Analisis kandungan asam amino utama menggunakan HPLC dapat membedakan daging babi dari daging sapi, kambing, ayam, dan chevon berdasarkan perbedaan kadar valin, histidin, dan arginin. Teknik ini berpotensi sebagai penanda halal untuk otentikasi daging.

1. Analisis Makanan Obat dan Kosmetik Halal
OR

2. Member List :
Ageng Hasna Fauziyah
1111102000088
Aditya Ramadhan
1111102000093
Nova Sari Aulia
1111102000098
M.A. W. Khairurrijal
1111102000102
Putri Nur Handayani
1111102000104
Hestiawati
1111102000110

3. Pengertian HPLC
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT/HPLC)
merupakan salah satu metode kromatografi cair
yang menggunakan fase diam yang ditempatkan
dalam suatu kolom tertutup dan juga fase
geraknya berupa pelarut yang dialirkan dengan
cepat kedalam kolom dengan bantuan pompa.

4. Schematic of an HPLC
instrument

5. Komponen pokok yang ada dalam alat HPLC :
1. Gradien Controller / solvent Reservoir, fungsinya untuk
menampung fasa gerak yang akan dialirkan ke dalam
kolom dengan bantuan pompa.
2. Pompa, fungsinya untuk mendorong fasa gerak masuk ke
dalam kolom.
3. Sample Introductions / Injector, fungsinya sebagai tempat
memasukan cuplikan / sampel dengan bantuan syringe.
4. Kolom, merupakan jantung dari sistem HPLC, karena di
dalam kolomlah terjadi pemisahan komponen –
komponen cuplikan.
5. Detektor, fungsinya untuk mendeteksi komponen – komponen
cuplikan hasil pemisahan kolom.
6. Data output, fungsinya untuk menampilkan hasil yang
diperoleh.

7. Keunggulan dan kelemahan
HPLC
Keunggulan Kelemahan
• Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu
campuran dengan daya memisah yang tinggi.
• Waktu analisa cukup singkat.
• Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan
bahan analisis.
• Dapat menganalisis sampel yang kecil
kuantitasnya.
• Dapat digunakan bermacam-macam detektor
dengan kepekaan yang tinggi.
• Kolom dapat digunakan kembali.
• HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak
mudah menguap dan zat yang tidak stabil.
• Membutuhkan waktu yang lama untuk optimasi,
• Mahal,
• Membutuhkan personil yang terlatih

8. Differentiation of pork from beef, chicken,
mutton and chevon according to their primary
amino acids content for halal authentication
Abstrak
Deteksi kandungan daging babi dalam berbagai produk makanan telah menjadi subjek
penting dari penelitian di banyak negara. Studi ini bertujuan untuk membedakan daging
babi dari daging yang dipilih yaitu daging sapi, daging kambing, chevon dan ayam
berdasarkan kadar asam amino utama mereka menggunakan fase terbalik-kromatografi
cair kinerja tinggi (RP-HPLC) dengan derivatisasi oleh o-phthalaldehyde (OPA) dan detektor
ultraviolet (UV). Hasil penelitian menunjukkan bahwa asam amino yang paling
membedakan antara daging babi dengan yang lain-lain adalah valin, histidin, serin, alanin
dan arginin. Temuan sini meletakkan dasar bagi masa depan penelitian untuk
mengembangkan penanda yang dapat berguna untuk autentikasi daging halal berdasarkan
kandungan dari asam amino.
Kata kunci: RP-HPLC, OPA, Asam amino, daging halal, daging babi.

9. Pendahuluan
Otentikasi bahan baku dan produk jadi dan deteksi berbagai bentuk
pemalsuan makanan merupakan kepentingan utama bagi konsumen dan
industri (Ahmad, 2006;. Aida et al, 2005; Ozen et al., 2003). Karena
meningkatnya masalah kesehatan dan sensitivitas di kalangan konsumen
terutama mengenai kualitas makanan, oleh karena itu, saat ini analisis
makanan dan autentikasi merupakan sesuatu yang sangat dibutuhkan.
Menurut Islam, faktor yang penting untuk konsumen Muslim adalah status
halal dan haram suatu makanan. Tuntutan untuk produk makanan dengan
otentikasi halal meningkat dan tren ini diperkirakan akan terus berlanjut
bersamaan dengan pertumbuhan penduduk (Ahmad, 2006). Oleh karena itu,
deteksi daging babi di berbagai produk makanan telah menjadi subjek
penting dari penelitian di banyak negara, terutama di mana hukum agama
yang melarang konsumsi produk daging babi.

