ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ & SẮC KÝ LỎNG KHỐI PHỔ LC-MS LẠI THỊ THU TRANG TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y THÁI BÌNH

1. ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ

2. Các khái ni m cơ b n1
Phân lo i2
Thành ph n, thông s đ c trưng, l c liên k t3
Nội dung
Pic s c ký và s c đ4
3
Đĩa lý thuy t và phương trình vandemter5
ng d ng6

3. ĐẠI CƯƠNG VỀ SẮC KÝ
Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục của các
cấu tử chất phân tích trên 2 pha: Một pha thường đứng yên,
I. Khái niệm
có khả năng hấp thu chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha
di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động.
Do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh,
chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.

4. Quá trình tách s c ký trên c t c a 2 ch t A và B

5. THỨ TỰ RA KHỎI CỘT
Hợp chất có ái lực nhiều với pha động thì có xu hướng ra
khỏi cột trước
Hợp chất có ái lực nhiều với pha tĩnh thì bị giữ lại lâu hơn
trong cột và ra sau

6. S C KÝ Đ

7. II. PHÂN LOẠI
Pha động
Sắc ký lỏng
Sắc ký khí
II.1. Phân loại theo trạng thái của pha động và pha tĩnh
Sắc ký khí
Pha tĩnh
Chất rắn
Chất lỏng

11. III. THÀNH PHẦN HỆ SẮC KÝ
CÁC THÔNG SỐ ĐẶC TRƯNG- LỰC LIÊN KẾT
III.1. Thành phần hệ sắc ký
Pha tĩnh: Chức năng lưu giữ chất phân tích
Pha động: Phân bố, tương tác di chuyển chất phân tích trênPha động: Phân bố, tương tác di chuyển chất phân tích trên
pha tĩnh
Chất phân tích: Phù hợp với các pha

12. III.2. LỰC LIÊN KẾT
Lực liên kết ion
Lực phân cực
Lực phân tánLực phân tán
Lực liên kết Hidro, liên kết cho nhận…

13. THỜI GIAN LƯU
Thông s quan tr ng đ
tách ch t, t i ưu hóa quá
trình s c ký
tR : th i gian lưu c a m t c u t t khi vào c t đ n khi tách ra ng i c t.
tO : th i gian đ cho ch t nào đó không có ái l c v i pha tĩnh đi qua
c t; đó cũng là th i gian pha đ ng đi t đ u c t đ n cu i c t và còn
g i là th i gian lưu ch t.
tR' : th i gian lưu th t c a m t c u t .
trình s c ký

14. Hệ số phân bố K
Hệ số dung lượng k’
V i VS : th tích pha tĩnh
VM : th tích pha đ ng
CS : n ng đ c u t trong pha tĩnh.
CM : n ng đ c u t trong pha đ ng.

15. ĐỘ CHỌN LỌC
Đ c trưng cho kh năng tách hai ch t c a c t.
Giá tr ch n l c luôn l n hơn 1.
Giá tr l n hay nh đ u tác đ ng đ n quá trình tách s c ký

16. IV. PIC SẮC KÝ VÀ SẮC ĐỒ
Hình dáng pic s c ký
b
Tính cân đ i c a pic s c ký AF
a
b
AF =
0,9 < AF <= 1,1

17. Tính cân đ i c a pic s c ký
Pic chu n Pic ñ ñ u Pic kéo ñuôi

18. C, Xác đ nh
n ng đ ch tn ng đ ch t

19. Sắc đồ

20. + Martin và Synge đã dùng phương pháp ĐLT để mô tả quá trình sắc ký.
+ Trong sắc ký lỏng – rắn các tiến trình cơ bản này là tuần hoàn của sự
hấp phụ và giải hấp phụ. Các bước này tái lập lại tuần hoàn theo sự di
chuyển của các cấu tử trong cột
+ Mỗi bước tương ứng với một trạng thái cân bằng mới gọi là đĩa lý
V. Đĩa lý thuy t ĐLT (N)
+ Mỗi bước tương ứng với một trạng thái cân bằng mới gọi là đĩa lý
thuyết
+ Các đĩa xếp dọc theo chiều dài của cột. Mỗi một chất khi di chuyển
trong cột sẽ có số lần tái tổ hợp khác nhau (hấp phụ / giải hấp phụ) nên số
đĩa khác nhau

21. + N u tính lư ng ch t trên đĩa th J t i th i đi m I ta có: T ng
lư ng chât tan mT là t ng s lư ng ch t tan đư c pha đ ng di
chuy n t i t đĩa th (j -1) n m cân b ng t i th i đi m (i-1) và
lư ng ch t tan th c s có s n đĩa th j t i th i đi m (i-1) có
H n ch c a đĩa lý thuy t: Không gi i thích đư c hi n tư ng giãn r ng pic
do không tính đ n phân tán trong c t do s khuyêch tán c a các h p ch t

