Nhận viết luận văn Đại học , thạc sĩ - Zalo: 0917.193.864 Tham khảo bảng giá dịch vụ viết bài tại: vietbaocaothuctap.net Download luận văn thạc sĩ ngành hóa phân tích với đề tài: Phân tích hàm lượng vitamin A trong một số loại trứng gia cầm bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao 50000100

1. ĐẠI HỌC HUẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
--------
NGUYỄN THANH BÍCH CHÂU
PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG VITAMIN A TRONG
MỘT SỐ LOẠI TRỨNG GIA CẦM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
Thừa Thiên Huế, năm 2016

2. i
M,
ĐẠI HỌC HUẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM
--------
NGUYỄN THANH BÍCH CHÂU
PHÂN TÍCH HÀM LƢỢNG VITAMIN A TRONG
MỘT SỐ LOẠI TRỨNG GIA CẦM BẰNG
PHƢƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
CHUYÊN NGÀNH : HÓA PHÂN TÍCH
MÃ SỐ : 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ HÓA HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC
PGS.TS. NGÔ VĂN TỨ
Thừa Thiên Huế, năm 2016

3. ii
LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi,
các số liệu và kết quả nghiên cứu ghi trong luận văn là trung thực,
đƣợc các đồng tác giả cho phép sử dụng và chƣa từng đƣợc công bố
trong bất kỳ một công trình nào khác.
Tác giả
Nguyễn Thanh Bích Châu

4. iii
Lời cảm ơn
Tôi xin chân thành cảm ơn Thầy giáo PGS.TS. Ngô Văn Tứ đã giao
đề tài, tận tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện
luận văn, đồng thời đã bổ sung cho tôi nhiều kiến thức chuyên môn và
kinh nghiệm quý báu trong nghiên cứu khoa học.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến các Thầy giáo, Cô giáo trƣờng Đại
học Sƣ phạm, trƣờng Đại học Khoa học và phòng Đào tạo Sau đại học đã
giảng dạy, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học
Cao học và thực hiện luận văn.
Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành đến các anh, chị và cán bộ
tại trung tâm kiểm nghiệm thuốc, mỹ phẩm, thực phẩm Thừa Thiên Huế
đã nhiệt tình giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn
thành luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè đã động
viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và hoàn thành bản luận văn này.
Chân thành cảm ơn!
Tác giả
Nguyễn Thanh Bích Châu
iii

5. 1
MỤC LỤC
PHỤ BÌA......................................................................................................................i
LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... ii
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... iii
MỤC LỤC...................................................................................................................1
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................4
DANH MỤC CÁC BẢNG..........................................................................................6
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ.....................................................................................8
MỞ ĐẦU ...................................................................................................................9
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN LÝ THUYẾT .............................................................11
1.1. Tổng quan về trứng gia cầm...............................................................................11
1.1.1. Hình thái và cấu tạo.........................................................................................11
1.1.2. Thành phần dinh dƣỡng của trứng gia cầm.....................................................11
1.1.3. Bảo quản trứng................................................................................................12
1.1.4. Tình hình sản xuất và tiêu thụ trứng gia cầm .................................................13
1.2. Tổng quan về vitamin.........................................................................................15
1.2.1. Khái niệm........................................................................................................15
1.2.2. Phân loại..........................................................................................................15
1.2.3. Vai trò..............................................................................................................15
1.3. Vitamin A...........................................................................................................16
1.3.1. Lịch sử tìm ra vitamin A .................................................................................16
1.3.2. Tính chất..........................................................................................................17
1.3.3. Chức năng của vitamin A................................................................................21
1.3.4. Ảnh hƣởng của vitamin đến sức khỏe con ngƣời ...........................................22
1.3.6. Nguồn cung cấp vitamin A ............................................................................24
1.4. Các phƣơng pháp xác định vitamin A................................................................25
1.4.1. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV – Vis .......................................25
1.4.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao.........................................................27
1.5. Giới thiệu về phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC).........................30

6. 2
1.5.1. Vài nét về lịch sử phát triển của phƣơng pháp................................................30
1.5.2. Nguyên tắc của phƣơng pháp HPLC...............................................................31
1.5.3. Phân loại và ứng dụng.....................................................................................32
1.5.4. Các giai đoạn chạy sắc ký HPLC....................................................................32
1.5.5. Detector trong HPLC ......................................................................................33
1.5.6. Phƣơng pháp định lƣợng trong HPLC ............................................................34
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU...........................37
2.1. Nội dung nghiên cứu..........................................................................................37
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu....................................................................................37
2.2.1. Lấy mẫu, bảo quản và chuẩn bị mẫu...............................................................37
2.2.2. Chọn kỹ thuật xử lý mẫu.................................................................................38
2.2.3. Khảo sát các điều kiện phân tích HPLC .........................................................38
2.2.4. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích.............................................38
2.2.5. Áp dụng phƣơng pháp để định lƣợng vitamin A trong một số mẫu trứng gia
cầm trên địa bàn Thừa Thiên Huế.............................................................................43
2.2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu thực nghiệm..........................................................45
2.3. Kỹ thuật thực nghiệm.........................................................................................45
2.3.1. Hóa chất ..........................................................................................................45
2.3.2. Thiết bị và dụng cụ..........................................................................................46
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................47
3.1. Khảo sát điều kiện phân tích HPLC...................................................................47
3.1.1. Chuẩn bị dung dịch chạy HPLC .....................................................................47
3.1.2. Ảnh hƣởng của thành phần pha động .............................................................48
3.1.3. Ảnh hƣởng của tốc độ dòng pha động ............................................................49
3.2. Kỹ thuật xử lý mẫu.............................................................................................52
3.3. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp HPLC xác định vitamin A.....................54
3.3.1. Độ ổn định của hệ thống HPLC với detector RF............................................54
3.3.2. Tính đặc hiệu của phƣơng pháp ......................................................................55
3.3.3. Khoảng tuyến tính của phƣơng pháp định lƣợng............................................56
3.3.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng .....................................................57

7. 3
3.3.5. Độ lặp lại của phƣơng pháp ............................................................................58
3.3.6. Độ đúng của phƣơng pháp ..............................................................................59
3.4. Xây dựng quy trình phân tích.............................................................................61
3.5. Áp dụng quy trình phân tích để định lƣợng vitamin A trong một số mẫu trứng
gia cầm trên địa bàn Thừa Thiên Huế.......................................................................63
3.5.1. Định lƣợng vitamin A trong một số mẫu trứng gia cầm trên địa bàn Thừa
Thiên Huế..................................................................................................................63
3.5.2. So sánh, đánh giá hàm lƣợng vitamin A trong một số mẫu trứng gia cầm trên
địa bàn Thừa Thiên Huế............................................................................................66
KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ ......................................................................................71
1. KẾT LUẬN...........................................................................................................71
2. KIẾN NGHỊ ..........................................................................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................73
PHỤ LỤC ................................................................................................................ P1

8. 4
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Stt Ký hiệu Tên tiếng Anh Tên tiếng Việt
1 AOAC
Association of Official Analytical
Chemists
Hiệp hội các nhà hóa phân
tích
2 BHT Butylated hydroxytoluene Butyl hyđroxytoluen
3 DIPE Diisopropyl ether Điisopropyl ete
4 ĐKSK Chromatography condition Điều kiện sắc ký
5 Et2O Diethyl ether Đietyl ete
6 EtOAC Ethyl acetate Etyl axetat
7 Hex Hexane Hexan
8 HPLC
High performance liquid
chromatography
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
9 IPA Isopropyl alcohol Isopropanol
10 ISO
International organization for
standardization
Tổ chức tiêu chuẩn hóa
quốc tế
11 IU International unit Đơn vị IU
12 IUPAC
International Union of Pure and
Applied Chemistry
Hiệp hội Hóa học lý thuyết
và ứng dụng Quốc tế
13 LOD Limit of detection Giới hạn phát hiện
14 LOQ Limit of quantitation Giới hạn định lƣợng
15 MeCN Acetonitrile Axetonitril
16 MeOH Methanol Metanol
17 NAD Nicotinamide adenine dinucleotide Coenzym NAD
18 NADH2
Nicotinamide adenine dinucleotide
plus hydrogen
Coenzym NADH2
19 PDA Photodiode array detector
Detector mảng diot phát
quang

9. 5
20 ppb Part per billion Phần tỉ
21 ppm Part per million Phần triệu
22 QCVN National technical regulation
Quy chuẩn kỹ thuật Quốc
gia
23 RAE Retinol activity equivalents Đƣơng lƣợng retinol
24 Rev Recovery Độ thu hồi
25 RF Fluorescence detector Detector huỳnh quang
26 RSD Relative standard deviation Độ lệch chuẩn tƣơng đối
27 TCVN Viet Nam Standard Tiêu chuẩn Việt Nam
28 THF Tetrahydrofuran Tetrahyđrofuran

10. 6
DANH MỤC CÁC BẢNG
Stt Bảng Tiêu đề Trang
1 1.1 Thành phần dinh dƣỡng của trứng gà 12
2 1.2 Tính chất quang phổ của vitamin A 20
3 1.3 Thất thoát vitamin A trong quá trình chế biến, đóng gói 20
4 1.4 Lƣợng vitamin A cần cung cấp trong 1 ngày 24
5 1.5 Vitamin A trong thực phẩm 24
6 2.1 Ma trận thực nghiệm để phân tích ANOVA một yếu tố 44
7 2.2 Bảng phân tích phƣơng sai theo ANOVA một yếu tố 44
8 3.1 Cách pha dãy dung dịch chuẩn 48
9 3.2 Kết quả hệ số đối xứng của các tỷ lệ hệ dung môi pha động 49
10 3.3 Các thông số cơ bản ở tốc độ dòng khác nhau 52
11 3.4
Kết quả đánh giá độ ổn định của hệ thống HPLC xác định
vitamin A
54
12 3.5 Sự tƣơng quan giữa diện tích peak và nồng độ chất phân tích 56
13 3.6 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lƣợng (LOQ) 57
14 3.7 Kết quả diện tích peak khảo sát độ lặp lại 58
15 3.8 Độ lặp lại của phƣơng pháp phân tích 59
16 3.9 Kết quả thời gian lƣu và diện tích peak khảo xác độ đúng 60
17 3.10 Kết quả khảo sát độ đúng theo phƣơng pháp thêm chuẩn 60
18 3.11 Đánh giá độ đúng của phƣơng pháp 61
19 3.12 Thông tin về các mẫu trứng gia cầm 63
20 3.13
Kết quả phân tích hàm lƣợng vitamin A trong một số mẫu
trứng gia cầm bằng phƣơng pháp HPLC
64

11. 7
21 3.14
Kết quả phân tích ANOVA 1 yếu tố (địa bàn lấy mẫu) đối
với các loại trứng gia cầm nuôi theo hộ gia đình
67
22 3.15
Kết quả phân tích ANOVA 1 yếu tố (địa bàn lấy mẫu) đối
với các loại trứng gia cầm nuôi theo mô hình công nghiệp
68
23 3.16
Kết quả phân tích ANOVA 1 yếu tố (mô hình nuôi) đối với
các loại trứng gia cầm ở Quảng Điền
69
24 3.17
Kết quả phân tích ANOVA 1 yếu tố (mô hình nuôi) đối với
các loại trứng gia cầm ở Hƣơng Thủy
69

