Xác định dư lượng kháng sinh nhóm Tetrecyline góp phần nâng cao công tác quản lý chất lượng thực phâm. Đồng thời giúp các doanh nghiệp xuất khẩu thủy sản đáp ứng các yêu cầu khắc khe các nước trên thế giới
1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN
XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NHÓM
TETRACYCLINES TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN
PHẨM THỦY SẢN BẰNG SẮC KÝ LỎNG GHÉP
KHỐI PHỔ (LG/MS/MS)
Đề tài:
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
TS. Nguyễn Thị Thu Thủy
SINH VIÊN THỰC HIỆN
Dương Nhựt MSHV: M2014007
Nguyễn Hữu Trứ MSHV: M2014010
Bùi Thúy Vy MSHV: M2014011
BÁO CÁO SEMINAR
2. Xác định hàm lượng nhóm Tetracyclines trong thủy
sản và sản phẩm thủy sản tại Thành Phố Cần Thơ
Mục tiêu:
3. Nội dung báo cáo
Giới thiệu
Phương Pháp Phân Tích
Đánh Giá Kết Quả Phân Tích
Tài Liệu Tham Khảo
4. 1.1. Sơ lược về kháng sinh nhóm Tetracyclines
Tetracyclines là nhóm kháng sinh có phổ kháng
khuẩn rộng, có khả năng kháng các loài vi khuẩn
gây bệnh trên thủy sản
Sử dụng trong thời gian lâu dài làm cho vi khuẩn
lờn thuốc làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ
miễn dịch của thủy sản,
1. GIỚI THIỆU
Ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng
gây ra nhiều bệnh về thận, dị tật bẩm sinh và các
bệnh về xương,...
Tetracyclines là nhóm kháng sinh có phổ kháng
khuẩn rộng, có khả năng kháng các loài vi khuẩn
gây bệnh trên thủy sản
Tetracyclines là nhóm kháng sinh có phổ kháng
khuẩn rộng, có khả năng kháng các loài vi khuẩn
gây bệnh trên thủy sản
Tetracyclines là nhóm kháng sinh có phổ kháng
khuẩn rộng, có khả năng kháng các loài vi khuẩn
gây bệnh trên thủy sản
5. Kháng sinh nhóm tetracyclin bao gồm 3 kháng sinh
chính sau: tetracyclin (gọi tắt là TC), oxytetracyclin
(gọi tắt là OTC) và clortetracyclin (gọi tắt là CTC).
1.1. Sơ lược về kháng sinh nhóm Tetracyclines
1. GIỚI THIỆU
Tetracycline
6. 1.1. Sơ lược về kháng sinh nhóm Tetracyclines
1. GIỚI THIỆU
Oxytetracyclin
7. 1.1. Sơ lược về kháng sinh nhóm Tetracyclines
1. GIỚI THIỆU
Chlortetracyclin
8. 1.2. Tác hại của Tetracyclines
1. GIỚI THIỆU
Ảnh Hưởng Tới Đường Tiêu Hóa:
+ Thường gặp như ăn mất ngon, buồn nôn, chứng
nóng rát dạ dày.
+ Bội nhiễm nấm Candida albicans phải chữa trị với
nystatin.
+ Viêm ruột do staphylocoque: thường nặng ở người
già và trẻ em.
9. 1.2. Tác hại của Tetracyclines
1. GIỚI THIỆU
Ảnh Hưởng Tới Gan:
+ Hiếm gặp nhưng rất nặng là thoái hóa mỡ gan do
dùng liều cao và theo đường tĩnh mạch.
+ Ở bệnh nhân có thai 3 tháng cuối hoặc sau khi
sinh con.
+ Ở người suy thận.
10. 1.2. Tác hại của Tetracyclines
1. GIỚI THIỆU
Ảnh Hưởng tới thận:
+ Làm nặng thêm bệnh suy thận đã có từ trước.
+ Viêm gan - thận trong tình trạng thoái hóa mỡ
của gan.
+ Gây tổn thương ống thận.
11. 1.2. Tác hại của Tetracyclines
1. GIỚI THIỆU
Ảnh Hưởng Tới Răng:
+ Làm hỏng men răng, hỏng chất xương của
răng dẫn đến dễ bị sâu răng ở trẻ em
12. 2. Phương Pháp Phân Tích
11 Phạm Vi Áp Dụng
22 Nguyên Tắc
33
Quy Trình Phân Tích
44
Thông Số Chạy Máy
13. 2.1. Phạm vi áp dụng
Phương pháp này mô tả cách xác định hàm
lượng nhóm tetracyclines (TCs) có trong thủy sản
và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng ghép phổ
(LC/MS/MS). Giới hạn phát hiện của phương pháp
là 10ppb.
