Download luận văn thạc sĩ ngành hóa học với đề tài: Phân tích và đánh giá hàm lượng một số chất tạo ngọt trong thực phẩm truyền thống ở tỉnh Thừa Thiên Huế 50000309

1. ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
TRẦN TIÊU LINH
PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG MỘT SỐ
CHẤT TẠO NGỌT TRONG THỰC PHẨM TRUYỀN
THỐNG Ở TỈNH THỪA THIÊN HUẾ
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Thừa Thiên Huế, 2016

2. i
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
TRẦN TIÊU LINH
PHÂN TÍCH VÀ ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG MỘT SỐ
CHẤT TẠO NGỌT TRONG THỰC PHẨM TRUYỀN
THỐNG Ở TỈNH THỪA THIÊN HUẾ
CHUYÊN NGÀNH : HÓA PHÂN TÍCH
MÃ SỐ : 60 44 01 18
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. NGUYỄN ĐÌNH LUYỆN
Thừa Thiên Huế, 2016

3. ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi.
Các số liệu và các kết quả nghiên cứu nêu trong luận văn là trung
thực, được các đồng tác giả cho phép sử dụng và chưa được công bố
trong bất kì một công trình nào khác.
Tác giả luận văn
Trần Tiêu Linh

4. iii
Lời Cảm Ơn
Để hoàn thành luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy
hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Đình Luyện - Người thầy kính mến đã luôn
giúp đỡ tôi, đọc bản thảo, bổ sung, động viên và hướng dẫn tôi trong suốt quá trình
thực hiện luận văn.
Xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô giáo khoa Hóa, Trường Đại học Sư
phạm Huế đã tạo mọi điều kiện thuận lợi và đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi
trong suốt thời gian thực hiện luận văn.
Xin chân thành cảm ơn các anh chị phụ trách phòng thí nghiệm của Trung
tâm Kiểm nghiệm Thuốc - Mỹ phẩm - Thực phẩm tỉnh Thừa Thiên Huế đã giúp đỡ
và tạo điều kiện cho tôi sử dụng một số thiết bị, hóa chất trong quá trình thực hiện
luận văn này.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc và chân thành đến gia đình,
bạn bè đã luôn động viên giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu
luận văn.
Huế, tháng 10 năm 2016
Trần Tiêu Linh

5. 1
MỤC LỤC
Trang phụ bìa .............................................................................................................. i
Lời cam đoan.............................................................................................................. ii
Lời cảm ơn ................................................................................................................ iii
Mục lục........................................................................................................................1
Danh mục các từ viết tắt..............................................................................................3
Danh mục các bảng .....................................................................................................4
Danh mục các hình......................................................................................................6
MỞ ĐẦU ....................................................................................................................7
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN LÝ THUYẾT ...........................................................9
1.1. Giới thiệu về phụ gia thực phẩm......................................................................9
1.1.1. Định nghĩa về phụ gia thực phẩm ...........................................................9
1.1.2. Vai trò của PGTP ....................................................................................10
1.1.3. Chức năng của nhóm phụ gia cho phép sử dụng trong thực phẩm ........10
1.1.4. Thực trạng quản lý sử dụng phụ gia thực phẩm......................................12
1.1.5. Tác động bất lợi của PGTP ....................................................................12
1.2. Chất tạo ngọt..................................................................................................13
1.2.1. Tổng quan về chất tạo ngọt ....................................................................13
1.2.2. Tổng quan saccharin ..............................................................................14
1.2.3. Tổng quan acesulfame kali ....................................................................15
1.2.4. Tổng quan về phương pháp phân tích saccharin và acesulfame kali .....16
1.3. Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)....................18
1.3.1. Nguyên tắc của phương pháp HPLC ......................................................18
1.3.2. Cơ sở của phép sắc ký lỏng hiệu năng cao .............................................18
1.3.3. Phân loại các kỹ thuật HPLC ..................................................................24
1.3.4. Cách đánh giá peak, tính kết quả trong phương pháp HPLC .................25
CHƯƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................28
2.1. Nội dung nghiên cứu......................................................................................28
2.2. Thiết bị và hóa chất........................................................................................28
2.2.1. Thiết bị ....................................................................................................28

6. 2
2.2.2. Hóa chất ..................................................................................................29
2.3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu .........................................................30
2.3.1. Đối tượng nghiên cứu .............................................................................30
2.3.2. Phương pháp lấy mẫu, xử lý mẫu và bảo quản mẫu ...............................30
2.3.3. Phương pháp định lượng saccharin và acesulfame kali..........................31
2.3.4. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích.....................................31
2.4. Quy trình xử lý mẫu.......................................................................................34
2.5. Xử lý số liệu thực nghiệm..............................................................................36
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .........................................................38
3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký định lượng saccharin và acesulfame kali.............38
3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng tới quá trình tách..........................38
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng độ phân cực của pha động đến quá trình tách........40
3.2. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích............................................42
3.2.1. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).......42
3.2.2. Phương trình đường chuẩn của saccharin và acesulfame kali ................43
3.2.3. Độ lặp lại của phương pháp ....................................................................45
3.2.4. Độ đúng của phương pháp ......................................................................47
3.3. Xác định, đánh giá hàm lượng saccharin và acesulfame kali trong thực
phẩm truyền thống ........................................................................................47
3.3.1. Xác định hàm lượng saccharin, acesulfame kali và so sánh với tiêu
chuẩn cho phép......................................................................................47
3.3.2. Đánh giá hàm lượng saccharin theo vị trí lấy mẫu .................................50
3.3.3. Đánh giá hàm lượng của saccharin giữa các loại thực phẩm cùng nguồn gốc...54
3.3.4. Đánh giá hàm lượng của saccharin giữa các loại thực phẩm khác nguồn gốc ...58
3.4. Một số khuyến cáo và giải pháp ....................................................................60
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................................61
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................62
PHỤ LỤC

7. 3
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
STT
Ký
hiệu
Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt
1 HPLC
High performance liquid
chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
2 TCVN Viet Nam Standard Tiêu chuẩn Việt Nam
3 ppm Part per million Phần triệu
4 ppb Part per billon Phần tỉ
5 LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện
6 LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lượng
7 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tương đối
8 ACN Acetonitrile Acetonitril
10 GHPH Limit Of Detection Giới hạn phát hiện
11 ML Maximum level Lượng đối đa cho phép
12 S Standard deviation Độ lệch chuẩn
13 tR Retentione time Thời gian lưu
14 R Correlation Hệ số tương quan
15 Rev Recovery Độ thu hồi
16 Sac Saccharin Saccharin
17 Ace Acesulfame potassium Acesulfame kali

8. 4
DANH MỤC CÁC BẢNG
STT Bảng Tiêu đề Trang
1 Bảng 2.1 Kí hiệu mẫu và vị trí lấy mẫu 31
2 Bảng 2.2 Sự biến động hàm lượng 2 chất tạo ngọt theo yếu tố
khảo sát
37
3 Bảng 2.3 Kết quả phân tích ANOVA 1 chiều 37
4 Bảng 3.1
Các thông số cơ bản ở tốc độ dòng khác nhau của
saccharin và acesunlfame kali
40
5 Bảng 3.2
Các thông số cơ bản của quá trình tách saccharin và
acesulfame kali ở tỷ lệ pha động khác nhau
42
6 Bảng 3.3 Kết quả xác định giới hạn phát hiện (LOD) 43
7 Bảng 3.4 Sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ 44
8 Bảng 3.5 Kết quả khảo sát độ lặp lại trên nền mẫu thử (n=8) 46
9 Bảng 3.6 Kết quả khảo sát độ đúng trên nền mẫu thử (n=3) 47
10 Bảng 3.7
Kết quả xác định hàm lượng saccharin và acesulfame
kali trong thực phẩm truyền thống được chế biến từ hải
sản
48
11 Bảng 3.8
Kết quả xác định hàm lượng saccharin và acesulfame
kali trong thực phẩm truyền thống được chế biến từ thịt
và đậu
49
12 Bảng 3.9
Kết quả phân tích ANOVA 1 chiều của sự biến động
hàm lượng saccharin trong thực phẩm truyền thống chế
biến từ hải sản theo vị trí lấy mẫu
50
13 Bảng 3.10
Kết quả phân tích ANOVA 1 chiều của sự biến động
hàm lượng saccharin trong thực phẩm truyền thống chế
biến từ thịt theo vị trí lấy mẫu
50
14 Bảng 3.11
Kết quả phân tích ANOVA 1 chiều của sự biến động
hàm lượng saccharin trong thực phẩm truyền thống chế
biến từ đậu theo vị trí lấy mẫu
51

9. 5
15 Bảng 3.12
Độ lệch nhỏ nhất và độ lệch giữa các giá trị trung bình
của hàm lượng saccharin trong thực phẩm có nguồn gốc
từ hải sản theo vị trí lấy mẫu
52
16 Bảng 3.13
Độ lệch nhỏ nhất và độ lệch giữa các giá trị trung bình
của hàm lượng saccharin trong thực phẩm có nguồn gốc
từ thịt và đậu theo vị trí lấy mẫu
53
17 Bảng 3.14
Các đại lượng thống kê thu được khi đánh giá hàm
lượng saccharin giữa các loại thực phẩm chế biến từ hải
sản
55
18 Bảng 3.15
Các đại lượng thống kê thu được khi đánh giá hàm
lượng saccharin giữa các loại thực phẩm chế biến từ thịt
56
19 Bảng 3.16
Các đại lượng thống kê thu được khi đánh giá hàm
lượng saccharin giữa các loại thực phẩm chế biến từ đậu
57
20 Bảng 3.17
Kết quả phân tích ANOVA 1 chiều sự biến động hàm
lượng saccharin theo nguồn gốc khác nhau
58
21 Bảng 3.18
Độ lệch nhỏ nhất và độ lệch giữa các giá trị trung bình
của hàm lượng saccharin trong thực phẩm theo nguồn
gốc khác nhau
58

10. 6
DANH MỤC CÁC HÌNH
STT Hình Tiêu đề Trang
1 Hình 1.1 Giới thiệu hệ thống HPLC 20
2 Hình 1.2 Sắc đồ hai cấu tử A và B 22
3 Hình 3.1
Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và acesulfame kali ở
tốc độ 0,6ml/phút
38
4 Hình 3.2
Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và acesulfame kali ở
tốc độ 0,8ml/phút
39
5 Hình 3.3
Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và acesulfame kali ở
tốc độ 1,0ml/phút
39
6 Hình 3.4
Sắc ký đồ hỗn hợp sacccharin và acesunlfame kali
với tỷ lệ pha động [40:60]
41
7 Hình 3.5
Sắc ký đồ hỗn hợp sacccharin và acesunlfame kali
với tỷ lệ pha động [80:40]
41
8 Hình 3.6 Đường chuẩn của saccharin 44
9 Hình 3.7 Đường chuẩn của acesulfame kali 45
10 Hình 3.8
Biểu đồ biểu diễn sự biến động hàm lượng của
saccharin trong ruốc và tôm chua
55
11 Hình 3.9
Biểu đồ biểu diễn sự biến động hàm lượng của
saccharin trong nem và chả
56
12 Hình 3.10
Biểu đồ biểu diễn sự biến động hàm lượng của
saccharin trong mè xửng và chè
57
13 Hình 3.11
Biểu đồ biểu diễn sự biến động hàm lượng saccharin
trung bình trong thực phẩm có nguồn gốc khác nhau 59

11. 7
MỞ ĐẦU
Sự phát triển kinh tế - xã hội luôn đi đôi với nhu cầu nâng cao chất lượng
cuộc sống của con người, trong đó có nhu cầu tiêu dùng các loại thực phẩm an
toàn. Hiện nay, các thực phẩm có vị ngọt như chè, bánh kẹo, nước ngọt, các loại
mứt hoa quả,… là thực phẩm phổ biến được người tiêu dùng sử dụng trong ăn
uống hằng ngày. Ngoài vị ngọt có giá trị dinh dưỡng thì đa phần các vị ngọt khác
đều do các chất tạo ngọt không có giá trị dinh dưỡng tạo nên. Khi sử dụng thực
phẩm có hàm lượng chất tạo ngọt quá liều lượng có thể gây ảnh hưởng sức khỏe
cho người tiêu dùng.
Việc sử dụng các chất tạo ngọt tổng hợp có trong danh mục phụ gia được
phép sử dụng trong thực phẩm với hàm lượng nằm khoảng giới hạn quy định thì
không gây ảnh hưởng đến sức khỏe của người tiêu dùng. Ngược lại khi sử dụng
chúng quá liều lượng thì có thể gây ngộ độc hóa học, và là nguyên nhân gây ra
nhiều chứng bệnh khác nhau[6]. Tuy nhiên tại nhiều cơ sở sản xuất thực phẩm,
người ta thường thêm chất tạo ngọt tổng hợp như acesulfam kali, aspartam,
saccharin,.. với những lượng khác nhau, có thể vượt quá giới hạn cho phép để tăng
vị ngọt, tạo hương vị thơm cho sản phẩm nhằm mang lợi nhuận nhiều hơn[4]. Vì
vậy việc phân tích và đánh giá hàm lượng của chúng có trong thực phẩm là nhiệm
vụ vô cùng cấp bách và cần thiết.
Theo Quyết định của Bộ Y tế về việc ban hành “Quy định danh mục các chất
phụ gia được phép sử dụng trong thực phẩm”, số 3742/2001/QĐ – BYT, tháng 8
năm 2001[4], danh mục các chất tạo ngọt tổng hợp gồm có manitol, acesulfame
kali, aspartam, isomalt, sucralozơ, sorbitol, saccharin…Trong đó hàm lượng
saccharin và acesulfam kali sử dụng khá phổ biến trong việc chế biến thực phẩm.
Nhằm nâng cao hiệu quả công tác kiểm tra chất lượng các loại thực phẩm
chế biến ở tỉnh Thừa Thiên Huế, từ đó đảm bảo an toàn thực phẩm cho người tiêu
dùng. Vì vậy chúng tôi lựa chọn và nghiên cứu đề tài: “Phân tích và đánh giá hàm
lượng một số chất tạo ngọt trong thực phẩm truyền thống ở tỉnh Thừa Thiên Huế”
với mục đích sau:

12. 8
- Xác định hàm lượng chất tạo ngọt trong các loại thực phẩm truyền thống
như: sản phẩm từ đậu, từ thịt lợn và từ hải sản.
- Đánh giá mức độ sử dụng chất tạo ngọt trong các thực phẩm truyền thống, từ
đó đưa ra khuyến cáo và một số giải pháp nhằm đảm bảo an toàn thực phẩm.