12. 8
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
Stt Hình Tiêu đề Trang
1 1.1 Cấu tạo mặt cắt dọc của quả trứng 11
2 1.2 Sản lƣợng trứng gia cầm ở Việt Nam từ 2000 – 2014 14
3 1.3
Phân bố sản lƣợng trứng gia cầm ở Thừa Thiên Huế
năm 2015
14
4 1.4 Quá trình tạo retinol từ β – caroten 18
5 1.5 Cấu tạo của một số vitamin A 19
6 1.6 Sơ đồ tổng hợp và chuyển hóa vitamin A 21
7 1.7 Mắt mắc bệnh đốm biot 22
8 1.8 Hệ thống HPLC 33
9 1.9 Detector huỳnh quang với hai bộ đơn sắc cách tử 34
10 3.1 Sắc đồ khảo sát thành phần pha động 49
11 3.2
Sắc đồ của hệ pha động MeOH:H2O = 90: 10 (v/v)
với các tốc độ dòng
51
12 3.3 Sơ đồ quy trình xử lý mẫu trứng gia cầm 53
13 3.4 Sắc kí đồ mẫu trắng (a) và mẫu trắng thêm chuẩn (b) 55
14 3.5
Đƣờng hồi quy tuyến tính giữa diện tích peak và
nồng độ vitamin A
56
15 3.6
Quy trình phân tích vitamin A trong trứng gia cầm
bằng HPLC
62
16 3.7 Sắc ký đồ mẫu trứng gà G1 65
17 3.8 Sắc ký đồ mẫu trứng vịt V1 66
18 3.9 Sắc ký đồ mẫu trứng cút C2 66
19 3.10 Hàm lƣợng vitamin A trong các mẫu thực tế 67

13. 9
MỞ ĐẦU
Để tồn tại, phát triển và cải thiện nòi giống, cơ thể chúng ta luôn cần đƣợc
cung cấp đủ các chất dinh dƣỡng, ngoài các thành phần chính nhƣ đạm, béo, đƣờng
còn có những thành phần thiết yếu khác đảm bảo sức khỏe cho con ngƣời, một
trong những thành phần đó chính là “vitamin”. Vitamin là một nhóm chất hữu cơ có
phân tử lƣợng lớn và các tính chất vật lý, hoá học rất khác nhau. Tác dụng của
chúng trên các cơ thể sinh vật cũng rất khác nhau nhƣng đều cần thiết cho sự sống
của sinh vật, nhất là đối với ngƣời và động vật. So với nhu cầu về các chất dinh
dƣỡng cơ bản nhƣ protein, lipit, gluxit thì nhu cầu về vitamin rất thấp. Trong cơ thể
vitamin đóng vai trò tạo ra các coenzym cần thiết trong các phản ứng chuyển hoá
khác nhau. Tất cả các quá trình sống gắn liền với sự trao đổi chất trong cơ thể đều
có sự tham gia trực tiếp của vitamin [8], [23].
Có khoảng 40 loại vitamin và khoáng chất cần thiết cho con ngƣời. Trong
đó, vitamin A là một trong những chất có hàm lƣợng đáng kể nên đã và đang đƣợc
nghiên cứu để phát huy tác dụng của nó đối với con ngƣời. Vitamin A không tồn tại
dƣới dạng một hợp chất duy nhất, mà dƣới một vài dạng. Trong thực phẩm có
nguồn gốc động vật, dạng chính của vitamin A là retinol, chủ yếu có trong: gan, cá
biển, bơ, sữa, trứng,... Vitamin A tồn tại trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật
dƣới dạng caroten (tiền vitamin A) nhƣ rau muống, rau ngót,… các loại củ, quả có
màu đỏ, vàng nhƣ: cà chua, bí đỏ, cà rốt, đu đủ,.... hay các loại ngũ cốc nhƣ ngô,
gạo, đậu,… [15], [57].
Vitamin A rất cần thiết cho sự sinh trƣởng và phát triển xƣơng ở trẻ em, cho
sự nhìn thấy, sự nguyên vẹn bề mặt biểu mô và niêm mạc, ngoài ra, còn có tác dụng
chống ung thƣ, chống lão hóa do kìm hãm và ngăn chặn sự phát triển của các gốc tự
do. Biểu hiện của bệnh thiếu vitamin A là quáng gà, khô mắt, nhuyễn giác mạc và
có thể gây mù, đặc biệt ở trẻ em. Bệnh thiếu vitamin A rất dễ xảy ra ở trẻ em trƣớc
tuổi đi học, chủ yếu là ở các nƣớc chậm phát triển: nó luôn kèm theo việc thiếu dinh
dƣỡng nói chung vì chất béo rất cần thiết cho sự hấp thụ caroten, protein kích thích
việc hấp thụ vitamin A [42], [59]. Hằng năm, trên thế giới có tới 250000 trẻ bị mù
do thiếu vitamin A [8], [57].

14. 10
Vitamin A hòa tan trong chất béo nên việc thải lƣợng dƣ thừa từ ăn uống là
khó khăn hơn so với các vitamin tan trong nƣớc. Vì vậy quá liều có thể dẫn đến ngộ
độc vitamin A. Nó có thể gây buồn nôn, vàng da, dị ứng, chứng biếng ăn, nôn mửa,
nhìn mờ, đau đầu, tổn thƣơng cơ và bụng, uể oải và thay đổi tính tình [55], [59].
Để phân tích và đánh giá hàm lƣợng vitamin A trong một số loại thực phẩm
ngƣời ta có thể sử dụng nhiều phƣơng pháp khác nhau: phƣơng pháp trắc quang, sắc
ký, hóa học,… Nhƣng do vitamin A tồn tại ở trạng thái tan trong dầu, khó phân tích
nên cần phải lựa chọn phƣơng pháp mang lại hiệu quả cao nhất. Vì vậy trong những
năm gần đây, phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC) đã đƣợc sử dụng
nhiều để đo các chất chuyển hóa quan trọng trong thực phẩm nói chung và vitamin
A nói riêng. Phƣơng pháp này có độ nhạy cao khi phân tích các hợp chất dễ bị oxi
hóa, dễ bị phân hủy nhiệt, khá hiện đại, phù hợp với điều kiện ở phòng thí nghiệm
của các trung tâm.
Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về vitamin A bằng phƣơng
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao đạt đƣợc kết quả phân tích tốt và đƣợc áp dụng trên
nhiều đối tƣợng nhƣ: thực phẩm [33], [37], [39], sữa tƣơi [41], sữa lỏng [32], huyết
thanh [27], [52],... Ở Việt Nam thì việc nghiên cứu xác định hàm lƣợng vitamin A
còn hạn chế, chƣa đƣợc quan tâm rộng rãi và chủ yếu mới áp dụng trên đối tƣợng
sữa [2], [4], [8].
Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi đã chọn đề tài: “Phân tích hàm
lượng vitamin A trong một số loại trứng gia cầm bằng phương pháp sắc ký lỏng
hiệu năng cao’’ với mục đích của đề tài nhằm giải quyết 2 vấn đề cơ bản sau:
- Xây dựng quy trình phân tích hàm lƣợng vitamin A bằng phƣơng pháp
HPLC với detector huỳnh quang.
- Cung cấp thông tin cơ bản về hàm lƣợng vitamin A trong một số loại
trứng gia cầm trên địa bàn tỉnh Thừa Thiên Huế.

15. 11
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN LÝ THUYẾT
1.1. Tổng quan về trứng gia cầm
1.1.1. Hình thái và cấu tạo [9], [14]
Trứng gia cầm có “hình trứng”, đó là hình bầu dục không cân đối, một đầu tù
và một đầu nhọn - hình Kassini. Trọng lƣợng của trứng phụ thuộc vào giống, tuổi,
chế độ nuôi dƣỡng, ví dụ nhƣ: trứng gà 40 † 60g, trứng vịt 60 † 100g,… Trứng gồm
3 phần: vỏ, lòng trắng và lòng đỏ, trung bình vỏ cứng chiếm 10%, lòng đỏ 33%,
lòng trắng 57% khối lƣợng 1 quả trứng và tỷ lệ này sẽ thay đổi theo khối lƣợng
tuyệt đối của trứng, tuổi và thành phần thức ăn.
Hình 1.1. Cấu tạo mặt cắt dọc của quả trứng
Bao bọc bên ngoài của quả trứng là vỏ cứng, trên đó có nhiều lỗ khí, bình
quân 1cm2
có 150 lỗ khí. Dƣới vỏ cứng có vỏ lụa gồm hai lớp: lớp trong gọi là lớp
màng trứng, và lớp ngoài dán chặt vào vỏ cứng gọi là lớp màng vỏ cứng. Khoảng
giữa lòng đỏ và vỏ chứa đầy lòng trắng, do nhiều lớp có độ đậm đặc khác nhau tạo
thành. Ngay dƣới lớp màng trứng là lớp loãng ngoài (khoảng 23% thể tích), sau đó
là lớp đặc giữa (57% thể tích) rồi đến lớp loãng giữa (17%) và lớp đặc trong (3%
thể tích), lớp cuối cùng này bọc lấy lòng đỏ. Lòng đỏ chính là tế bào của quả trứng,
nằm ở trung tâm do màng lòng đỏ, còn gọi là màng mỏng bọc ngoài.
1.1.2. Thành phần dinh dƣỡng của trứng gia cầm [9], [14], [58]
Lòng đỏ là nơi tập trung chủ yếu các chất dinh dƣỡng: có 14% đạm, 30% béo
và gần 2% chất khoáng. Đạm trong lòng đỏ trứng có các axit amin tốt nhất và toàn
diện nhất. Lòng trắng trứng có tỷ lệ nƣớc rất cao (88,10%), thành phần còn lại là
tro, protein và gluxit. Trứng cũng là nguồn cung cấp vitamin và khoáng chất rất tốt.
Lòng đỏ trứng có cả các vitamin tan trong nƣớc (B1, B6) và vitamin tan trong dầu
Màng lòng đỏ
Lòng đỏ trứng
Vỏ cứng
Buồng khí
Màng ngoài (keo)
Màng lòng trắng
Dây treo
Màng trong vỏ
Đĩa phôi và phôi
Lòng trắng trứng

16. 12
(vitamin A, D, K). Trong lòng trắng trứng chỉ có một ít vitamin tan trong nƣớc (B2,
B6). Cả trong lòng đỏ và lòng trắng trứng đều có chất Biotin (vitamin B8), tham gia
vào chu trình sản xuất năng lƣợng để đáp ứng nhu cầu của cơ thể. Các nguyên tố vi
lƣợng nhƣ sắt, kẽm, đồng, mangan, iot... tập trung hầu hết trong lòng đỏ.
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của trứng gà [9]
Thành phần Toàn quả trứng (%) Lòng đỏ (%) Lòng trắng (%)
Nƣớc 65,0 48,0 88,1
Protein 12,0 17,5 9,9
Mỡ 11,0 32,5 0,2
Đƣờng 1,0 1,0 1,0
Khoáng 11,0 1,0 0,8
Ngoài ra, trứng còn chứa nhiều axit amin có giá trị sinh học hoàn chỉnh.
Theo tài liệu của Romanoff [9], trong trứng có các axit amin không thay thế đƣợc
nhƣ: valin (0,24g), isoleucin (0,36g), leucin (1,21g), lysin (0,38g), threonin (0,33g),
methionin (0,27g), phenylalanin (0,41g), tryptophan (0,17g),… Nhìn chung, trứng
là nguồn thực phẩm tốt cho sức khỏe và có giá trị dinh dƣỡng cao.
1.1.3. Bảo quản trứng [9], [26], [28], [38]
Cùng với thời gian bảo quản, trong trứng diễn ra những sự biến đổi hoá học,
lý học và hoá sinh học. Các biến đổi này liên quan với các enzym có mặt trong đó.
Sự thay đổi của màng lòng đỏ và sự bốc hơi nƣớc qua các lỗ khí gây ra các quá
trình thẩm thấu giữa lòng trắng và lòng đỏ, làm cho nồng độ của các thành phần
trứng cũng thay đổi theo. Các quá trình phân huỷ và khuếch tán làm thay đổi kích
thƣớc của buồng khí nên hàm lƣợng vật chất khô của lòng trắng và lòng đỏ cũng
thay đổi (có thể cảm quan qua độ nhớt của lòng trắng và lòng đỏ giảm).
Các quá trình lên men xảy ra trong trứng lúc bảo quản là môi trƣờng thuận
lợi cho hoạt động của vi khuẩn. Vi khuẩn có từ những gà mái bị bệnh, sự nhiễm
bệnh từ ngoài vào bởi vi trùng amip coc, coli hoặc vỏ trứng bị hỏng, dính phân,
dính các nguyên liệu của lớp độn chuồng,….
Nhiệt độ và thời gian bảo quản cũng ảnh hƣởng đến chất lƣợng trứng. Chỉ số
Haugh (Hu) của trứng sẽ giảm đi theo thời gian bảo quản. Tuy nhiên, mức độ giảm

