THỰC HÀNH TỐT PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT THEO TIÊU CHUẨN WHO

1. THỰC HÀNH TỐT
PHÒNG THÍ NGHIỆM VI SINH VẬT
THEO TIÊU CHUẨN WHO

2. NHỮNG YÊU CHUNG CỦA PHÒNG
THỬ NGHIỆM VI SINH VẬT

3. MỤC ĐÍCH VÀ PHẠM VI ÁP DỤNG
 Cung cấp cho phòng thí nghiệm (PTN) Vi sinh những
qui định cơ bản để xây dựng hệ thống chất lượng theo
tiêu chuẩn GLP – WHO
 Các phép thử PTN Vi sinh thường được thực hiện:
- Thử vô khuẩn
- Phát hiện, phân lập, định tính, định lượng VSV (VD: Thử
giới hạn nhiễm khuẩn; định tính, định lượng VSV trong
chế phẩm probiotics); thử endotoxin
- Định lượng bằng PP VSV (VD: Định lượng kháng sinh
bằng PP khuyếch tán trên thạch; định lượng vitamin B12
bằng PP đo độ đục)

4. 1. NHÂN SỰ
Có kiến thức cơ bản về vi sinh vật
 Được đào tạo kỹ năng, giáo dục các nguyên tắc GLP, GMP,
kiểm tra trình độ chuyên môn và các nguyên tắc định kỳ
 Rèn luyện tính tự giác và tuân thủ quy định
 Phân công chi tiết
 Mọi nhân viên phải có nghĩa vụ báo cáo với người có
thẩm quyền những biểu hiện không phù hợp trong quá trình
hoạt động

5. NHÂN SỰ

6. NHÂN SỰ
 Năng lực: có đủ năng lực và kinh nghiệm để thực hiện
phép thử và vận hành thiết bị
- Có trình độ phù hợp: được đào tạo cơ bản về sinh học
(DSĐH, DSTH, CNSH). Nắm được các kĩ thuật vi sinh cơ bản:
đổ đĩa thạch, đếm khuẩn lạc, kĩ thuật vô khuẩn, pha chế môi
trường, thao tác pha loãng, kĩ thuật định danh VSV… Có thể
đào tạo lại nếu cần. Nếu 1 phép thử ko được tiến hành
thường xuyên, cần đánh giá lại năng lực của KNV trước khi
tiến hành phép thử đó
- Nhân viên phải được huấn luyện các kĩ năng cần thiết để
lưu giữ, sử dụng VSV an toàn trong KV thử nghiệm (thay
trang phục phòng sạch, vệ sinh tay trước khi vào/ra PTN,
thao tác tránh tạp nhiễm, vệ sinh PTN…)

7. NHÂN SỰ
 Đào tạo:
- Đào tạo ban đầu đầy đủ bao gồm cả các kỹ thuật VSV cơ
bản:
+ Phân công KNV có kinh nghiệm kèm cặp KNV mới
+ Trong quá trình kèm cặp, có so sánh kết quả kiểm
nghiệm của 2 KNV để đánh giá
. Phép thử ĐL kháng sinh bằng PP VSV: ≤ 5%
. Phép thử định tính (bao gồm cả đếm TS VSV):
kết quả giống nhau
+ Lưu lại HSKN của 2 KNV trên
- Đào tạo định kì hay khi thay đổi qui trình hay khi cập nhật
một PP thử mới
- Đánh giá định kì tay nghề của KNV nội bộ trong PTN (1
năm/1 lần)

8. 2. CƠ SỞ VẬT CHẤT, MÔI TRƯỜNG
* Nguyên tắc chung để thiết kế phòng sạch:
- Các thao tác khác nhau được thiết kế ở các khu vực riêng
biệt, đặc biệt phải có khu vực riêng tiến hành “Thử vô khuẩn”.
(Trang 74, TRS 961)
- PTN phải được bố trí phù hợp: đủ rộng để cho tất cả các hoạt
động ko bị xáo trộn, nhiễm bẩn, nhiễm chéo.
Có đủ ko gian cho các hoạt động: lưu mẫu, lưu giữ chủng
chuẩn, m/tr, tiến hành thử nghiệm, đọc kết quả. Tách riêng nơi
bảo quản: chủng chuẩn, m/tr vô khuẩn… (tránh nhiễm chéo)

9. 2. CƠ SỞ VẬT CHẤT, MÔI TRƯỜNG
- Cấp độ sạch phù hợp với từng phép thử (Trang 75, TRS
961)
- Phòng thay trang phục phải cùng cấp sạch với phòng thử
nghiệm (Trang 76, TRS961)
- Cấp độ sạch được thiết kế tăng dần: Vùng đệm - D – C – B
- Hướng mở cửa: mở cửa vào khu vực được phép ô nhiễm

10. CƠ SỞ VẬT CHẤT, MÔI TRƯỜNG
- Chất liệu trần, tường: dễ vệ sinh, chịu hóa chất ăn mòn, chất
tẩy rửa, chống cháy nổ, chống truyền nhiệt, ức chế sự phát
triển vi sinh vật. Hạn chế việc sử dụng tủ (cupboard), ngăn kéo
(shelves)
- Phải có chốt gió giữa các khu vực sạch khác nhau
- Chênh áp giữa các cấp sạch: Chênh áp giữa hai cấp sạch tốt
nhất là 15 pa ± 3 pa , giá trị chấp nhận được từ 5 pa đến 20 pa.

11. CƠ SỞ VẬT CHẤT, MÔI TRƯỜNG

12. CƠ SỞ VẬT CHẤT, MÔI TRƯỜNG

13. CƠ SỞ VẬT CHẤT, MÔI TRƯỜNG
- Bố trí hệ thống cấp khí riêng giữa PTN Vi sinh với khu vực SX.
Cần có hệ thống riêng xử lí khí, khống chế nhiệt độ, độ ẩm cho
PTN VSV để cung cấp khí có chất lượng phù hợp, ko bị tạp nhiễm
- Hạn chế việc ra vào PTN VSV. Nhân viên PTN phải hiểu rõ:
+ Q/tr đi vào và đi ra khỏi PTN bao gồm cả việc mặc trang
phục phòng sạch
+Mục đích sử dụng của khu vực bị hạn chế ra vào
+Các qui định cần tuân thủ khi làm việc trong khu vực đó
+Lí do của việc đặt ra những qui định như vậy
+ Cấp độ nguy hiểm của khu vực (KV thao tác với VSV
gây bệnh P. aeruginosa, C. albicans…: an toàn SH cấp 2)

14. CƠ SỞ VẬT CHẤT, MÔI TRƯỜNG
- Các hoạt động của PTN (VD: c/bị mẫu, c/bị m/tr, c/bị thiết
bị, đếm số lượng VSV nên được tách biệt bởi ko gian hoặc ít
nhất bởi thời gian để tránh nhiễm chéo, dương tính giả, âm
tính giả.
Riêng phép thử vô khuẩn phải được tiến hành ở khu vực riêng
chuyên biệt, kiểm soát nghiêm ngặt
- Hạn chế di chuyển thiết bị giữa các khu vực có cấp sạch khác
nhau trong PTN để tránh nhiễm chéo. Các TB của PTN VSV
ko nên đặt bên ngoài PTN VSV, trừ khi có chỉ dẫn đặc biệt để
tránh nhiễm chéo

15. CƠ SỞ VẬT CHẤT, MÔI TRƯỜNG
(Appendix 1 – Annex 2 –TRS 961)
KHU VỰC CẤP SẠCH
Nhận mẫu Ko xếp loại
Chuẩn bị môi trường, dung dịch Ko xếp loại
Đưa dụng cụ và môi trường vào nồi hấp Ko xếp loại
Lấy dụng cụ và m/tr ra khỏi nồi hấp Cấp B
Thử vô khuẩn – UDAF (unidirectional
airflow)
Cấp A
Thử vô khuẩn – nơi KNV ngồi thao tác Cấp B
KV đặt tủ nuôi cấy vi sinh vật Ko xếp loại
Thử giới hạn nhiễm khuẩn Ko xếp loại
(các thao tác nghiêm ngặt
được tiến hành dưới
LAF/BSC)
Xử lí dụng cụ, m/tr sau thí nghiệm Ko xếp loại