13. 9
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN LÝ THUYẾT
1.1. Giới thiệu về phụ gia thực phẩm
1.1.1. Định nghĩa về phụ gia thực phẩm (PGTP) [1], [7], [10]
Theo Ủy ban Tiêu chuẩn thực phẩm Quốc tế (Codex Alimentarius Commisson
– CAC): PGTP là chất có hay không có giá trị dinh dưỡng, không được tiêu thụ
thông thường như một thực phẩm và cũng không được sử dụng như một thành phần
của thực phẩm. Việc bổ sung chúng vào thực phẩm là để giải quyết mục đích công
nghệ trong sản xuất, chế biến, bao gói, bảo quản, vận chuyển thực phẩm, nhằm cải
thiện kết cấu hoặc đặc tính kỹ thuật của thực phẩm đó. Phụ gia thực phẩm không
bao gồm các chất ô nhiễm hoặc các chất độc bổ sung vào thực phẩm nhằm duy trì
hay cải thiện thành phần dinh dưỡng của thực phẩm.
Theo tổ chức Lương thực và Nông nghiệp Liên Hiệp Quốc (Food and
Agriculture Organization of the United Nations – FAO): PGTP là chất không dinh
dưỡng được thêm vào các sản phẩm với các ý định khác nhau. Thông thường các
chất này có hàm lượng thấp, dùng để cải thiện tính chất cảm quan, cấu trúc, mùi vị
cũng như bảo quản sản phẩm.
Theo Tiêu chuẩn Việt Nam (TCVN): PGTP là những chất không được coi là
thực phẩm hoặc một thành phần của thực phẩm. Phụ gia thực phẩm có ít hoặc
không có giá trị dinh dưỡng, được chủ động cho vào với mục đích đáp ứng yêu cầu
của công nghệ trong quá trình sản xuất, chế biến, xử lý, bao gói, vận chuyển, bảo
quản thực phẩm. Phụ gia thực phẩm không bao gồm các chất ô nhiễm hoặc các chất
bổ sung vào thực phẩm với mục đích tăng thêm giá trị dinh dưỡng của thực phẩm.
Từ xưa đến nay, các loại gia vị tự nhiên được sử dụng nhiều trong chế biến
thông dụng như: hành, gia vị ớt, hạt tiêu tạo vị cay, cà chua tạo vị chua - ngọt, củ
cải tạo vị đắng. Đến năm 1990 từ vanille, tinh dầu chanh, cam, bạc hà được chiết
xuất từ thực vật, còn chất hương liệu khác sử dụng trong thực phẩm đều đã được
tổng hợp. Ngày nay, nhờ tiến bộ của khoa học kỹ thuật, nhất là ngành công nghiệp
hóa học và ngành công nghiệp thực phẩm, phụ gia thực phẩm cũng gia tăng nhanh
chóng về chủng loại và số lượng.

14. 10
1.1.2. Vai trò của PGTP [8]
Khoa học và công nghệ ngày càng phát triển giúp cho PGTP cũng đa dạng
hơn. Đến nay đã có hơn 2500 phụ gia đã được sử dụng trong công nghệ thực phẩm
góp phần quan trọng trong việc chế biến thực phẩm.
Phụ gia thực phẩm đóng vai trò quan trọng trong lĩnh vực công nghệ thực
phẩm:
- Góp phần điều hòa nguồn nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất thực phẩm,
giúp nhà máy có thể hoạt động quanh năm, sản phẩm được phân phối trên toàn thế
giới.
- Cải thiện được tính chất của sản phẩm: PGTP được bổ sung vào thực phẩm
nhằm làm thay đổi tính chất cảm quan như cấu trúc, màu sắc, độ đồng đều,… của
sản phẩm.
- Làm thỏa mãn thị hiếu ngày càng cao của người tiêu dùng.
- Góp phần làm đa dạng hóa các thực phẩm: cùng với sự xuất hiện của PGTP
thức ăn nhanh, thức ăn ít năng lượng, các thực phẩm thay thế khác cũng ra đời và
phát triển để đáp ứng nhu cầu ăn uống ngày càng đa dạng của con người.
- Nâng cao chất lượng sản phẩm: các chất màu, chất mùi, chất tạo vị làm gia
tăng tính hấp dẫn của sản phẩm.
- Đơn giản hóa các công đoạn sản xuất: việc sử dụng các hợp chất bóc vỏ
trong chế biến các loại củ giúp rút ngắn thời gian bóc vỏ.
1.1.3. Chức năng của nhóm phụ gia cho phép sử dụng trong thực phẩm [7], [10]
Theo Ủy ban tiêu chuẩn hóa thực phẩm quốc tế (CAC), PGTP được chia làm 23
nhóm dựa trên mục đích sử dụng của chất phụ gia. Tùy theo tình hình của mỗi nước
mà cơ quan quản lý về an toàn thực phẩm quy định danh mục riêng áp dụng cho quốc
gia đó. Các chất phụ gia chứa chức năng cụ thể đảm bảo các nguyên tắc sau:
- Tất cả các phụ gia thực phẩm dù trong thực tế đang sử dụng hoặc sẽ được đề
nghị đưa vào sử dụng phải được tiến hành nghiên cứu về độc học hoặc bằng việc
đánh giá và thử nghiệm mức độc hại, mức độ tích lũy, tương tác hoặc các phản ứng
tiềm tàng của chúng theo phương pháp thích hợp.

15. 11
- Chỉ có phụ gia thực phẩm đã được xác nhận bảo đảm độ an toàn theo quy
định, không gây nguy hiểm cho sức khỏe người tiêu dùng ở tất cả các liều lượng
được đề nghị mới cho phép sử dụng.
- Các phụ gia thực phẩm đã được xác nhận vẫn cần xem xét, thu thập những
bằng chứng thực tế chứng minh không có nguy cơ ảnh hưởng đến sức khỏe người
tiêu dùng ở ML (maximun level) đã đề nghị, vẫn phải theo dõi liên tục và đánh giá lại
về tính độc hại bất kể thời điểm nào cần thiết khi những điều kiện sử dụng thay đổi và
các thông tin khoa học mới.
- Tại tất cả các lần đánh giá, phụ gia thực phẩm phải phù hợp với các yêu cầu kỹ
thuật đã được phê chuẩn, nghĩa là các phụ gia thực phẩm phải có tính đồng nhất, tiêu
chuẩn hóa về chất lượng và độ tinh khiết đạt các yêu cầu kỹ thuật theo CAC.
- Các phụ gia thực phẩm chỉ được sử dụng khi đảm bảo các yêu cầu sau:
+ Không làm thay đổi chất lượng dinh dưỡng của thực phẩm.
+ Cung cấp thành phần hoặc các kết cấu cần thiết cho thực phẩm được sản xuất
phục vụ đối tượng có nhu cầu đặc biệt.
+ Tăng khả năng duy trì chất lượng, tính ổn định của thực phẩm hoặc các thuộc
tính cảm quan của chúng nhưng phải đảm bảo không làm thay đổi bản chất, thành
phần hoặc chất lượng của thực phẩm.
+ Hỗ trợ quy trình chế biến, bao gói, vận chuyển và bảo quản thực phẩm, phải
bảo đảm rằng phụ gia không được dùng để “cải trang”, “che giấu” các nguyên liệu hư
hỏng hoặc các điều kiện thao tác kỹ thuật không phù hợp (không đảm bảo vệ sinh)
trong quá trình sản xuất chế biến thực phẩm.
- Việc chấp nhận hoặc chấp nhận tạm thời một chất phụ gia thực phẩm để đưa
vào danh mục được phép sử dụng cần phải: Xác định mục đích sử dụng cụ thể, loại
thực phẩm cụ thể và dưới các điều kiện nhất định; Hạn chế sử dụng càng nhiều càng
tốt đối với những thực phẩm đặc biệt dùng cho các mục đích đặc biệt, với mức thấp
nhất có thể đạt được hiệu quả mong muốn (về mặt công nghệ); Đảm bảo độ tinh khiết
nhất định và nghiên cứu những chất chuyển hóa của chúng trong cơ thể; Khi phụ gia
dùng để chế biến thực phẩm cho nhóm người tiêu dùng đặc biệt thì cần xác định liều
tương ứng với nhóm người đó.

16. 12
1.1.4. Thực trạng quản lý sử dụng phụ gia thực phẩm[7], [10]
Nguồn phụ gia thực phẩm được sử dụng để sản xuất và chế biến thực phẩm
hiện nay ở nước ta chủ yếu là nhập khẩu. Tuy nhiên, hiện tượng nhập lậu phụ gia
thực phẩm vẫn đang xảy ra, gây khó khăn cho các cơ quan chức năng trong việc
kiểm soát chất lượng. Phụ gia được bán ra tại các cửa hàng hầu hết đều là những
mặt hàng đã được công bố chất lượng, tuy vậy tại một số cơ sở kinh doanh phụ gia
vẫn còn tồn tại tình trạng kinh doanh phụ gia không rõ nguồn gốc, bao gói, nhãn
mác của phụ gia không đúng quy định, ngoài danh mục của Bộ Y tế. Việc quản lý
an toàn vệ sinh thực phẩm đối với chất phụ gia, chất hỗ trợ chế biến, chất tạo ngọt
thực phẩm còn bất cập: việc thanh tra, kiểm tra, xử lý vi phạm chưa thường xuyên;
phương tiện, trang thiết bị kiểm tra còn hạn chế. Tình trạng mua bán, sử dụng các
chất phụ gia như chất tạo ngọt, chất bảo quản không rõ nguồn gốc, ngoài danh mục
cho phép sử dụng còn phổ biến ở các cơ sở kinh doanh nhỏ.
1.1.5. Tác động bất lợi của PGTP [7], [10]
Bên cạnh những tác động có lợi, PGTP cũng tác động bất lợi đến sức khỏe
người tiêu dùng. Đây là một vấn đề phức tạp và nhiều nhà khoa học vẫn đang tranh
luận về sự an toàn của các chất PGTP. Các tác hại của PGTP gồm:
- Ngộ độc cấp tính: có thể gây mẫn cảm như ngứa, sưng phù, nóng bừng mặt,
cứng gáy, chóng mặt, tê lưỡi, nhức đầu, buồn nôn…
- Ngộ độc mãn tính: dù dùng liều nhỏ, nếu thường xuyên, một số PGTP tích
lũy trong cơ thể có thể gây mất cảm giác ngon miệng, giảm cân, tiêu chảy, rụng tóc,
suy thận mãn tính, da xanh xao, động kinh, thiếu máu, suy tim, suy gan, suy thận,
tiểu đường, nguy cơ hình thành khối u, ung thư, đột biến gen, quái thai. Khi phát
hiện một chất PGTP nào gây ra ung thư cho vật thí nghiệm, nó sẽ bị cấm sử dụng
ngay tức khắc ở bất cứ liều lượng nào.
Ngoài ra, PGTP có thể ảnh hưởng đến chất lượng thực phẩm như phá hủy các
chất dinh dưỡng và các vitamin. Tác hại của PGTP còn do một số chất thêm vào thực
phẩm để bảo quản hoặc tăng sức hấp dẫn, mặc dù chúng chưa có trong danh mục cho
phép của Bộ Y tế hoặc đã bị cấm. Hầu hết các chất đó đều có hại đến sức khỏe con
người, thậm chí có thể gây ung thư, quái thai,…