22. Xác định số đĩa lý thuyết ĐLT - N
Gọi N là số đĩa lý thuyết, L chiều dài của cột sắc ký, H là chiều cao ĐLT
V i W1/2 là chi u r ng pic s c ký v trí ½ chi u cao pic (phút)
W là chi u r ng pic s c ký v trí đáy pic (phút) B r ng pic

23. XÁC ðỊNH SỐ ðĨA LÝ THUYẾT - N
w1/2 là độ rộng tại ½ chiều cao pic sắc ký. w1/2 = 2,35σ. Độ rộng của
pic tính tại nền và được đo ở chiều cao đạt được là 13,5% sao với
chiều cao cực đại của pic sắc ký w = 4σ

24. Độ phân giải
Đây là đ i lư ng bi u th rõ c ba kh năng c a c t
s c ký: s gi i h p, s ch n l c và hi u qu tách.

26. Phương trình Vandemter
Phương trình mô t s nh hư ng c a t c đ dòng pha đ ng đ n hi u qu tách.
Cu
u
B
AH ++=
Trong đó: A là h s khuyêch tán xoáy
B là h s khuy ch tán d c theo c t
C là h s truy n kh i
N u H có đơn v là cm thì A là cm, B là cm2/s ; C là s

27. Hi u qu c t cao nh t khi H nh nh t tương ng t c đ t i ưu
C
B
u =

28. VI. ỨNG DỤNG CỦA SẮC KÝ

29. So sánh thời gian lưu của chất phân tích với thời gian lưu
của chất chuẩn đối chiếu trong cùng một điều kiện
So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu
1111
Định tính
So sánh sắc ký đồ của mẫu phân tích với sắc ký đồ của mẫu
phân tích đã thêm chuẩn để đối chiếu trong cùng điều kiện
• Kết hợp với một số máy móc khác để phân tích
2222
3333

32. PHƯƠNG PHÁP ĐƯ NG CHU N
Đư ng chu n Fenobucarb
y = 3990x - 5018.5
R2
= 0.9994
1500000
2000000
2500000
3000000
3500000
4000000
4500000
Diệntích
4000000
5000000
6000000
7000000
8000000
9000000
Diệntích
Nồng độ (ppb) 20 50 100 200 500 1000 1500
Diện tích (mAu) 1818155 4323952 8848970 17287122 38708909 75531554 95077738
0
500000
1000000
1500000
0 500 1000 1500
Nồng độ (ppb)
Di
0
1000000
2000000
3000000
0 500 1000 1500 2000
Nồng độ (ppb)
Diệ

33. PHƯƠNG PHÁP THÊM CHU N
250000
300000
350000
400000
S(mAu.s)
Tên hoạt
chất
∆∆∆∆C Diện tích S
(mAu.s)
Cx Cs C2 C3
0 200921 2,14
-3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0
50000
100000
150000
200000
250000
Y = A + B * X
Thong so Gia tri Sai so
-----------------------------------------------------------
A 201954,33333 2310,60358
B 94320 1789,78583
-----------------------------------------------------------
S(mAu.s)
CPEN
(mg/l)
PEN G
1 298341 3,18
2 389561 4,15
3 478932 5,17

34. PHƯƠNG PHÁP NỘI CHUẨN
Không có mặt trong mẫu (mà phải được thêm vào).
- Tín hiệu phân tích của nội chuẩn phân biệt rõ với chất phân tích và các tạp chất khác
trong mẫu
- Thời gian lưu càng gần với chất phân tích càng tốt
- Lượng nội chuẩn bằng nhau trong tất cả các dung dịch chuẩn và mẫu
- Nồng độ nội chuẩn nên có để tín hiệu phân tích nằm khoảng 1/3 của đường chuẩn
chất phân tích.

35. PHƯƠNG PHÁP CHUẨN HÓA DIỆN TÍCH

37. BÀI TẬP
1) Cho 2 chất có thời gian lưu tR1=1,43, tR2= 4,5 và bề rộng đáy
Wb1=0,1; Wb2 = 0,3. Tính số đĩa lý thuyết ứng với mỗi chất
2) Mội cặp peak có độ chọn lọc a = 1,1 và hệ số phân giải Rs=1, hệs
số chứa K’2=0,5. Tính số đĩa lý thuyết N?
3) Một hỗn hợp gồm 2 chất có hệ số chứa K’1= 2,58 và K’2=2,64.
Tính hệ số chọn lọc α?