2. Phương Pháp Phân Tích
14. 2.2. Nguyên Tắc
2. Phương Pháp Phân Tích
TCs được chiết tách từ mẫu thủy sản bằng
đệm McIlvaine-EDTA, dịch chiết được làm sạch
bằng cách cho qua cột chiết pha rắn C18. Cô
dịch chiết đến khô, cặn khô được hòa tan trong
hỗn hợp MeOH:H2O (50:50). Hàm lượng TCs
được xác định bằng máy LC/MS/MS với giới
hạn phát hiện là 10ppb.
15. 2.3. Quy Trình Phân Tích
2. Phương Pháp Phân Tích
Chuẩn bị mẫu:
Chuẩn bị mẫu thử
Chuẩn bị mẫu trắng
Chuẩn bị mẫu kiểm soát (QC)
Dựng đường chuẩn
+ Nghiền ít nhất 200g mẫu, đựng trong túi
PE bảo quản trong tủ đông cho tới khi phân
tích (đối với mẫu thủy sản khô dùng kéo cắt
nhỏ và trộn đều).
+ Cân 2g ± 0.05g mẫu đã được nghiền vào
ống ly tâm nhựa 15ml.
+ Cân 2g ± 0.05g mẫu thủy sản
không chứa TCs vào ống ly
tâm nhựa 15ml.
+ Tiến hành chiết mẫu trắng
giống như mẫu thử.
+ Cân 2g ± 0.05g mẫu thủy sản không chứa TCs vào
ống ly tâm 15ml thêm 40µl dung dịch chuẩn 1ppm.
+ Tiến hành giống như mẫu thử.
+ Cân 2g ± 0.05g mẫu trắng lần lượt vào các ống
S1, S2, S3, S4, S5 đã được mã hóa trước.
+ Thêm lần lượt dung dịch chuẩn vào các ống theo
thứ tự như bảng sau:
Số thứ tự
Thể tích (µl)
TCs 1ppm
Nồng độ TCs
trong mẫu (ppb)
S1 20 10
S2 40 20
S3 100 50
S4 160 80
S5 200 100
16. 2.2. Quy Trình Phân Tích
2. Phương Pháp Phân Tích
Nghiền mẫu Cân Mẫu Chiết
Giải Hấp (10 ml dd 10mM
A.Oxalic trong MeOH)
Làm Sạch (Bằng cột Strata
C18 500mg/6ml)
Thổi Khô (N2, 400
C) Hòa Tan (1ml
MeOH:H2O (50:50))
Lọc (BK 0.2µm)Vial – LC/MS/MS
Lần 1:
+ 8 ml đệm Mcllvaine-ADTA (PH = 4).
+ Vortex 1 phút, lắc 15 phút với tốc độ 450 vòng/phút.
+ Ly tâm mẫu 4000 vòng/phút trong 5 phút, ở 40
C.
+ Hút lớp trên cho vào ống nghiệm nhựa 15ml khác.
Lần 2: Phần cặn được chiết lần hai với 7ml đệm
McIlvaine-EDTA (pH=4) tương tự như lần một.
+ Hút lớp trên cho vào ống nghiệm nhựa 15ml trên.
+ Ly tâm dịch chiết 4000 vòng/phút trong 10 phút,40
C.
HOẠT HÓA CỘT
+ 2 ml MeOH
+ 2ml H2O
Chú ý: không để cột bị khô+ Cho dịch chiết qua cột chiết pha rắn
C18, tốc độ chảy khoảng 1ml/phút.
+ Sau khi mẫu chảy xuống hết rửa cột
bằng 2ml nước HPLC.
Chú ý: Phải làm cho cột khô hết nước.
17. 2.4. Thông số cài đặt trên LC/MS/MS
2. Phương Pháp Phân Tích
Cài đặt thông số cho LC:
Pha động A: ACN 0.3% FA.
Pha động B: H2O 0.3% FA.
Thể tích tiêm 10µl.
HPLC Agilent 1200.
Cột: ZORBAX Eclipse XDB, 4.6 x 150mm, 5µm.