17. 13
1.2. Chất tạo ngọt
1.2.1. Tổng quan về chất tạo ngọt [10]
Chất tạo ngọt là phụ gia thực phẩm được sử dụng khá phổ biến trong công
nghệ chế biến và bảo quản thực phẩm. Chất tạo ngọt có nhiều loại ứng với cấu trúc
và tính chất hóa học khác nhau.
Đến nay, các nhà khoa học đã tìm thấy hàng trăm chất hóa học có khả năng
tạo vị ngọt, chúng được chiết tách từ thực vật hoặc sản xuất bằng phương pháp tổng
hợp. Tuy nhiên, chỉ vài phụ chất được phép sử dụng trong công nghệ thực phẩm.
Tùy vào quy định của mỗi quốc gia, mà danh mục các chất tạo ngọt cho phép sử
dụng có thể khác nhau.
Có nhiều phương pháp phân loại các chất tạo ngọt. Theo Branen và cộng sự
(1989), các chất tạo ngọt có thể chia thành hai nhóm: có giá trị dinh dưỡng và
không có giá trị dinh dưỡng (xem phụ lục 4).
 Vấn đề sử dụng chất tạo ngọt trong thực phẩm hiện nay
Phụ gia thực phẩm nói chung và chất tạo ngọt nói riêng được sử dụng trong rất
nhiều loại thực phẩm nhằm hoàn thiện và tăng tính hấp dẫn của sản phẩm. Trong
đó, các chất tạo ngọt tổng hợp phổ biến bao gồm acesulfame kali, aspartam, sodium
cyclamate và saccharin đều được phép sử dụng tại nhiều quốc gia trên thế giới. Các
chất này được quy định như PGTP theo Cục quản lý Thực phẩm và Dược phẩm
Hoa Kỳ và cần phải được phê chuẩn về sự an toàn trước khi đưa ra thị trường.
Acesulfame kali và aspartam cũng được phép sử dụng tại Anh. Tuy nhiên, các sản
phẩm có chất này phải thực hiện yêu cầu ghi nhãn đặc biệt.
Ở Việt Nam, do giá thành rẻ và độ ngọt cao nên các chất tạo ngọt acesulfame
kali, aspartam, cyclamate và saccharin được bán nhiều tại các chợ đầu mối và các
chợ nhỏ. Chúng được sử dụng nhiều trong các sản phẩm đóng chai, đóng hộp có
thông tin về các chất tạo ngọt được ghi trên nhãn, ngoài ra chúng còn được sử dụng
tại nhiều hàng quán vỉa hè, tiểu thương vẫn dùng loại đường hóa học này để chế
biến thức ăn, nấu chè, luộc bắp hay ngâm trái cây để tăng vị ngọt và không được
kiểm soát chặt chẽ.

18. 14
Như vậy, các chất tạo ngọt được sử dụng khá rộng rãi tại Việt Nam, tuy nhiên
các cơ quan chức năng cần quản lý chặt chẽ hơn trong quá trình sử dụng để chúng
đảm bảo an toàn sức khỏe cho người tiêu dùng.
1.2.2. Tổng quan saccharin [26]
 Cấu tạo
Công thức cấu tạo:
Saccharin có công thức hóa học là C7H5NO3S, danh pháp quốc tế là 1-dioxo-
1,2-benzothiazol-3-1; tên gọi khác là benzoic sunfimit hoặc octho- sunphobenzamit.
Vào năm 1878, khi nghiên cứu về các dẫn xuất trong than đá tại phòng thí
nghiệm, tình cờ giáo sư Constantine Fahlberg và giáo sư Ira Remsen đã phát hiện ra
vị ngọt của chất bám trên tay khi ăn bánh mỳ do không rửa sạch tay sau khi thí
nghiệm. Đến năm 1879 và năm 1880 họ đã chính thức công bố phát hiện và đặt tên
cho chất ngọt này là saccharin.
 Tính chất:
- Khối lượng phân tử: 183,17g/mol
- Tỷ trọng: 0,828g/cm3
- Nhiệt độ nóng chảy: 228,8 – 229,7o
C
- Độ hòa tan trong nước: 1g/270ml nước
Bột saccharin kết tinh có màu trắng, tan ít trong nước và ête, nhưng dạng muối
natri và canxi của nó thì dễ tan. Saccharin ổn định trong môi trường axit, nhưng lại
không có phản ứng gì với các thành phần trong thực phẩm nên nó thường được
dùng nhiều trong đồ uống, nước ngọt. Ở nhiệt độ cao saccharin vẫn giữ được độ
ngọt vốn có, có thể thay thế tối đa là 25% lượng đường saccharose nên cũng được
sử dụng trong sản xuất bánh, mứt, kẹo cao su, hoa quả đóng hộp, kẹo, bánh tráng
miệng,…

19. 15
Saccharin có độ ngọt cao gấp 200 - 700 lần những loại đường tự nhiên, nhưng
nó có nhược điểm lớn là có hậu vị cay và đắng cùng với mùi kim loại nhất là khi
nồng độ cao. Vì vậy saccharin thường được kết hợp với các loại đường khác như
đường cyclamate và aspartame với nồng độ thấp, để bổ trợ và khắc phục nhược
điểm này, cũng như nhiều chất ngọt thay thế khác saccharin không bị hấp thu bởi hệ
tiêu hóa, không gây ảnh hưởng tới hàm lượng insulin trong máu, không tạo năng
lượng. Vì vậy saccharin được xếp vào nhóm chất ngọt không calo, còn được sử
dụng trong cả những sản phẩm mỹ phẩm, vitamin và dược phẩm.
 Vai trò
Được sử dụng để tạo vị ngọt hay che giấu mùi vị trong thức ăn, đồ uống, kem
đánh răng, nước súc miệng. Nó thường được sử dụng ở nồng độ 0,02 - 0,5%. Phản
ứng bất lợi do saccharin đã được ghi nhận: mề đay, nhạy cảm với ánh sáng, hằng
ngày không nên đưa vào cơ thể một lượng saccharin dưới dạng muối (natri, kali)
lớn hơn 5mg/kg trọng lượng
1.2.3. Tổng quan acesulfame kali [25]
 Cấu tạo:
Acesulfame kali có công thức hóa học là C4H4KNO4S, danh pháp quốc tế là
Potassium-6-methyl-2, 2-dioxo-oxathiazin-4-olate.
Năm 1967: Được nhà hóa học người Đức Karl Clauss phát hiện.
 Tính chất:
- Khối lượng mol: 201,24 g/mol
- Điểm nóng chảy: 225o
C
- pH: 2 - 10
- Trạng thái: dạng tinh thể màu trắng, không mùi
Độ ngọt: Acesulfame kali ngọt gấp 180 - 200 lần đường saccharose. Vị ngọt
bắt đầu nhanh và hậu vị không kéo dài. Giống saccharin, nó có hậu vị đắng nhẹ, đặc

20. 16
biệt khi ở nồng độ cao. Acesulfame kali thường được dùng kết hợp với các chất tạo
ngọt khác như aspartame, sucralose. Sự kết hợp này giúp tạo ra vị giống với đường
hơn vì mỗi chất tạo ngọt sẽ che đi hậu vị của những chất khác.
Tính ổn định: Acesulfame kali ổn định dưới tác dụng của nhiệt, ngay cả
trong điều kiện có tính axit hoặc kiềm mạnh, nó được phép dùng trong các sản
phẩm nướng hay các sản phẩm yêu cầu hạn sử dụng dài. Hợp chất có độ ổn định
cao trong môi trường lỏng.
Độ hòa tan: Tan tốt trong nước, một lít nước ở 200
C có thể hòa tan được
270g acesulfame kali.
 Vai trò
Được sử dụng để tạo vị ngọt trong thức ăn, đồ uống, dược phẩm nhằm tăng
cường vị và che dấu những vị khó chịu. Thường được dùng phối hợp với các chất
ngọt tổng hợp khác như aspartam, cyclamat. Không được chuyển hóa trong cơ thể
và nhanh chóng đào thải ra khỏi cơ thể. Hằng ngày không nên đưa vào cơ thể một
lượng lớn hơn 15mg/kg trọng lượng.
1.2.4. Tổng quan về phương pháp phân tích saccharin và acesulfame kali [13]
1.2.4.1. Các phương pháp và xu hướng nghiên cứu trong nước
Hiện nay, tùy thuộc vào điều kiện cơ sở vật chất mà các phòng thí nghiệm
có thể tiến hành phân tích chất tạo ngọt theo các phương pháp khác nhau. Một số
phương pháp phổ biến có thể kể đến như quang phổ hấp thụ phân tử UV-VIS, điện
di mao quản vùng CZE, sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC. Trong đó phương pháp
quang phổ UV-VIS tuy có thể dùng để định hướng riêng các chất nhưng có nhược
điểm là khó phân biệt phổ của các chất khi có lẫn các chất cản trở như: chất bảo
quản, các loại đường, phẩm màu,… nên hiện nay ít sử dụng. Trong đó phương
pháp HPLC có độ chính xác và độ chọn lọc rất cao nên được các cơ sở thí nghiệm
tin dùng.
1.2.4.2. Các phương pháp trên thế giới
Phương pháp HPLC là kỹ thuật phân tích phù hợp cho việc xác định đồng thời
một số các chất ngọt tổng hợp và đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới. Vậy nên
trong mục này chỉ đề cập tới những công trình nghiên cứu tiêu biểu.

21. 17
 Phương pháp quang phổ UV-VIS (Phương pháp chung cho các đồ uống
không cồn)
+ Nguyên tắc: Saccharin được trích ly từ một lượng mẫu axit hóa với diethyl
ete. Các dung môi được loại bỏ và dung dịch còn lại được đồng hóa bởi axit HCl,
sau đó được sử lý bằng thuốc thử Nessler và đo độ hấp thụ quang của sản phẩm ở
bước sóng 425nm.
+ Quy trình: Thêm 2ml dung dịch HCl vào 50g mẫu. Trích ly với 50ml diethyl
ete (3 lần). Lọc dung dịch trích ly vào bình tam giác 250ml sạch và làm bay hơi
dung môi. Thêm 6ml HCl và 5ml nước cất và cho bay hơi khoảng 1ml trong chậu
nước nóng. Một lần nữa thêm 6ml HCl và 5ml nước cất cho bay hơi khoảng 1ml.
Pha loãng dung dịch thành 50ml với nước cất. Hút 2ml dung dịch này vào bình định
mức 25ml. Thêm 1ml thuốc thử Nessler và dùng nước cất định mức đến vạch.
Tương tự hút 0,5; 1; 2; 3 và 4ml dung dịch chuẩn (200mg/ml) vào bình định mức
25ml và tạo màu với thuốc thử Nessler. Đo độ hấp thụ quang của mẫu tại bước sóng
425nm. Từ đó tính hàm lượng sacccharin trong mẫu từ đồ thị hiệu chuẩn.
 Phương pháp điện di mao quản
Tách và sử dụng chất tạo ngọt tổng hợp sử dụng điện di mao quản là phương
pháp thực hiện nhanh và đơn giản có thể kể đến một số công trình nghiên cứu đã
được triển khai thành công trên hệ thống này trong việc xác định các chất ngọt tổng
hợp như sau:
Phương pháp xác định đồng thời aspartame, cyclamate, saccharin, acesulfame
kali trong đồ uống và các chất làm ngọt bằng điện di mao quản với dectector độ dẫn
của các tác giả Anna Beatriz Bergamo, Jose Alberto Fracassi Du Silva, Dosil
Pereiru De Jesus. Trong công trình nghiên cứu này tác giả đã sử dụng dung dịch
đệm tris(hydroxymethyl)aminomethane 100mmol.L-1
(TRIS) và histidine(His)
10mmol.L-1
, với thời gian phân tích các mẫu trong vòng 6 phút, và hiệu suất thu hồi
các chất trong khoảng 94 -108%.
 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là kỹ thuật có độ chính xác độ, độ
chọn lọc rất cao nên được sử dụng rất nhiều ở các nước trên thế giới. Một số công
trình tiêu biểu của các tác giả:

22. 18
Xác định đồng thời 9 chất tạo ngọt nhân tạo có nồng độ cao trong thực phẩm
(Aspartame, saccharin, acesulfame kali, alitame, axit cyclamic, neotame,
hydrochlcone, sucraloze, neohesperidine) bằng phương pháp HPLC của các tác giả
Andrzej Wasik, Josephine McCourt, Manuela Buchgraber, phương pháp có độ
chính xác tốt với hiệu suất thu hồi trong khoảng 93 – 109%, LOD dưới 15 µg.g-1
và
LOQ dưới ug.g-1
.
Phương pháp HPLC cũng được các tác giả Chigusa Kobayashi, Mitsuo
Nakazoto, Hirofumi Ushiyama, Yuka Kawai, Yukinari Tateshi, Kazuo Yasuda
sử dụng để xác định đồng thời 5 chất tạo ngọt: slitame (AL), acesulfame kali
(Ace kali), saccharin (Sac), aspartam (Asp) và dulcin (DU) trong rất nhiều loại
thực phẩm khác nhau. Độ thu hồi của các chất tạo ngọt trong mẫu thức ăn
khoảng 77 ÷ 102%, giới hạn phát hiện là 10ppm. Với Tetra n-butylammonium
bromide và đệm photphat pH = 5,0 được thêm vào dung dịch hỗn hợp, sau đó
cho chảy qua cột C18 và được rửa bằng nước và hỗn hợp methanol – nước
(45:55). Các chất tạo ngọt này được tách trên cột ODS-2 với pha động là
methanol – nước (1:3), bao gồm 0,01 mol/l tetra-n-propylammonium hydroxide
được điều chỉnh đến pH = 3,5 với axit photphoric và được phát hiện ở bước
sóng 210nm.
1.3. Giới thiệu về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.3.1. Nguyên tắc của phương pháp HPLC [9]
Nguyên tắc của phương pháp HPLC là quá trình tách các chất ở trạng thái lỏng
dựa trên sự phân bố liên tục các chất lên 2 pha: Một pha đứng yên có khả năng hấp
phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh; một pha di chuyển qua pha tĩnh để mang chất
phân tích ra khỏi cột tách gọi là pha động. Do các chất phân tích có ái lực khác nhau
với pha tĩnh nên chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và được tách ra khỏi nhau.
1.3.2. Cơ sở của phép sắc ký lỏng hiệu năng cao [11], [14], [16], [17], [12]
* Giai đoạn tách
Thực hiện phép tách các chất ở trạng thái lỏng trong cột sắc ký dưới áp suất
cao (200500 atm). Vì vậy phải chuyển toàn bộ chất phân tích vào trong dung dịch
(thường là hòa tan trong dung môi làm pha động). Phương pháp này thích hợp cho