38. BỘ Y TẾ
SẮC KÝ LỎNG - KHỐI PHỔ
LC-MSLC-MS

39. 1. Nguyên tắc – Phân loại
T = 0
T = 1 0 ’
I n j e c t o rI n j e c t o r D e t e c t o rD e t e c t o r
F l o w o f M o b i l e P h a s eF l o w o f M o b i l e P h a s e
T = 0
T = 1 0 ’
I n j e c t o rI n j e c t o r D e t e c t o rD e t e c t o r
F l o w o f M o b i l e P h a s eF l o w o f M o b i l e P h a s e
Các chất được tách ra với thời gian lưu tương ứng
T = 2 0 ’
M o s tM o s t I n t e r a c t i o n w i t h S t a t i o n a r y P h a s eI n t e r a c t i o n w i t h S t a t i o n a r y P h a s e L e a s tL e a s t
T = 2 0 ’
M o s tM o s t I n t e r a c t i o n w i t h S t a t i o n a r y P h a s eI n t e r a c t i o n w i t h S t a t i o n a r y P h a s e L e a s tL e a s t

40. * Detecter huỳnh quang
S d ng thi t b huỳnh quang kính l c ho c quang ph
huỳnh quang cho detector huỳnh quang.
ð ch n l c và ñ nh y có th hơn ñ n 1000 l n detector h p th
Áp d ng: H p ch t thơm ña vòng, d n ch t quinolin, steroid, anc
Do ñ nh y cao nên s d ng cho phân tích lư ng v t, m uDo ñ nh y cao nên s d ng cho phân tích lư ng v t, m u
sinh h c, giám ñ nh pháp y,…

41. ESI APCI
Ion hóa ở pha lỏng trong vùng
thế cao. Các chất phân cực
hơn sẽ dễ dạng ion hóa hơn
Bay hơi dung môi > tạo hạt
Bay hơi dung môi, chất phân
tích. Dễ dàng phân tích các
chất có phân tử lượng nhỏ và
ít phân cực
So sánh 2 kỹ thuật ESI và APCI
sương nhỏ hơn
Ion tạo thành sẽ di chuyển
nhờ lực hút tĩnh điện ( Các ion
có mật độ điện tích cao và sức
căng bề mặt thấp sẽ di chuyển
dễ hơn)
Ion hóa các chất, tạo ion ở thể
khí bởi kim tích điện thế cao
Ion tạo thành bởi phản ứng
giữa ion proton và phân tử chất
phân tích

42. ng dng dng dng d ng cng cng cng c a HPLC/MSa HPLC/MSa HPLC/MSa HPLC/MS
42

43. 3.3. Phương pháp định lượng
Định lượngĐịnh lượng
Phương phápPhương phápPhương phápPhương pháp
cơ bảncơ bản
Thêm Chuẩn Đường Chuẩn Nội chuẩnNội chuẩn

44. Lựa chọn kỹ thuật…
Tôi cần tách
Kháng sinh khỏi
hỗn hợp thật nhanh
đảm bảo chất lượng.
I’ll get
on it!
44
Tôi sẽ nghiên cứu
công nghệ tách.

45. 45
Lựa chọn công nghệ nào?

46. Xác ñXác ñXác ñXác ñ nh mnh mnh mnh m c tiêu phân tíchc tiêu phân tíchc tiêu phân tíchc tiêu phân tích1111
ChChChCh n kn kn kn k thuthuthuthu t xt xt xt x lý mlý mlý mlý m uuuu2222
3333
Quy trình phân tíchQuy trình phân tíchQuy trình phân tíchQuy trình phân tích
ChChChCh n detecter thích hn detecter thích hn detecter thích hn detecter thích h pppp4444
ChChChCh n cn cn cn c t tách phù ht tách phù ht tách phù ht tách phù h pppp3333
ChChChCh n ñin ñin ñin ñi u kiu kiu kiu ki n sn sn sn s c kýc kýc kýc ký5555
ðánh giá phương pháp phân tíchðánh giá phương pháp phân tíchðánh giá phương pháp phân tíchðánh giá phương pháp phân tích6666

47. Các phương pháp phân tích định lượng β-lactam
PHƯƠNG PHÁP
PHƯƠNG PHÁP ĐI N HÓA
PHƯƠNG PHÁP QUANG H CPHƯƠNG PHÁP QUANG H C
PHƯƠNG PHÁP ĐI N DI MAO QU N
PHƯƠNG PHÁP S C KÝ L P M NG
PHƯƠNG PHÁP S C KÝ L NG HI U NĂNG CAO

