing 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP) and nitro blue tetrazolium (NBT) (row F) 7. Stop reaction (row E)

30. HASIL NEGATIF PALSU Potensi terjadinya negatif palsu 0,3% pada populasi prevalensi tinggi dan < 0,001% pada populasi prevalensi rendah Penyebab: Window period Serokonversi Agammaglobulinemia Atypical host response Strain N atau O atau HIV-2

32. INDETERMINATE Penyebab : Tes serologi dilakukan pada saat serokonversi Infeksi HIV stadium lanjut Reaksi silang antibodi nonspesifik, multiple skelosis, psx vaskular-kolagen, limfoma, penyakit liver HIV vaccine recipients

33. HIV-1 adalah virus yang sangat berubah-ubah yang dapat bermutasi dengan sangat mudah. Jadi ada banyak jenis ( strain ) HIV-1 yang berbeda-beda. Jenis ini digolongkan menurut golongan ( group ) dan subtipe ( subtype ). Ada dua golongan, yaitu golongan M dan golongan O. Pada September 1998 , peneliti dari Perancis mengumumkan penemuan jenis HIV baru pada seorang wanita dari Kamerun di Afrika Barat. Jenis ini tidak termasuk dalam golongan M atau pun golongan O , dan hanya ditemukan pada tiga orang lainnya, semua di Kamerun. Saat ini dalam golongan M sedikitnya diketahui ada sepuluh subtipe HIV-1 yang secara genetis berbeda. Subtipe ini terdiri dari A sampai J. Tambahan pula, golongan O terdiri dari beberapa golongan yang berbeda dari virus yang sangat beraneka ragam. Subtipe di golongan M dapat berbeda antar subtipe sebanyak perbedaan golongan M dengan golongan O.

34. SUBTIPE BERDASAR LOKASI PENEMUAN Subtipe tersebar sangat tidak merata di seluruh dunia. Sebagai contoh, subtipe B kebanyakan ditemukan di sekitar Amerika (utara dan selatan), Jepang, Australia, Karibia, dan Eropa ; subtipe A dan D adalah yang paling sering ditemukan di Afrika sub-Sahara; subtipe C di Afrika Selatan dan India ; dan subtipe E di Republik Afrika Tengah, Thailand, dan negara lainnya di Asia Tenggara . Subtipe F (Brazil dan Rumania), G dan H (Rusia dan Afrika Tengah), I (Siprus), dan golongan O (Kamerun) mempunyai prevalensi sangat rendah. Di Afrika, sebagian besar subtipe ditemukan, walaupun subtipe B kurang umum.

35. subtipe tertentu dapat dihubungkan dengan cara penyebaran tertentu pula: misalnya, subtipe B dengan hubungan homoseksual dan penggunaan narkotik secara suntikan (pada intinya, melalui darah) dan subtipe E dan C, melalui hubungan heteroseksual (melalui jalur mukosal). Penelitian di laboratorium yang dilakukan oleh Dr. Max Essex dari Harvard School of Public Health di Boston, AS, menunjukkan subtipe C dan E menularkan dan menggandakan diri lebih efisien dibandingkan dengan subtipe B pada sel Langerhans yang ada dalam mukosa vagina, leher rahim, dan kulup penis, tetapi tidak pada dinding dubur. Data memperlihatkan HIV subtipe E dan C lebih mudah menyebar secara heteroseksual dibandingkan dengan subtipe B.