23. 19
tách các chất có nhiệt độ sôi cao cũng như nhiệt độ sôi thấp (trừ những chất là thể
khí ở điều kiện thường).
Dùng thiết bị bơm mẫu để bơm chất phân tích vào đầu cột tách  chất phân
tích được hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh.
Dùng bơm cao áp để bơm dung môi rửa giải qua cột (có thể là dung môi đơn
hoặc hỗn hợp các dung môi) để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột (do lực liên kết
giữa các cấu tử chất phân tích với pha tĩnh khác nhau mà chúng tách ra khỏi nhau).
Kỹ thuật chạy sắc ký:
+ Kỹ thuật cố định pha động (giữ thành phần và vận tốc pha động không
đổi).
+ Kỹ thuật građient pha động (biến đổi pha động liên tục). Građient có thể là
từng bậc hoặc liên tục tùy thuộc vào mẫu phân tích và thành phần pha động sao cho
quá trình tách sắc ký xảy ra hoàn toàn.
* Giai đoạn phát hiện và xử lý kết quả phân tích
Các chất phân tích sau khi tách ra khỏi nhau được phát hiện nhờ 1 bộ dò gọi là
detectơ.
Việc ghi nhận và xử lý kết quả được thực hiện nhờ máy tính chuyên dụng, kết
quả cho một sắc ký đồ trong đó chứa các thông tin cần thiết: thời gian lưu, diện tích
và chiều cao peak, hệ số phân giải, hệ số đối xứng,…
+ Với 1 chất sẽ có 1 thời gian lưu đặc trưng cho chất đó nên ta có thể căn cứ
vào tính chất này để phân tích định tính.
+ Độ lớn peak được đặc trưng bằng diện tích hay chiều cao, 2 đại lượng này tỉ
lệ với nồng độ chất phân tích trong 1 khoảng xác định nào đó, được sử dụng để định
lượng chất phân tích.

24. 20
Hình 1.1. Giới thiệu hệ thống HPLC
 Các thông số của phương pháp sắc ký lỏng
+ Hệ số phân bố KD và cách xác định
Cấu tử A phân bố giữa pha động và tĩnh khi cân bằng được thiết lập:
As  Am
Hệ số phân bố được định nghĩa là tỉ số của nồng độ chất phân tích giữa hai pha:
KD =
][
][
m
s
A
A
Trong đó : [Am ] là nồng độ chất phân tích trong pha động
[As ] là nồng độ chất phân tích trong pha tĩnh
Để cân bằng thiết lập nhanh một yêu cầu rất cần thiết là lớp pha tĩnh phải
mỏng, hệ số khuếch tán của chất phân tích trong pha tĩnh lớn hơn hệ số khuếch tán
trong pha động. Hệ số phân bố KD có thể được xác định theo phương pháp tính
bằng cách đo nồng độ chất phân tích trong pha động và nồng độ chất phân tích
trong pha tĩnh sau khi đã đạt cân bằng. Một cách gần đúng KD được xác định theo
công thức sau:
 1
1
.
.
D
M M V
K
M m


Trong đó: M là lượng chất ban đầu: mg
M1 là lượng chất phân tích còn lại sau khi tiếp xúc: mg
V là thể tích pha động: ml
m là lượng chất hấp thụ: g

25. 21
+ Đĩa lý thuyết
Đĩa lý thuyết là phần nào đó của cột mà ở đó cân bằng được thiết lập. Theo
quan niệm của Martin và Synge, cân bằng được thiết lập nhanh chóng, tức thời. Tuy
nhiên điều này gặp khó khăn khi giải thích hiện tượng giãn rộng vùng mẫu, hiện
tượng peak sắc ký không cân đối. Amundson và Lapidus và sau đó là Van Deemter
cho rằng đĩa được cân bằng khi đạt cân bằng chuyển khối lượng chất tan từ pha
động vào pha tĩnh và ngược lại, từ đó tác giả đã đưa ra thuyết tốc độ.
Như vậy có thể nói rằng phần nhỏ của cột gọi là đĩa lý thuyết khi đạt được cân
bằng phân bố chất phân tích.
Gọi n là số đĩa lý thuyết,  là độ lệch chuẩn;  ~ n . Đối với cột sắc ký n
càng lớn peak càng hẹp, thời gian lưu tỷ lệ với số đĩa lý thuyết n, tR ~ n, nên ta có
thể viết:
n
ntR


hay
2








Rt
n
Mặt khác: w = 4 hay
4
W

Số đĩa lý thuyết có thể viết lại là:
22
1/2
16 5,54R Rt t
n
W W
  
    
   
+ Hệ số đối xứng Sa
Sa được xác định tại 10% chiều cao peak. Công thức tính : Sa= b/a
a là độ rộng nửa peak trước ở 10% chiều cao peak
b là độ rộng nửa peak sau ở 10% chiều cao peak được lựa chọn thường có giá
trị từ 0,8 – 1,2
+ Sắc đồ
Sắc đồ là sự biểu diễn sự phụ thuộc diện tích (S) hoặc chiều cao (h) tín hiệu đo
được có thể là độ hấp thụ quang, cũng có thể là độ dẫn điện hoặc là tần số xung điện
liên quan chặt chẽ tới nồng độ chất phân tích có trong mẫu và thời gian. Các tín hiệu
này được gọi là “peak” sắc ký. Để tính toán hàm lượng chất phân tích, tính diện tích
peak sắc ký là chính xác nhất. Ngày nay hầu hết các máy hiện đại đều được trang bị
các thiết bị tính diện tích của peak sắc ký một cách tự động.

26. 22
Hình 1.2. Sắc đồ hai cấu tử A và B
+ Detector trong HPLC
Detector là một bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của phương pháp, là
bộ phận dùng để phát hiện chất phân tích, cũng như pha động, pha tĩnh. Có nhiều
loại detector thường được sử dụng trong HPLC như detector quang phổ, điện hóa.
Detector hấp thụ tử ngoại - khả kiến UV-Vis
Đây là loại detector rất thông dụng, hầu hết các thiết bị sắc ký lỏng được trang
bị loại detector này. Nó có cấu tạo gần giống với máy trắc quang bình thường, điểm
khác nhau ở buồng mẫu, phần cuvet tĩnh được thay bằng Flowcell. Nồng độ chất
phân tích tối thiểu có thể phát hiện được thông qua công thức:
0I
A log lC
I
  
Trong đó: A: mật độ quang; I0 và I là cường độ của tia tới và tia truyền qua
: hệ số tắt phân tử; l chiều dày cuvet (cm)
C: nồng độ chất tan cần xác định (mol/l)
Detector điện hóa
Các detector điện hóa đóng vai trò như các máy phân tích điện hóa có độ nhạy
cao để phát hiện và định lượng các chất cần phân tích theo 1 tính chất điện hóa nào đó
của chúng nhờ sự thay đổi cường độ dòng, thế, độ dẫn điện, điện lượng... Loại detector
này có thể dùng phân tích nhiều chất vô cơ, hữu cơ với giới hạn độ nhạy rất cao.
Tín hiệu đo được theo một tính chất điện hóa của chất phân tích trong những
điều kiện thực nghiệm đã chọn, nồng độ của chúng tuân theo biểu thức sau:
RBRB Vt .
''
, RBRB Vt
RARA Vt ,
''
RA¶ , RAVt
hS,
Vt,mt
0t
BWWA

27. 23
A = k.C
Trong đó: A là tín hiệu đo, k là hằng số thực nghiệm, C là nồng độ chất phân tích.
+ Pha tĩnh trong HPLC
Pha tĩnh được chia làm 2 loại: rắn và lỏng. Nếu pha tĩnh là chất lỏng ta có sắc
ký lỏng - lỏng; nếu pha tĩnh là chất rắn ta có sắc ký lỏng - rắn.
Các hạt chất nhồi trong pha tĩnh rắn có d = 310 m, phổ biến nhất là 37 m.
Chọn pha tĩnh trong HPLC sao cho:
Cân bằng chuyển khối lượng chất tan từ pha động vào pha tĩnh và ngược lại
phải được thiết lập nhanh.
Pha tĩnh có dung lượng lớn để hấp phụ một lượng lớn chất phân tích.
Khoảng áp suất làm việc tương đối rộng.
* Pha tĩnh hấp thụ pha thường: trên bề mặt của nó có chứa các nhóm OH là
các nhóm phân cực. Nhóm này là nhóm ưa nước vì dễ tạo cầu liên kết H với các
phân tử nước, vì vậy nó làm giảm hoạt tính sắc ký pha tĩnh. Loại pha tĩnh này được
sử dụng để tách các chất không phân cực hoặc ít phân cực. Pha động cho loại pha
tĩnh này là những chất không tan trong nước như: C6H6, C6H5CH3, CCl4,…
* Pha tĩnh hấp thụ pha ngược: là những silicat trung tính đã được ankyl hóa
các nhóm OH trên bề mặt bằng các gốc ankyl: C3, C5, C8, C18 …
Vì vậy mà chất nhồi này có bề mặt không phân cực, nó thuộc loại chất nhồi kỵ
nước nghĩa là nước không làm ảnh hưởng đến bề mặt của nó. Vì vậy pha động cho
loại sắc ký này là nước có hòa tan các chất hữu cơ như: nước – metanol, nước –
acetonitril, ... được trộn theo những thể tích xác định. Loại pha tĩnh này để tách cả chất
không phân cực và phân cực.
Các tính chất đặc trưng như cấu trúc hạt, độ xốp hạt, kích thước hạt đều có
ảnh hưởng đến kết quả phép tách sắc ký.
+ Pha động trong HPLC
Pha động trong HPLC được chọn là tùy thuộc vào mẫu phân tích hoặc nồng độ,

28. 24
nó có thể là dung môi đơn hay hỗn hợp 2, 3 dung môi được trộn theo những thể tích
nhất định. Khi chọn pha động thì phải chú ý những yêu cầu sau:
- Trơ và không tác dụng hóa học với pha tĩnh.
- Bền và ổn định trong quá trình chạy sắc ký.
- Hòa tan tốt hỗn hợp các chất phân tích.
- Phù hợp với detectơ đã lựa chọn.
Trong sắc ký hấp thụ pha thường: vì pha tĩnh là phân cực nên pha động là chất
không phân cực hay ít phân cực, nói chung đó là dung môi hữu cơ không hòa tan
trong nước. Hệ dung môi hữu cơ này dùng để tách hiđrocacbon hoặc các hợp chất
hữu cơ ít phân cực.
Trong sắc ký hấp thụ pha ngược vì pha tĩnh không phân cực hay ít phân cực
nên pha động phải phân cực như: dung môi hữu cơ phân cực hoặc hỗn hợp các dung
môi hữu cơ phân cực với nước. Người ta thường dùng nhất là metanol – nước và
acetonitril – nước. Hệ sắc ký này có thể dùng để tách nhiều hỗn hợp từ phân cực
đến không phân cực. Vì vậy phạm vi sử dụng đa dạng, phong phú hơn.
1.3.3. Phân loại các kỹ thuật HPLC [11], [14], [16], [17], [18]
Hiệu quả của quá trình tách sắc ký phụ thuộc nhiều vào việc lựa chọn kỹ thuật
chạy sắc ký. Việc lựa chọn này phụ thuộc vào tính chất của chất phân tích. Hiện nay
có nhiều kỹ thuật tách.
* Sắc ký hấp thụ:
Sắc khí hấp thụ là phương pháp dựa trên cơ sở phân bố chất phân tích giữa pha
tĩnh và pha động nhờ tương tác phân tử thông qua các trung tâm hấp thụ. Pha tĩnh là
các chất rắn hoặc lỏng có diện tích bề mặt lớn, bền vững về mặt hoá học. Chúng hấp
thụ chất phân tích trên bề mặt của chúng ở các mức độ khác nhau khi cho pha động
chứa chất phân tích tiếp xúc với chúng. Tuỳ thuộc lực liên kết giữa pha tĩnh và từng
cấu tử chất phân tích có trong pha động, khi cho pha động đi qua pha tĩnh chúng sẽ di
chuyển với tốc độ khác nhau.
* Sắc ký phân bố lỏng - lỏng
Sự phân biệt giữa sắc ký phân bố lỏng - lỏng và sự phân bố thông thường là ở
chỗ sắc ký phân bố lỏng - lỏng còn được gọi là sắc ký chiết, pha tĩnh là chất lỏng