16. THẨM ĐỊNH
BAN ĐẦU KHI LẮP ĐẶT PHÒNG SẠCH
Nên tiến hành lặp lại 3 lần:
- Thẩm định toàn bộ các chỉ tiêu phòng sạch lúc mới lắp đặt
- Thẩm định PP thử vô khuẩn
- Thẩm định q/tr VS PTN
- Thẩm định thời hạn sử dụng m/tr, dung dịch đệm, dụng cụ,
trang phục
- Thẩm định thời gian cần thiết để phòng sạch đạt được độ sạch
theo yêu cầu sau khi bị ngừng hoạt động do sự cố mất điện, do
bảo dưỡng

17. CÁC THÔNG SỐTHẨM ĐỊNH HỆ THỐNG HVAC
(TRS 961)
1. HEPA filter penetration tests (Độ kín của màng HEPA)
2. Room particle counts (Tiểu phân đối với cấp sach A, B, C, D)
3. Room clean-up rates (Khả năng làm sạch của phòng đối với cấp
sach B, C)
4. Microbiological air and surface counts where appropriate (Chỉ tiêu
vi sinh đối với cấp sach A, B, C, D)
5. Room pressures (pressure differentials) (Chênh áp phòng)
6. Room airflow patterns (Hướng dòng khí đối với cấp sạch A, B)
7. Unidirectional flow velocities (Tốc độ gió đối với cấp sạch A )
8. Containment system velocities

18. CÁC THÔNG SỐTHẨM ĐỊNH HỆ THỐNG HVAC
(TRS 961)
9. Temperature (Nhiệt độ)
10. Relative humidity (Độ ẩm)
11. Supply air quantities for all diffusers (Lưu lượng gió cấp)
12. Return air or exhaust air quantities ( Tỷ lệ khí hồi hoặc khí thải)
13. Room air change rates (Số lần trao đổi khí trong phòng)
14. Operation of de-dusting (Quy trình vệ sinh)
15. Warning/alarm systems where applicable (Hệ thống cảnh báo)
(Trang 256, 257 TRS 961)
* Cấp sạch A: 6 tháng tiến hành tái thẩm định đầy đủ các chỉ tiêu.
* Cấp sạch B: 12 tháng tiến hành tái thẩm định đầy đủ các chỉ tiêu.

20. THIẾT KẾ PHÒNG SẠCH

21. KIỂM SOÁT M/TR PTN VSV
Cần có qui trình kiểm soát định kỳ m/tr PTN VSV:
- Lấy mẫu không khí: xác định số lượng tiểu phân và vi sinh
vật.
- Kiểm soát vi sinh bề mặt (contact plate), vi sinh trong
không khí bằng PP đặt đĩa (settle plate)
- Kiểm soát nhiệt độ, độ ẩm
- Chênh lệch áp suất
- Xác định GH cảnh báo (Alert Limit) và GH hành động
(Action Limit)
- Đánh giá xu hướng của môi trường

22. 3.VỆ SINH PHÒNG THÍ NGHIỆM
- Phải có qui trình VS, khử trùng PTN, thiết bị
- Phải có qtr xử lí khi có sự cố đổ tháo VSV sống
- Nên SD nhiều loại h/ch khử trùng, nên thay đổi 3 tháng 1 lần
để tránh VSV đề kháng với hóa chất
- Có đầy đủ dd rửa tay và khử trùng tay cho KNV
-Tần suất vệ sinh (Appendix 2/ Annex 2):
+ Làm sạch và khử trùng bề mặt làm việc: hàng ngày
và trong quá trình sử dụng
+ Lau sàn, khử trùng sàn và bồn rửa: hàng ngày
+ Làm sạch và khử trùng các bề mặt khác: 3 tháng 1
lần

23. Các hóa chất khử trùng
Khử trùng: là quá trình làm giảm số lượng vi sinh vật trên đối
tượng tượng bằng các tác nhân: hóa học, vật lý
* Các hóa chất khử trùng:
+ Các alcol: Thời gian tác dụng nhanh nhưng hoạt tính
diệt khuẩn yếu, có tác dụng trên các vi sinh vật ở dạng sinh
dưỡng, virus, nấm nhưng không có tác dụng trên nha bào. Các
chất thường dùng ethanol nồng độ ≥ 60º, isopropyl nồng độ ≥
20°, dễ cháy nổ....
+ Clo và dẫn chất clo: Thời gian tác dụng nhanh, phổ tác
dụng rộng, nhưng dễ gây kích ứng cho người sử dụng. Các hóa
chất thường dùng dd HCL (5,25%–6,15%), natri hypoclorid,
calci hypoclorid (nồng độ ≥ 500 ppm)...Có tác dụng diệt nha
bào.
3.VỆ SINH PHÒNG THÍ NGHIỆM

24. 3.VỆ SINH PHÒNG THÍ NGHIỆM
+ Dẫn chất aldehyd: độc tính hiên nay không sử dụng
+ Hydroxy peroxyd: Thời gian tác dụng trung bình, phổ
tác dụng rộng có tác dụng trên cả nha bào và bào tử nấm, nồng
độ 0,5 % đã bắt đầu có khả năng diệt khuẩn, nồng độ hữu dụng
≥ 3%
+ Một số hóa chất khác: Ortho-phthalaldehyde (OPA),
Peracetic Acid , Peracetic Acid and Hydrogen Peroxide,
Phenolics, dẫn chất amin …..

25. 4. KHU VỰC THỬ VÔ KHUẨN
1. Phép thử VK phải được tiến hành trong phòng sạch được
kiểm soát môi trường chặt chẽ để đảm bảo chất lượng phép
thử vô khuẩn
2. Thử vô khuẩn được tiến hành trong cấp sạch A
(Unidirectional airflow - UDAF hoặc Biosafety cabinet -
BSC) được đặt trong khu vực cấp sạch B
Ngoài ra, thử VK còn được tiến hành trong Isolator
3. Khi thiết kế PTN cần đảm bảo dòng khí thổi đều song song,
ko bị gián đoạn

26. KHU VỰC THỬ VÔ KHUẨN
4. Khí sạch cấp cho khu vực cấp sạch A và B phải qua màng
lọc HEPA cuối cùng
5. Cần có đồng hồ đo chênh áp và thiết bị cảnh báo hướng
của dòng khí.
6. Chênh áp PTN cần được theo dõi và ghi lại bởi đồng hồ
đo từ bên ngoài. Ngoài ra, phải có đồng hồ đo chênh áp
ngay trước cửa PTN để KNV đọc giá trị chênh áp trước khi
vào khu vực đó. Nên ghi rõ giới hạn chấp nhận của chênh
áp của khu vực cạnh đồng hồ để dễ kiểm soát

27. KHU VỰC THỬ VÔ KHUẨN
7. Để đi vào phòng sạch cần qua hệ thống airlock và phòng
thay đồ. Phòng thay đồ cuối cùng (final change room) có cấp
sạch (ở trạng thái nghỉ) bằng với cấp sạch mặc trang phục đó.
Phòng thay đồ có thể được bố trí thành airlock, nên bố trí
ghế thay dép; gương
8. Phòng sạch
- Khu vực sạch cấp A, B được thiết kế sao cho các hoạt động
trong KV này có thể quan sát từ bên ngoài

28. KHU VỰC THỬ VÔ KHUẨN
9. Phòng sạch:
- Không để thiết bị vì gây khó khăn khi vệ sinh
- Không để bồn rửa, ống thoát nước
10. Phải kiểm soát vi sinh vật khu vực thử vô khuẩn phải được
tiến hành trong mỗi lần thí nghiệm
Kiểm soát vi sinh vật: lấy mẫu không khí; đặt đĩa; kiểm tra bề
mặt; kiểm tra găng tay.