17. 13
của đơn vị Hu còn tuỳ thuộc vào nhiệt độ môi trƣờng. Các thí nghiệm của Coutts và
Wilson (1986) cho thấy, với trứng trƣớc khi bảo quản Hu là 90 đơn vị. Ở -10
C, sau
5 ngày bảo quản, giảm đi 5 đơn vị, trong khi đó, ở 100
C giảm đi 15 đơn vị, 150
C
giảm đi 18 đơn vị, 210
C giảm đi 25 đơn vị và 240
C giảm đi 30 đơn vị [9], [38].
Vì vậy, để tăng chất lƣợng của trứng trong thời gian dài ta cần bảo quản
trứng đúng cách. Có nhiều phƣơng pháp bảo quản nhƣ: bảo quản lạnh, bảo quản
trong nƣớc vôi, bảo quản bằng màng bảo vệ (silicat, parafin,…), bảo quản trong môi
trƣờng khí trơ, bảo quản bằng xử lý nhiệt, xử lý dầu,…. Trƣớc khi xuất hiện tủ lạnh
thì cách bảo quản trứng phổ biến là ngâm trứng vào nƣớc vôi hay dung dịch Na+
(natri silicat). Hiện nay phần lớn ở các nƣớc trên thế giới, ngƣời ta bảo quản trứng
trong phòng lạnh đƣợc bổ sung thêm loại khí nhƣ: CO2, O3 vào buồng lạnh hoặc
phủ một lớp dầu lên vỏ trứng giúp bảo quản tốt hơn.
Trong luận văn, chúng tôi chọn cách bảo quản đơn giản và tiện lợi nhất, đó là
bảo quản lạnh. Qua nghiên cứu tài liệu, chúng tôi quyết định chọn nhiệt độ của tủ
lạnh ở khoảng 20
C, ở điều kiện này, trứng có thể giữ đƣợc từ 6 – 7 tháng [9], [26],
[28], [38].
1.1.4. Tình hình sản xuất và tiêu thụ trứng gia cầm [6], [7], [21], [54]
Đảm bảo nguồn cung lƣơng thực, thực phẩm là vấn đề sống còn của nhân
loại. Trong nông nghiệp, ngành trồng trọt có vai trò cung cấp nguồn lƣơng thực, còn
ngành chăn nuôi đóng vai trò cung cấp nguồn thực phẩm.
Chăn nuôi gia cầm bắt đầu xuất hiện ở Việt Nam từ khoảng 3000 đến 3500
năm trƣớc và là nghề truyền thống lâu đời đối với hầu hết ngƣời dân. Mặc dù còn
gặp nhiều khó khăn và hạn chế, tuy nhiên sản phẩm trứng gia cầm đã đạt đƣợc
những kết quả đáng khích lệ. Trong hơn 10 năm qua, sản phẩm trứng có sự biến
động đáng kể, từ 2001 đến 2003 thì liên tục tăng lên, đạt tốc độ tăng trƣởng bình
quân là 7,61%/năm. Tuy nhiên, từ cuối năm 2003 đã xảy ra các đợt dịch cúm gia
cầm trên diện rộng, trong thời gian dài đã ảnh hƣởng rất lớn đến sản lƣợng trứng, so
với năm 2003, sản lƣợng trứng năm 2007 giảm 7,96%. Trong 5 năm gần đây dịch
cúm gia cầm đã đƣợc kiểm soát tốt hơn nên số lƣợng lại liên tục tăng trở lại, từ
6421,9 triệu quả năm 2010 lên 8297,5 triệu quả năm 2014 [7], [21].

18. 14
Hình 1.2. Sản lượng trứng gia cầm ở Việt Nam từ 2000 – 2014
Nguồn: Tổng cục thống kê [21]
Theo tiến trình phát triển của nền kinh tế Quốc dân thì chất lƣợng cuộc sống
ngày càng tăng nên mức tiêu thụ trứng gia cầm liên tục tăng, nếu năm 2010 bình
quân mỗi ngƣời dân tiêu thụ 72,5 quả/năm thì đến năm 2015 là 96,2 quả/năm, tăng
gần 30% so với năm 2010 [7].
Cùng với sự phát triển của cả nƣớc, ngành chăn nuôi của Thừa Thiên Huế
cũng đang trên đà phát triển, năm 2015 sản lƣợng trứng gia cầm 100588,40 nghìn
quả, tăng 8,01% so với năm trƣớc, trong đó Quảng Điền chiếm 14,36%, Phong Điền
chiếm 14,12 %, Hƣơng Thủy là 14,11%. Tuy Phong Điền chiếm tỉ lệ cao hơn
Hƣơng Thủy nhƣng trong luận văn này, chúng tôi vẫn chọn Hƣơng Thủy và Quảng
Điền là địa bàn lấy mẫu, do Phong Điền có địa hình gần giống với Quảng Điền,
đồng thời ở đây không triển khai mô hình nuôi cút [6], [54].
Hình 1.3. Phân bố sản lượng trứng gia cầm ở Thừa Thiên Huế năm 2015 (%)
Nguồn: Chi cục thú y Thừa Thiên Huế [6]
Năm
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000
2000
2001
2002
2003
2004
2005
2006
2007
2008
2009
2010
2011
2012
2013
2014
Triệuquả
14,12
14,369,75
7,95
10,02
14,11
12,22
8,40
9,07
Phong Điền
Quảng Điền
Hƣơng Trà
Phú Lộc
Phú Vang
Hƣơng Thuỷ
Nam Đông
A Lƣới
TP Huế

19. 15
1.2. Tổng quan về vitamin
1.2.1. Khái niệm [15], [17], [61]
Vitamin là chất hữu cơ có phân tử lƣợng tƣơng đối lớn và có bản chất hoá
học rất khác nhau, với lƣợng rất nhỏ nhƣng cần thiết cho hoạt động sống của các cơ
thể sinh vật dị dƣỡng. Nó đảm nhận vai trò nhƣ là những chất xúc tác ở cơ thể sinh
vật [18], [61].
Cơ thể con ngƣời và động vật hầu nhƣ không tự tổng hợp đƣợc vitamin, phần
lớn phải đƣa vào từ thực phẩm, dƣợc phẩm hằng ngày nhƣ thảo mộc, rau, trái cây,
các loại thuốc,.... Dù lƣợng vitamin sử dụng rất ít nhƣng khi thiếu 1 loại vitamin nào
đó thì sẽ dẫn đến những rối loạn hoạt động sinh lý bình thƣờng của cơ thể [15].
1.2.2. Phân loại [8], [15], [17]
Dựa vào cơ sở sinh lý và hoá học vitamin đƣợc phân chia thành 2 nhóm lớn:
 Vitamin hòa tan trong chất béo (dầu): gồm có các vitamin A, D, E, K và
Q. Những vitamin này có tính chất tồn trữ dài hạn trong cơ thể, tại các mô tầng chất
béo và tại một số bộ phận khác, nhất là ở gan. Do đó, khi cơ thể tiếp nhận một
lƣợng lớn, vƣợt ngƣỡng cho phép các vitamin này có thể gây độc hại cho cơ thể,
trong một số trƣờng hợp có thể dẫn đến rối loạn quá trình trao đổi chất [15], [17].
 Vitamin hòa tan trong nƣớc: gồm có vitamin C và các vitamin hỗn hợp B.
Những vitamin này có tính chất tồn trữ ngắn hạn trong cơ thể, bằng cách thấm thấu
qua hệ thống tiêu hóa và hòa tan trong nƣớc của cơ thể để tiến hành các nhiệm vụ
riêng biệt của chúng. Sau đó, chúng đƣợc thải ra ngoài cơ thể cùng các cặn bã khác
bằng sự bài tiết của cơ thể. Do đó, khi chúng ta dùng lƣợng lớn (quá ngƣỡng cho
phép) chúng vẫn không thể gây độc hại cho cơ thể [8], [15].
1.2.3. Vai trò [1], [8], [17]
Khi đƣợc đƣa vào cơ thể con ngƣời, vitamin là một chất xúc tác trong các hệ
thống sinh hóa của cơ thể, và có nhiệm vụ tác dụng biến thể hay biến năng để giúp
các tế bào và các mô tầng thực hiện những chức năng sinh lý riêng biệt, nhằm bảo
tồn sự lành mạnh cho cơ thể [8].
Mỗi vitamin đều có nhiệm vụ hóa học khác nhau. Trong một vài trƣờng hợp
đặc biệt, giữa các vitamin cũng có vài nhiệm vụ hóa học trùng hợp, nhƣng chúng

20. 16
không thể thay thế nhiệm vụ của nhau. Vitamin D hoạt động tốt hơn nếu có sự hiện
diện của vitamin A. Hơn nữa, hai vitamin D và A sẽ hoạt động tốt hơn nếu có sự
hiện diện của vitamin B. Vitamin E có hiệu quả hơn khi đƣợc đi chung với hai
vitamin D và A,... Vitamin C sẽ gây ảnh hƣởng cho sự hữu dụng của vitamin A. Sự
khiếm khuyết trầm trọng của vitamin B1 có thể gây ảnh hƣởng đến sự thấm thấu
của những vitamin khác. Do đó, sức khỏe của cơ thể luôn luôn phụ thuộc vào những
vai trò hoạt động phối hợp bên trong của những vitamin với nhau. Ngoài ra, vitamin
còn kiểm soát việc sử dụng các chất dinh dƣỡng khác nhƣ: khoáng chất, đạm,
đƣờng, và nƣớc, do đó, chúng cần thiết cho việc kéo dài cuộc sống. Bên cạnh đó,
vitamin không có giá trị năng lƣợng, cũng nhƣ không phải là chất cấu tạo và tăng
trƣởng cơ thể, vì vậy không có nhiệm vụ thay thế cho thực phẩm để nuôi sống và
phát triển cơ thể [1], [17].
1.3. Vitamin A
1.3.1. Lịch sử tìm ra vitamin A [8], [35],[44], [45], [49], [57]
Năm 1909, Step đã tiến hành cho chuột ăn thực phẩm đã bị rút hết chất béo
bằng hỗn hợp ete – rƣợu thì thấy chuột sụt cân nhanh và chết, nếu thêm chất béo
vào thực phẩm thì chúng lại phục hồi sức khỏe và tiếp tục phát triển. Với thí nghiệm
này, Step đã đƣa ra nhận xét rằng: trong thực phẩm có các yếu tố hòa tan trong chất
béo cần thiết cho hoạt động sống của cơ thể con ngƣời gọi là yếu tố A, sau này đƣợc
gọi là vitamin nhóm A [8], [57].
Năm 1920, hai nhà sinh hóa ngƣời Mỹ Osborn, Mendel và 1 số tác giả khác
phát hiện thấy có các hợp chất tƣơng tự nhƣ vậy ở thực vật [8].
Cho đến năm 1929, Moore T. ở trƣờng đại học Cambridge đã đƣa ra ý kiến
cho rằng các caroten chính là tiền thân của vitamin A hay là các provitamin A. Năm
1930, Moore đã nghiên cứu đƣợc hàm lƣợng vitamin A tăng lên đáng kể trong gan
của chuột so với các bộ phận khác của chúng [44], [45].
Năm 1931, nhà bác học ngƣời Đức Karrer đã dùng phƣơng pháp sắc ký để
phân chia và phát hiện ra cấu trúc của vitamin A và caroten [49].
Năm 1937, hai nhà khoa học Holmes H.N. và Corbet R.E. tại trƣờng đại học
Oberlin, Hòa Kỳ đã kết tinh và cô lập đƣợc vitamin A [35].