10. Pendahuluan
• Perangkat analisis seperti kromatografi cair kinerja tinggi
(HPLC) secara luas digunakan untuk karakterisasi dan
deteksi pemalsuan dari berbagai produk makanan .
• Teknik berbasis kromatografi menawarkan alat cepat dan
terpercaya untuk pemisahan dan analisis kuantitatif dari
banyak komponen mayor dan minor dengan struktur
kimia yang sangat mirip dalam makanan yang kompleks.
• Dengan demikian, tujuan dari penelitian ini adalah untuk
membedakan jenis daging yang umum menggunakan
profil asam amino utama mereka yang mungkin sebagai
penanda dalam otentikasi daging.

11. Bahan dan Metodologi
Bahan Kimia dan Reagen :
• Asetonitril
• Asam klorida
• Metanol (HPLC grade)
[diperoleh dari Merck KGaA (Darmstadt, Jerman)]
• o-Phthaldialdehyde asam 3-Mercaptopropionic (OPA/3-MPA)
• Buffer borat
• Amber wideopening vial
• Sisipan berbentuk kerucut kaca dengan kaki polimer dan tutup
sekrup
• Larutan 17 asam amino standar dalam lima konsentrasi (10, 25,
100, 250 dan 1 nmol / L)
[diperoleh dari Agilent (USA)]
• Milli-Q water.

12. Preparasi Sampel
– Enam sampel otentik dari daging per jenis hewan dikumpulkan. Sampel
daging sapi, daging kambing, chevon, dan ayam chevon (24 total
sampel) diperoleh dari Departemen Ilmu Hewan, Fakultas Pertanian,
Universitas Putra Malaysia, Serdang, Malaysia.
– Enam sampel babi yang dibeli dari pasar basah lokal di Malaysia.
– Sampel daging (0,3-0,4 g) dada ayam dan longissimus dorsi dari daging
sapi, daging kambing, chevon, dan babi dihidrolisis dalam gas nitrogen
dengan 15 ml HCl 6 N.
– Kemudian dimasukkan ke dalam oven bersuhu 110°C selama 24 jam.
– Setelah itu dilakukan pendinginan pada suhu kamar.
– ad hingga mencapai 50 mL dengan Milli-Q water.
– Larutan sampel disaring dengan filter membran selulosa asetat yang
ukuran porinya 0,45 M.
– Injeksikan ke dalam HPLC.

13. Cont., Preparasi Sampel
– Asam amino ditentukan menggunakan Agilent 1100 sistem HPLC (Agilent
Technologies, USA), dilengkapi dengan pompa kuartener.
– Sampel yang diajukan ke pra-kolom di derivatisasi otomatis dengan bantuan
OPA-3MPa.
– Setelah derivatisasi, jumlah yang setara dengan 3,5 uL dari masing-masing
sampel disuntikkan pada kolom Zorbax Eclipse-AAA, 4,6 × 150 mm, 3.5 m (PN
963400-902).
– Fase gerak A adalah 40 mM NaH2PO4, diatur pHnya hingga pH 7,8 dengan
NaOH.
– Fase gerak B mengandung 45 asetonitril, metanol 45, dan 10% air deionisasi.
– Suhu kolom kromatografi sebesar 40°C.
– Laju alir 1,5 mL/menit dengan program gradien (Tabel 1).
– Panjang gelombang untuk deteksi ditetapkan pada UV 338 nm, 10 nm
bandwith.
– Identitas dan jumlah asam amino yang dinilai dibandingkan dengan waktu
retensi dan luas puncak dari asam amino standar yang diperoleh.