29. KHU VỰC THỬ VÔ KHUẨN
- Tần suất kiểm tra các chỉ tiêu vi sinh vật

30. 5.TRANG PHỤC PHÒNG SẠCH
1. Lựa chọn chất liệu: vải, chỉ khâu, khóa, phụ kiện
+ Khả năng chịu nhiệt:
+ Khả năng tạo bụi
+ Khả năng ngăn cản xâm lấn
2. Kiểu dáng:
+ Phù hợp với cấp sạch, quần áo liền bộ trong cấp sạch C, B
+ Mầu sắc thay đổi theo cấp độ sạch khác nhau

31. TRANG PHỤC PHÒNG SẠCH
1. Quần áo khu vực bên ngoài (outdoor clothing) không được
mang vào khu thay đồ dẫn đến cấp sạch C và B.
Với các KNV làm việc tại cấp sạch A và B, trang phục vô
khuẩn, khẩu trang và găng tay phải được thay mới cho mỗi
buổi thử nghiệm. Găng tay được khử trùng thường xuyên trong
quá trình thử nghiệm. KNV làm việc trong khu vực A và B phải
mang kính bảo hộ đã được tiệt trùng
2. Không sử dụng đồng hồ đeo tay, trang điểm, đeo trang sức
trong phòng sạch

32. 3. Trang phục cấp D: Tóc, râu được che kín; mặc quần áo, đi
giày/bao giày phù hợp; có biện pháp phù hợp để tránh tạp
nhiễm ra PTN
4. Cấp C: Tóc, râu được che kín; mặc áo liền quần; có chun ở
cổ tay; cổ cao; đi giày/bao giày phù hợp; vải quần áo bằng chất
liệu chuyên dụng không nhả sơ, tiểu phân.
5. Quần áo phòng sạch được giặt sạch, không lưu giữ tác nhân
gây tạp nhiễm. Nên giặt ở khu vực riêng. Nếu quần áo vải
không được giặt theo cách phù hợp, có thể sẽ tăng nguy cơ
phát tán tiểu phân. Cần có SOP về việc giặt và khử trùng quần
áo
TRANG PHỤC PHÒNG SẠCH

33. Trang phục cấp D Trang phục cấp C
TRANG PHỤC PHÒNG SẠCH

34. Hình ảnh
Trang phục phòng sạch
cấp B
TRANG PHỤC PHÒNG SẠCH

35. 6. PHƯƠNG PHÁP THỬ
-Tất cả các phương pháp thử VSV phải được biên soạn thành
SOP và thường xuyên cập nhật
- Các SOP phải luôn có sẵn để thuận tiện tham khảo
-Các phương pháp thử thường được sử dụng:
+Phương pháp tiêu chuẩn trong các Dược điển
+Phương pháp của các hiệp hội khoa học có uy tín như
AOAC, APHA…
+Phương pháp đăng tải trên các tạp chí KH
+Phương pháp của các nhà sản xuất
+Phương pháp do PTN tự biên soạn

36. PHƯƠNG PHÁP THỬ
- PP tiêu chuẩn (PP Dược điển) coi như đã được thẩm định.
Tuy nhiên, khi PTN áp dụng 1 PP tiêu chuẩn trên mẫu cụ thể
thì PTN cần được chỉ ra sự phù hợp của PP đó. PTN cần chỉ
rõ các tiêu chí của PP tiêu chuẩn đó đã được PTN đáp ứng
trước khi PTN áp dụng PP này vào thử nghiệm mẫu hàng
ngày (method verification).

37. 7. SỬ DỤNG BẢO TRÌ, HIỆU CHUẨN THIẾT BỊ
- Phải có qui trình thẩm định IQ, OQ, PQ (với TB mới mua),
q/tr hiệu chuẩn, q/tr bảo dưỡng, hướng dẫn SD cho từng thiết
bị
- Phải có kế hoạch hiệu chuẩn, bảo dưỡng TB cơ bản ảnh
hưởng trực tiếp đến KQ thí nghiệm (tủ ấm, nồi hấp, cân,
BSC...) dùng cho phép thử Vi sinh
- Phải tiến hành bảo trì, hiệu chuẩn thiết bị theo chương trình
đã đưa ra.
- Chi tiết của công tác bảo trì, hiệu chuẩn phải được ghi chép
đầy đủ và lưu trữ

38. SỬ DỤNG,BẢO TRÌ, HIỆU CHUẨN THIẾT BỊ
- Ngày hiệu chuẩn, bảo dưỡng, ngày hiệu chuẩn tới cần được
ghi trên nhãn của thiết bị.
- Tần suất hiệu chuẩn theo quy định

39. BẢO TRÌ THIẾT BỊ
(Appendix 2-Annex 2 TRS 961)
THIẾT BỊ YÊU CẦU TẦN SUẤT
- Tủ n/c VSV
- Tủ sấy, tủ lạnh sâu
- Tủ lạnh
- Vệ sinh và tẩy uế
bề mặt bên trong của
TB
- Hàng tháng, khi có yêu
cầu
- Khi có y/c (VD: 3
tháng/lần)
- Khi có y/c (VD: 3
tháng/lần)
Nồi cách thuỷ - Tháo hết nước, vệ
sinh, tẩy uế, cấp
nước trở lại
- Hàng tháng hoặc 6
tháng nếu có h/ch diệt
khuẩn
Máy li tâm - Bảo dưỡng toàn
diện
- Vệ sinh và tẩy uế
- Hàng năm
- Mỗi lần sử dụng
BSC và LAF - Bảo dưỡng toàn
diện và kiểm tra cơ
khí
- Hàng năm hay theo
khuyến cáo của NSX

40. BẢO TRÌ THIẾT BỊ
THIẾT BỊ YÊU CẦU TẦN SUẤT
Nồi hấp - K/tra joant, VS và tháo
nước khỏi TB
- Bảo dưỡng toàn diện
- K/tra về an toàn (áp suất)
- Thường xuyên theo
k/cáo của NSX
- Hàng năm hay theo
k/cáo của NSX
- Hàng năm
Kính hiển
vi
- Bảo dưỡng toàn diện - Hàng năm
Máy đếm
tiểu phân,
lấy mẫu
KK
- Vệ sinh, sạc pin, bảo dưỡng
toàn diện
- Theo k/cáo của
NSX

41. BẢO TRÌ THIẾT BỊ
THIẾT BỊ YÊU CẦU TẦN SUẤT
Máy đo pH Rửa điện cực Mỗi lần sử dụng
Cân - Vệ sinh
- Bảo dưỡng
- Mỗi lần sử dụng
- Hàng năm
Hệ thống cấp nước
RO
Thay cục lọc,
màng lọc
- Theo khuyến cáo
của NSX
Bình kị khí Vệ sinh/Khử
trùng
Sau mỗi lần sử dụng
Máy phân phối môi
trường, dụng cụ thể
tích, pipet
Khử trùng, vệ
sinh
Sau mỗi lần sử dụng

42. HIỆU CHUẨN THIẾT BỊ
(Appendix 3-Annex 2 TRS 961)
Thiết bị Yêu cầu Tần suất
Nhiệt kế chuẩn (thủy
tinh)
- Hiệu chuẩn toàn bộ
- Hiệu chuẩn 1 điểm
(có kiểm tra điểm lạnh)
- 3 năm/lần
- Hàng năm
Nhiệt kế làm việc Kiểm tra đối chiếu với nhiệt kế
chuẩn ở điểm lạnh và điểm làm
việc
Hàng năm
Cân Hiệu chuẩn toàn bộ Hàng năm
Quả cân chuẩn Hiệu chuẩn toàn bộ Hàng năm
Dụng cụ thủy tinh Hiệu chuẩn bằng phân tích
trọng lượng
Hàng năm
Ẩm kế Hiệu chuẩn Hàng năm
Máy li tâm Hiệu chuẩn tốc độ Hàng năm

43. THẨM ĐỊNH VÀ KIỂM SOÁT THIẾT BỊ
(Appendix 4-Annex 2 TRS 961)
Thiết bị Yêu cầu Tần suất
Tủ nuôi cấy,
nồi cách thủy,
tủ lạnh, tủ lạnh
sâu
- Ktr sự ổn định nhiệt độ và đồng
đều nhiệt độ
- Kiểm soát nhiệt độ
- Ban đầu, 2 năm/lần và
sau mỗi lần SC, thay đổi
- Hàng ngày/mỗi khi SD
Tủ sấy - Ktr sự ổn định nhiệt độ và đồng
đều nhiệt độ
- Kiểm soát nhiệt độ
- Ban đầu, 2 năm/lần và
sau mỗi lần SC, thay đổi
- Mỗi khi SD
Nồi hấp - Thiết lập đặc tính cho mỗi
cycle hấp
- Kiểm soát nhiệt độ/áp suất/thời
gian
- Ban đầu, 2 năm/lần và
sau mỗi lần SC, thay đổi
- Mỗi khi SD
Class A
(BSC/Isolator)
dùng cho phép
thử vô khuẩn
- Thiết lập vận hành
- Kiểm soát VSV
- Kiểm soát tốc độ gió
- Ktr tính toàn vẹn của HEPA
- Ban đầu, hàng năm và
sau mỗi lần SC, thay đổi
- Mỗi khi SD
- 6 tháng/lần
- 6 tháng/lần