21. 17
Năm 1947, vitamin A đƣợc tổng hợp đầu tiên bởi hai nhà hóa học Hà Lan
David Adriaan van Dorp và Jozef Ferdinand Arens. Sau đó, năm 1950, nhiều nhà
hóa học trong đó có Karrer đã tổng hợp thành công β – caroten là một trong 3 dạng
đồng phân quan trọng của caroten [8], [49].
1.3.2. Tính chất
1.3.2.1. Tính chất vật lý [8], [15], [48]
Vitamin A là chất kết tinh, màu vàng, nóng chảy ở nhiệt độ 620
– 640
C.
Vitamin A không hòa tan trong nƣớc nhƣng hòa tan trong chất béo, dầu và nhất là
các dung môi hữu cơ.
Vitamin A có thể bị ảnh hƣởng xấu bởi oxi hay không khí, ánh sáng và nhiệt
độ. Sự ẩm ƣớt và độ ẩm không khí cao sẽ làm tăng các hiệu ứng. Vì vậy sự hƣ hỏng
có thể đƣợc giảm đáng kể khi tách nó khỏi nguồn oxi hay hơi ẩm và sự hiện diện
của chất chống oxi hoá cùng với việc bảo quản ở nhiệt độ thấp.
β – caroten là tiền chất của vitamin A (caroten) quan trọng nhất, tan tốt trong
cloroform, benzen, tan trung bình trong ete, dầu thực vật, tan ít trong metanol,
etanol, nhƣng không tan trong nƣớc, axit, hợp chất ankan, có nhiệt độ nóng chảy
cao 1760
C – 1830
C. Tinh thể β – caroten có dạng hình lăng trụ 6 mặt, màu tím đậm
nếu kết tinh từ dung môi benzen, metanol và có hình thoi, màu đỏ nếu kết tinh từ
petroleum ete.
1.3.2.2. Tính chất hóa học [8], [42], [48]
Vitamin A không tồn tại dƣới dạng một hợp chất duy nhất, mà dƣới một vài
dạng khác nhau. Trong thực phẩm có nguồn gốc động vật, dạng chính của vitamin
A là retinol.
Công thức hóa học: C20H30O.
Trọng lƣợng phân tử: 286,45 g/mol.
Công thức cấu tạo:
Tên theo hệ thống IUPAC: (all–E)–3,7–đimetyl–9–(2,6,6–trimetyl–1–
xyclohexen–1–yl)nona–2,4,6,8–tetraen–1–ol.

22. 18
Tên thông thƣờng: Retinol.
Vitamin A dễ bị oxi hóa trong điều kiện phòng thí nghiệm.
Trong cơ thể dƣới tác dụng của chất xúc tác sinh học vitamin A dạng retinol
chuyển thành vitamin A dạng retinal.
Vitamin A bị phân hủy khi có oxi không khí, hoặc bị đun nhẹ. Tuy nhiên, nó
khá bền trong điều kiện yếm khí, bền với axit và kiềm ở nhiệt độ không quá cao.
Phản ứng với SbCl3 cho phức màu xanh.
Phản ứng với H2SO4 tạo hợp chất màu nâu.
Vitamin A và caroten tham gia vào quá trình oxi hóa – khử, có thể đồng thời
là chất nhận và chất nhƣờng oxi.
Trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật, vitamin A tồn tại dƣới dạng caroten
và chủ yếu dƣới dạng β – caroten.
Công thức hóa học: C40H56.
Trọng lƣợng phân tử: 536,85 g/mol.
Công thức cấu tạo:
Tên hệ thống IUPAC: 1,3,3–trimetyl–2–[(all–E)–3,7,12,16–tetrametyl–18–
(2,6,6–trimetylxyclohex–1–en–1–yl)octadeca–1,3,5,7,9,11,13,15,17–nonaen–1–yl]
xyclohex–1–en.
Tên thông thƣờng: β – caroten.
Khi chuyển hóa β – caroten bằng enzym carotenase sẽ thu đƣợc 2 phân tử
retinol. β – caroten không tự chuyển hóa qua vitamin A mà phụ thuộc vào nhu cầu
của cơ thể.
Hình 1.4. Quá trình tạo retinol từ β – caroten

23. 19
Khi đƣa vào cơ thể động vật, caroten chuyển thành vitamin A nhờ hệ vi sinh
đặc trƣng. Sự chuyển hóa này có thể xảy ra ở tuyến giáp trạng, nhờ sự tham gia của
chất tireogbulin (có tính chất của enzym carotenase), hay có nghiên cứu cho rằng, vị
trí chuyển hóa của caroten thành vitamin A là thành ruột non [8].
Ở thực vật, β – caroten có thể chuyển hóa thành vitamin nhờ sự phân cắt một
nối đôi ở trung tâm.
All – trans – retinal Axit All – trans – retinoic
All – trans – retinyl axetat 11 – cis – retinal
α – caroten
Hình 1.5. Cấu tạo của một số vitamin A
1.3.2.3. Tính chất quang phổ [8], [48]
Vitamin A có tính hấp thụ tia cực tím UV nhờ vào hệ nối đôi liên hợp. Phổ
hấp thụ cực đại (λmax) biến thiên trong khoảng 318 – 360 nm, giá trị này thay đổi
phụ thuộc vào dung môi và cấu trúc.
Ngoài ra, một số vitamin A có thể đƣợc phát hiện bởi phổ huỳnh quang, đặc
biệt all – trans – retinol và este retinol, chúng có tính huỳnh quang tốt tại bƣớc sóng
kích thích từ 325 – 350 nm và phát xạ tại 470 – 490 nm. Hầu hết các retinoid tổng
hợp và axit retinoic lại không phát huỳnh quang, ngoài ra, quá trình oxi hóa trong
rƣợu có thể dẫn đến việc mất tính huỳnh quang. Vì vậy, phổ tử ngoại đƣợc sử dụng
để định lƣợng các retinoid tổng hợp và axit retinoic.
Từ bảng 1.2, nhìn chung, đồng phân cis có độ hấp thụ cực đại thấp hơn đồng
phân trans.

24. 20
Bảng 1.2. Tính chất quang phổ của vitamin A
Chất Công thức
Quang phổ
λmax (nm) E-1
(cm-1
)
All – trans – retinol C20H30O 325 1845
11 – cis – retinol C20H30O 319 1220
All – trans – retinyl axetat C22H32O2 325 1560
All – trans – retinyl panmitat C36H60O2 325 940
All – trans – retinal C20H28O 383 1510
11 – cis – retinal C20H28O 380 878
Axit all – trans – retinoic C20H28O2 350 1510
Axit 13 – cis – retinoic C20H28O2 354 1325
1.3.2.4. Tính ổn định [1], [48]
Vitamin A là một trong những vitamin tan trong dầu. Chất này nhạy cảm với
oxi, tia tử ngoại nhƣng khi ở dạng este thì nó tƣơng đối bền vững (ví dụ nhƣ: retinyl
panmitat hay retinyl axetat).
Vitamin A có tính ổn định trong huyết tƣơng và thực phẩm. Nhƣng hiện
tƣợng mất vitamin A có thể xuất hiện do các phản ứng hóa học gây mất hoạt tính
của vitamin A, do bị tách ra hay bị rò rỉ khỏi thực phẩm. Các quá trình chế biến và
bảo quản thực phẩm có thể làm mất từ 5 – 40% vitamin A và caroten. Khi không có
mặt oxi và ở nhiệt độ cao (nhƣ quá trình tiệt trùng, nấu) các phản ứng cơ bản xảy ra
là sự isomer hóa và sự phân hủy vitamin, ngƣợc lại, trong môi trƣờng có oxi thì
phản ứng oxi hóa có thể tạo ra các hợp chất bay hơi hoặc không bay hơi. Vì thế việc
bảo vệ các vitamin trong quá trình chế biến và bảo quản thực phẩm là rất cần thiết.
Bảng 1.3. Thất thoát vitamin A trong quá trình chế biến, đóng gói
Phƣơng thức
Sản phẩm
Đông lạnh
(%)
Tiệt trùng
(%)
Rau của
12 10
Trái câyb
37 39
a: so với sản phẩm mới nấu, b: so với sản phẩm tƣơi

25. 21
1.3.3. Chức năng của vitamin A [8], [15], [42], [59]
 Tham gia vào quá trình trao đổi protein, lipit, saccarit, muối khoáng. Nếu
thiếu vitamin A sẽ làm giảm quá trình sinh tổng hợp protein, giảm quá trình tích lũy
glycogen trong gan, giảm lƣợng α, β, γ – globulin, albumin trong máu, ảnh hƣởng
tới quá trình hoạt động của tuyến giáp, tuyến thƣợng thận.
 Tham gia chức năng cảm nhận thị giác: đây là chức năng đƣợc xác định
rõ nhất của vitamin A, đóng vai trò quan trọng trong quá trình cảm quang của mắt.
Dạng andehit của vitamin A kết hợp opsin (protein), tạo nên sắc tố thị giác gọi là
rodopsin, chất này đảm bảo tính nhạy cảm của mắt đối với ánh sáng. Dƣới tác dụng
của ánh sáng, rodopsin sẽ bị phân giải thành opsin và andehit của vitamin A là
retinal (trans), ngƣợc lại, trong bóng tối xảy ra quá trình tổng hợp rodop (để tổng
hợp đƣợc rodopsin, retinal phải tồn tại ở dạng cis).
Hình 1.6. Sơ đồ tổng hợp và chuyển hóa vitamin A
 Duy trì cấu trúc các mô: vitamin A kích thích quá trình phát triển và tái
tạo của các biểu mô nhƣ mô sừng, ruột và các con đƣờng hô hấp. Nó cũng ảnh
hƣởng đặc biệt đến da, kích thích sự liền sẹo và phòng ngừa các chứng bệnh của da
nhƣ trứng cá. Nếu thiếu vitamin A, các tế bào sản xuất keratin thay thế các tế bào
tiết nhày ở nhiều tổ chức biểu mô của cơ thể, đặc biệt là ở mắt, dẫn tới khô kết mạc,
giác mạc.
 Sinh trƣởng: do vai trò quan trọng trong sự phát triển tế bào của con
ngƣời, nên vitamin A là yếu tố không thể thiếu đối với sự phát triển của phôi thai và
trẻ em. Vitamin A còn có vai trò đối với sự phát triển của xƣơng, thiếu vitamin A

26. 22
làm xƣơng mềm và mảnh hơn bình thƣờng, quá trình vôi hoá bị rối loạn.
 Miễn dịch: vitamin A cần thiết cho quá trình chức năng bình thƣờng của
hệ miễn dịch, nên giúp bảo vệ chống lại các bệnh do nhiễm trùng. Nó đóng vai trò
quan trọng trong việc duy trì tính toàn vẹn và chức năng của da và màng nhầy tế
bào, đồng thời cũng là rào cản bảo vệ cơ thể chống nhiễm trùng. Thiếu vitamin A,
kích thƣớc của tổ chức lympho thay đổi. β – caroten làm tăng sự nhân lên của tế bào
lympho B và T. Vitamin A cũng là nhân tố trung tâm trong quá trình phát triển và
biệt hóa của tế bào bạch huyết nhƣ tế bào lympho, thực bào và bạch huyết cầu, giúp
cơ thể chống lại các mầm bệnh.
 Chống lão hoá: vitamin A kéo dài quá trình lão hoá do làm ngăn chặn sự
phát triển của các gốc tự do.
 Chống ung thƣ: hoạt động kìm hãm của nó với các gốc tự do cũng dẫn
đến ngăn chặn đƣợc một số bệnh ung thƣ [17].
1.3.4. Ảnh hƣởng của vitamin đến sức khỏe con ngƣời
1.3.4.1. Thiếu vitamin A [8], [42], [57]
Một trong những biểu thị đầu tiên của thiếu hụt vitamin A là thị lực suy
giảm, cụ thể là suy giảm nhẹ thị lực, còn đƣợc gọi là quáng gà (khả năng nhìn giảm
khi độ chiếu sáng thấp). Thiếu hụt liên tục sẽ sinh ra một loạt các thay đổi có tính
chất hủy hoại nhiều nhất diễn ra ở mắt. Các thay đổi về thị giác đƣợc gọi chung là
bệnh khô mắt. Đầu tiên là sự khô đi của màng kết do biểu mô của tuyến tiết nƣớc
mắt và nƣớc nhầy bị thay thế bằng biểu mô keratin hóa. Tiếp theo là sự tích tụ các
mảnh vụn keratin thành các mảng trong mờ nhỏ (đốm biot), cuối cùng là sự ăn mòn
bề mặt màng sừng thô ráp với sự thoái hóa và phá hủy các giác mạc dẫn đến mù
toàn phần.
Hình 1.7. Mắt mắc bệnh đốm biot