29. 25
pha động cũng là chất lỏng, sự phân bố chất phân tích giữa hai pha lỏng giống như
quá trình chiết, còn sự phân bố nói chung là sự phân chia chất phân tích vào hai pha
không cần xét tới lỏng hay rắn.
Điểm khác nhau cơ bản giữa sắc ký phân bố lỏng - lỏng và sắc ký hấp phụ là ở
chỗ: sắc ký phân bố lỏng - lỏng có đường đẳng nhiệt tuyến tính ở khoảng nhiệt độ
lớn, phương pháp có độ nhạy cao nhưng có nhược điểm là pha tĩnh không được bền
vững, hiện tượng trôi mất pha tĩnh làm cho độ lặp lại bị giảm.
* Sắc ký ion (trao đổi ion)
Pha tĩnh thường là pha rắn có khả năng trao đổi ion của nó với các chất phân
tích trong pha động. Chất có khả năng trao đổi cation gọi là cationit, còn chất có khả
năng trao đổi anion gọi là anionit. Lực liên kết chủ yếu giữa chất phân tích và pha
tĩnh chủ yếu là liên kết tĩnh điện, phụ thuộc nhiều vào điện tích của ion chất phân
tích, pH của dung dịch và bán kính hidrat hoá của các ion chất phân tích. Ví dụ:
phản ứng trao đổi ion giữa cationic axit mạnh và Ca2+
có thể viết như sau:
2R-SO3H + Ca2+
= (R-SO3)Ca + 2H+
Phản ứng của anionit bazơ mạnh với Cl-
:
R-N(CH3)3OH + Cl-
= R-N(CH3)3Cl + OH-
* Sắc ký rây phân tử
Pha tĩnh là các chất rắn có diện tích bề mặt lớn, xốp, có những đường đi trong
lòng chất rắn, còn gọi là mao quản có kích thước cỡ phân tử. Các phân tử chất phân
tích có thể thấm vào chất đó ở mức độ khác nhau tuỳ theo kích thước của chúng.
Các chất phân tích có kích thước lớn không thể đi sâu vào pha tĩnh được sẽ bị rửa
giải nhanh còn các phân tử chất phân tích có kích thước nhỏ phân bố sâu vào pha
tĩnh sẽ bị rửa giải chậm. Thứ tự rửa giải là các chất có kích thước nhỏ đi ra sau và
ngược lại. Thời gian lưu của các chất tỷ lệ nghịch với kích thước phân tử của
chúng. Tuy nhiên chất phân tích có thể có tương tác khác với pha tĩnh. Như vậy
một phép sắc ký có thể tách theo một hay nhiều cơ chế khác nhau mà chúng ta
không xét ở đây.
1.3.4. Cách đánh giá peak, tính kết quả trong phương pháp HPLC [11], [17]
 Cách đánh giá peak

30. 26
Tín hiệu đo là diện tích của peak hay chiều cao của peak. Để tiến hành định
lượng chất phân tích người ta sử dụng các chất chuẩn là chất phân tích có độ tinh
khiết cao. Tiến hành khảo sát chất chuẩn để tìm điều kiện đo của chất chuẩn, mẫu
giả và cuối cùng mới đo trên mẫu thực tế.
Mỗi chất phân tích trong những điều kiện tối ưu đã lựa chọn thì diện tích hoặc
chiều cao của peak tỉ lệ với nồng độ của chất phân tích:
S = K.C (S: diện tích của peak)
h = K.C (h: chiều cao của peak)
Các phương trình này dùng để định lượng chất phân tích bằng HPLC, thường
người ta dùng diện tích của peak để độ chính xác cao hơn.
Để tính diện tích peak, ta dùng máy tính đã cài sẵn chương trình, phương pháp
này có thể dùng cho cả những peak bị trôi đường nền. Phương pháp này đòi hỏi hệ
số đối xứng nằm trong khoảng 0,80  1,20. Việc tính toán diện tích peak sẽ gặp khó
khăn khi peak có cường độ quá cao, bị doãn, không đối xứng hoặc detector bị nhiễu.
Nếu đánh giá dựa vào chiều cao peak (khoảng cách từ đường nền đến đỉnh
peak) thì không cần xét đến hệ số đối xứng.
 Cách tính kết quả
 Phương pháp ngoại chuẩn (phương pháp đường chuẩn)
Chuẩn bị một dãy dung dịch chuẩn có nồng độ khác nhau trong điều kiện
tương tự mẫu phân tích. Tiến hành phép tách sắc kí và tính diện tích của peak đối
với dãy chất chuẩn. Sau đó dựng đường chuẩn hay đường hồi quy tuyến tính biểu
diễn sự phụ thuộc chiều cao (diện tích) của peak vào nồng độ chất phân tích. Để xác
định nồng độ chất phân tích Cx ta cũng thực hiện phép đo đối với chất phân tích,
được Sx (hx) nhất định, đối chiếu với đường chuẩn ta có nồng độ chất phân tích
trong mẫu.
 Phương pháp thêm chuẩn
Nguyên tắc của phương pháp này là dùng ngay mẫu phân tích làm nền. Dung
dịch mẫu thử được thêm 1 lượng chính xác chất chuẩn, tiến hành phép sắc ký trên
mẫu thử và mẫu thêm chuẩn phải trong cùng điều kiện.

31. 27
Tiến hành phép tách sắc kí và tính diện tích (chiều cao) của peak đối với dãy
mẫu đầu. Sau đó dựng đường chuẩn hay đường hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ
thuộc chiều cao (diện tích) của peak vào nồng độ chất phân tích.
Phương pháp này có ưu điểm là quá trình chuẩn bị mẫu dễ dàng, không cần có
nhiều hoá chất có độ tinh khiết cao để chuẩn bị dãy mẫu đầu. Mặt khác lại loại trừ
hoàn toàn ảnh hưởng về thành phần của mẫu cũng như cấu trúc vật lí của mẫu,
những sai số ngẫu nhiên do thao tác.
Phương pháp này xác định được hàm lượng chất phân tích ở nồng độ bé mà
phương pháp đường chuẩn không phân tích được và cho độ chính xác cao, được
nhiều người sử dụng.
Nhưng phải chú ý rằng, nồng độ thêm của chất chuẩn phải theo từng bậc và
khoảng cách của các bậc đó phải xấp xỉ bằng Cx thì phần nội suy tuyến tính mới
chính xác.

32. 28
CHƯƠNG 2
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
+ Khảo sát điều kiện sắc ký định lượng saccharin và acesulfame kali.
+ Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích.
+ Xác định và đánh giá hàm lượng saccharin và acesulfame kali trong các mẫu
thực phẩm truyền thống được sản xuất trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế.
2.2. Thiết bị và hóa chất
2.2.1. Thiết bị
- Máy trộn tốc độ cao.
- Bình định mức, có dung tích thích hợp, ví dụ: 1000ml, 500ml và 100ml.
- Pipet có dung tích thích hợp, ví dụ: 100ml, 25ml, 10ml, 5ml và 1ml.
- Cốc có mỏ, dung tích 1000ml.
- Micropipet, dung tích 1000µl.
- Ống đong chia độ, dung tích 1000ml.
- Giấy lọc gấp nếp.
- Thiết bị siêu âm.
- Hệ thống khử khí cho các dung môi.
- Bộ lọc màng kích thước lỗ 0,45µm hoặc nhỏ hơn.
- Giá đỡ các bộ lọc màng.
- Cột chiết pha rắn với cột C18 pha đảo.
- Máy li tâm có các ống li tâm với dung tích thích hợp, có khả năng tạo gia tốc
li tâm nhỏ nhất tại đáy ống là 1400g.
- Máy sắc kí lỏng hiệu năng cao được trang bị một detector cực tím (khả năng
hoạt động ở bước sóng 220nm, tốt nhất là detector mảng diot) và được gắn một máy
ghi.
- Cột sắc kí dùng cho HPLC, kiểu pha đảo, ví dụ:
+ Pha tĩnh của cột C18 pha đảo từ 3µm đến 10µm
+ Chiều dài từ 100mm đến 300mm
+ Đường kính trong từ 3mm đến 4mm

33. 29
+ Cột bảo vệ, C18 pha đảo
Các tiêu chí tính năng đối với các cột tách thích hợp là độ phân dải nền của
chất phân tích tương ứng.
2.2.2. Hóa chất
- Chất chuẩn saccharin
- Chất chuẩn Acesulfame kali
- Acetonitril.
- Metanol.
- Kali dihydro orthophosphat (KH2PO4).
- Dikali hydro orthophosphat (K2HPO4).
- Axit phosphoric, p20(H3PO4) = 1,71g/ml, w(H3PO4) = 85%.
- Axit phosphoric, w(H3PO4) = 5%: Dùng pipet lấy cẩn thận 6ml axit
phosphoric cho vào bình định mức 100ml, có chứa 80ml nước. Pha loãng bằng
nước đến vạch.
-Dung dịch Carrez I: Hòa tan 15g kali hexaxyanoferrat (II)
(K4[Fe(CN)6].3H2O) trong nước và thêm nước đến 100ml.
- Dung dịch Carrez II: Hòa tan 30 g kẽm sulfat (ZnSO4.7H2O) trong nước và
thêm nước đến 100ml.
- Dung dịch đệm phosphat c(KH2PO4) = 0,02 mol/l, pH = 4,32: Hòa tan 2,72g
kali dihydro orthophosphat vào 800ml nước trong cốc có mỏ dung tích 1000ml.
Chỉnh pH đến 3,5 bằng axit phosphoric. Chuyển dung dịch này sang bình định mức
1000ml và thêm nước đến vạch.
- Pha động: dung dịch đệm phosphat và acetonitril
Đong cẩn thận lượng dung dịch đệm phosphat đã chọn cho vào acetonitril và
trộn. Lọc qua bộ lọc màng cỡ lỗ 0,45µm và khử khí để 5 phút trong thiết bị siêu âm.
Chuẩn bị pha động trong ngày sử dụng.
- Dung dịch gốc
Cân 10mg saccharin và 10mg acesunlfame kali, chính xác đến 0,1mg, cho vào
bình định mức 100ml. Hòa tan và pha loãng bằng nước đến vạch. Dung dịch này có
chứa 1g/l của từng chất tạo ngọt.

34. 30
- Dung dịch chuẩn:
+ Dung dịch chuẩn I
Dùng pipet lấy 10ml dung dịch gốc cho vào bình định mức 100ml và pha
loãng bằng nước đến vạch. Dung dịch này có chứa 100mg/l của từng chất tạo ngọt.
+ Dung dịch chuẩn II
Dùng pipet lấy 5ml dung dịch gốc cho vào bình định mức 100ml và pha
loãng bằng nước đến vạch. Dung dịch này có chứa 50mg/l của từng chất tạo
ngọt.
+ Dung dịch chuẩn III
Dùng pipet lấy 1ml dung dịch gốc cho vào bình định mức 100ml và pha
loãng bằng nước đến vạch. Dung dịch này có chứa 10mg/l của từng chất tạo
ngọt.
2.3. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Đối tượng nghiên cứu
Các loại thực phẩm truyền thống được chế biến từ hải sản, thịt lợn, đậu.
2.3.2. Phương pháp lấy mẫu, xử lý mẫu và bảo quản mẫu [3]
Mẫu thực phẩm truyền thống được lấy gồm thực phẩm chế biến từ hải sản
(tôm chua, ruốc), từ thịt lợn (nem, chả), đậu (mè xửng, chè đậu xanh). Mỗi mẫu
được tiến hành lấy ở 5 cơ sở nổi tiếng khác nhau trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế
và bảo quản theo quy định [3]
Kí hiệu mẫu: mẫu ruốc kí hiệu Ri, mẫu tôm chua kí hiệu Ti, mẫu chả kí hiệu
Ci, mẫu nem kí hiệu Ni, mẫu mè xửng kí hiệu Mi, mẫu chè kí hiệu Chi trong đó
i = 1÷5 là vị trí lấy mẫu, mẫu lấy ở tỉnh Thừa Thiên Huế được trình bày ở bảng 2.1.