44. THẨM ĐỊNH VÀ KIỂM SOÁT THIẾT BỊ
Class A (LAF) - Thiết lập vận hành
- Kiểm soát VSV
- Kiểm soát tốc độ gió
- Ktr tính toàn vẹn của HEPA
- Ban đầu, hàng năm và
sau mỗi lần SC, thay đổi
- Hàng tuần
- 6 tháng/lần
- 6 tháng/lần
Đồng hồ So sánh với đồng hồ chuẩn
quốc gia
Hàng năm
Kính hiển vi Kiểm tra trục quang học Hàng ngày/mỗi khi SD
Máy đo pH Ktr với ít nhất 2 dung dịch đệm Hàng ngày/mỗi khi SD
Cân Ktr điểm zero, Ktr bằng quả
cân chuẩn
Hàng ngày/mỗi khi SD
Hệ thống cấp
nước RO
- Ktr độ dẫn điện
- Ktr VSV
- Hàng tuần
- Hàng tháng
Pipet Ktr độ đúng, độ chính xác - định kì (phụ thuộc tần
suất, quá trình SD)

45. KIỂM TRA VÀ HIỆU CHUẨN
TỦ NUÔI CẤY, NỒI CÁCH THUỶ, TỦ SẤY, TỦ LẠNH
 K/tr sự ổn định nhiệt độ, đồng đều nhiệt độ, t/gian để đạt
được nhiệt độ yêu cầu với từng ĐK làm việc cụ thể (VD:
khoảng cách, vị trí, độ cao giữa các ngăn đặt đĩa petri)
- Khi mới lắp đặt
- Định kì 1 năm/lần
- Sau khi sửa chữa lớn
 K/tra nhiệt độ: hàng ngày/mỗi khi SD bằng nhiệt kế đã được
hiệu chuẩn
 Cần ghi và lưu lại nhiệt độ hoạt động của TB (records)

46. KIỂM TRA VÀ HIỆU CHUẨN NỒI HẤP
 Nồi hấp phải có bộ phận cho phép theo dõi được nhiệt độ và
t/gian và áp suất. Sensor kiểm soát và điều khiển phải được
hiệu chuẩn định kì
 PTN cần 1 nồi hấp riêng để xử lí m/tr sau thí nghiệm
Ngoại lệ: dùng chung 1 nồi hấp, phải hấp riêng load
sạch/bẩn, có ch/tr VS bên trong và bên ngoài nồi hấp phù
hợp
 Tiến hành thẩm định khi:
- mới lắp đặt
- theo định kì 2 năm/1 lần, hoặc hàng năm
- khi có sửa chữa hay thay đổi lớn (thay sensor điều khiển nhiệt,
load, điều kiện hấp)

47. 8. NỒI HẤP
- Nồi hấp phải có bộ phận cho phép theo dõi được nhiệt độ và
t/gian và áp suất
- PTN cần 1 nồi hấp riêng để xử lí mtr sau thí nghiệm
-Ngoại lệ: dùng chung 1 nồi hấp, phải hấp riêng load sạch/bẩn.
-Tiến hành thẩm định khi:
+ Mới lắp đặt
+ Theo định kì 1 năm 1 lần
+ Khi có sửa chữa hay thay đổi lớn

48. PHÂN LOẠI NỒI HẤP THEO CẤU TẠO
1. Nồi hấp một cửa hay 2. Nồi hấp 2 cửa
còn gọi nồi hấp đứng.

49. 1. Nồi hấp áp suất
dương: Khi bắt đầu quá
trình tiệt khuẩn nước
trong bình hấp được hóa
sương và bão hòa toàn
bộ bình chứa.
PHÂN LOẠI NỒI HẤP THEO PHƯƠNG THỨC
HOẠT ĐỘNG

50. SỬ DỤNG, BẢO TRÌ, KIỂM ĐỊNH, HIỆU CHUẨN, THẨM ĐỊNH
NỘI DUNG TẦN SUẤT
Sử dụng - Vệ sinh bằng nước RO
- Sử dụng theo đúng hướng dẫn
- Kiểm soát nhiệt độ và thời
gian.
- Kiểm tra zoăng kín khí, tình
trạng vệ sinh của bình hấp
bằng mắt.
- Dùng chỉ thị sinh học
- Hàng tuần hoặc
theo khuyến cáo
của nhà sản suất
- Mỗi khi sử dụng
-Mỗi khi sử dụng
- Hàng tháng
Bảo trì - Bảo dưỡng toàn diện từ hang
sản xuất
- Hàng năm
Kiểm định - Kiểm an toàn bình chịu áp lực - 2 năm

51. SỬ DỤNG, BẢO TRÌ, KIỂM ĐỊNH, HIỆU CHUẨN, THẨM
ĐỊNH
NỘI DUNG TẦN SUẤT
Hiệu chuẩn Đồng hồ đo áp - Hàng năm
Thẩm định
(7 bước)
1. Kiểm tra lại các thông số IQ,
OQ, lựa chọn các chương trình
hấp
2.Phân bố nhiệt: kiểm tra mức độ
đồng đều nhiệt độ trong nồi hấp ở
trạng thái không tải (distribution
test). Yêu cầu khi tất cả đầu dò
nhiệt đạt 121ºC: chênh lệnh của 1
đầu dò ≤ 1º, giữa các đầu dò ≤ 2º,
đầu dò và hiển thị 3º.
3. Thiết kế bao gói các vật hấp
- Hàng năm

52. SỬ DỤNG, BẢO TRÌ, KIỂM ĐỊNH, HIỆU CHUẨN, THẨM ĐỊNH
NỘI DUNG TẦN SUẤT
Thẩm định 4. Thiết kế sơ đồ vật hấp trong nồi:
Fix load- fix position
Load Max-Min
5. Lựa chọn chỉ thị sinh học
6. Thâm nhập nhiệt : kiểm tra mức độ thâm
nhập nhiệt độ trong nồi hấp ở trạng thái có
tải (Penetrtion test). Sử dụng ít nhất 7 đầu dò
nhiệt (mục 16.2.2.3 EN 285)
Yêu cầu tất cả đầu dò nhiệt đạt 121ºC trở
nên: chênh lệch đầu dò và hiển thị 3º. F ≥
12D. Chỉ thị sinh học phải chết
7. Kết luận và công bố kết quả thẩm định
- Hàng năm

53. * Hệ số tích lũy nhiệt
- Sự thâm nhập của nhiệt ở trạng thái có tải (Penetration
test): đ/v mỗi chế độ hấp môi trường, dụng cụ
Yêu cầu: F ≥ 12D phút
trong đó: L: tỷ lệ chết
T: nhiệt độ tại thời điểm t
Tb: nhiệt độ hấp cơ bản
Z : giá trị Z của chỉ thị sinh học
∆t: khoảng t/g đọc kết quả
S1 đến Sn: lần đọc KQ thứ 1 đến n
THẨM ĐỊNH NỒI HẤP

54. CHỈ THỊ SINH HỌC
Các loại chỉ thị sinh học
Chỉ thị hấp Chỉ thị hấp dụng cụ
môi trường
SD chỉ thị sinh học (Biological indicator - BI) để k/tra khả năng tiệt
trùng của nồi hấp
-Thường SD: Geobacillus sterothermophilus
- Ngoài ra: Clostridium sporogenes, Bacillus subtilis, Bacillus
coagulans (theo USP)
HỆ SỐ Fo
Fo = D121 (log No – log N)
Trong đó: No: Số vi sinh vật có trong đối tương lúc
bắt đầu quy trình hấp
N: Số VSV có trong đối tượng lúc kết thúc
quy trình hấp

55. THẨM ĐỊNH NỒI HẤP
Yêu cầu:
F ≥ Fo
Overkill: F ≥ 12D phút

56. THIẾT BỊ ĐO THỂ TÍCH
TB, d/cụ đo thể tích phải được k/tr độ đúng và độ CX:
+ khi mới mua về
+ theo định kì
 Có thể bỏ qua g/đoạn k/tra ban đầu khi mới mua về đối với
d/cụ thuỷ tinh chính xác có GCN chất lượng của NSX
 Micropipet thay đổi được thể tích: phải được k/tra vài mức
thể tích. VD: k/tra ở thể tích 2 - 5 và 10ml đ/v pipet 10ml
 D/c đo thể tích dùng 1 lần:
- Có CQ của NSX:
+ K/tr lần đầu mới mua
+ Các lần sau: k/tra ngẫu nhiên 1 lô
- Ko có CQ của NSX: k/tra tất cả các lô