48. D ng c và hoá ch t
Máy móc và d ng c
Máy HPLC model LC-10A c a hãng Shimadzu
Máy đo quang ph t ngo i kh ki n UV-1650 PC
Máy đo pH
Catrige l c v i kích thư c mao qu n 0,45mm ; 0,2mm , b siêu âm, t l nh, máy đi u
nhi t, t s y, máy sinh khí nitơ, c t chi t pha r n SPE-C18, và các d ng c thí
nghi m thông d ng khác.nghi m thông d ng khác.
Hoá ch t
Các ch t chu n PEN G, AMP.3H2O, CLO (Na), CEP.H2O, OXA, do Vi n ki m
nghi m B Y t ( 48A Hai Bà Trưng – Hà N i) s n xu t và cung c p.
MeOH, ACN tinh khi t cho ch y HPLC Merck (Đ c). Các hoá ch t khác: axit acetic,
natri acetate, axit boric, HCl, KOH tinh khi t phân tích và nư c c t 2l n.
Dung d ch đ m đư c pha t axit acetic và natri acetate, dung d ch đư c l c qua
màng l c 0,45mm trư c khi bơm vào c t s c ký.

49. Nghiền mịn, cân 20mg
20mg thuốc + metanol
QUY TRÌNH
PHÂN TÍCH
MẪU DƯỢC
PHẨM
Lắc, siêu âm 15’ , lọc qua cartrig 0,45µm
Thổi khô bằng khí Nito, pha loãng
Dung dịch 20mg/20ml

50. Injector
Pumps
Mixer
Chromatogram
Start Injection
mAU
time
50
Detector
Column
Solvents

51. Sắc đồ chất chuẩn
ACN/MeOH/đệm Acetat pH=4 là 15/15/70. Tốc độ 0.8ml/phút. Nồng độ đệm 10mM
OXA AMP CEP
CLO PEN G

52. pH dung d ch đ m
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50 k'
PEN G
CEP
AMP
OXA
CLO
Đi u ki n kh o sát: ACN/MeOH/đ m
Acetat = 15/15/70. T c đ 0.8ml/phút.
N ng đ đ m 10mM
Kh o sát thành ph n d ng d ch đ m
CH3COOH/CH3COONa có n ng đ
0,00
0,50
1,00
3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5
pH
CLOCH3COOH/CH3COONa có n ng đ
10mM v i kho ng pH thay đ i t 3,5
– 5,0.
Th t r a gi i c a các b-lactam là :
PEN G, CEP, AMP, OXA, CLO
Sự phụ thuộc k’vào pH pha động
TTTT iiii pHpHpHpH ==== 3333,,,,5555 cáccáccáccác pícpícpícpíc ssss cccc kýkýkýký cócócócó ssss kháckháckháckhác nhaunhaunhaunhau rõrõrõrõ rrrr tttt vvvv hhhh ssss táchtáchtáchtách k’,k’,k’,k’, ssss
táchtáchtáchtách rõrõrõrõ ràngràngràngràng hơn,hơn,hơn,hơn, thththth iiii giangiangiangian lưulưulưulưu ngngngng nnnn hơnhơnhơnhơn.... NhưNhưNhưNhư vvvv y,y,y,y, kkkk tttt ququququ chchchch nnnn pHpHpHpH ====
3333,,,,5555 chochochocho cáccáccáccác thíthíthíthí nghinghinghinghi mmmm titititi pppp theotheotheotheo

53. T l thành ph n pha đ ng
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
3,50
4,00
4,50
5,00
0 10 20 30
%ACN
k'
PEN G
CEP
AMP
OXA
CLO
ACN/MeOH/đệm
H s k’
PEN
G
CEP AMP OXA CLO
05/25/70 0,38 0,70 1,24 1,91 4,33
10/20/70 0,52 0,88 1,52 2,23 3,17
15/15/70 0,31 0,58 1,51 1,80 2,54
ACN/MeOH/đệm Acetat pH=3,5 là 15/15/70. Tốc độ 0.8ml/phút. Nồng độ đệm 10mM
15/15/70 0,31 0,58 1,51 1,80 2,54
20/10/70 0,16 0,51 0,87 1,16 3,29
25/05/70 0,27 0,56 0,79 1,27 1,59
Sắc đồ sắc ký tại tỷ lệ thành phần
pha động khác nhau
ACN/MeOH/đệm acetat
(a). 05/25/70
(b). 10/20/70
(c). 15/15/70
(d). 20/10/70
(e). 25/05/70
Nhận thấy khi thành phần ACN cao, pic sắc ký xuất hiện sớm, hệ số k’ gần nhau, các chân pic tách nhau không rõ ràng , ảnh hưởng đên kết quả phân tích.
Khi giảm tỷ lệ ACN thì mất nhiều thời gian rửa giải chất ra khỏi cột hơn, hệ số k’ tăng, đồng thời pic bị doãng.
Chọn tỷ lệ pha động có chứa tỷ lệ như sau: ACN / MeOH / Đệm là 10/20/70
Sự phụ thuộc k’vào thành phần pha động