Cột và tỉ lệ pha động thay đổi nếu cần.
Nhiệt độ cột: 350
C.
Time Flow rate %A %B
Initial 0.2 10 90
0 0.2 10 90
4 0.2 50 50
8 0.2 80 20
8.5 0.2 30 70
12 0.2 10 90
20 0.2 10 90
18. 2.4. Thông số cài đặt trên LC/MS/MS
2. Phương Pháp Phân Tích
Cài đặt thông số cho MS:
Agilent 6410
LC/MS/MS
Source ESI+
Gas temp (oC) 350
Gas flow (l/min) 9
Nebulizer (psi) 35
Capillary positive (V) 3500
Capillary negative (V 3500
MS1 Heater (o
C) 100
MS2 Heater (o
C) 100
19. 2.4. Thông số cài đặt trên LC/MS/MS
2. Phương Pháp Phân Tích
Điều kiện phân mảnh MS/MS:
Component
Precursor
ion (m/z)
Product ion
(m/z)
Dwell
time
(s)
Fragmentor
(V)
Collision
energy (eV)
TC
445
445
428
410
0.2
0.2
100
100
17
15
OTC
461
461
426
444
0.2
0.2
100
100
18
25
CTC
479
479
461.8
444
0.2
0.2
100
100
17
15
20. 2.4. Thông số cài đặt trên LC/MS/MS
2. Phương Pháp Phân Tích
Thứ tự tiêm mẫu:
Mẫu chuẩn để xây dựng đường chuẩn
Mẫu trắng
Mẫu thử
Mẫu kiểm soát
21. Chất cần phân tích được khẳng định là hiện diện khi:
Yêu cầu về thời gian lưu
Mức dung sai cường độ ion tương đối,…
(đáp ứng theo chỉ thị 2002/657/EC của cộng đồng Châu
Âu.)
2. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ
2.1. Định Tính
Mức dung sai tối đa cho phép của các cường độ ion tương đối:
Cường độ tương đối (% của peak cơ sở) LC-MS, LC-MSn ( tương đối)
>50% ±20%
>20 đến 50% ±25%
>10 đến 20% ±30%
≤ 10% ±50%
22. 2. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ
2.2. Định Lượng
Hệ số hồi qui tuyến tính của đường chuẩn: R2
≥0.99
Không có peak nhiễu ở thời gian lưu của nhóm TCs
Tỉ lệ tín hiệu/nhiễu của các ion thứ cấp trong mẫu phải
≥3:1
Độ thu hồi từ 60% đến 100%
23. 2. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ
2.3. Tính Toán Kết Quả
Tính tỉ số ion theo phương trình:
1
2
100%
A
R
A
= ×
Trong đó:
R : tỉ số ion (%)
A1: Diện tích của peak ion thứ cấp có cường độ
cao
A2: Diện tích của peak ion thứ cấp có cường độ
thấp
Hệ số pha loãng n: v
m
n =
Trong đó:
m: khối lượng mẫu
v: thể tích cuối cùng
Tính hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu kiểm dựa
theo hệ số tín hiệu của từng mẫu phân tích và đường chuẩn,
kết quả nhân với hệ số pha loãng tính theo đơn vị µg/Kg với
2 số thập phân.
24. 4. TÀI LIỆU THAM KHẢO
1/ AOAC Official Method 995.09 2005
2/ Analysis of tetracyclines by HPLC of Agilent.
3/ 28TCVN 177:2002
4/ Rapid determination of residues of 4 Tetracyclines in meat by a
Microbiological screening, HPLC and LC/MS/MS;
5/ High-throughput analysis of Tetracycline and Peniciclin antibiotics
in animal tissues using electrospray tandem mass spectrometry with
selectd reaction monitoring transition;
6/ Official Joural of the European Communities, Commission decision
(2002/657/EC);
7/ Qualitative Identification of Tetracyclines, United States
Department of Agriculture Food Safety and Inspection Service- Office
of Public Health Science, 12/2007.
26. 2.1. Quy Trình Phân Tích
2. Phương Pháp Phân Tích
Nghiền mẫu Cân Mẫu Chiết
Giải Hấp (10 ml dd 10mM
A.Oxalic trong MeOH)
Làm Sạch (Bằng cột Strata
C18 500mg/6ml)
Thổi Khô (N2, 400
C) Hòa Tan (1ml
MeOH:H2O (50:50))
Lọc (BK 0.2µm)Vial – LC/MS/MS