57. THUỐC THỬ
 Phải k/tra tính phù hợp của thuốc thử quan
trọng đối với thử nghiệm, khi mới mua, mới pha và
trong quá trình SD
VD: khi SD huyết tương thỏ để p/hiện S.
aureus
- S. aureus: chủng dương tính
- S. epidermidis: chủng âm tính

58. MÔI TRƯỜNG
 Phải đ/g nhà cung cấp m/tr. Nhà cung cấp có chứng chỉ chất lượng mtr ở
mỗi lô mtr. Cần đánh giá khả năng dinh dưỡng (growth promotion test)
hoặc các chỉ tiêu phù hợp khác trên tất cả các loại m/tr ở từng lô và từng
lần mua hàng
 Khi nhà cung cấp mtr pha chế sẵn (ready to use) đã được đánh giá, có
certificate k/tr chất lượng (growth promotion test) của mỗi lô mtr, ĐK vận
chuyển đảm bảo thì người sử dụng chỉ cần k/tr định kì chất lượng mtr đó
 Một số chỉ tiêu về chất lượng cần đánh giá ở từng lô pha chế, mỗi lần
nhận mtr về :
- K/n phục hồi và kích thích sự ptr của VSV: Mtr phải có tỷ lệ phục hồi 50
- 200% (sau khi cấy 100 CFU VSV đích vào mtr)
- Khả năng ức chế sự ptr VSV không phải là VSV đích (non-target
organism). VD: M/tr Enterobacteria-Mossel lỏng ức chế sự ph/tr của S.
aureus
- Các p/ứ sinh hóa: đối với mtr phân biệt và mtr chẩn đoán
- Các đặc điểm khác: pH, thể tích, độ vô khuẩn

59. MÔI TRƯỜNG
 M/tr khô (dạng có sẵn đủ thành phần hoặc từng thành phần
mtr được đóng dạng khô, riêng lẻ) phải được bảo quản trong
lọ kín trong ĐK thích hợp, nơi khô mát, tránh á/s, theo nhãn
của NSX
 Ko sử dụng mtr khô có hiện tượng đóng cục, thay đổi màu
sắc.
 Nước dùng để pha chế mtr phải có CL phù hợp (nước cất,
nước tinh khiết), ko được chứa chất sát khuẩn, chất ức chế, trừ
khi có chỉ dẫn đặc biệt khác

60. MÔI TRƯỜNG
 Mtr chứa chất ức chế VSV phải được pha chế trong d/c
chuyên dụng để tránh lây nhiễm chất ức chế VSV sang mtr khác.
Nếu ko có d/c chuyên dụng thì phải thẩm định q/t rửa d/c đó
(Dùng chung đĩa petri cho phép thử ĐLKS và cho phép thử
ĐNK: có thể chứng minh qua đĩa chứng dương tính)
 Phân phối mtr sau tiệt trùng phỉ được tiến hành trong
LAB/BSC
 Mtr sau khi pha chế phải được bảo quản ở ĐK thích hợp và
loại bỏ sau khi hết hạn
 ĐK bảo quản và hạn dùng của mtr phải được thẩm định

61. MÔI TRƯỜNG TỰ PHA CHẾ
 Mtr chiếu xạ phải được bổ sung các chất chống oxy hóa để
bảo vệ mtr trước t/d của q/tr chiếu xạ. Mtr chiếu xạ phải được
thẩm định bằng cách tiến hành growth promotion test (định
lượng) trên mtr chiếu xạ và mtr ko chiếu xạ
 Mtr phải có số lô và CoA. Khi mua mtr, người sử dụng phải
chắc chắn sẽ được nhà cung cấp mtr cung cấp thông tin về bất
cứ sự thay đổi nào về chất lượng của mtr
 Pha chế mtr theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Chú ý điều
kiện nhiệt độ và thời gian hấp tiệt khuẩn
 Ko sử dụng lò vi sóng để đun chảy mtr do lò vi sóng cung
cấp nhiệt độ ko đồng đều

62. DÁN NHÃN
PTN phải đảm bảo để tất cả thuốc thử (bao gồm cả dung dịch
gốc), mtr nuôi cấy, dung dịch pha loãng được ghi nhãn đầy đủ
thông tin:
- Tên thuốc thử, mtr
- Nồng độ
- Điều kiện bảo quản
- Ngày pha chế
- Người pha chế
- Ngày hết hạn
Nên: Ghi số lô mtr trên nhãn, số lô này sẽ link với HS pha chế
và K/tra CL m/tr

63. CHỦNG ĐỐI CHIẾU VSV
 Mục đích sử dụng:
• K/tra chất lượng mtr nuôi cấy
• Thẩm định PP, xác định tính phù hợp của PP thử (chứng
dương tính)
• Định lượng kháng sinh bằng p/pháp VS
• Thẩm định thiết bị (nồi hấp, tủ sấy)
 Chủng đối chiếu phải được nối chuẩn:
• Sử dụng chủng đối chiếu được cung cấp trực tiếp từ các bảo
tàng giống quốc tế/quốc gia, ví dụ ATCC, NCTC, VTCC...

64. Các kỹ thuật cấy truyền vi sinh vật
 Định nghĩa một lần cấy truyền: “One passage is defined
as the transfer of organisms from a viable culture to a
fresh medium with growth of the microorganisms”
 Yêu cầu kỹ thuật của mỗi lần cấy truyền (GLP -WHO):
Phải kiểm tra độ thuần khiến và tính chất sinh vật hóa
học của chủng vi sinh vật ở mỗi lần cấy truyền.
 Đảm bảo không tạp nhiễm mỗi lần cấy truyền

65. Các kỹ thuật bảo quản vi sinh vật
1. Bảo quản bằng phương pháp đông lạnh
2. Bảo quản bằng phương pháp đông khô
3. Giữ giống trên thạch
4. Giữ giống trên môi trường thạch dưới lớp dầu khoáng

66. Bảo quản chủng vi sinh vật bằng phương
pháp đông lạnh
- Có thể bảo quản chủng vi sinh vật ở nhiệt độ ≤ - 30°C
trong thời gian 6-9 tháng.
- Chủng vi sinh vật bảo quản ở nhiệt độ ≤ - 70°C sẽ giữ
được tính chất định danh của vi sinh vật, trong thời gian
thẩm định và có thể kéo dài đến 10 năm.
*Kỹ thuật:
+ Nhũ hóa hỗn dịch vi sinh vật bằng các chất: sữa,
lòng trắng trứng, dung dịch glycerin 15%, dung dịch
glucose, lactose có 10-30% sữa… để bảo vể tế bào.
+ Phục hồi giống phải rất nhanh bằng cách đặt ống
vào nồi cách thủy 37 °C.
+ Không làm đông lạnh và tan băng nhiều lần

67. Bảo quản chủng vi sinh vật bằng phương
pháp đông khô
- Bảo quản bằng phương pháp đông khô giữ được tính chất
định danh của vi sinh vật, chủng đóng trong ống kín, bảo
quản trong tủ lạnh từ 1-2 năm.
*Kỹ thuật:
+ Nhũ hóa hỗn dịch vi sinh vật bằng các chất: sữa,
huyết thanh, dung dịch 10 % sacarose + 1 % glycerin,
dextran, polyvinyl… để bảo vể tế bào.
+ Làm giảm áp suất, hạ nhiệt trong khoảng từ - 20°C
đến – 40 °C
+ Độ ẩm dư của giống từ 1-6%

68. Giữ giống trên thạch


69. Giữ giống trên thạch
- Chủng được giữ trên môi trường thạch dinh dưỡng, bảo
quản ở 4-7 °C, thêm lớp dầu khoáng (paraffin, vazolin …)
vô khuẩn, thời gian giữ giống dài hơn có thể đến 12 tháng.