54. N ng đ đ m acetat c a pha đ ng
C (mM) t (phút)
PEN G CEP AMP OXA CLO
12 2,722 3,790 4,470 5,281 6,808
10 3,047 4,162 4,917 5,811 7,426
8 3,049 4,178 4,844 5,818 7,472
Thời gian lưu của chất phụ thuộc vào nồng độ đệm
ACN/MeOH/đệm Acetat pH = 3,5 là 10/20/70. Tốc độ 0.8ml/phút.
6 3,144 4,184 4,921 6,276 8,133
C (mM) Spic
PENG CEP AMP OXA CLO
6 381511 980696 953589 1046897 936952
8 427124 1002316 1168266 1051618 1023112
10 417793 950603 1130074 1061320 981943
12 375940 976765 1097411 939179 977458
Diện tích píc chất phân tích tại nồng độ đệm khác nhau
Sắc đồ sắc ký ở các nồng độ khác nhau
(a). C = 12mM (b). C = 10mM (c). C = 8mM (d). C = 6mM
Chọn nồng độ đệm C = 10mM cho các khảo sát tiếp theo

55. Tốc độ pha động
ACN/MeOH/đệm Acetat pH=3,5 là 10/20/70. Nồng độ đệm 10mM
F (ml/phút) Spic
PEN G CEP AMP OXA CLO
0,6 1162139 1283828 1412412 1625354 1479415
0,8 877983 962871 1185631 1221644 1109561
1,0 692386 710296
Diện tích pic của các chất phân tích phụ thuộc vào tốc độ pha động
1,0 692386 710296 908504 877315 867648
1,2 485335 581914 790420 800429 689707
Sắc đồ sắc ký ở các tốc độ khác nhau
(a). 1,2ml/phút (b). 1,0ml/phút (c).0,8ml/phút (d).0,6ml/phút
0
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
0,5 0,7 0,9 1,1 1,3
F (ml/phút)
Spic
PEN G
CEP
AMP
OXA
CLO
Chọn tốc độ 0,8ml/phút cho các thí nghiệm tiếp theo.

56. ĐIỀU KIỆN TỐI ƯU
Pha tĩnh: C t Supelcosil RP-C18 v i kích thư c h t nh i 5µµµµm c a
hãng Sulpenco-Autralia
Pha đ ng:
● pH = 3,5
● T l ACN/MeOH/đ m là 10/20/70
Các đi u ki n t i ưu đ tách các β-lactam
●
● N ng đ đ m 10mM
● T c đ 0,8ml/phút
● Ch y đ ng dòng
Nhi t đ c t tách 30oC
Th tích m u 20µµµµl
Detector đơn bư c sóng 225nm
Sắc đồ sắc ký tại điều kiện tối ưu

57. ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
100000
150000
200000
250000
Y = A + B * X
S(mAu.s)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0
50000
100000 Thong so Gia tri Sai so
------------------------------------------------------------
A 1387,76949 1189,01108
B 125161,88226 1154,86965
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,99987 1793,58359 5 <0.0001
-------------------------------------------------
S(mAu.s)
CCEP
(ppm)
Sử dụng phần mềm Origin version 7.5 xây dựng đường chuẩn
SSSS phphphph thuthuthuthu c cc cc cc c a Spic vào na Spic vào na Spic vào na Spic vào n ng ñng ñng ñng ñ chchchch t phân tích 0,1t phân tích 0,1t phân tích 0,1t phân tích 0,1----2,0 ppm2,0 ppm2,0 ppm2,0 ppm

58. ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
0
50000
100000
150000
200000
Y=A+B*X
Thongso Giatri Saiso
------------------------------------------------------------
A -1204,58375 1322,34821
B 101183,39967 1284,37812
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
S(mAu.s)
0
50000
100000
150000
200000
250000
Y=A+B*X
Thongso Giatri Saiso
------------------------------------------------------------
A 1387,76949 1189,01108
B 125161,88226 1154,86965
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
S(mAu.s)
0
50000
100000
150000
200000
Y=A+B*X
Thongso Giatri Saiso
------------------------------------------------------------
A -880,73134 986,88916
B 96837,01493 958,55149
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
S(mAu.s)
Sử dụng phần mềm Origin version 7.5 xây dựng đường chuẩn
Đư ng chu n c a các
ββββ-lactam trong kho ng n ng đ
0,10ppm đ n 2,00ppm
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0 0,99976 1994,7182 5 <0.0001
--------------------------------------------------
C(ppm)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0
------------------------------------------------------------
0,99987 1793,58359 5 <0.0001
-------------------------------------------------
CCEP
(ppm)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0 ------------------------------------------------------------
0,99985 1488,68941 5 <0.0001
--------------------------------------------------
CAMP
( ppm)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0
50000
100000
150000
200000
250000
Y=A+B*X
Thongso Giatri Sai so
------------------------------------------------------------
A 188,36318 278,63793
B 121186,89055 270,63708
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,99999 420,31602 5 <0.0001
S(mAu.s)
CoxA
(ppm)
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0
50000
100000
150000
200000
250000
Y=A+B* X
Thongso Giatri Sai so
------------------------------------------------------------
A -801,5738 2307,5596
B 105681,80763 2241,30002
------------------------------------------------------------
R SD N P
------------------------------------------------------------
0,99933 3480,87675 5 <0.0001
---------------------------------------------------
S(mAu.s)
CCLO
(ppm)
S ph thu c c a Spic vào n ng ñ ch t phân tích

59. Giá tr Ftính , gi i h n phát hi n và gi i h n đ nh lư ng
Ch t phân
tích
Phương trình h i quy
H s góc
(b)
Đ l ch
chu n
(Sy)
Ftinh Fbang
LOD
(ppm)
LOQ
(ppm)
AMP
y = (-880,7313±±±±1740,4004) +
(96837,0149±±±±1725,4107)x 96837,0149 1488,6894
1,05 9,55 0,0461 0,1537
y = (96205,5472±±±± 1133,9571 )x 96205,5472 1450,3141
CEP
y = (1387,7695±±±±2140,2199) +
(125161,8823±±±±2078,7653)x 125161,8823 1793,5836
1,09 9,55 0,0431 0,1433CEP 1,09 9,55 0,0431 0,1433
y = (126156,8868±±±±1464,4764)x 126156,8868 1873,0434
OXA
y = (188,3632±±±±501,5482) +
(121186,8906±±±±487,1468)x 121186,8906 420,3160
1,16 9,55 0,0104 0,0347
y = (121321,9434±±±±305,5133 )x 121321,9434 390,7462
CLO
y = (801,5738±±±±4153,6072) +
(105681,8076±±±±4034,3400)x 105681,8076 3480,8768
1,28 9,55 0,0988 0,3294
y = (105107,0943±±±±2403,9021)x 105107,0943 3074,5547

60. B NG KH O SÁT Đ CHÍNH XÁC VÀ Đ L P L I C A PHÉP ĐO
TT Chất C (ppm) Độ lệch chuẩn
S(mAu.s)
Độ chính xác
%X
Độ biến động
CV(%)
1 PEN G
0,15 482,80 1,2 3,59
0,40 113,74 5,4 0,31
0,80 584,75 4,7 0,70
2 CEP
0,15 307,04 0,19 2,21
0,40 235,30 2,8 0,64
0,80 1512,16 2,7 1,92
Phương pháp có độ chính xác và độ lặp lại tốt
0,80 1512,16 2,7 1,92
3 AMP
0,15 1027,16 3,5 4,92
0,40 227,82 4,5 0,47
0,80 901,23 0,3 0,89
4 OXA
0,15 283,97 2,8 1,50
0,40 509,84 4,7 1,11
0,80 950,61 4,2 0,94
5 CLO
0,15 372,79 1,9 2,20
0,40 436,27 5,3 1,07
0,80 1520,65 6,0 1,68

61. Phân tích m u dư c ph m
Penicillin G
Nhà sản xuất CTCP Hoá-Dược phẩm MEKOPHAR
Số lô sản xuất 10043 TN
Số đăng ký VD-8951-09
Thành phần Dạng bột, mỗi lọ chứa 1.000.000 IU PEN G, tá dược vừa đủ. (≈ 600mg)
Hạn sử dụng
Savixin
Nhà sản xuất CTCPDP Hà Tây
Ngày sản xuất
Số đăng ký VD-1891-06
Thành phần Viên con nhộng, đóng vỉ, 10viên/vỉ. Mỗi viên chứa 500mg cephacillin, tá dược vừa đủ.
Hạn sử dụng
Nhà sản xuất Cty CPDP TIPHARCO
Ampicillin
Ngày sản xuất
Số đăng ký VD-2472-07
Thành phần Viên con nhộng, đóng vỉ, 10viên/vỉ. Mỗi viên chứa 500mg ampicillin, tá dược vừa đủ
Hạn sử dụng
Cloxacillin
Nhà sản xuất Aegis Ltd, Nicosia, Cyprus, Europe
Ngày sản suất
Số đăng ký VN-4699-07
Thành phần Cloxacillin 500mg
Hạn sử dụng
Clopencil
Nhà sản xuất X.n.d.p.t. ư. I Pharbaco
Ngày sản suất
Số đăng ký VNA-0538-03
Thành phần Viên con nhộng, đóng vỉ, 10viên/vỉ. Mỗi viên chứa 500mg oxacillin, tá dược vừa đủ
Hạn sử dụng

