Các bước tái tổ hợp Tác chiết & tinh sạch acid nucleic 1 số vector tác (nhân) dòng Các nhóm enzyme cơ bản

1. 5.1- Công nghệ DNA tái tổ hợp
Đinh Đoàn Long
I. Các bước tái tổ hợp DNA
1. Chọn nguồn gen cần tách dòng (chứa trình tự DNA quan tâm)
2. Chuẩn bị DNA ngoại lai (3’, 5’ phù hợp)
3. Chọn lọc vector
4. Cải biến 3’ & 5’ của vector & DNA rồi nối với nhau
5. Cho vector tái tổ hợp vào tế bào chủ  nhân lên
6. Sàng lọc: Chọn dòng tế bào mang vector
7. Xác định đặc tính các dòng  dùng để ncứu
II. Tách chiết & tinh sạchacidnucleic
DNA RNA
+ Nếu môi trường điện môi thay đổi do dung
môi hữu cơ mất nước):
Dùng cột Oligo dT – cellulose hoặc cột hấp thụ
từ tính với biotin-oligo(dT) để tách chiết

2.  Kết tủa Protein rõ rệt, DNA cx bị kết tủa
+ Quy tắc:
- pH: 7 – 8.5
- Phenol, chlorform, isoamylalcohol: kết tủa protein
- Chất chống oxy hóa: giảm nguy cơ biến tính acid
nucleic
III. 1 số vector tách (nhân) dòng
Kích thước nhỏ, kích
thước đoạn xen càng
lớn
Trình tự nucleotide đc
biết đầy đủ
Trong tb chủ, có khả
năng tự sao chép
Nhận biết nhờ gen
đánh dấu chỉ thị
Gắn ptử DNA ngoại lai
(polycloning site)
1. Plasmid
Ưu điểm Nhược điểm
+ Cấu trúc đơn giản, kích thước nhỏ
+ Dễ tinhsạch & phân tích đoạn tái tổ hợp
+ Nhân nhanh lên số bản sao lớn
+ Hiệu suấtbiến nạp thấp (đôi khi)
+ Ko hiệuquả ở nhân thực
+ DNA phân đoạn lớn ko tách dòng đc
2. Phage
Ưu điểm Nhược điểm
+ Xâm nhập tb nhanh
+ Tách cả DNA nhân sơ, nhân thực
+ Đoạn cài lên đến 20 kb
+ Dễ bảo quản (virus bền ở nhiệt độ lạnh)
+ Phân tích phức tạp
+ Ítbản sao
IV. 5 nhóm Enzyme cơ bản dùng cho DNA tái tổ hợp
Enzyme Ví dụ
a) Làm đứt gãy liên kết phosphodieste Endonuclease

3. Exonuclease
b) Nối khung ptử DNA Ligase
c) Bổ sung/loại nhómphosphateở đầu tận
cùng của acid nucleic
Kinase, phosphatase, pyrophosphatase
d) Tổng hợp liên kết phosphodiestemới
trong acid nucleic
Polymerase
Reverse trascriptase
Transferase
e) Bảo vệ, đóng gói, xoắn, giãn …
Methylase
Protein liên kết
Topoisomerase
a) Enzyme đứt gãy liên kết phosphodieste
Enzyme Nguồn gốc
(tách từ)
Chức năng Sản phẩm Ứng dụng
Dnase I
Tuyến tụy
bò
Phân hủy
phosphodieste DNA
mạch đơn
Các oligo-nucleotide
Đầu 5’-P & 3’-OH tự
do
Tạo phân đoạn DNA / vector đầu
tù
Mungbean
nuclease
Cây đậu đỗ
Phân hủy
phosphodieste DNA,
RNA
Đối với DNA mạch
đơn: oligonucleotide
5’-P, 3’OH free
Cắt gọt plasmid
Gắn ptử DNA vào đúng khung dọc,
theo chiều mong muốn
RnaseH
Virus
Vi khuẩn
Nhân chuẩn
Phân hủy RNA khi có
cấu trúc lai DNA/RNA
Các đoạn
oligonucleotide 5’-P
+ Cắt trình tự đặc hiệu = cách tạo
đoạn lai
+ Bỏ đầu polyA của mRNA trong
điện di  giảm nhiễu khi phân
tích RNA
+ Loại bỏ mRNA khi tổng hợp
cDNA
Exonuclease
VII
E.Coli
Phân cắt DNA mạch
đơn từ 3’ & cả 5’
Từng đoạn 2 – 100
nucleotide
Cắt bỏ đầu thừa trên DNA sợi kéo
Xác định kích thước, lập bản đồ
trình tự intro
Nuclease S1
(exonuclease &
endonlease)
Nấm mốc
Aspergillus
oryzae
Cắt RNA & DNA mạch
đơn
Cắt cả trong lẫn ngoài
Các phân tử lai
DNA/RNA ko đầu
thừa
Cắt bỏ kẹp tóc khi tổng hợp cDNA
Xác định intro

4. b) Enzyme nối khung DNA & RNA – Ligase
Mã hóa bởi hệ gene phage T4
Enzyme Chức năng/hoạt tính Ứng dụng
E.Coli DNA ligase
Xúc tác hình thành liên kết phosphodieste giữa
2 phân đoạn DNA nằm kề (1 có 5’-P; 1 có 3’OH)
Nối các đoạn polynucleotide tổng
hợp gián đoạn
T4 DNA ligase Chỉ nối DNA sợi kép với nhau Nối DNA sợi kép đầu dính or tù
T4 RNA ligase Nối DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA (đơn or kép)
Nối dài ptử DNA or RNA
Gắn các trình nucleotide đánh dấu (GFP…)
c) Enzyme tổng hợp liên kết phosphodieste
Enzyme Hoạt tính Ứng dụng
Reverse
transcriptase
(1) Tổng hợp DNA: dùng
mạch DNA or RNA làm khuôn
(2) RNase H
Xây dựng thư viện cDNA
Đánh dấu đầu 3’ của DNA
Giải mã trình tự mã hóa
Poly(A)
polymerase
Bổ sung các tiểu phần AMP
vào đầu 3’ RNA
(1) Đánh dấu đầu 3’ mRNA
(2) Ghép đầu poly(A) vào các mARN thiếu đầu  dùng mồi
poly(T) tổng hợp cADN.
Terminal deoxyribo-
nucleotidyl
transferase
Tách từ tuyến ức bê
Xúc tác pứ gắn các dNTP vào
phía đầu 3’ của DNA (ko cần
mạch khuôn)
(1) Đánh dấu đầu 3’ DNA.
(2) Tạo các đầu gắn mong muốn cho vector và DNA ngoại lai:
+ dùng nucleotide bổ trợ
+ hữu hiệu cho xây dựng thư viện cADN).