70. CHỦNG ĐỐI CHIẾU VSV
 Nên lưu giữ chủng đối chiếu dạng đông khô hoặc trong tủ
lạnh sâu. Nếu đã rã đông chủng gốc thì không được phép sử
dụng lại hoặc làm đông lại
 Chỉ SD chủng VSV được cấy chuyển ko quá 5 lần từ ống
chủng gốc
 Cần kiểm tra tính thuần khiết và đặc tính sinh hóa của
chủng VSV ở mỗi lần cấy truyền (nên qui định riêng mỗi cấp
cấy truyền sẽ K/tr đặc điểm nào):
- Khả năng sống
- Chủng có bị tạp nhiễm ko?
- Chủng có duy trì tính chất sinh hóa ban đầu. (VD:
chủng S. aureus có phản ứng đông huyết tương hay
ko hoặc SD API kit)
 Ko sử dụng chủng làm việc (cấp 3,4,5) để làm nguồn chủng
ban đầu

71. CHỦNG ĐỐI CHIẾU VSV

72. CHỦNG ĐỐI CHIẾU VSV
 Hồ sơ chủng vi sinh vật:
• Phải ghi lại, lưu giữ hồ sơ của quá trình cấy chuyển: chủng gốc,
cấp 1, 2, 3, 4, 5.
VD: Đánh số theo số tiến để các số lô chủng ko bị lặp lại
Chủng thế hệ 2 ban đầu do Microbiologics cung cấp có số lô là
0234
Cấp 3: 0234/C3/01...0234/C3/100
- Lần 1: Cấp 4: 0234/C4/01.01;
Cấp 5: 0234/C5/01.01... 0234/C5/01.03;
- Lần 2: Cấp 4: 0234/C4/02.02;
Cấp 5: 0234/C5/02.04... 0234/C5/02.05;

73. LẤY MẪU
 Nếu PTN trực tiếp lấy mẫu và đóng gói, qui định lấy mẫu
phải được x/đ rõ trong hệ thống CL và phải có sự k/tr thường
xuyên
 Bất cứ qtr xử lí tạp nhiễm nào được á/d khi lấy mẫu thử đều
phải ko làm ảnh hưởng đến số lượng VSV trong mẫu
 Mẫu thử phải được vận chuyển và BQ trong ĐK thích hợp để
đảm bảo tính toàn vẹn của mẫu thử (làm lạnh nếu cần). ĐK vận
chuyển và BQ phải được ghi chép và lưu trữ. T/h thử nghiệm
mẫu càng sớm càng tốt
 Việc lấy mẫu phải do cán bộ được đào tạo đầy đủ thực hiện.
Thao tác lấy mẫu phải tuân thủ KT vô khuẩn, dụng cụ/thiết bị
lấy mẫu phải vô khuẩn
 T/gian lấy mẫu và ĐK mtr tại nơi lấy mẫu (nhiệt độ, chất
lượng ko khí) được theo dõi và ghi vào biên bản lấy mẫu, nếu
cần

74. QUẢN LÝ MẪU
 PTN phải có qui định về vận chuyển, tiếp nhận, mã hóa
mẫu. Nếu số lượng mẫu thử ko đủ hay ở trong tình trạng bảo
quản kém PTN phải thảo luận với khách hàng trước khi nhận
hay từ chối mẫu
 Ghi chép lại thông tin liên quan đến mẫu thử:
 ngày nhận mẫu
 tình trạng mẫu, nhiệt độ của mẫu thử (nếu cần)
 ngày lấy mẫu, ĐK lấy mẫu, ĐK vận chuyển mẫu từ nơi lấy
mẫu đến PTN

75. QUẢN LÝ MẪU
 Mẫu thử đang chờ kết quả phải được BQ trong ĐK thích hợp
để giảm đến mức tối đa sự thay đổi VSV có thể có trong mẫu
thử. ĐK bảo quản, phải được thẩm định, ghi chép lại
 Bao bì và nhãn của mẫu thử có thể bị nhiễm khuẩn nặng, do
đó, cần được xử lí, bảo quản cẩn thận (lau cồn 70°: diệt VK, ko
diệt được bào tử) để tránh gây nhiễm chéo. Xử lí tạp nhiễm bao
bì mẫu thử phải ko ảnh hưởng đến tính toàn vẹn mẫu thử
 Có qui định cụ thể về việc lưu trữ và loại bỏ mẫu thử. Mẫu
thử được xác định bị nhiễm khuẩn nặng hoặc nhiễm VSV gây
bệnh cần được xử lí (tiệt khuẩn) trước khi loại bỏ

76. BÁO CÁO KẾT QUẢ
 Hồ sơ KN: ghi lại các bước tiến hành (mtr sử dụng,
người pha, ngày pha, ngày thử nghiệm...), số liệu thu
được (quan trắc gốc) thu được trên mẫu thử
 Đối với phép thử đếm SL VSV: nếu KQ âm tính
- Nên: “<ko phát hiện/1 đơn vị mẫu thử» hoặc
«nhỏ hơn giới hạn phát hiện/ 1 đơn vị mẫu thử»
- Ko nên: “ko có /1 đơn vị mẫu thử »
- PT GHNK, nếu KQ 10-1: âm tính, nên «<10 CFU/g»
 Đối với phép thử định tính:
- Nên: «Tìm thấy/Ko tìm thấy /1 đơn vị mẫu thử «
- Hoặc nên «Nhỏ hơn 1 số xác định/ 1 đơn vị mẫu
thử» với số xác định này lớn hơn GHPH của PP.
T/hợp này cần có sự đồng ý của khách hàng
- Ko nên: «ko có /1 đơn vị mẫu thử "

77. ĐẢM BẢO CHẤT LƯỢNG
- PTN cần xây dựng hệ thống đảm bảo chất lượng để kiểm tra
tính hiệu lực của phép thử
- Có thể tiến hành trên:
+ Mẫu chuẩn
+ Tham gia chương trình so sánh liên phòng, thử nghiệm thành
thạo
+ Mẫu dương tính tự tạo (mẫu bị nhiễm E. coli)
+Mẫu đã kiểm nghiệm từ trước (mẫu lưu)

78. PHẦN 2
PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ
PHÒNG SẠCH

79. ISO 14644
Cleanrooms and associated controlled environments
Part 1: Classification of air cleanliness
Part 2: Specification for testing and monitoring to prove
continued compliance with ISO 14644-1
Part 3: Test methods
Part 4: Degisn, construction and start-up
Part 5: Operations
Part 6: Vocabulary
Part 7: Separative devices (clean air hoods, gloveboxes,
isolator and mini-environments)
Part 8: Classification of air cleanliness by chemical
concentration (ACC)

80. XẾP LOẠI KHU VỰC SẠCH THEO
ISO 14644-1

81.  Tính toàn vẹn của màng lọc HEPA: Hiệu suất lọc
phải đạt:
+ HEPA H14: 99,995% với tiểu phân 0,3 µm
+ HEPA H13: 99,95% với tiểu phân 0,3 µm
CHỈ TIÊU ĐÁNH GIÁ KHU VỰC SẠCH

82. CHỈ TIÊU ĐÁNH GIÁ KHU VỰC SẠCH
CHỈ TIÊU TIỂU PHÂN (TRS 961)
Cấp
sạch
Trạng thái nghỉ Trạng thái hoạt động
SL tối đa tiểu phân
cho phép/m3
SL tối đa tiểu phân
cho phép/m3
≥0,5m ≥ 5m ≥ 0,5m ≥ 5m
A 3520 20 3520 20
B 3520 29 352 000 2900
C 352 000 2 900 3 520 000 29 000
D 3 520 000 29 000 Ko qui
định
Ko qui
định

83. CHỈ TIÊU ĐÁNH GIÁ KHU VỰC SẠCH
CHỈ TIÊU VI SINH VẬT (TRS 961)
Cấp
sạch
Lấy mẫu
KK
(CFU/m3)
Đặt đĩa
thạch
(ĐK 9,0 cm)
(CFU/4h)
Đĩa thạch
tiếp xúc
(ĐK 5,5 cm)
(CFU/đĩa)
In găng
tay
(5 ngón
tay)
(CFU/găng)
A <1 <1 <1 <1
B 10 5 5 5
C 100 50 25 -
D 200 100 50 -

84.  Recovery/clean up time: Trạng thái nghỉ của phòng
sạch phải đạt được sau khi nhiễm bẩn thí nghiệm 15-
20’
 Chênh áp trước và sau màng lọc HEPA: theo thông số
của NSX cung cấp
VD: Faster Safe fast Elite 215D: < 220 Pa
 Số lần trao đổi khí tại Class B, C, D trong trạng thái làm
việc phù hợp với thể tích của phòng, số lượng thiết bị
và nhân viên trong đó
+ Class B: 120 lần/h
+ Class C: 40 lần/h
+ Class D: 20 lần/h
CHỈ TIÊU ĐÁNH GIÁ KHU VỰC SẠCH