62. XÁC Đ NH N NG Đ CH T
250000
300000
350000
400000
450000
S(mAu.s)
Đ th xác đ nh n ng đ ch t theo
phương pháp thêm chu n
trong m u thu c
-3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0
50000
100000
150000
200000
Y = A + B * X
Thong so Gia tri Sai so
-------------------------------------------------------------
A 247371,16667 5019,59993
B 125852,5 3888,16539
--------------------------------------------------------------
S(mAu.s)
CCLO
(mg/l)

63. Đ TH XÁC Đ NH CX
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
Y=A+B*X
Thongso Giatri Sai so
-----------------------------------------------------------
A 201954,33333 2310,60358
B 94320 1789,78583
-----------------------------------------------------------
S(mAu.s)
-3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
Y=A+B*X
Thongso Giatri Sai so
-------------------------------------------------------------
A 247371,16667 5019,59993
B 125852,5 3888,16539
--------------------------------------------------------------
S(mAu.s)
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
Y=A+B*X
Thongso Giatri Sai so
-------------------------------------------------------------
A 247371,16667 5019,59993
B 125852,5 3888,16539
--------------------------------------------------------------
S(mAu.s)
Đ th xác đ nh các ch t theo
phương pháp thêm chu n
trong m u thu c
-3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0
CPEN
(mg/l)
-3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
Y=A+B*X
Thongso Giatri Sai so
-------------------------------------------------------------
A 201954,33333 2310,60358
B 94320 1789,78583
--------------------------------------------------------------
S(mAu.s)
CCEP
(mg/l)
-3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
CMAP
(mg/l)
-3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0
50000
100000
150000
200000
250000
300000
350000
400000
450000
500000
Y=A+B*X
Thongso Giatri Saiso
---------------------------------------------------------------------------
A 247371,16667 5019,59993
B 125852,5 3888,16539
----------------------------------------------------------------------
S(mAu.s)
CoxA
(mg/l)
-3,0 -2,5 -2,0 -1,5 -1,0 -0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
0
CCLO
(mg/l)

64. Sắc đồ thuốc kháng sinh ββββ-lactam
Sắc đồ thuốc kháng sinh
ββββ-lactam
OXA AMP CEP
CLO PEN G

65. K t qu phân tích m u thu c
Tên hoạt
chất
∆∆∆∆C Diện tích S
(mAu.s)
Cx Cs mt thuốc
Khối lượng thuốc
xác định được trong
1 viên (mi)
Sai số so với
hàm lượng in
trên nhãn
( C%)
Hiệu suất
trung bình
%H0
PEN G
0 200921 2,14
678,25
580,58
-3,24 102,21 298341 2,14 3,18
2 389561 2,14 4,15
CEP
0 189769 1,91
583,75
475,13
-4,99 94,651 279788 1,91 2,82
2 385772 1,91 3,882 385772 1,91 3,88
AMP
0 249616 1,97
600,75
473,39 -5,30
96,681 368734 1,97 2,90
2 501321 1,97 3,96
OXA
0 242002 2,08
605,00 503,36 0,67
100,481 359586 2,08 3,09
2 474782 2,08 4,09
CLO
0 211566 2,09
575,25 509,67 0,19
102,521 317423 2,09 3,13
2 415532 2,09 4,10
Kết quả tính nồng độ Cx và sự sai khác hàm lượng so với kết quả in trên nhãn thuốc và độ thu hồi xác định β-Lactam
theo phương pháp thêm chuẩn trong mẫu thuốc

66. Mẫu sinh học
Hút 1,5 – 2ml
Ly tâm 15 phút , 10.000rpm , tách cặn
Hút 50µl dung dịch
Dung dịch
QUY TRÌNH PHÂN
TÍCH MẪU SINH HỌC
- Loại bỏ protein
Hòa tan bằng dung môi chạy
mẫu (rung siêu âm 2 phút)
Dịch chiết
+ cho 200µl etanol + 500µl n-hexan + TCA
+ Ly tâm 15 phút ở 10.000rpm
Lọc, hút 200 µl dịch lọc
thổi khô bằng khí nito