27. 23
Các thay đổi khác còn có sự suy giảm miễn dịch, giảm chiều dày lớp vảy ở
da (các bƣớu nhỏ màu trắng ở nan tóc), bệnh da gà (Keratosis pilaris) và Squamous
metaplasia của biểu mô ở bề mặt lối vào phía trên của hệ hô hấp và bàng quang với
lớp biểu mô bị keratin hóa.
1.3.4.2. Thừa vitamin A [1], [8], [15], [48], [55], [56], [57], [59]
Do vitamin A hòa tan trong chất béo, việc thải lƣợng dƣ thừa đã hấp thụ vào
từ ăn uống là khó khăn hơn so với các vitamin hòa tan trong nƣớc nhƣ vitamin B và
C (các vitamin tan trong nƣớc khi dƣ thừa thì đƣợc cơ thể tự đào thải qua bài tiết
hoặc tiêu hóa). Do vậy, nếu quá liều có thể dẫn đến ngộ độc vitamin A [59].
Ngày nay, chúng ta thƣờng bổ sung vitamin A nhƣng khi dùng quá liều sẽ
gây nên những hậu quả khó lƣờng. Đối với ngƣời lớn khi dùng với liều cao trên
1500000 UI/ngày và trẻ em trên 300000 UI/ngày sẽ dẫn đến ngộ độc cấp tính.
Thƣờng có biểu hiện hoa mắt, chóng mặt, buồn nôn, tiêu chảy, co giật, mê sảng.
Khi dùng liều trên 100000 IU/ngày, liên tục trong 10 – 15 ngày sẽ làm mệt mỏi, rối
loạn tiêu hóa, gan to, lách to, rụng tóc, gãy xƣơng, mất ngủ, chảy máu, phù nề, đối
với trẻ em có thể làm tăng áp lực nội sọ, ù tai, ngừng phát triển xƣơng,…, đối với
phụ nữ mang thai có thể dẫn đến quái thai. Đặc biệt, khi uống từ 15000 – 40000
IU/ngày trong 1 năm có khả năng gây ngộ độc cho gan có thể dẫn đến xơ gan [55].
Nhìn chung, chúng ta không nên lạm dụng vitamin A, chỉ sử dụng một lƣợng
đủ với nhu cầu của cơ thể, đặc biệt, không nên uống thêm vitamin A khi không cần
thiết. Nhu cầu vitamin A hàng ngày ở ngƣời trƣởng thành khoảng từ 1,5 – 1,8 mg,
trong đó 75% vitamin A đƣợc lấy từ các nguồn thực phẩm (ở dạng este của axit béo,
chủ yếu là retinyl panmitat), 25% còn lại đƣợc chuyển hóa từ β – caroten và các loại
tiền vitamin A khác. Đối với trẻ đã uống vitamin A trong chƣơng trình bổ sung vi
chất dinh dƣỡng thì không cần dùng thêm bất cứ loại thuốc chứa vitamin A nào nữa.
Với ngƣời già bị loãng xƣơng thì không nên bổ sung thƣờng xuyên vitamin A. Đối
với phụ nữ mang thai chỉ cần ăn nhiều các thực phẩm giàu vitamin A. Đồng thời,
không nên kéo dài thời gian sử dụng các loại thực phẩm chứa nhiều vitamin A, thay
vào đó nên đa dạng hóa thực phẩm để có chế độ ăn tốt nhất cho cơ thể.
Thiếu hụt hay dƣ thừa vitamin A đều đem đến những vấn đề không tốt cho

28. 24
sức khỏe của con ngƣời. Vì thế, nhiều nghiên cứu đã đƣợc tiến hành và đƣa ra
những quy định và khuyến cáo về hàm lƣợng vitamin A cho phép đƣợc bổ sung vào
thực phẩm cũng nhƣ lƣợng vitamin A giới hạn cao nhất cung cấp cho từng đối
tƣợng, từng độ tuổi sử dụng trong 1 ngày.
Hàm lƣợng vitamin A trong thực phẩm thƣờng đƣợc biểu thị dƣới dạng
đƣơng lƣợng retinol RAE hoặc IU. Tỷ lệ chuyển đổi giữa μg RAE và IU nhƣ sau:
1 IU retinol = 0,3 μg RAE = 1,8 μg β – caroten
= 3,6 μg các carotenoid khác có hoạt tính vitamin A
1 RAE = 1 μg retinol = 3,33 IU
Bảng 1.4. Lượng vitamin A cần cung cấp trong 1 ngày (µg RAE/ngày) [48], [56]
Độ tuổi Nam Nữ
Phụ nữ
có thai
Phụ nữ
cho con bú
0 – 6 tháng 400 – 600 400 – 600 - -
7 – 12 tháng 500 – 600 500 – 600 - -
1 – 3 năm 300 – 600 300 – 600 - -
4 – 8 năm 400 – 900 400 – 900 - -
9 – 13 năm 600 – 1700 600 – 1700 - -
14 – 18 năm 900 – 2800 700 – 2800 750 – 2800 1200 – 2800
19 – 50 năm 900 – 3000 700 – 3000 770 – 3000 1300 – 3000
Trên 50 năm 900 – 3000 700 – 3000 - -
1.3.6. Nguồn cung cấp vitamin A [15], [60]
Có 2 nguồn chính cung cấp vitamin A cho cơ thể:
- Thực phẩm có nguồn gốc động vật, vitamin A ở dạng chính là retinol và có
nhiều trong gan, sữa, lòng đỏ trứng,…
- Thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật, vitamin A tồn tại dƣới dạng caroten
(chủ yếu là β – caroten). Caroten có nhiều trong rau có màu xanh đậm hoặc màu
vàng, quả có màu vàng nhƣ: rau muống, rau ngót, bí đỏ, cà rốt, xoài,…
Bảng 1.5. Vitamin A trong thực phẩm
Loại Hàm lƣợng vitamin A (µg/100 g)
1. Bơ dầu, khô 840
2. Phomat, có kem 308

29. 25
3. Kem tƣơi 181
4. Sữa đặc đóng hộp, có đƣờng 74
5. Trứng nguyên quả, tƣơi 160
6. Lòng đỏ trứng, tƣơi 381
7. Cá hồi, tƣơi 35
8. Cá ngừ, vây xanh, tƣơi 655
9. Quả mơ, tƣơi 96
10. Quả anh đào, tƣơi 64
11. Quả nho, tƣơi 46
12. Quả xoài, tƣơi 54
13. Củ cải xanh, tƣơi 579
14. Cà rốt, tƣơi 835
15. Rau diếp xoăn, tƣơi 286
16. Cải xoong, tƣơi 346
17. Ngò tây, tƣơi 421
18. Bí ngô, quả 426
19. Rau khoai lang, tƣơi 189
20. Khoai lang, củ, tƣơi 709
21. Rau bina, tƣơi 469
22. Cà chua đỏ, tƣơi 42
23. Gan bò, tƣơi 4968
24. Gan ngỗng, tƣơi 9309
25. Dầu cá, gan cá 30000
Nguồn: The U.S. Department of Agriculture [60]
1.4. Các phƣơng pháp xác định vitamin A
1.4.1. Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV – Vis [8]
Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng rộng rãi nhất để phân tích các vitamin A
trƣớc khi phƣơng pháp HPLC ra đời. Phƣơng pháp này dùng để phân tích chất tổng
hợp và thực phẩm dựa trên sự hình thành một phức chất màu xanh giữa triclorua
antimony hoặc axit trifluoroaxetic với retinol trong cloroform, đƣợc đo ở 620 nm.
Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng trên toàn thế giới nhƣng dần đƣợc thay thế

30. 26
bằng phƣơng pháp HPLC. Vì phƣơng pháp so màu có nhƣợc điểm: thiếu đặc trƣng,
màu sắc không ổn định, đòi hỏi thao tác phải nhanh chóng, thời gian đo lƣờng phải
phù hợp, sử dụng các thuốc thử ăn mòn và gây ung thƣ (nhƣ cloroform và axit
trifluoroaxetic,…), các bƣớc khảo nghiệm phải đƣợc kiểm soát cẩn thận.
1.4.1.1. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV – Vis trực tiếp [2], [8]
Có thể áp dụng đối với các nguyên liệu vitamin A este tổng hợp (retinyl
axetat, retinyl propionat hoặc retinyl panmitat,…) và các dầu hoặc nang mềm chứa
vitamin A este với hàm lƣợng lớn ( 5000 IU/g).
Cân chính xác khoảng từ 25 mg đến 100 mg chế phẩm và đem hoà tan trong
5 mL pentan rồi pha loãng trong isopropanol để đƣợc dung dịch chứa chính xác
khoảng 10 IU đến 15 IU vitamin A trong 1 mL.
Xác định bƣớc sóng có hấp thụ cực đại và đo độ hấp thụ của dung dịch tại
các bƣớc sóng 300 nm, 326 nm, 350 nm và 370 nm trong cuvet dày 1 cm, dùng
isopropanol làm mẫu trắng.
Tính tỷ lệ độ hấp thụ tại các bƣớc sóng 300 nm, 350 nm và 370 nm so với độ
hấp thụ tại các bƣớc sóng 326 nm ( 326A /A
). Nếu các tỷ lệ 326A /A
không vƣợt
quá: 0,593 ở bƣớc sóng 300 nm, 0,537 ở bƣớc sóng 350 nm và 0,142 ở bƣớc sóng
370 nm tƣơng ứng, thì tính kết quả hàm lƣợng vitamin A trong mẫu thử (IU/g) theo
công thức:
326A .1900.V
(IU/g) (1.1)
100.m
Trong đó:
A326 là độ hấp thụ tại bƣớc sóng 326 nm.
m là lƣợng chế phẩm đem thử (g).
V là thể tích dung dịch thu đƣợc sau khi pha loãng để đem đo (mL).
1900 là hệ số chuyển đổi độ hấp thụ riêng của este retinol thành IU/g.
1.4.1.2. Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV-Vis sau khi chiết tách
vitamin A [8], [48]
Có thể áp dụng cho các nguyên liệu vitamin A có nguồn gốc tự nhiên và đa
số các dạng thuốc chứa vitamin A: thuốc nang, viên nén, thuốc mỡ, dầu gan cá,….