85. Chênh lệch áp giữa 2 KV có cấp độ sạch khác
nhau: 10-15 Pa
Nhiệt độ: 18-26oC
Độ ẩm 30-65% (ISO 14644)
Cường độ ánh sáng:
- Khu vực làm việc: ≥ 400 Lux
- Khu vực phụ trợ (airlock): ≥ 200 Lux
Độ ồn: ≤ 65 dB
Cường độ đèn UV/passbox: ≥ 39,5 µW/cm2
CHỈ TIÊU ĐÁNH GIÁ KHU VỰC SẠCH

86. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ
 Qui định về trạng thái của KV sạch
- Trạng thái “nghỉ”: 15 phút sau khi kiểm
nghiệm viên kết thúc thí nghiệm (ko có KNV
tiến hành thí nghiệm)
- Trạng thái “hoạt động”: có KNV tiến hành thí
nghiệm
 Số lượng tiểu phân được k/tra ở cả 2 trạng
thái “nghỉ” và “hoạt động” của KV sạch
 Các chỉ tiêu khác được kiểm tra trong trạng
thái “hoạt động” của KV sạch

87. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ
TÍNH TOÀN VẸN CỦA MÀNG LỌC HEPA
 SD máy tạo hạt tiểu phân kích thước 0,3 µm, đưa vào
khoảng 3x106 tiểu phân/ft3
 Sử dụng 2 máy đếm tiểu phân:
- Máy 1: đo tiểu phân đưa vào trước màng lọc:
thường dùng loại có tốc độ 2,83 l/phút
- Máy 2: đo tiểu phân sau màng lọc: thường dùng
loại có tốc độ 28,3 l/phút
- T/gian đo: dùng d/cụ thu tiểu phân (phễu) scan
toàn bộ màng lọc 1’, tính hiệu suất màng lọc
 Tần suất:
- HEPA/BSC: 6 tháng/lần
- HEPA/Phòng sạch: 12 tháng/lần

88. PHÉP THỬ RÒ RỈ CỦA HỆ THỐNG LỌC ĐÃ LẮP ĐẶT
 ISO 14644-3 annex B6: Installed filter system
leakage test

89. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ
SỐ LƯỢNG TIỂU PHÂN TRONG 1M3 KK
 Chọn vị trí lấy mẫu tại các vùng có nguy cơ cao: vị
trí gió quẩn, đường khí ra, vị trí sa lắng bụi, vùng khó
vệ sinh…
 Cỡ mẫu (lit): (ISO 14644-1)
Cn,m: giới hạn tiểu phân 5 µm
Class C (TT hoạt động), D (TT nghỉ): ≥ 2 lit và ≥ 1 phút
 Số lượng mẫu lấy: ISO 14644-1:2015
 Sử dụng máy đếm tiểu phân (airborne particle
counter) đã được hiệu chuẩn
 Tần suất: 3 tháng/lần
1000
×
20
=
m
n
s
c
V
,

90. Area of cleanroom (m2) ≤
Minimum number of sample
locations
to be tested (NL)
2 1
4 2
6 3
8 4
10 5
24 6
28 7
32 8
36 9
52 10
56 11
64 12
68 13
72 14
76 15
104 16
108 17
116 18
148 19
156 20
192 21
232 22
276 23
352 24
436 25
636 26
1000 27
> 1000 See Equation
Old way: Number of sample locations
NL = √Area of Cleanroom or Zone
The number of sample
locations in the lookup
table are based achieving
95 % confidence that at
least 90 % of the total area
does not exceed the class
limit.
>1000m²
90
ISO 14644-1:2015
Changes
90
Maximum Length of Tubing = 1m

91. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ
THỂ TÍCH KHÔNG KHÍ CẦN LẤY MẪU
Cấp
sạch
Trạng thái
nghỉ
Trạng thái
hoạt động
A 1000 lit 1000 lit
B 690 lit 7 lit
C 7 lit 2 lit (1’)
D 2 lit (1’)

92. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ
SỐ LƯỢNG VSV TRONG 1M3 KK
 Chọn vị trí lấy mẫu tại các vùng có nguy cơ cao: vị
trí gió quẩn, đường khí ra, vị trí sa lắng bụi, vùng khó
vệ sinh…
 Cỡ mẫu: 1m3 hoặc 10 phút
 Số lượng mẫu lấy: theo ISO 14644-1:2015
Sử dụng máy lấy mẫu ko khí
(air sampler) đã được hiệu chuẩn
 Tần suất :
- Định kì KV sạch: 3 tháng/lần
- Tủ ATSH, KV nuôi cấy BQ: 1 tuần/lần, 1 vị trí
- Class B: mỗi khi tiến hành phép thử VK, 1 vị trí

93. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ
SỐ LƯỢNG VSV TRÊN BỀ MẶT
 Bề mặt nhẵn (sàn, bàn, TBị): dùng đĩa Rodac ĐK 5,5
cm
 Bề mặt ko nhẵn (góc cạnh): dùng pp phết, dd NaCl
0,9% + Tween 80 (0,7%) + Lecithin 0,1%
 Chai lọ: dùng pp tráng, dd tráng giống như pp phết ,
ngâm trong 30 phút

94. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ
SỐ LƯỢNG VSV TRÊN BỀ MẶT
 Môi trường: Thạch casein đậu tương
 ĐK ủ: 30 - 350C/3-5 ngày, tiếp tục 20 - 250C/5-7 ngày
 Tần suất :
- Định kì KV sạch: 3 tháng/lần
- Tủ ATSH, tủ nuôi cấy VSV: 1 tuần/lần, 1 vị trí

95. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ
Số lượng VSV bằng PP đặt đĩa thạch:
 Môi trường: Thạch casein đậu tương
 Thời gian đặt: 4h
Số lượng mẫu lấy theo phân tích nguy cơ (tham khảo
ISO14644 Part 1)
 ĐK ủ: 30 - 350C/3-5 ngày, tiếp tục 20 - 250C/5-7 ngày
 Tần suất :
- Định kì KV sạch: 3 tháng/lần
- Tủ ATSH: mỗi khi tiến hành phép thử VK, 1 vị trí
- Class B: mỗi khi tiến hành phép thử VK, 4 vị trí
Kiểm tra găng tay:
 M/tr, ĐK ủ: Như trên
 SD 2 đĩa thạch, in 5 ngón tay vào đĩa, k/tr trên 2 găng
 Tần suất : mỗi khi tiến hành phép thử VK

96. RECOVERY CLEAN UP TIME
- Sử dụng máy tạo hạt để đưa số hạt tiểu phân vào khu vực thử với nồng
độ ≥ 100 lần giới hạn tiểu phân 0,5 µm của khu vực đó ở trạng thái tĩnh
- Sử dụng máy đếm tiểu phân, cài đặt chường trình đếm tự động trong
20 cycle, đặt thời gian chờ máy chạy là 1 min, đặt thời gian chờ giữa mỗi
lần đếm là 10 giây và thời gian mỗi lần đếm là 1 min.
- Đặt máy đếm tiểu phân vào vị trí xa HEPA cấp khí và cổng hồi khí. Ghi
lại vị trí đặt máy. Kiểm nghiệm viên đi ra nhanh khỏi phòng trong vòng
1 min
- Sau khi kết thúc đếm, lấy kết quả ra. Tính thời gian cần thiết để khu
vực thử nghiệm hồi phục được từ trạng thái nhiễm bẩn đến trạng thái
đạt được theo giới hạn qui định
PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ

97. RECOVERY CLEAN UP TIME
PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ
Trong đó/Where:
n: tốc độ hồi phục/recovery rate
t1: khoảng thời gian giữa 2 lần đo (t1 = 1 min)/time elapsed between the first and second
measurement (t1 = 1 min)
Co: Nồng độ tiểu phân ban đầu/initial concentration
C1: Nồng độ tiểu phân sau thời gian t1/concentration after t1
t0.01: thời gian hồi phục (min)/recovery time (min)
Cần có từ 5-10 giá trị n. Lấy giá trị nTB từ đó tính ra giá trị t0.01

