Uji penetapan antibiotik

1. UJI POTENSI ANTIBIOTIK

2. Metode umum yang digunakan
• Lempeng Silinder (Lempeng)
• Lempeng Turbidimetri

3. Memuat antubiotik yang potensinya dapat ditetapkan secara
mikrobiologi dan cara penetapannya

4. Penetapan Lempeng-Silinder (Lempeng)
• Penetapan cara dalam silinder yang dipasang tegak lurus pada lapisan agar padat dalam cawan Petri atau
lempeng, sehingga pertumbuhan mikroba spesifik yang diinokulasikan dihambat pada daerah disekeliling
silinder yang berisi larutan antibiotik berupa lingkaran atau “zona”.
• Lempeng: Cawan Petri kaca atau plastik sekali pakai (berukuran 20x100 mm atau ukuran lain yang sesuai)
dengan penutup.
• Silinder: Silinder besi tahan karat atau porselen; diameter luar 8 ± 0,1 mm; diameter dalam 6 ± 0,1 mm;
tinggi 10 ± 0,1 mm. [Catatan Cuci silinder dengan seksama dengan asam nitrat 2 N atau asam kromat]
• Larutan baku: Larutkan sejumlah baku pembannding yang sesuai seperti yang tertera pada tabel. Encerkan
hingga dosis yang telah ditentukan dan gunakan dalam waktu yang disarankan.

5. Pada hari penetapan, siapkan pengenceran dari larutan persediaan 5 atau lebih larutan untuk pengujian
dengan dosis bertahap, umumnya dengan perbandingan 1:1,25. Gunakan pengencer akhir yang
dinyatakan dan urutan dosis dengan dosis tengah
• Larutan sampel: Tentukan perkiraan potensi per bobot atau volume sampel. Pada hari penetapan,
siapkan larutan persediaan serta enceran larutan sampel setiap antibiotik dengan pengencer akhir
yang sama seperti untuk baku pembanding. Encerkan larutan persediaan sampel dengan pengencer
akhir untuk mendapatkan dosis setara dengan dosis tengah larutan baku
• Inokula: Suspensikan mikroba uji dari biakan segar agar miring atau biakan lain dalam 3 mL salin LP
steril. Butiran kaca dapat digunakan untuk memudahkan pembuatan suspensi. Sebarkan suspensi ke
permukaan lapisan dari dua atau lebih lempeng agar atau permukaan media agar dalam botol Roux
(menutupi seluruh permukaan) yang berisi 250 mL media
• Analisis: Siapkan lapisan dasar untuk sejumlah cawan Petri penetapan, gunakan media dan volume

6. Penetapan Cara Tabung
Penetapan cara tabung berdasarkan pada penghambatan pertumbuhan mikroba dalam larutan serba
sama, baik dengan antibiotik dan tanpa antibiotik, dalam media cair yang dapat menumbuhkan
mikroba dengan cepat.
Spektrofotometer: Pengukuran serapan atau transmitan dalam pita frekuensi yang sempit,
membutuhkan spektrofotometer yang sesuai dan mempunyai sumber cahaya panjang gelombang
yang dapat diubah atau dibatasi menggunakan filter 580 nm atau dengan 530 nm. Kemungkinan lain
dapat digunakan spektrofotometer dengan panjang gelombang bervariasi dan diatur 580 nm atau
530 nm
Peralatan: Tabung reaksi kaca atau plastik ukuran 16 x 125 mm atau 18 x 150 mm.

7. Larutan baku: Untuk menyiapkan larutan persediaan, larutkan sejumlah baku pembanding antibiotik yang
sesuai atau seluruh isi satu vial jika diperlukan dalam pelarut seperti tertera pada Tabel 7; dan encerkan
hingga dosis yang dikehendaki. Simpan pada suhu 2o -8 o , dan gunakan dalam waktu yang ditentukan.
Pada hari penetapan, siapkan dari larutan persediaan sebanyak lima atau lebih larutan uji, dengan
peningkatan dosis berturut-turut, umumnya dalam perbandingan 1:1,25.
Larutan sampel: Tentukan perkiraan potensi per bobot atau volume sampel. Pada hari penetapan, siapkan
larutan persediaan serta enceran larutan uji dengan pengencer akhir yang sama seperti untuk baku
pembanding (Tabel 7). Encerkan larutan persediaan sampel dengan pengencer akhir untuk mendapatkan
dosis setara dengan dosis tengah baku dari larutan baku (S3)

8. Inokula: Suspensikan mikroba uji dari pertumbuhan biakan segar agar miring atau dalam 3 mL salin LP steril. Butiran
kaca dapat digunakan untuk memudahkan pembuatan suspensi. Enterococcus hirae (ATCC 10541) dan
Staphylococcus aureus (ATCC 9144) dibiakkan dalam media cair tidak pada agar. Sebarkan suspensi ke permukaan
lapisan dari dua atau lebih lempeng agar atau ke permukaan media agar dalam botol Roux (menutupi seluruh
permukaan) yang berisi 250 mL media Inkubasi selama waktu dan suhu tertentu.
Analisis: Pada hari penetapan siapkan dosis antibiotik seperlunya dengan mengencerkan larutan baku persediaan
dan sampel seperti yang ditetapkan pada Larutan baku dan Larutan sampel. Siapkan lima tingkat dosis larutan baku
(S1 – S5) dan satu tingkat dosis larutan uji (U3) masing-masing tiga replikat, terhadap lebih dari 20 sampel sesuai
dengan dosis tengah larutan baku (S3).

9. Media
Larutkan bahan-bahan dalam air hingga 1 liter, dan atur pH larutan menggunakan natrium hidroksida 1 N
atau asam hidroklorida 1 N sehingga sesudah sterilisasi uap air, pH media sesuai dengan yang tertera.
Larutan
Dapar: Siapkan seperti tertera pada Tabel 12, atau cara lain yang sesuai. Dapar disterilkan setelah
pembuatan dan pH yang tertera pada masing-masing adalah pH setelah sterilisasi.
Larutan lain: Seperti tertera pada Pereaksi, Indikator dan Larutan.
Air: Gunakan Air Murni. Salin: Gunakan salin LP. Formaldehida encer: Formaldehida P dan air 1:3.

10. PERHITUNGAN
Langkah 1 : Lakukan perhitungan awal dan periksa kesesuaian variasi. Untuk setiap tiga lempeng, rata
ratakan sembilan nilai pembanding dan sembilan nilai baku.
Langkah 2: Lakukan koreksi variasi lempeng ke lempeng. Koreksi ini diterapkan untuk merubah hasil
pengukuran rerata zona dari tiap dosis ke nilai yang hanya bisa jika hasil pengukuran rerata dosis
pembanding dari 3 lempeng sama seperti nilai angka koreksi yang dihitung dengan rumus:
XC = XS - (XR - P)
XC = rerata baku terkoreksi
XS = rerata baku sebelum koreksi
XR = rerata pembanding
P = angka koreksi
Langkah 3: Penentuan garis kurva baku
Langkah 4: Hitung konsentrasi sampel dengan melakukan konversi menggunakan garis kurva baku.