35. 31
Bảng 2.1. Kí hiệu mẫu và vị trí lấy mẫu
Kí
hiệu
Vị trí lấy mẫu
Kí
hiệu
Vị trí lấy mẫu
R1 Cô Ri – 184 Tăng Bạt Hổ N1 Bà Ký – 3 Đào Duy Từ
R2 Bà Xoa – 32 Tô Hiến Thành N2 191 Tăng Bạt Hổ
R3 39 – Dương Văn An N3 Bà Đầm - lô 454 – An Cựu
R4 453 – Nguyễn Tất Thành N4 2 Đào Duy Từ
R5 15/03 Mạc Đỉnh Chi N5 115 Hàn Mặc Tử
T1 Cô Ri – 184 Tăng Bạt Hổ M1 Thiên Hương
T2 Bà Xoa – 32 Tô Hiến Thành M2 Sông Hương
T3 39 – Dương Văn An M3 Tấn Lộc
T4 22 - Chi Lăng M4 Thuận Hưng
T5 12 - Trần Quang Bích M5 Nam Thuận
C1 Bà Ký – 3 Đào Duy Từ Ch1 Bà Triệu
C2 191 Tăng Bạt Hổ Ch2 Nguyễn Công Trứ
C3 Bà Đầm - lô 454 – An Cựu Ch3 Nguyễn Huệ
C4 2 Đào Duy Từ Ch4 Hùng Vương
C5 115 Hàn Mặc Tử Ch5 Nguyễn Công Trứ 2
2.3.3. Phương pháp định lượng saccharin và acesulfame kali [3]
Hàm lượng saccharin, và acesulfame kali được xác định bằng kỹ thuật sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC), pha đảo, dùng detector UV.
 Điều kiện sắc ký:
- Sử dụng cột pha đảo RP18 (150 x 4,6 mm; 3µm)
- Dung môi pha động: đệm phosphat : acetonitril (60:40)
- Thể tích bơm mẫu 20µl
- Tốc độ dòng 0,8ml/phút
- Detector: UV bước sóng 220nm
2.3.4. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích [15]
+ Khảo sát khoảng tuyến tính

36. 32
Khoảng tuyến tính được khảo sát bằng phương pháp xây dựng đường chuẩn
biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak thu được theo dãy nồng độ của hai chất
saccharin và acesulfame kali.
Để xác định sự phụ thuộc này ta sử dụng phương trình hồi quy tuyến tính, tính
hệ số tương quan R được xây dựng trên phần mềm máy tính.
+ Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ).
Giới hạn phát hiện LOD là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích tạo ra được
một tín hiệu có thể phân biệt một cách tin cậy với tín hiệu trắng (tín hiệu nền).
Có nhiều cách xác định LOD khác nhau. Một trong những phương pháp phổ
biến hiện nay là “quy tắc 3 ”.
Theo quy tắc này LOD được xác định như sau:
y = yB + 3B hay y = yB + 3SB (2.1)
Trong đó: y là LOD hoặc tín hiệu ứng với LOD. Biết tín hiệu y sẽ tính được
LOD từ phương trình đường chuẩn hồi quy tuyến tính:
y = a + b.x  LOD = x =
( )y a
b

(2.2)
yB là nồng độ hoặc tín hiệu mẫu trắng
B (hoặc SB) là độ lệch chuẩn của nồng độ hoặc tín hiệu mẫu trắng.
yB và SB được xác định như sau: Tiến hành thí nghiệm để thiết lập phương
trình đường chuẩn y = a + bC. Từ đó xác định yB và SB bằng cách chấp nhận yB (tín
hiệu mẫu trắng) là giá trị của y khi x = 0  yB = a (đoạn cắt trên trục tung của
đường chuẩn hồi quy tuyến tính) và SB = Sy (độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên
đường chuẩn):
 
2
1
2




n
Yy
SS
n
i
ii
yB
(2.3)
Ở đây: yi là giá trị thực nghiệm của y
Yi là các giá trị tính từ phương trình đường chuẩn của y.
Sau đó, tính tín hiệu ứng với LOD theo (2.1):
y = yB + 3SB = a + 3Sy (2.4)
Thay y ở (2.4) vào (2.2), ta sẽ được công thức tính LOD:

37. 33
3,0×S
y
LOD =
b
(2.5)
Ở đây, b là độ dốc của đường chuẩn hồi quy tuyến tính.
Giới hạn định lượng LOQ là tín hiệu hay nồng độ thấp nhất của chất phân tích
mà hệ thống định lượng được.
LOQ = 10Sy/b  3,3LOD (2.6)
Để xác định LOD, người ta xây dựng đường chuẩn tuyến tính ở gần gốc tọa
độ, hay trong khoảng hẹp của nồng độ các chất ở gần gốc tọa độ.
Kết quả được tính trên phần mềm Excel.
+ Độ lặp lại
Độ lặp lại của phương pháp được xác định thông qua độ lệch chuẩn tương đối
(RSD).
RSD (%) = 100.
tbx
S
Trong đó : S: độ lệch chuẩn
tbx : giá trị trung bình
Khi phân tích một nồng độ xác định (C) (độ lặp lại được đánh giá qua độ lệch
chuẩn tương đối của các kết quả ở các phòng thí nghiệm tham gia), nồng độ đó tuân
theo phương trình Horwitz:
RSDH (%) = 2(1 – 0,5*log C)
Trong đó :
RSDH là độ lệch chuẩn tương đối khi xác định chất phân tích có nồng độ C
(các phòng thí nghiệm tham gia phân tích dùng bất kỳ phương pháp nào).
C là nồng độ chất phân tích biểu diễn dưới dạng phân số.
Khi chất phân tích nồng độ C trong nội bộ phòng thí nghiệm, nếu đạt được độ
lặp lại với RSD (%) ≤ ½ RSDH là đạt yêu cầu.
+ Độ đúng
Độ đúng của phương pháp được xác định bằng cách phân tích mẫu thêm
chuẩn rồi tính độ thu hồi (Rev).

38. 34
Tiến hành: phân tích mẫu có thêm chuẩn ở mức nồng độ 8 ppm, 10 ppm, 12
ppm. Đo lặp lại 3 lần, lấy giá trị trung bình. Độ thu hồi tính theo công thức:
Rev % = 2
0 1
C
.100
C +C
C0 là nồng độ chất thêm chuẩn trong mẫu thử
C1 là nồng độ chất phân tích trong mẫu thử
C2 là nồng độ chất phân tích trong mẫu thử đã thêm chuẩn.
2.4. Quy trình xử lý mẫu
 Chuẩn bị dung dịch mẫu thử [3]
Cân khoảng từ 5g phần mẫu đã đồng hóa kỹ, chính xác đến 1mg, cho vào bình
định mức 100ml. Thêm khoảng 50ml nước và đặt bình này vào thiết bị siêu âm ở
40 C trong 20 phút.
Làm nguội dung dịch đến nhiệt độ phòng. Thêm 2ml dung dịch thuốc thử
Carrez I, trộn rồi thêm 2ml dung dịch Carrez II. Lắc mạnh và để yên dung dịch ở
nhiệt độ phòng trong 10 phút. Pha loãng bằng nước đến vạch. Lọc dung dịch qua
giấy lọc gấp nếp, loại bỏ 10ml dịch lọc đầu tiên.
 Nhận biết: [3]
Nhận biết các chất tạo ngọt trong dung dịch mẫu bằng cách so sánh các thời
gian lưu của chất phân tích có liên quan trong dung dịch mẫu với các thời gian lưu
của chất chuẩn.
Bơm các thể tích bằng nhau của dung dịch mẫu thử và dung dịch chuẩn.
Khoảng thời gian giữa các lần bơm kế tiếp của các dung dịch chuẩn không được
nhỏ hơn 15 phút.
Khi có khả năng bị nhiễu thì nên rửa các cột. Pha động thích hợp để rửa cần có
các thành phần sau: 50 phần thể tích đệm phosphat + 50 phần thể tích acetonitril.
 Xác định [3]
Đối với việc xác định theo phương pháp ngoại chuẩn, thì tích phân các diện
tích peak hoặc xác định chiều cao peak và so sánh kết quả với giá trị tương ứng của
chất chuẩn có diện tích peak, chiều cao peak gần nhất hoặc sử dụng đường chuẩn.

39. 35
Để chuẩn bị đường chuẩn bơm một lượng thích hợp các dung dịch chuẩn có
các nồng độ khối lượng thích hợp. Vẽ các chiều cao peak hoặc diện tích peak của
các dung dịch chuẩn tương ứng với nồng độ khối lượng tính bằng mg/l. Kiểm tra độ
tuyến tính của đường chuẩn.
Ngoài ra việc hiệu chuẩn cũng có thể được đánh giá bằng hồi quy toán học.
Kiểm tra độ tuyến tính của đường hồi quy.
 Tính kết quả [3]
 Phương pháp ngoại chuẩn:
Tính phần khối lượng của chất tạo ngọt có liên quan (w) đo bằng mg/kg hoặc
nồng độ khối lượng (p) đo bằng mg/l theo công thức (1):
w hoặc p = 1000
022
111



mVA
FmVA
(1)
Trong đó:
A1 là diện tích peak của chất tạo ngọt có liên quan thu được bằng dung dịch
mẫu thử;
A2 là diện tích peak của chất tạo ngọt có liên quan thu được bằng dung dịch
chuẩn;
V1 là thể tích của dung dịch mẫu (ở đây là 100ml hoặc 500ml) tính bằng ml;
V2 là thể tích của dung dịch chuẩn (ở đây là 100ml) tính bằng ml;
m1 là khối lượng của chất tạo ngọt có liên quan trong dung dịch chuẩn (V2) tính
bằng mg;
m0 là khối lượng của phần mẫu thử, tính bằng g hoặc ml.
F là hệ số pha loãng dùng cho phương pháp tinh sạch được sử dụng. (Ví dụ:
khi làm sạch cột thì F = 10; khi làm trong thuốc thử Carrez thì F = 1).
 Đường chuẩn:
Tính phần khối lượng của chất tạo ngọt có liên quan (w) đo bằng mg/kg hoặc
nồng độ khối lượng (p) đo bằng mg/l theo công thức (2):
w hoặc p =
0
1
m
VFC 
(2)

40. 36
Trong đó:
C là hàm lượng chất tạo ngọt có liên quan trong dung dịch mẫu thử, đọc
được từ đường chuẩn, tính bằng mg/l hoặc mg/kg;
F, V1, m0 xem trong công thức (1).
2.5. Xử lý số liệu thực nghiệm
Áp dụng phần mềm excel 2010 để xử lý và kiểm tra các số liệu thực nghiệm,
phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA 1 chiều).
Đánh giá hàm lượng hai chất bằng phương pháp thống kê.
 Tính sai số [15]
Các kết quả sau khi xử lý bằng phầm mềm Excel 2010 trên máy vi tính và biểu
diễn dưới dạng: . X
X X t S 
Trong đó:
Giá trị trung bình của các lần xác định
Chuẩn student ứng với p = 0,95
Sai số chuẩn của các giá trị trung bình được xác định bằng biểu thức: X
S
S
N

Trong đó:
S là độ lệch chuẩn:
2
1
( )
( 1)
N
i
i
X X
S
N





Do đó:
2
1
( )
( 1)
N
i
i
X
X X
S
N N





(N: số lần thí nghiệm)
 Phân tích phương sai một yếu tố (ANOVA 1 chiều)
+ Ảnh hưởng của một yếu tố trên giá trị quan sát Yi (i= 1, 2, 3, …, k).

41. 37
Bảng 2.2. Sự biến động hàm lượng 2 chất tạo ngọt theo yếu tố khảo sát
Số thí nghiệm
Các mức độ của yếu tố khảo sát
1 2 … j … m
1 x11 x12 … x1j … x1m
2 x21 x22 … x2j … x2m
… … … … … … …
I xi1 xi2 … xij … xim
… … … … … … …
N xn1 xn2 … xnj … xnm
Tổng cộng T1 T2 … Tj … Tm
Bảng 2.3. Kết quả phân tích ANOVA 1 chiều
Nguồn
phương sai
Tổng bình
phương
Bậc tự
do (f)
Phương
sai
Ftính Flý thuyết
Khối yếu tố 1 2
2
m
j
j
T
T
n N

 1f m 
2
AS 2
1 2
A
TN
S
F
S

1( 0,05, , )TNF p f f
Sai số thí
nghiệm
(2) (3) (1)  ( 1)TNf m n  2
TNS
Phương sai
tổng
2
2
nm
ij
T
x
N

1N  2
S

(*) với N = n.m
Nếu ttính < tlý thuyết tương ứng với mức ý nghĩa p = 0,05: các kết quả thí
nghiệm như nhau, hay yếu tố khảo sát không ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm có
ý nghĩa về mặt thống kê với p > 0,05.
Nếu ttính > tlý thuyết tương ứng với mức ý nghĩa p = 0,05: các kết quả thí
nghiệm khác nhau, hay yếu tố khảo sát ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm có ý
nghĩa về mặt thống kê với p < 0,05.

42. 38
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát điều kiện sắc ký định lượng saccharin và acesulfame kali
3.1.1. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng tới quá trình tách
Tốc độ dòng là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến hiệu quả của quá
trình tách sắc ký. Do đó chúng tôi tiến hành khảo sát trên hệ dung môi pha động
dịch dịch đệm phosphat: acetonitril = (60:40) với tốc độ dòng 0,6ml/phút;
0,8ml/phút; 1,0ml/phút, thể tích bơm mẫu 20µl, bước sóng 220nm. Từ các điều kiện
trên khi chạy sắc ký lỏng hiệu năng cao ta có sắc ký đồ được biểu diễn qua hình 3.1;
3.2; 3.3 và kết quả trong hình được trình bày ở bảng 3.1.
Hình 3.1. Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và acesulfame kali ở tốc độ 0,6ml/phút

43. 39
Hình 3.2. Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và acesulfame kali ở tốc độ 0,8ml/phút
Hình 3.3. Sắc ký đồ của hỗn hợp saccharin và acesulfame kali ở tốc độ 1,0ml/phút

44. 40
Bảng 3.1. Các thông số cơ bản ở tốc độ dòng khác nhau của
saccharin và acesunlfame kali
Tốc độ dòng
(ml/phút)
Thời gian lưu tR (phút) Hệ số đối xứng - Sa
Saccharin Acesulfame kali Saccharin Acesulfame kali
0,6 6,360 5,094 1,527 1,537
0,8 3,682 3,005 1,185 1,259
1,0 3,101 2,729 1,359 1,259
Từ sắc ký đồ hình 3.1; 3.2; 3.3 và bảng 3.1 cho thấy tốc độ dòng pha động
càng lớn (hình 3.3), peak xuất hiện càng sớm, thời gian phân tích giảm. Tuy nhiên
trên thực tế khi phân tích mẫu thử, thời gian lưu dưới 3 phút của quá trình tách
thường là thời gian lưu của các tạp chất và dung môi. Vì vậy peak nghiên cứu xuất
hiện quá sớm dễ bị ảnh hưởng bởi các peak tạp và cho kết quả không ổn định.
Ở hình 3.1 do tốc độ dòng pha động yếu, thời gian phân tích dài, nên peak
thu được bị doãng, tốn kém dung môi, hóa chất và thời gian… Do đó chúng tôi tiếp
tục thay đổi tốc độ dòng của hệ dung môi pha động, kết quả ở trường hợp hình 3.2
cho thấy peak phân tích xuất hiện ở khoảng thời gian không quá dài khoảng 3 phút,
hiệu quả tách tốt, peak thu được nhọn đẹp, có cường độ tín hiệu cao,… vì vậy chúng
tôi chọn tốc độ dòng 0,8ml/phút để khảo sát các bước tiếp theo.
3.1.2. Khảo sát ảnh hưởng độ phân cực của pha động đến quá trình tách
Tiến hành pha các tỷ lệ dịch đệm phosphat : acetonitril ngoài tỉ lệ (60:40)
như mục 3.1.1 pha tiếp tỉ lệ (40:60); (80:20); Tốc độ dòng duy trì 0,8ml/phút; Tiến
hành bơm 20µl vào cột. Sắc ký đồ thu được ứng với mỗi tỷ lệ của pha động được
biểu diễn ở hình 3.4; 3.5 và ghi kết quả bảng 3.2.