31. 27
Lấy chính xác một lƣợng chế phẩm không ít hơn 500 IU vitamin A và không
nhiều hơn 1 gam chất béo cho vào bình nút mài, thêm 30 mL etanol, 3 mL dung
dịch KOH bão hòa, vài viên đá mầm sôi, đun sôi 30 phút trên bếp cách thủy có lắp
ống sinh hàn hồi lƣu, dƣới dòng khí N2 không có O2. Làm nguội nhanh rồi dùng 30
mL nƣớc cất chuyển hết hỗn hợp sang bình gạn, sau đó thêm 4 gam Na2SO4 đã
nghiền mịn.
Chiết vitamin A với 150 mL đietyl ete và lắc 2 phút (nếu tạo thành nhũ
tƣơng thì chiết thêm 3 lần nữa, mỗi lần với 25 mL ete). Tập trung dịch chiết lại rồi
rửa sạch chiết 4 lần, mỗi lần 50 mL nƣớc cất, chú ý lắc rất nhẹ nhàng ở 2 lần đầu để
tránh tạo thành nhũ tƣơng. Làm bay hơi dịch chiết ete trên bếp cách thủy dƣới dòng
khí N2 không có O2 hoặc cất quay chân không ở nhiệt độ không quá 300
C đến hết
dung môi. Hòa tan cặn trong một lƣợng isopropanol vừa đủ để thu đƣợc dung dịch
chứa 10 IU đến 15 IU vitamin A trong 1 mL. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở
các bƣớc sóng 300 nm, 310 nm, 325 nm, 334 nm trong cuvet dày 1 cm với mẫu
trắng là isopropanol, sau đó xác định bƣớc sóng có hấp thụ cực đại.
1.4.2. Phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phƣơng pháp HPLC là phƣơng pháp tốt nhất để đánh giá độ hoạt động của
vitamin A và đặc tính của retinol và caroten trong các mẫu sinh học với độ chính
xác và độ tin cậy cao, khả năng áp dụng rộng rãi trên nhiều loại chế phẩm và giải
quyết nhiều loại vitamin A nhƣ: trans – retinol, trans – caroten, các loại tiền
vitamin A có trong hỗn hợp phức tạp,…
1.4.2.1. Phương pháp sắc ký lỏng sau khi xà phòng hóa [34], [46], [48], [50], [53]
Xà phòng hóa đƣợc dùng để chiết retinol có trong các mô, các loại thực
phẩm có nguồn gốc động vật và caroten trong thực phẩm có nguồn gốc từ thực vật.
Các chất này thƣờng rất khó để chiết trực tiếp bằng các dung môi chiết do dung môi
khó thâm nhập vào hỗn hợp các chất hoặc cần sử dụng một lƣợng lớn dung môi
chiết. Mặt khác, phƣơng pháp này giúp loại bỏ các chất béo, chất diệp lục và các
chất khác có khả năng cản trở đến quá trình tách sắc ký.
Sau khi xà phòng hóa, tiến hành pha loãng với nƣớc hoặc dung dịch muối để
tránh sự hình thành nhũ tƣơng và thêm dung môi hữu cơ vào để tách phần không bị

32. 28
xà phòng hóa. Dung môi đƣợc dùng nhƣ hexan, đietyl ete, hỗn hợp hexan – đietyl
ete (1:1, v/v), hexan có chứa 15% axetonitril,…. Ngƣời ta tăng hiệu quả của quá
trình chiết bằng cách giảm lƣợng axit béo có trong mẫu, tối ƣu hóa lƣợng nƣớc
đƣợc thêm vào trƣớc khi chiết, chiết nhiều lần với từng lƣợng nhỏ dung môi chiết.
Ngoài ra, cần thêm các chất nhƣ axit ascorbic, pyrogallol và BHT để ức chế quá
trình oxi hóa của vitamin A, đồng thời, ta cần xem xét nhiệt độ của quá trình vì nó
ảnh hƣởng đến sự ổn định của chất phân tích.
Panfili G., Fratianni A. và Irano M. (2004) đã nghiên cứu caroten trong ngũ
cốc bằng phƣơng pháp HPLC [46]. Các nhà nghiên cứu tiến hành xà phòng hóa
mẫu, sau đó chiết 2 lần bằng Hex:EtOAC (9:1, v/v), làm bay hơi lớp hữu cơ, cuối
cùng, rửa giải trong pha động. Tiến hành phân tích mẫu với cột nhồi Kromasil
Phenomenex Si (5 µm, 25 cm × 4,6 mm), pha động là hỗn hợp IPA:Hex (5:10, v/v),
tốc độ dòng 1,5 mL/phút, detector PDA với bƣớc sóng 450 nm thì độ thu hồi đạt
đƣợc từ 92 – 122%.
Các tác giả Got L., Gousson T. và Delacoux E. (1995) đã xác định đồng thời
retinol và các este của nó trên gan ngƣời bằng cách lắc hỗn hợp gồm mẫu + EtOH
chứa 1% pyrogallol trong vòng 30 phút ở 40
C. Sau đó thêm nƣớc và chiết 2 lần
bằng hexan. Tiến hành ly tâm, bay hơi rồi hòa tan chất rắn thu đƣợc trong MeOH.
Cuối cùng, tiến hành xà phòng hóa trong 30 phút, ở 600
C. Tiến hành phân tích với
điều kiện sắc ký sau: cột nhồi Supelosil LC–8 (5 µm, 25 cm × 4,6 mm), pha động là
hỗn hợp MeOH:H2O (94:6, v/v), tốc độ dòng 1,5 mL/phút, detector PDA với bƣớc
sóng 325 nm thì độ thu hồi đạt 80 – 100%, %CV < 11 [34].
Van den Berg H. (1996) đã phân tích retinol trong sữa bằng cách xà phòng
hóa mẫu ở 700
C trong 20 phút, sau đó chiết với heptan:DIPE (3:1, v/v). Tiến hành
chạy máy với cột nhồi HS–5–Silica (12,5 cm x 4,0 mm), với heptan:IPA (60:1, v/v)
làm pha động, tốc độ dòng 1,0 mL/phút, detector huỳnh quang ở bƣớc sóng 344/472
nm thì thu đƣợc kết quả sau: %CV = 3,6, độ thu hồi 98,5% [50].
Năm 1994, Yong L.C.F., Beecher M.R., Graubard G.R., Campbell B.I.,
Reichman W.S., Taylor M.E., Lanza P.R., Holden E. và Judd J.T. đã nghiên cứu
mối quan hệ giữa lƣợng và nồng độ caroten trong khẩu phần ăn ở phụ nữ tiền mãn

33. 29
kinh. Nghiên cứu đƣợc tiến hành nhƣ sau: xử lý mẫu với Na2SO4, MgCO3, sau đó
lọc. Thêm BHT vào rồi xà phòng hóa, để lắng qua đêm, cuối cùng, chiết với hỗn
hợp Hex:Et2O (7:3, v/v) có chứa 1% BHT. Tiến hành phân tích với cột Spherisorb
ODS2 (5 μm x 25 cm x 4,6 mm), pha động là hỗn hợp dung môi
MeCN:MeOH:CH2Cl2:Hex (75:15:5:5, v/v), tốc độ dòng 1,0 mL/phút, ở 300
C, với
detector PDA ở 450 nm thì độ thu hồi đạt đƣợc từ 101 – 103% [53].
1.4.2.2. Phương pháp sắc ký lỏng sau khi chiết trực tiếp [48]
Nhiều dung môi, hỗn hợp dung môi hữu cơ có hiệu quả trong việc chiết trực
tiếp retinol và caroten có trong đối tƣợng. Nguyên tắc của phƣơng pháp là các dung
môi chiết thâm nhập vào các mô và phá vỡ liên kết lipoprotein để giải phóng các
chất. Quá trình chiết đƣợc thực hiện theo trình tự sau:
- Làm biến tính protein bằng một lƣợng etanol, metanol hoặc axetonitril bằng
khối lƣợng của mẫu.
- Thêm đệm hoặc nƣớc để tăng hiệu quả chiết của dung môi.
- Thêm các pha hữu cơ để chiết retinol và caroten.
- Ly tâm để phân chia các pha.
- Làm bay hơi dung môi.
Dung môi chiết đƣợc sử dụng phổ biến nhất là hexan, ngoài ra còn có đietyl
ete, axetonitril, axeton, heptan,… và hỗn hợp các dung môi theo tỉ lệ khác nhau:
etanol:hexan (4:3, v/v), heptan:isopropanol (99,8:0,2, v/v), hexan:etyl axetat (85:15,
v/v), axeton:metanol (50:50, v/v),… [48, tr. 49 – 52].
Ngoài ra, ngƣời ta có thể sử dụng kĩ thuật chiết pha rắn SPE để chiết retinol
ra khỏi mẫu. All – trans retinol và cis – isomer của nó đƣợc chiết từ huyết tƣơng
bằng kĩ thuật SPE bằng cách thêm ancol isopropylic vào để làm biến tính protein,
sau đó thêm axetonitril chứa 0,01M BHT. Tiếp theo, li tâm rồi thêm amoni axetat
vào để làm giảm nồng độ của dung môi và đảm bảo axit retinoic lƣu lại trên cột.
Cuối cùng, tiến hành rửa giải bằng axetonitril chứa 0,01M BHT [48, tr. 52].
Ở những điều kiện nhất định, caroten cũng đƣợc chiết một cách hiệu quả từ
thực vật bằng dung môi chiết trực tiếp. Khachik và đồng sự đã chiết trực tiếp este
của carotenol từ bí đỏ và các loại trái cây khác nhau theo các bƣớc sau: thêm THF,

34. 30
Na2SO4 (200% khối lƣợng mẫu) và MgSO4 (10% khối lƣợng mẫu) vào, dùng máy
xay để trộn hỗn hợp trong 5 phút. Tiến hành lọc, chiết cho đến khi thu đƣợc dịch
chiết không màu, làm bay hơi bằng thiết bị bay hơi quay đến gần khô ở 300
C. Phân
tách dịch chiết đậm đặc giữa 2 pha ete dầu và nƣớc (muối có thể đƣợc thêm vào để
phá vỡ nhũ tƣơng). Rửa nhiều lần lớp dịch nƣớc với ete dầu có chứa 15% metanol
cho đến không màu, trộn lớp hữu cơ với Na2SO4 khan, cuối cùng, cho bay hơi, rồi
hòa tan cặn trong hexan [48, tr. 52].
Để loại bỏ các yếu tố cản trở và tăng hiệu quả của quá trình chiết caroten thì
quá trình chiết phải đƣợc tiến hành nhanh chóng, trong bóng tối, và không tiếp xúc
với oxi ở nhiệt độ cao; thêm các chất chống oxi hóa để tăng cƣờng tính ổn định của
dung môi; thêm MgCO3, CaCO3 để trung hòa lƣợng axit hữu cơ.
Ngoài ra để mô tả và định lƣợng retinol và caroten, ngƣời ta còn sử dụng các
phƣơng pháp nhƣ cộng hƣởng Raman, 1
H – quang phổ cộng hƣởng từ hạt nhân,
điện di mao quản, quang phổ nguyên tử,… [48].
1.5. Giới thiệu về phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao (HPLC)
1.5.1. Vài nét về lịch sử phát triển của phƣơng pháp [8], [19], [40]
HPLC là chữ viết tắt của 4 chữ cái đầu bằng tiếng Anh của phƣơng pháp sắc
ký lỏng hiệu năng cao (High Performance Liquid Chromatography).
Sắc ký là một phƣơng pháp hóa lý đƣợc phát hiện vào đầu thế kỷ XX, một
nhà thực vật học ngƣời Nga Tswet M.S. [40] đã dùng phƣơng pháp này để tách các
chất mang màu ở thực vật. Trong bài báo của ông “Về các phƣơng thức mới của
hiện tƣợng hấp phụ và ứng dụng của nó trong phân tích sinh hóa” (1903), Tswet đã
đƣa ra một mô tả rất chi tiết về hiện tƣợng tách hấp phụ cơ bản dựa trên các hỗn
hợp phức tạp, mà sau này ông gọi là phƣơng pháp sắc ký. Phƣơng pháp sắc ký đã
không đƣợc đánh giá cao trong thời điểm này, cũng nhƣ gần 10 năm sau đó, cho
đến khi Palmer L.S. ở Hoa Kỳ và Dhere C. ở châu Âu đã độc lập công bố một quy
trình tách tƣơng tự.
Năm 1931, Lederer cùng với Kuhn và Winterstein [40] đã tiến hành tinh chế
các xanthophyll bằng cột hấp phụ CaCO3 theo quy trình của Tswett.
Sắc ký đƣợc phát hiện bởi Tswet dƣới dạng sắc ký lỏng – rắn (LSC), trong