67. Phân tích mẫu nước tiểu
ST Tên ∆∆∆∆C
Diện tích S
(mAu.s)
Cx Cs %H
Hiệu suất
trung bình
%H0
0 179896 1,89
2 CEP 90,621 259788 1,89 2,73 83,62
2 365412 1,89 3,85 97,62
3 AMP
0 221213 1,63
86,331 325414 1,63 2,39 76,63
2 482351 1,63 3,55 96,03
Hiệu suất thu hồi của mẫu nước tiểu

68. K t qu m t s phương pháp khác xác
đ nh kháng sinh cùng lo i
Chất phân tích
Điện di mao quản Sắc ký lỏng hiệu năng
cao
Điện hoá
LOD
(mg/l)
LOQ
(mg/l) LOD LOQ LOD
µµµµ
LOQ
µµµµ
(mg/l) (mg/l)
(mg/l) (mg/l) (µµµµg/l) (µµµµg/l)
CEP 0.98 3.26 0,0461 0,1537 6,15 20,50
AMP 0.73 2.45 0,0431 0,1433
PENG 0.85 2.82 0,0591 0,1971
OXA 0.93 3.08 0,0104 0,0347
CLO 1.00 3.34 0,0988 0,3294
Hiệu suất thu
hồi 83,43%-116,80% 94,52%-105,21% 93,6%-97,52%

69. Ưu nhược điểm của phương pháp
Ưu
Đi n di mao qu n S c ký l ng hi u năng cao Đi n hoá
- Xác đ nh đư c trên nhi u
đ i tư ng khác nhau
- Xác đ nh đư c trên nhi u
đ i tư ng khác nhau
- Ch m t s đ i tư ng
đi n hình
- Lư ng m u phân tích nh ,
thao tác đơn gi n
- Lương m u phân tích nh ,
thao tác ph c t p
- Thao tác đơn gi n
Ưu
đi m
và
như c
đi m
thao tác đơn gi n thao tác ph c t p
- Chi phí không cao
- Phân tích đư c nhi u ch t
cùng m t lúc
- Gi i h n phát hi n và đ nh
lư ng th p
- Chi phí cao
- Phân tích đư c nhi u m u
cùng m t lúc
- Gi i h n phát hi n và đ nh
lư ng cao hơn phương
pháp đi n di
- Chi phí ít
- Ch phân tích t ng m u
đơn l
- Gi i h n phát hi n và
đ nh lư ng cao

70. K T LU N
Khảo sát và chọn được thông số tối ưu cho quá trình chạy sắc ký:
1. Pha tĩnh: Cột Supelcosil RP-C18 với kích thước hạt nhồi 5µµµµm
hãng Sulpenco-Autralia
2. Pha động:
pH = 3,5
Tỷ lệ ACN/MeOH/đệm acetat là 10/20/70Tỷ lệ ACN/MeOH/đệm acetat là 10/20/70
Nồng độ đệm 10mM
Tốc độ 0,8ml/phút
3. Chạy đẳng dòng
4. Nhiệt độ cột tách 30oC
5. Thể tích mẫu 20µµµµl
6. Detector đơn bước sóng tại 225nm

71. Đánh giá phương pháp phân tích:
- Xây dựng đường chuẩn các kháng sinh trong khoảng 0,10 – 2,00ppm, hệ số
tương quan các đường chuẩn R2 > 0,99
- Giới hạn phát hiện LOD của các kháng sinh từ 0,01ppm đến 0,10ppm. Giới
hạn định lượng LOQ từ 0,03ppm đến 0,30ppm
- Độ chính xác ở các nồng độ 0,15ppm; 0,40ppm; 0,80ppm nằm trong
KẾT LUẬN
- Độ chính xác ở các nồng độ 0,15ppm; 0,40ppm; 0,80ppm nằm trong
khoảng 0,30% – 8,40 %
- Hệ số biến động ở các nồng độ 0,15ppm; 0,40ppm; 0,80ppm nằm trong
khoảng 0,31% - 4,92%
Phân tích hàm lượng kháng sinh trong mẫu thuốc và nước tiểu.
- Với mẫu thuốc: hiệu suất thu hồi đạt được từ 94,52%. đến 102.20%.
- Với mẫu nước tiểu: hiệu suất thu hồi từ 86,33% tới 90,62%.

72. Phân tích sulfonamid bằng kỹ thuật
LC/MS/MS và HPLC

73. SULFONAMID