14. Elusi Gradien yang Digunakan

15. Analisis Statistikal
• Analisis satu arah varians dilakukan dengan menggunakan
General Linear Model (GLM PROC).
• Analisis komponen utama (PCA) dilakukan dengan
menggunakan PROC PRINCOMP dari paket komputer Statistik
Analisis Sistem (SAS) (SAS Institute Inc, 2005).
• Selanjutnya, Duncan’s New Multiple Range Test digunakan
untuk memisahkan.
• Principal Component Analysis (PCA) dilakukan untuk
menentukan arah utama dari variasi antara daging. Sampel
yang diteliti akan berada dalam sebuah grafik berdasarkan
pada tiga PC.

16. Hasil dan Diskusi
• Penggunaan RP-HPLC memungkinkan penentuan asam
amino dalam waktu yang relatif singkat pada sampel
kecil dan dengan sensitivitas dan spesifisitas yang baik.
• Dalam studi ini, dipilih metode yang menggunakan pra-
kolom derivatisasi dengan OPA / 3-MPA. OPA telah
digunakan untuk bereaksi dengan asam amino primer.
Bahan kimia ini lebih sensitif dan lebih mudah
digunakan daripada fluorescamine dan 10 kali lebih
sensitif dibandingkan ninhidrin.

17. • GLY memiliki konsentrasi tertinggi dibandingkan dengan asam amino lainnya diukur
pada semua jenis daging, dan menurut Aristoy dan Toldra ( 1991) GLY memiliki jumlah
tertinggi dibandingkan dengan asam amino lainnya dipelajari dalam daging babi
• MET memiliki konsentrasi terendah dari asam amino dalam daging sapi, kambing,
ayam, dan chevon.
• Konsentrasi terendah dari asam amino dalam daging babi adalah TYR.
• VAL ditemukan secara signifikan lebih rendah dalam daging babi daripada jenis daging
lain yang dipelajari, sehingga membuat VAL penanda kandidat yang mungkin untuk
otentikasi halal pada produk daging, sementara Gilka et al. ( 1989) dan Webb et al . (
2005) menunjukkan kuantitas tinggi VAL dalam daging kambing dan chevon

18. Analisis satu arah varians dilakukan dengan
menggunakan General Linear Model (GLM PROC)
VAL sebagai penanda utama untuk memisahkan daging babi dari jenis daging lainnya yang ditemukan sangat
berkorelasi (p ≤ 0,01) dengan ASP, SER, HIS, THR dan ALA dengan koefisien korelasi masing-masing -0.63, - 0,82,
0,68, 0,68 dan -0,77. Arah koefisien korelasi menunjukkan hubungan negatif antara VAL dan ASP, SER dan ALA.
Hal ini menunjukkan bahwa Konsentrasi VAL dalam daging dipelajari meningkat ketika konsentrasi ASP, SER dan
ALA menurun, dan sebaliknya. Sebaliknya, konsentrasi VAL ditemukan meningkat seiring dengan peningkatan
HIS dan THR, yang menunjukkan hubungan positif. Selain itu, VAL juga mengungkapkan hubungan negatif dan
signifikan (p ≤ 0,05 di) dengan ILE, LYS dan PRO dengan koefisien korelasi masing-masing -0.59, -0.54, dan -0.54.

19. Pengelompokkan asam amino kemudian dilakukan
dengan metode Principal Components Analysis (PCA).
PCA adalah teknik untuk menentukan komponen
utama yang merupakan kombinasi linier dari variabel
asli.
Dengan demikian dapat disimpulkan bahwa tiga PC
mampu membedakan jenis daging berdasarkan variasi
dalam persentase SER, HIS, VAL, ALA dan ARG

20. Kesimpulan
• SER, ALA dan VAL mungkin penanda kandidat untuk
membedakan daging babi dan ayam.
• Daging babi dapat dibedakan dari jenis daging merah
lainnya menggunakan indikator VAL, HIS dan ARG.
• RP-HPLC dengan pra-kolom derivatisasi dapat
digunakan dengan cepat, sederhana dan biaya teknik
yang efektif untuk otentikasi daging babi dari ayam,
sapi, kambing, dan chevon.

21. Lets ask ...
And we
search
the answer
together