35. 31
hơn 50 năm sau đó, nó tiếp tục đƣợc phát triển dƣới hình thức sắc ký khí (GC), sắc
ký lớp mỏng (HPTLC) và sắc ký lỏng – lỏng (LLC).
Giữa những năm 1960, GS. Horvath tại đại học Yale [40] đã sử dụng sắc ký
lỏng giọt thủy tinh với lớp xốp trên bề mặt của chúng để chuyển giao chất giữa pha
lỏng và bề mặt, sau đó, ông đã xây dựng thành công một công cụ cho phép các chất
chảy thành dòng liên tục qua cột. Đây chính là nguồn gốc của phƣơng pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC).
Ban đầu, phƣơng pháp đƣợc thực hiện ở áp suất thƣờng vì chất nhồi cột có
kích thƣớc lớn. Cơ chế tách là sắc ký hấp phụ, sắc ký phân bố nhƣng do tốc độ phát
triển nhanh của phƣơng pháp, các chất nhồi cột khác nhau ngày càng đƣợc cải tiến,
hiệu quả tách của cột ngày càng đƣợc nâng cao.
Hiện nay phƣơng pháp HPLC ngày càng phát triển và hiện đại hoá cao nhờ
sự phát triển nhanh chóng của ngành chế tạo máy phân tích và đƣợc ứng dụng rộng
rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau: kiểm nghiệm, đặc biệt là trong kiểm nghiệm
thuốc và hiện là công cụ đắc lực trong phân tích các thuốc đa thành phần (cho phép
định tính và định lƣợng); nghiên cứu khoa học; môi trƣờng;….
1.5.2. Nguyên tắc của phƣơng pháp HPLC [8], [10], [11], [13]
Nguyên tắc của phƣơng pháp HPLC là quá trình tách các chất ở trạng thái
lỏng dựa trên sự phân bố liên tục các chất lên 2 pha: Một pha đứng yên có khả năng
hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh; một pha di chuyển qua pha tĩnh để mang chất
phân tích ra khỏi cột tách gọi là pha động.
Quá trình tách sắc ký gồm những cân bằng động xảy ra và diễn biến liên tục
trong cột sắc ký giữa pha tĩnh và pha động trong những điều kiện nhất định. Nó là
sự vận chuyển và phân bố lặp đi lặp lại nhiều lần liên tục của các chất tan Xi (hỗn
hợp mẫu phân tích) theo từng lớp qua chất nhồi cột (pha tĩnh) từ đầu cột đến cuối
cột tách. Trong quá trình đó, chất tan Xi luôn luôn đƣợc phân bố lại giữa 2 pha,
trong khi pha động luôn luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định.
Cấu trúc và tính chất của mỗi phân tử chất phân tích là khác nhau, do đó
chúng có ái lực khác nhau với pha tĩnh nên các chất phân tích di chuyển với tốc độ
khác nhau và đƣợc tách ra khỏi nhau.

36. 32
1.5.3. Phân loại và ứng dụng [13], [19]
Dựa vào bản chất của các quá trình sắc ký của pha tĩnh xảy ra trong cột tách
mà ngƣời ta chia thành các loại sau:
+ Sắc ký phân bố của chất tan giữa hai pha không tan vào nhau (PC).
+ Sắc ký hấp thụ pha thƣờng (NP – HPLC).
+ Sắc ký hấp thụ pha ngƣợc hay pha đảo (RP – HPLC).
+ Sắc ký trao đổi ion (IEx – HPLC) và cặp ion (IP – HPLC).
+ Sắc ký rây phân tử (FG – HPLC).
Dựa vào trạng thái của pha tĩnh, ngƣời ta chia thành:
+ Sắc ký lỏng – lỏng (LLC): pha tĩnh và pha động đều là chất lỏng.
+ Sắc ký lỏng – rắn (LSC): pha tĩnh là chất rắn, pha động là chất lỏng.
Phạm vi ứng dụng của phƣơng pháp HPLC rất rộng, nhƣ phân tích hỗn hợp
các chất có tính chất gần tƣơng tự nhau và thuộc loại không phân cực, phân cực yếu
hay trung bình nhƣ các các loại vitamin, các hợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng
sinh, các chất phụ gia thực phẩm,…
1.5.4. Các giai đoạn chạy sắc ký HPLC [8], [10], [13]
1.5.4.1. Giai đoạn tách
Thực hiện phép tách các chất ở trạng thái lỏng trong cột sắc ký dƣới áp suất
cao (200  500 atm). Vì vậy phải chuyển toàn bộ chất phân tích vào trong dung dịch
(thƣờng là hòa tan trong dung môi làm pha động). Phƣơng pháp này thích hợp cho
tách các chất có nhiệt độ sôi cao cũng nhƣ nhiệt độ sôi thấp (trừ những chất là thể
khí ở điều kiện thƣờng).
Dùng thiết bị bơm mẫu để bơm chất phân tích vào đầu cột tách, sau đó chất
phân tích đƣợc hấp phụ trên bề mặt pha tĩnh.
Dùng bơm cao áp để bơm dung môi rửa giải qua cột (có thể là dung môi đơn
hoặc hỗn hợp các dung môi) để rửa giải chất phân tích ra khỏi cột (do lực liên kết
giữa các cấu tử chất phân tích với pha tĩnh khác nhau mà chúng tách ra khỏi nhau).
1.5.4.2. Giai đoạn phát hiện và xử lý kết quả phân tích
Các chất phân tích sau khi tách ra khỏi nhau đƣợc phát hiện nhờ một bộ dò
gọi là detector.

37. 33
Việc ghi nhận và xử ký kết quả đƣợc thực hiện nhờ máy tính chuyên dụng,
kết quả cho một sắc ký đồ trong đó chứa các thông tin cần thiết nhƣ: thời gian lƣu,
diện tích và chiều cao peak, hệ số phân giải, hệ số đối xứng,…
+ Với 1 chất sẽ có 1 thời gian lƣu đặc trƣng cho chất đó nên ta có thể căn cứ
vào tính chất này để phân tích định tính.
+ Độ lớn peak đƣợc đặc trƣng bằng diện tích hay chiều cao, 2 đại lƣợng này
tỉ lệ với nồng độ chất phân tích trong 1 khoảng xác định nào đó, nên đƣợc sử dụng
để định lƣợng chất phân tích.
Hình 1.8. Hệ thống HPLC
1.5.5. Detector trong HPLC [10], [13], [27], [29], [30], [51]
Trong kĩ thuật phân tích HPLC, việc tách các chất xảy ra liên tục trong cột
tách, các chất tan đƣợc nạp vào đầu cột và đi ra khỏi cột tách nhờ pha động. Vì thế
detector là bộ phận theo dõi phát hiện các chất tan trong pha động đi ra từ cột sắc ký
với dòng chảy liên tục. Detector là một bộ phận quan trọng quyết định độ nhạy của
phƣơng pháp, là bộ phận dùng để thu nhận và phát hiện các chất hoặc hợp chất phân
tích dựa theo tính chất hóa học, hóa lý hay tính chất vật lý của chất phân tích.
Có nhiều loại detector khác nhau cho kĩ thuật HPLC nhƣ detector phổ hấp
thụ quang phân tử UV – Vis, detector mảng diot phát quang (PDA), detector huỳnh
quang (RF), detector phổ khối phân tử (MMS),...
 Detector huỳnh quang
Detector huỳnh quang có ƣu điểm là độ nhạy cao vì bức xạ phát ra đƣợc đo
đối với nền tối, nhƣng đƣợc sử dụng ít hơn detector UV – Vis vì chất phát huỳnh
quang không nhiều.
Độ chọn lọc của việc phát hiện dựa trên tính chất huỳnh quang đƣợc đặt ra

38. 34
do phải dùng đến hai bƣớc sóng trong quá trình đo: Bƣớc sóng kích thích và bƣớc
sóng phát xạ và đặc biệt là các hợp chất phải có cấu trúc nhất định để có khả năng
phát huỳnh quang.
Detector này đƣợc sử dụng cho các chất có khả năng phát huỳnh quang bao
gồm các chất tự bản thân chúng phát huỳnh quang và sản phẩm của chất phân tích
với thuốc thử có khả năng phát huỳnh quang.
Nguyên tắc của phép đo huỳnh quang là chiếu một chùm tia sáng kích thích
có bƣớc sóng xác định phù hợp vào cuvet chứa chất phân tích để chất phân tích phát
ra chùm tia phát xạ huỳnh quang của nó. Sau đó nhờ hệ quang học thu, phân ly, tách
lấy tia phát xạ huỳnh quang thích hợp cần đo hƣớng vào nhân quang điện để đo
chúng, khuếch đại và chỉ thị chúng.
Để tăng độ nhạy, đồng thời retinol có tính huỳnh quang tốt tại bƣớc sóng
kích thích từ 325 – 350 nm và phát xạ tại 470 – 490 nm, đồng thời nghiên cứu các
tài liệu [27], [29], [30], [51], chúng tôi quyết định chọn detector huỳnh quang và
bƣớc sóng 348/470 nm để khảo sát các yếu tố khác trong luận văn nghiên cứu hàm
lƣợng vitamin A trong trứng gia cầm.
Hình 1.9. Detector huỳnh quang với hai bộ đơn sắc cách tử
1.5.6. Phƣơng pháp định lƣợng trong HPLC
1.5.6.1. Diện tích và chiều cao peak [8], [11]
Diện tích peak của một chất phân tích là đại lƣợng tỉ lệ thuận với nồng độ
của chất đó. Để tính diện tích peak, ngƣời ta thƣờng dùng tích phân kế hoặc dùng
máy tính đã cài sẵn chƣơng trình. Việc tính toán diện tích peak sẽ gặp khó khăn khi
Hệ phát xạ
Hệ kích thích

39. 35
peak quá lớn, bị doãn hoặc không đối xứng.
Khi peak có dạng không đổi, thì chiều cao peak (khoảng cách từ đƣờng nền
đến đỉnh peak) là một đại lƣợng tỉ lệ thuận với diện tích peak, do đó, tỉ lệ thuận với
nồng độ chất phân tích. Khi xác định chiều cao peak (bằng máy tính) thì không cần
xét đến hệ số đối xứng.
1.5.6.2. Định lượng [11], [13]
Trong phân tích sắc ký, thƣờng dùng các phƣơng pháp định lƣợng sau:
 Phƣơng pháp ngoại chuẩn (phƣơng pháp đƣờng chuẩn): tiến hành
xây dựng phƣơng trình đƣờng chuẩn (bằng phƣơng pháp hồi quy tuyến tính) biểu
diễn sự phụ thuộc tuyến tính giữa diện tích (hoặc chiều cao) peak vào nồng độ các
dung dịch chuẩn của chất phân tích có dạng A = a + b.C. Sau đó, từ diện tích (hoặc
chiều cao) peak của chất phân tích trong mẫu, xác định nồng độ chất phân tích trong
mẫu từ phƣơng trình đƣờng chuẩn.
A a
C
b


 Phƣơng pháp thêm chuẩn:
 Thêm chuẩn đường chuẩn: phƣơng pháp này thƣờng sử dụng khi có
ảnh hƣởng của các chất trong môi trƣờng mẫu (matrix). Chuẩn bị 1 dãy dung dịch
phân tích trong những điều kiện hoàn toàn nhƣ nhau. Thêm vào dãy dung dịch trên
những lƣợng chất chuẩn chính xác khác nhau. Tiến hành chạy sắc kí và xây dựng
phƣơng trình hồi quy tuyến tính biểu diễn sự phụ thuộc giữa diện tích peak và nồng
độ dung dịch chuẩn chất phân tích thêm vào mẫu (Cthêm). Phƣơng trình có dạng A =
a + b.Cthêm và từ đó tính đƣợc nồng độ chất phân tích trong mẫu (C):
a
C
b

Trong đó: a là đoạn cắt trên trục tung của đƣờng hồi quy tuyến tính.
b là hệ số góc của đƣờng hồi quy tuyến tính.
 Thêm chuẩn một điểm: trong các điều kiện phù hợp đã chọn, vùng
tuyến tính của phép đo HPLC với một chất là một vùng xác định, nên trong nhiều
trƣờng hợp không nhất thiết phải dựng cả đƣờng chuẩn vì mẫu chuẩn rất đắt. Tiến