98. CHÊNH ÁP TRƯỚC VÀ SAU MÀNG HEPA
- SD máy đo chênh áp đã được hiệu chuẩn
- Kết nối đầu đo vào cổng đã lắp sẵn trên HEPA ở khu
vực sạch hoặc kết nối vào cổng đo DOP của BSC
- Tần suất: 3 tháng/lần
PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ

99. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ
SỐ LẦN TRAO ĐỔI KHÍ
 Đo t/độ gió tại nguồn cấp (9 vị trí): a (m/h)
 Đo diện tích màng lọc: b (m2)
 Tính lưu lượng khí trao đổi trong 1 h: c=ab
(m3/h)
 Tính thể tích của khu vực thí nghiệm: d (m3)
 Tính số lần trao đổi khí trong 1h: c/d (lần/h)
 Tần suất: 3 tháng/lần

100. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ
CHÊNH LỆCH ÁP SUẤT
 Sử dụng áp kế đã được hiệu chuẩn
 Hàng ngày: bằng đồng hồ đo chênh áp gắn
trên tường (9 h và 14 h)
 3 tháng/lần: bằng máy đo
vi KH (đo tại VT gắn đ/hồ c/áp)

101. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ
NHIỆT ĐỘ, ĐỘ ẨM
 Sử dụng nhiệt ẩm kế đã được hiệu chuẩn
 Hàng ngày: SD nhiệt ẩm kế (9 h và 14 h)
 3 tháng/lần: SD máy đo vi khí hậu (đo tại 1
điểm/khu vực, 3 lần/điểm, cách nhau 5’)

102. PHƯƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ
Cường độ ánh sáng:
 SD máy đo cường độ ánh sáng được hiệu chuẩn
 Đo 3 vị trí/khu vực
 Tần suất: 12 tháng/lần
Độ ồn:
 SD máy đo độ ồn được hiệu chuẩn
 Đo 1 vị trí/khu vực
 Tần suất: 12 tháng/lần
Cường độ đèn UV/passbox:
 SD máy đo cường độ đèn UV được hiệu chuẩn
 Đo 1 vị trí/passbox
 Tần suất: 12 tháng/lần

103. THẨM ĐỊNH BSC/LAF (class A)
 Thẩm định khi lắp đặt ban đầu:
+ K/tra tính toàn vẹn của HEPA: 99,995%
+ K/tra c/lệch áp suất của HEPA: theo NSX
+ Hướng của dòng khí
+ Đếm tổng số tiểu phân/m3 (particles)
+ Đếm tổng số VSV (lấy mẫu KK, đặt đĩa
thạch, đĩa thạch tiếp xúc)
+ Đo tốc độ gió: 0,36 – 0,54 m/s
+ Cường độ đèn UV (nếu có): ≥ 39,5 µW/cm2
+ Cường độ ánh sáng: ≥ 415 Lux
+ Độ ồn: BSC dừng: ≤ 57 dB;
BSC hoạt động: ≤ 66,5 dB

104. THẨM ĐỊNH BSC/LAF (class A)
 Định kì kiểm tra hoặc sau khi có sửa chữa lớn
 Định kì 3 tháng 1 lần:
+ Đếm tổng số tiểu phân/m3 (particles)
+ Đếm tổng số VSV (lấy mẫu KK, đặt đĩa
thạch, đĩa thạch tiếp xúc)
 Định kì 6 tháng 1 lần:
+ K/tra tính toàn vẹn của HEPA
+ K/tra chênh lệch áp suất của HEPA
+ Hướng của dòng khí
+ Đo tốc độ gió
+ Cường độ đèn UV (nếu có)
+ Cường độ ánh sáng
+ Độ ồn

105. THẨM ĐỊNH BSC/LAF (class A)
Hướng của dòng khí bằng smoke test:
- Hướng khí cấp (cửa làm việc) phải theo hướng
đi từ phòng vào tủ. Dòng khí phải bị hút xuống cửa hút
khí, ko được đi vào khu vực làm việc
- Khí sau HEPA cấp phải đi theo phương thẳng
đứng xuống bề mặt làm việc, tốc độ khí phải đều. Khi
xuống bề mặt làm việc, ko khí chia theo 2 hướng đi
vào cửa hút trước và sau
- Tại các góc tủ ko khí phải đảm bảo ko bị rò rỉ ra
ngoài
- Tại bề mặt làm việc, ko khí chia làm 2 khu vực
rõ rệt đi ra 2 cửa hút trước và sau. Tốc độ khí phải
đều, hướng dòng khí vuông góc với cửa tủ

106. THẨM ĐỊNH BSC/LAF (class A)
Tốc độ gió:
- SD máy đo tốc độ gió đã được hiệu chuẩn
- Đo tốc độ gió tại 24 vị trí dưới màng lọc HEPA 15 - 30
cm và ngang tầm làm việc: được chia làm 3 hàng, mỗi
hàng 8 vị trí theo sơ đồ

107. THẨM ĐỊNH BSC/LAF (class A)
Tốc độ gió:
+ Tốc độ gió tại 24 điểm nằm trong khoảng 0,36 –
0,54 m/s
+ Tốc độ gió TB của từng hàng ko chênh lệch quá
17,5% tốc độ TB của 3 hàng
+ Tốc độ điểm cao nhất và thấp nhất trong 1 hàng
ko chênh quá 17,5% so với tốc độ TB của hàng đó
+ Tốc độ gió tại các điểm ngang tầm làm việc phải
ko nhỏ hơn 0,36 m/s

108. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. WHO Expert Committee on Specification for Pharmaceutical
Preparations - 45th Report (2011) - Annex 2 “WHO Good Practices
for Pharmaceutical Microbiology Laboratories” (Các nguyên tắc
chung cho riêng phòng vi sinh, thiết kế khu vực làm việc, cách
kiểm soát thiết bị, môi trường, điều kiện thử nghiệm trong phòng
thử nghiệm vi sinh)
2. WHO Expert Committee on Specification for Pharmaceutical
Preparations - 45th Report (2011) – Annex 6 “WHO Good
Manufacturing Practices for Sterile Pharmaceutical Products” (Tra
cứu các chỉ tiêu phòng sạch, vệ sinh, quần áo theo GMP WHO)

109. 3. WHO Expert Committee on Specification for
Pharmaceutical Preparations - 45th Report (2011) –TRS 961.
(Các yêu cầu kỹ thuật của GMP WHO, thiết kế, thẩm định,
hoạt động phòng sạch)
4. WHO (2004), Laboratory Biosafety Manual (Các nguyên
tắc an toàn trong phòng thử nghiệm vi sinh )

110. 5. ISO 14644 Cleanrooms and associated controlled
environments (Các thông số thiết lập và duy trì chất lượng phòng
sạch, các phương pháp kiểm tra, yêu cầu kỹ thuật đối máy móc
thiết bị dùng để kiểm tra phòng sạch)
6. ISO 11133:2014
Microbiology of food, animal feed and water — Preparation,
production, storage and performance testing of culture media.
(Cách pha chế, bảo quản môi trường dinh dưỡng)

111. 7. USP 38, (1116) Microbiolical control and monitoring of aseptic
processing environments. (Kiểm soát vi sinh vật trong môi trường
phòng sạch)
8. USP 38, (1117) Microbiolical best laboratory practices. (Các
nguyên tắc chung thực hành tốt phòng thử nghiệm vi sinh)
9. ISO 14698: 2003 Cleanroom and associate controlled
environments – Biocontamination control (Phòng sạch và các
phương pháp kiểm soát vi sinh vật)
10. USP 41, (1072) Disinfection and Antiseptics, 2018 (Hướng dẫn
khử trụng và tiệt khuẩn trong lĩnh vực y tê)

112. 11. USP 40, (1229.5) Biolical indicators for sterilization. (Chỉ thị
sinh học)
12. USP 41, (1211) Sterilization and Sterility Assurance of
Compendial Articles. (Tiệt khuẩn và đảm bảo bảo chất lượng quy
trình hiệu chuẩn)
13. USP 41, (1229.1) Streame Sterilization by direct contact. (Tiệt
khuẩn bằng hơi nước)
 15 BS EN 285:1997 Sterilization – Steam sterilizers – Large
sterilizers
14. Center for Disease Control and Prevention, Gudideline for
Disinfection and Sterilization in Healthcare Facilities, 2008 (Hướng
dẫn khử trụng và tiệt khuẩn trong lĩnh vực y tế)