45. 41
Hình 3.4. Sắc ký đồ hỗn hợp sacccharin và acesunlfame kali
với tỷ lệ pha động [40:60]
Hình 3.5. Sắc ký đồ hỗn hợp sacccharin và acesunlfame kali
với tỷ lệ pha động [80:20]

46. 42
Bảng 3.2. Các thông số cơ bản của quá trình tách saccharin và
acesulfame kali ở tỷ lệ pha động khác nhau
Pha động
[Đệm phosphat:acetonitril]
Thời gian lưu tR ( phút) Hệ số đối xứng- Sa
Saccharin Acesulfame
kali
Saccharin Acesulfame
kali
[80:20] 8,554 5,629 4,150 2,161
[60:40] 3,682 3,005 1,185 1,259
[40:60] 3,468 2,933 1,406 1,349
Kết quả trên cho thấy khi độ phân cực của pha động giảm kéo theo sự tăng
thời gian lưu. Khi giảm tỷ lệ đệm photphat trong pha động, thì độ phân cực dung
môi tăng, làm giảm thời gian lưu của saccharin xuống 2,47 lần và giảm 1,92 lần đối
với acesulfame kali. Với nguyên tắc chọn chương trình sắc ký sao cho quá trình
tách hỗn hợp có hệ số đối xứng cho phép nhỏ hơn 1,5. Kết hợp với peak thu được
nhọn đẹp, cường độ tín hiệu cao. Qua đó nhận thấy tỷ lệ dung môi pha động đệm
phosphat : acetonitril = (60:40) là phù hợp cho việc phân tích định lượng.
Từ các kết quả khảo sát trên chúng tôi chọn điều kiện sát ký:
• Sử dụng cột pha đảo RP18 (150 x 4,6mm; 3µm)
• Pha động: dung dịch đệm phosphat và xetonitril (60:40)
• Thể tích bơm mẫu 20µl
• Tốc độ dòng 0,8ml/phút
• Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
• Detector: UV bước sóng 220nm
3.2. Đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích
3.2.1. Xác định giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
Tiến hành xác định giới hạn phát hiện (LOD) của phương pháp theo quy tắc
3 và áp dụng hồi quy tuyến tính. Đường hồi quy tuyến tính được xây dựng trong
khoảng hẹp của nồng độ (1,0 – 20,0ppm).
Pha loãng các dung dịch chuẩn thành các dung dịch có nồng độ: 1,0; 5,0;
10,0; 20,0 ppm, lọc qua màng 0,45µm, định lượng bằng phương pháp HPLC.
LOD được tính theo công thức 2.5 mục 2.3.5. Kết quả thu được trình bày ở
bảng 3.3.

47. 43
Bảng 3.3. Kết quả xác định giới hạn phát hiện (LOD)
Tên hoạt chất Nồng độ (ppm) Diện tích peak
Phương trình hồi quy
tuyến tính, hệ số tương
quan (R), và LOD
Saccharin
1,0
5,0
10,0
20,0
80875
441498
886204
1784515
y = 89618x – 8290,8
R = 1
Sy =1750,577
LOD = 0,059
Acesulfame kali
1,0
5,0
10,0
20,0
66020
351953
704330
1421808
y = 71328x – 5923,8
R = 1
Sy = 2493,891
LOD = 0.105
*ĐKTN như mục 3.1
 Từ LOD tính được giới hạn định lượng (LOQ) như sau:
• Đối với saccharin: LOQ = 3,3.LOD = 3,3.0,059 = 0,195 (ppm)
• Đối với acesulfame kali: LOQ = 3,3.LOD = 3,3.0,105 = 0,347 (ppm)
Với LOQ đó phương pháp HPLC sử dụng detector DAD ở các điều kiện thí
nghiệm đã chọn hoàn toàn có thể xác định đồng thời hai hoạt chất trên trong các
mẫu thực phẩm
3.2.2. Phương trình đường chuẩn của saccharin và acesulfame kali
Chúng tôi tiến hành xác định khoảng phụ thuộc tuyến tính giữa nồng độ
saccharin và acesulfame kali với diện tích peak trên sắc ký đồ. Phép xác định này
được tiến hành trên các dung dịch chuẩn.
Tiến hành chuẩn bị các dung dịch chuẩn như sau: Pha hai dãy dung dịch
chuẩn saccharin và acesulfame kali có nồng độ: 1, 5, 10, 20, 50, 100ppm. Lọc các
dung dịch qua màng 0,45µm sau đó định lượng bằng phương pháp HPLC. Kết quả
được thể hiện ở bảng 3.4 và được biểu diễn trên hình 3.6 và 3.7.

48. 44
Bảng 3.4. Sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ
C (ppm) 1 5 10 20 50 100
Diện tích píc của
Saccharin (mAU)
80875 441498 886204 1784515 4358087 8818698
Diện tích píc của
Acesulfame–K (mAU)
66020 351953 704330 1421808 3490502 7137679
Hình 3.6. Đường chuẩn của saccharin

49. 45
Hình 3.7. Đường chuẩn của acesulfame kali
Qua các phương trình tuyến tính của từng hoạt chất nhận thấy có mối tương
quan tuyến tính rất chặt chẽ giữa nồng độ và diện tích peak tương ứng thu được trên
sắc ký đồ. Trong khoảng nồng độ từ 1ppm đến 100ppm với hệ số tương quan R2
= 1
đối với saccharin và R2
= 0,999 đối với acesulfame kali.
3.2.3. Độ lặp lại của phương pháp
Tiến hành 8 thí nghiệm lặp lại trên nền mẫu thử thêm chuẩn và mỗi thí
nghiệm tiêm 3 lần để lấy giá trị trung bình của diện tích peak. Kết quả thu được ở
bảng 3.5 cho thấy:

50. 46
Bảng 3.5. Kết quả khảo sát độ lặp lại trên nền mẫu thử (n = 8)
Thí nghiệm
Saccharin Acesulfame kali
Diện tích peak
(mAU)
Nồng độ xác
định được
(ppm)
Diện tích peak
(mAU)
Nồng độ xác
định được
(ppm)
1
2
3
4
5
6
7
8
1785987
1771817
1783004
1771972
1776546
1787600
1785715
1774989
20,30
20,14
20,26
20,14
20,19
20,31
20,29
20,17
1417843
1410277
1407600
1409069
1408283
1410353
1414168
1407989
20,09
19,98
19,94
19,96
19,95
19,98
20,04
19,95
X
S
RSD(%)
20,23
0,07
0,35
19,97
0,06
0,003
Độ lặp lại của phương pháp được xác định qua độ lệch chuẩn tương đối
(RSD%). Kết quả phân tích hai hoạt chất ở (bảng 3.5) trên nền mẫu thử được thêm
chuẩn ở mức nồng độ 20ppm. Sau khi đã đem phân tích lại đã được xác định. Theo
Horwitz, khi phân tích những nồng độ cỡ ppm, thì sai số trong nội bộ phòng thí
nghiệm nhỏ hơn ½.RSDH tính theo công thức: RSDH (%) = 2(1 – 0,5lgC)
(C là nồng độ
chất phân tích) thì đạt yêu cầu.
+ Đối với phép phân tích saccharin
6
20
(1 0,5lg )
10
H
1 1
RSD = 2 = 5,096 %
2 2

 > 0,35 %
+ Đối với phép phân tích acesulfame kali
6
20
(1 0,5lg )
10
H
1 1
RSD = 2 = 5,096 %
2 2

 > 0,003 %
Vì RSD(%) ≤ 1/2RSD Horwitz nên phương pháp phân tích có độ lặp lại tốt.

51. 47
3.2.4. Độ đúng của phương pháp
Độ đúng được xác định trên mẫu thử đã nghiên cứu với chương trình sắc ký
đã chọn. Độ đúng của phương pháp được đánh giá qua độ thu hồi khi phân tích mẫu
thêm chuẩn. Phân tích mẫu thêm chuẩn ở 3 mức nồng độ là 8ppm, 10ppm, 12ppm.
Kết quả được trình bày trong bảng 3.6.
Bảng 3.6. Kết quả khảo sát độ đúng trên nền mẫu thử (n=3)
Hoạt chất Mẫu
Lượng có
sẵn trong
mẫu thử
(ppm)
Lượng
thêm vào
(ppm)
Lượng tìm
thấy
(ppm)
Độ thu
hồi (%)
Saccharin
1
0
8 7,36 92,02
2 10 9,21 92,00
3 12 11,08 92,30
Acesulfame kali
1
0
8 7,40 92,51
2 10 9,45 94,49
3 12 11,31 94,28
Qua bảng 3.6 cho thấy phương pháp đạt được độ đúng tốt cho cả hai hoạt chất
và độ thu hồi nằm trong khoảng từ 92,00% - 94,49%, thỏa mãn hàm Horwitz.
Chứng tỏ phương pháp phân tích đã chọn là hoàn toàn phù hợp để định lượng
saccharin và acesulfame kali trong các sản phẩm thực phẩm.
3.3. Xác định, đánh giá hàm lượng saccharin và acesulfame kali trong thực
phẩm truyền thống
3.3.1. Xác định hàm lượng saccharin, acesulfame kali và so sánh với tiêu
chuẩn cho phép
Từ kết quả nghiên cứu ở trên đã tiến hành phân tích các mẫu thực phẩm thực
tế từ hải sản (ruốc, tôm chua), thịt (nem, chả) và đậu (chè, mè xửng). Quy trình xử
lý mẫu được thực hiện theo mục 2.4 và điều kiện sắc ký HPLC thực hiện theo mục

52. 48
3.1. Các kết quả thu được khi phân tích mẫu thực tế không chứa hàm lượng
acesunlfame kali chỉ chứa hàm lượng saccharin. Kết quả hàm lượng sacccharin
được trình bày trong bảng 3.7 và 3.8.
Bảng 3.7. Kết quả xác định hàm lượng saccharin và acesulfame kali trong thực
phẩm truyền thống được chế biến từ hải sản
Mẫu
Hàm lượng
Sac
(mg/kg)
Hàm
lượng
Sac
Cho phép
(mg/kg)
Kết
luận
Hàm
lượng
Ace
(mg/kg)
Hàm
lượng Ace
Cho phép
(mg/kg)
Kết
luận
R1 90,2 ± 4,4 200 Đạt < LOD 200 Đạt
R2 122,9 ± 7,2 200 Đạt < LOD 200 Đạt
R3 181,1 ± 5,6 200 Đạt < LOD 200 Đạt
R4 101,0 ± 2,5 200 Đạt < LOD 200 Đạt
R5 35,0 ± 0,7 200 Đạt < LOD 200 Đạt
T1 190,7 ± 4,9 200 Đạt < LOD 200 Đạt
T2 131,4 ± 1,1 200 Đạt < LOD 200 Đạt
T3 167,5 ± 8,3 200 Đạt < LOD 200 Đạt
T4 45,7 ± 0,5 200 Đạt < LOD 200 Đạt
T5 121,3 ± 0,4 200 Đạt < LOD 200 Đạt

53. 49
Bảng 3.8. Kết quả xác định hàm lượng saccharin và acesulfame kali trong thực
phẩm truyền thống được chế biến từ thịt và đậu
Mẫu
Hàm lượng
Sac
(mg/kg)
Hàm
lượng Sac
Cho phép
(mg/kg)
Kết
luận
Hàm
lượng
Ace
(mg/kg)
Hàm
lượng Ace
Cho phép
(mg/kg)
Kết
luận
N1 420,8± 3,5 500 Đạt < LOD Không dùng Đạt
N2 114,3 ± 3,7 500 Đạt < LOD Không dùng Đạt
N3 350,4 ± 8,4 500 Đạt < LOD Không dùng Đạt
N4 396,6 ± 1,6 500 Đạt < LOD Không dùng Đạt
N5 272,1 ± 5,4 500 Đạt < LOD Không dùng Đạt
C1 429,8 ± 0,4 500 Đạt < LOD Không dùng Đạt
C2 96,1 ± 0,5 500 Đạt < LOD Không dùng Đạt
C3 435,5 ± 1,4 500 Đạt < LOD Không dùng Đạt
C4 340,2 ± 2,5 500 Đạt < LOD Không dùng Đạt
C5 425,5 ± 1,4 500 Đạt < LOD Không dùng Đạt
M1 498,2 ± 3,2 500 Đạt < LOD 500 Đạt
M2 340,5 ± 0,2 500 Đạt < LOD 500 Đạt
M3 397,2 ± 1,9 500 Đạt < LOD 500 Đạt
M4 376,5 ± 1,6 500 Đạt < LOD 500 Đạt
M5 268,1 ± 2,1 500 Đạt < LOD 500 Đạt
Ch1 712,0 ± 1,4 200 Không đạt < LOD 350 Đạt
Ch2 224,7 ± 0,4 200 Không đạt < LOD 350 Đạt
Ch3 353,6 ± 2,6 200 Không đạt < LOD 350 Đạt
Ch4 182,4 ± 2,3 200 Đạt < LOD 350 Đạt
Ch5 188,1 ± 2,1 200 Đạt < LOD 350 Đạt
Qua các bảng cho thấy tất cả các mẫu có hàm lượng saccharin nhưng không
mẫu nào chứa acesunlfame kali. Trong đó, có 3 mẫu chè có hàm lượng saccharin
vượt quá mức cho phép theo thông tư số 27/10/2012 của Bộ Y tế về hướng dẫn việc
quản lý phụ gia thực phẩm.

54. 50
3.3.2. Đánh giá hàm lượng saccharin theo vị trí lấy mẫu
Kết quả phân tích 30 mẫu thực phẩm truyền thống ở tỉnh Thừa Thiên Huế
cho thấy không có mẫu nào chứa acesulfame kali. Vì vậy chúng tôi chỉ đánh giá
hàm lượng saccharin trong thực phẩm theo vị trí lấy mẫu (cơ sở sản xuất).
Kết quả phân tích ANOVA 1 chiều của sự biến động hàm lượng saccharin
trong các mẫu thực phẩm theo vị trí lấy mẫu được trình bày ở bảng 3.9; 3.10 và
3.11.
Bảng 3.9. Kết quả phân tích ANOVA 1 chiều của sự biến động hàm lượng
saccharin trong thực phẩm truyền thống chế biến từ hải sản theo vị trí lấy mẫu
Mẫu
Nguồn phương
sai
Bậc
tự do
Tổng
bình
phương
Phương
sai
Ftính
Flí thuyết
(fA=4,fTN=10)
Ruốc
Giữa các vị trí 4 33708,76 8427,19
2140,69 3,48Sai số thí nghiệm 10 39,40 3,94
Phương sai tổng 14 33748,16
Tôm
chua
Giữa các vị trí 4 36798,52 9199,63
3141,24 3,48Sai số thí nghiệm 10 29,30 2,93
Phương sai tổng 14 36827,82
Bảng 3.10. Kết quả phân tích ANOVA 1 chiều của sự biến động hàm lượng
saccharin trong thực phẩm truyền thống chế biến từ thịt theo vị trí lấy mẫu
Mẫu
Nguồn phương
sai
Bậc
tự
do
Tổng bình
phương
Phương
sai
Ftính
Flí thuyết
(fA=4,fTN=10)
Nem
Giữa các vị trí 4 183450,76 45862,69
11749,62 3,48Sai số thí nghiệm 10 39,30 3,93
Phương sai tổng 14 183490,06
Chả
Giữa các vị trí 4 251453,84 62863,46
8929,47 3,48Sai số thí nghiệm 10 70,40 7,04
Phương sai tổng 14 251524,24

55. 51
Bảng 3.11. Kết quả phân tích ANOVA 1 chiều của sự biến động hàm lượng
saccharin trong thực phẩm truyền thống chế biến từ đậu theo vị trí lấy mẫu
Mẫu
Nguồn phương
sai
Bậc
tự
do
Tổng bình
phương
Phương
sai
Ftính
Flí thuyết
(fA=4,fTN=10)
Mè
xửng
Giữa các vị trí 4 84880,00 21220,00
18505,82 3,48Sai số thí nghiệm 10 11,50 1,15
Phương sai tổng 14 84891,5
Chè
Giữa các vị trí 4 598506,08 149626,52
104829,4Sai số thí nghiệm 10 14,30 1,43
Phương sai tổng 14 598520,38
+ Qua các bảng cho thấy:
Giá trị Ftính lớn hơn Flí thuyết tương ứng với mức ý nghĩa p = 0,05. Như vậy vị
trí lấy mẫu có ảnh hưởng đến kết quả phân tích hàm lượng saccharin trong các mẫu
thực phẩm (có ý nghĩa về mặt thống kê với p < 0,05).
Để xác định xem hàm lượng saccharin trong mẫu thực phẩm ở các sơ sở sản
xuất khác nhau như thế nào ta tính độ lệch nhỏ nhất (  ) hàm lượng trung bình của
saccharin giữa các kết quả đo được theo công thức:
TN(p = 0,05 ; f ) TN
2
= t .S .
n

Sau đó so sánh độ lệch giữa các giá trị trung bình với  để kết luận. Kết quả
tính toán được trình bày ở bảng 3.12, 3,13.

56. 52
Bảng 3.12. Độ lệch nhỏ nhất và độ lệch giữa các giá trị trung bình của hàm lượng
saccharin trong thực phẩm có nguồn gốc từ hải sản theo vị trí lấy mẫu.
Mẫu
Hàm lượng
saccharin (mg/kg)
Độ lệch chuẩn giữa các giá trị
trung bình
Độ lệch nhỏ
nhất ( )
Ruốc
1xR 90,2 1 2x xR R 32,7
1,9
2xR 122,9 2 3x xR R 58,2
3xR 181,1 3 4x xR R 80,1
4xR 101,0 4 4x xR R 66,0
5xR 35,0 5 1x xR R 55,2
Tôm
chua
1Tx 190,7 1 2x xT T 59,3
1,7
2Tx 131,4 2 3x xT T 36,1
3Tx 167,5 3 4x xT T 121,8
4Tx 45,7 4 5x xT T 75,6
5Tx 121,3 5 1x xT T 69,4

57. 53
Bảng 3.13. Độ lệch nhỏ nhất và độ lệch giữa các giá trị trung bình của hàm lượng
saccharin trong thực phẩm có nguồn gốc từ thịt và đậu theo vị trí lấy mẫu.
Mẫu
Hàm lượng saccharin
(mg/kg)
Độ lệch chuẩn giữa các
giá trị trung bình
Độ lệch nhỏ
nhất (  )
Nem
N1
x 420,8 1 2x xN N 306,5
1,9
N2
x 114,3 2 3x xN N 236,1
N3
x 350,4 3 4x xN N 46,2
N4x 396,6 4 5x xN N 124,5
N5
x 272,1 5 1x xN N 148,7
Chả
C1
x 429,8 1 2x xC C 333,7
2,6
C2
x 96,1 2 3x xC C 339,4
C3
x 435,5 3 4x xC C 95,3
C4
x 340,2 4 5x xC C 85,3
C5
x 425,5 5 1x xC C 4,3
Mè xửng
M1
x 498,2 1 2x xM M 157,7
1,1
M2
x 340,5 2 3x xM M 56,7
M3
x 397,2 3 4x xM M 20,7
M4
x 376,5 4 5x xM M 108,4
M5
x 268,1 5 1x xM M 230,1
Chè
Ch1
x 712,0 1 2x xCh Ch 487,3
1,2
Ch1
x 224,7 2 3x xCh Ch 128,9
Ch1
x 353,6 3 4x xCh Ch 171,2
Ch1
x 182,4 4 5x xCh Ch 5,7
Ch1
x 188,1 5 1x xCh Ch 523,9

58. 54
Khi so sánh độ lệch giữa các giá trị trung bình với độ lệch nhỏ nhất, ta nhận
thấy độ lệch giữa các giá trị trung bình đều lớn hơn giá trị độ lệch nhỏ nhất. Vậy
hàm lượng saccharin trong mẫu thực phẩm là khác nhau. Cụ thể như sau:
- Đối với mẫu ruốc, hàm lượng saccharin trung bình trong ruốc lấy ở 39
Dương Văn An là cao nhất còn ruốc lấy ở 284 Tăng Bạt Hổ có hàm lượng saccharin
thấp nhất.
- Đối với mẫu tôm chua, hàm lượng saccharin trung bình trong bánh ướt lấy
ở 39 Dương Văn An là cao nhất còn tôm chua lấy ở 32 Tô Hiến Thành có hàm
lượng saccharin thấp nhất.
- Đối với mẫu nem, hàm lượng saccharin trung bình trong nem lấy ở 3 Đào
Duy Từ là cao nhất còn nem lấy ở Bà Đầm lô 454 An Cựu có hàm lượng saccharin
thấp nhất.
- Đối với mẫu chả, hàm lượng saccharin trung bình trong chả lấy ở 191 Tăng
Bạt Hổ là cao nhất còn chả lấy ở 115 Hàn Mặc Tử có hàm lượng saccharin thấp
nhất.
- Đối với mẫu mè xửng, hàm lượng saccharin trung bình trong mè xửng Nam
Thuận là cao nhất còn mè xửng Sông Hương có hàm lượng saccharin thấp nhất.
- Đối với mẫu chè, hàm lượng saccharin trung bình trong chè lấy Đường
Nguyễn Công Trứ 2 là cao nhất còn chè lấy Hùng Vương có hàm lượng saccharin
thấp nhất.
3.3.3. Đánh giá hàm lượng của saccharin giữa các loại thực phẩm cùng nguồn
gốc
Vì acesulfame kali không có trong mẫu thực phẩm nên chúng tôi chỉ đánh
giá hàm lượng saccharin.
3.3.3.1. Đánh giá hàm lượng saccharin giữa các loại thực phẩm chế biến từ hải
sản
Các đại lượng thống kê thu được khi đánh giá hàm lượng sacccharin trong 2
loại thực phẩm chế biến từ hải sản được trình bày ở bảng 3.14.

59. 55
Bảng 3.14. Các đại lượng thống kê thu được khi đánh giá hàm lượng
saccharin giữa các loại thực phẩm chế biến từ hải sản
Thực phẩm Hàm lượng (mg/kg) Phương sai (S2
)
Ruốc 106,0 ± 53,1 2810,3
Tôm chua 116,8 ± 51,2 2619,6
• So sánh độ lặp lại của hàm lượng saccharin qua chuẩn F (Fischer)
1 2
2
1
ính 0,05, 4, 42
2
1,01 9,61t p f f
S
F F
S
     
2
1S , 2
2S là phương sai tương ứng của saccharin trong ruốc và tôm chua.
 Như vậy, độ lặp lại hàm lượng saccharin của tôm chua và ruốc là như nhau
với mức ý nghĩa p > 0,05.
Tính độ lệch chuẩn chung:
2 2
1 1 2 2
1 2
( 1). ( 1).
54,11
2
chung
n S n S
S
n n
  
 
 
1 2 1 2
ính
1 2
.
. 0,31t
chung
x x n n
t
S n n

 

Vì 1 2ính ( 0,05, 2 8)0,31 2,31t p f n nt t        nên hàm lượng saccharin trong ruốc và tôm
chua là như nhau với mức ý nghĩa p > 0,05
Hình 3.8. Biểu đồ biểu diễn sự biến động hàm lượng
của saccharin trong ruốc và tôm chua

60. 56
3.3.3.2. Đánh giá hàm lượng của saccharin giữa các loại thực phẩm chế biến
từ thịt
Các đại lượng thống kê thu được khi đánh giá hàm lượng sacccharin trong 2
loại thực phẩm chế biến từ thịt được trình bày ở bảng 3.15.
Bảng 3.15. Các đại lượng thống kê thu được khi đánh giá hàm lượng
saccharin giữa các loại thực phẩm chế biến từ thịt
Thực phẩm Hàm lượng (mg/kg) Phương sai (S2
)
Nem 310,8 ± 123,6 15284,9
Chả 345,4 ± 144,8 20958,7
• So sánh độ lặp lại của hàm lượng saccharin qua chuẩn F (Fischer)
1 2
2
1
ính 0,05, 4, 42
2
1,37 9,61t p f f
S
F F
S
     
2
1S , 2
2S là phương sai tương ứng của saccharin trong chả và nem
 Như vậy, độ lặp lại hàm lượng saccharin của nem và chả là như nhau với
mức ý nghĩa p > 0,05.
Tính độ lệch chuẩn chung:
2 2
1 1 2 2
1 2
( 1). ( 1).
134,62
2
chung
n S n S
S
n n
  
 
 
1 2 1 2
ính
1 2
.
. 0, 41t
chung
x x n n
t
S n n

 

Vì 1 2ính ( 0,05, 2 8)0,41 2,31t p f n nt t        nên hàm lượng saccharin trong chả
và nem là như nhau với mức ý nghĩa p > 0,05
Hình 3.9. Biểu đồ biểu diễn sự biến động hàm lượng
của saccharin trong nem và chả