40. 36
hành chạy 2 phép sắc ký:
- Thứ nhất là phép sắc ký của dung dịch mẫu: Sx = k.Cx
- Thứ hai là phép sắc ký của dung dịch mẫu sau khi đƣợc thêm một lƣợng
chính xác chất chuẩn phân tích: Sx,T = k.(Cx +CT)
Từ đó ta rút ra đƣợc Cx là nồng độ chất phân tích:
x T
x
x,T x
S .C
C
S S


 Phƣơng pháp nội chuẩn: trong mẫu, các chất phân tích có thể bị ảnh
hƣởng bởi nhiều yếu tố nhƣ: nền, các điều kiện khác gây sai số hệ thống. Để loại trừ
ảnh hƣởng này ngƣời ta thêm vào mẫu chất nội chuẩn có tính chất gần giống tính
chất của chất phân tích, có nồng độ cũng gần bằng nồng độ của chất phân tích (CX),
có thời gian lƣu gần thời gian lƣu của chất phân tích, đỉnh peak tách khỏi đỉnh peak
của chất phân tích ở cùng điều kiện sắc ký. Tiến hành 3 phép đo sắc ký:
- Thứ nhất là phép sắc ký của chất chuẩn nội (Ci, Hi).
- Thứ hai là phép sắc ký cho chất chuẩn (CC, CC), từ đó rút ra đƣợc hệ số
ảnh hƣởng FX – là đại lƣợng đƣa vào để loại trừ ảnh hƣởng của nền cũng nhƣ
các điều kiện đo khác.
- Phép thứ ba là phép sắc ký của chất phân tích chƣa biết (CX, HX).
C C ii
X X
C i C i
C C .HC
: F F
H H H .C
  
CX i i
X X X X X X
X C i i
CC C C
C .H .F hay C .S .F
H H H S
   

41. 37
CHƢƠNG 2. NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Nội dung nghiên cứu
Để tiến hành phân tích hàm lƣợng vitamin A trong một số loại trứng gia cầm
bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) dùng detector RF, trong luận
văn này chúng tôi nghiên cứu những nội dung cụ thể sau:
1) Lựa chọn các điều kiện tiến hành sắc ký thích hợp để phân tích hàm lƣợng
vitamin A bằng phƣơng pháp HPLC dùng detector RF.
- Khảo sát ảnh hƣởng của pha động.
- Khảo sát tốc độ dòng pha động.
2) Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích
- Khảo sát độ ổn định của hệ thống HPLC.
- Khảo sát tính đặc hiệu.
- Khoảng tuyến tính.
- Giới hạn phát hiện, giới hạn định lƣợng.
- Độ lặp lại của phƣơng pháp.
- Độ đúng của phƣơng pháp.
3) Xây dựng quy trình phân tích và áp dụng vào thực tế.
- Quy trình xử lý mẫu.
- Áp dụng quy trình đã xây dựng để định lƣợng vitamin A trong một số loại
trứng gia cầm trên địa bàn Thừa Thiên Huế.
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Lấy mẫu, bảo quản và chuẩn bị mẫu
Các mẫu trứng đƣợc lấy ngẫu nhiên tại các trang trại ở huyện Quảng Điền
và thị xã Hƣơng Thủy thuộc tỉnh Thừa Thiên Huế (mỗi loại lấy 6 quả, riêng trứng
cút lấy 25 quả). Tất cả trứng đƣợc lấy ở trạng thái còn tƣơi, không bị vữa, có kích
thƣớc gần nhƣ đồng đều, đƣợc đóng gói trong túi kín. Sau khi đƣa mẫu về phòng thí
nghiệm, mẫu đƣợc bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ khoảng 20
C đến khi phân tích.
Thực hiện trộn đều giữa lòng trắng và lòng đỏ trứng của cùng một loại mẫu
(khoảng 100g) trƣớc khi đem cân.

42. 38
2.2.2. Chọn kỹ thuật xử lý mẫu
Thực tế, vitamin A là chất dễ bị oxi hóa dƣới tác động của một số yếu tố, vì
vậy, muốn phân tích chính xác đòi hỏi phải có quy trình xử lý mẫu thích hợp để
không bị mất chất phân tích do quá trình oxi hóa của vitamin A cũng nhƣ một số
quá trình khác.
Mẫu đƣợc xà phòng hóa, sau đó trung hòa để chuyển dạng retinyl este thành
retinol. Trong quy trình xử lý mẫu phân tích vitamin A, giai đoạn chiết tách, xà
phòng hóa rất quan trọng. Quá trình chiết và xà phòng hóa đƣợc tiến hành theo tài
liệu của AOAC [25].
2.2.3. Khảo sát các điều kiện phân tích HPLC
Dựa vào tài liệu nghiên cứu [8], [27], [29], [30], [31], [51], chúng tôi tiến
hành khảo sát mẫu chuẩn trên máy HPLC với cột C18, nhiệt độ phòng, thể tích tiêm
20µL, detector huỳnh quang (RF) ở bƣớc sóng kích thích huỳnh quang 348 nm và
phát xạ tại 470 nm.
2.2.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của pha động
Hệ pha động có thể sử dụng là hỗn hợp dung môi phân cực, pha động chính
là cơ sở để khảo sát tốc độ dòng. Tiến hành khảo sát lựa chọn tỉ lệ dung môi pha
động thích hợp.
2.2.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ dòng
Dựa trên pha động và tỉ lệ đã đƣợc chọn, khảo sát các tốc độ dòng từ 0,5
mL/phút đến 1,3 mL/phút, nhằm xác định tốc độ dòng tốt nhất cho phép phân tích
vitamin A.
2.2.4. Đánh giá độ tin cậy của phƣơng pháp phân tích
2.2.4.1. Khảo sát độ ổn định của hệ thống HPLC [8], [11], [20]
Với mục đích kiểm tra hệ thống thiết bị và hóa chất phải đạt chuẩn tinh khiết
trƣớc khi sử dụng. Tiến hành tiêm lặp lại với dung dịch chuẩn phân tích vitamin A
vào hệ thống sắc ký ở điều kiện đã khảo sát. Ghi diện tích peak, thời gian lƣu và số
đĩa lý thuyết.
Độ ổn định của hệ thống sắc ký đƣợc biểu thị bằng sai số tƣơng đối RSD%,
yêu cầu đặt ra là RSD ≤ 2%, thời gian lƣu không quá dài, số đĩa lý thuyết N > 2000.

43. 39
2.2.4.2. Tính đặc hiệu [20]
Tính đặc hiệu là khả năng phát hiện đƣợc chất phân tích khi có mặt các tạp
chất khác nhƣ các tiền chất, các chất chuyển hóa, các chất tƣơng tự, tạp chất....
Trong phép phân tích định tính: phải chứng minh đƣợc kết quả là dƣơng tính
khi có mặt chất phân tích, âm tính khi không có mặt nó, đồng thời kết quả phải là
âm tính khi có mặt các chất khác có cấu trúc gần giống chất phân tích. Trong phép
phân tích định lƣợng, là khả năng xác định chính xác chất phân tích trong mẫu khi
bị ảnh hƣởng của tất cả các yếu tố khác, nhằm hƣớng đến kết quả chính xác.
Tính đặc hiệu của phƣơng pháp sắc ký lỏng thƣờng đƣợc tiến hành thông qua
hai phép thử sau:
- Thứ nhất, phân tích mẫu trắng: kết quả thu đƣợc là không cho tín hiệu phân
tích. Nếu mẫu trắng xuất hiện tín hiệu thì cần phải thay đổi phƣơng pháp để loại trừ
các ảnh hƣởng.
- Thứ hai, phân tích mẫu trắng thêm chuẩn: kết quả phải cho tín hiệu đối với
chất phân tích.
Tuy phƣơng pháp HPLC là phƣơng pháp chuẩn để xác định vitamin A,
nhƣng trong luận văn này chúng tôi vẫn quyết định khảo sát tính đặc hiệu do một
số nguyên nhân nhƣ: nền mẫu, mẫu phân tích tại phòng thí nghiệm khác với nền
mẫu, mẫu nêu trong phƣơng pháp chuẩn, có sự khác nhau về thiết bị phân tích làm
ảnh hƣởng đến tính đặc hiệu,…
2.2.4.3. Khoảng tuyến tính [8], [12], [20], [43]
Đối với hầu hết các phƣơng pháp định lƣợng, cần phải thực hiện việc xác
định khoảng tuyến tính. Việc xác định khoảng tuyến tính thƣờng đƣợc khảo sát bắt
đầu từ giới hạn định lƣợng (điểm thấp nhất) và kết thúc là giới hạn tuyến tính (điểm
cao nhất). Nói chung, để xác định khoảng tuyến tính cần khoảng 10 (tối thiểu là 6)
nồng độ khác nhau. Để xác định khoảng tuyến tính cần thực hiện đo các dung dịch
chuẩn có nồng độ thay đổi và khảo sát sự phụ thuộc của tín hiệu vào nồng độ. Vẽ
đƣờng cong phụ thuộc giữa tín hiệu đo và nồng độ, sau đó quan sát sự phụ thuộc
cho đến khi không còn tuyến tính. Khoảng tuyến tính dài hay ngắn phụ thuộc vào
nhiều yếu tố, trong đó quan trọng nhất là bản chất của chất phân tích và kỹ thuật sử

44. 40
dụng. Sau khi xác định khoảng tuyến tính cần xây dựng đƣờng chuẩn và xác định
hệ số hồi quy tƣơng quan. Trong phân tích thực tế, có thể xây dựng các đƣờng
chuẩn ngắn, bao trùm lên vùng nồng độ trong mẫu, không nhất thiết phải lập đƣờng
chuẩn toàn bộ khoảng tuyến tính. Nồng độ trong mẫu không đƣợc vƣợt ra ngoài
giới hạn cao nhất và thấp nhất của đƣờng chuẩn và tốt nhất phải nằm ở vùng giữa
đƣờng chuẩn. Có nhiều loại đƣờng chuẩn khác nhau tùy thuộc vào các phƣơng pháp
và kỹ thuật khác nhau.
Khi phân tích hàm lƣợng vitamin A bằng phƣơng pháp HPLC, thì khoảng
tuyến tính đƣợc khảo sát bằng phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn biễu diễn sự
phụ thuộc diện tích peak thu đƣợc theo dãy nồng độ của vitamin A. Trong luận văn
này, để phù hợp với khoảng nồng độ của mẫu trong thực tế, chúng tôi xây dựng
đƣờng chuẩn 6 điểm với khoảng nồng độ từ 0,05 – 10,00 ppm.
Mức độ tƣơng quan tuyến tính giữa tín hiệu đo và nồng độ chất phân tích
trên đƣờng chuẩn dạng y = a + bx đƣợc đánh giá thông qua hệ số tƣơng quan R. Hệ
số tƣơng quan R đƣợc tính theo biểu thức sau:
i j i i
2 2 2 2
i i i i
n( x y ) - x y
R = (2.1)
[n x - ( x ) ].[n y - ( y ) ]
  
   
Trong đó: y là diện tích peak.
x là nồng độ chất phân tích.
Biểu thức (2.1) chỉ ra đƣợc giá trị R nằm trong khoảng từ -1 đến +1. Nhƣ vậy
nếu phƣơng trình đƣờng chuẩn (hoặc đƣờng thêm chuẩn) có tƣơng quang tuyến tính
tốt thì giá trị R sẽ xấp xỉ  1 và nếu R  0 thì giữa chúng không có mối tƣơng quan
tuyến tính.
2.2.4.4. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng [20], [43]
Giới hạn phát hiện (LOD – Limit of detection) là nồng độ nhỏ nhất của chất
phân tích có thể xác định tin cậy bằng một phƣơng pháp nào đó.
LOD thƣờng đƣợc xác định theo “quy tắc 3σ” nhƣ sau:
y = yB + 3B (2.2)
Hay y = yB + 3SB
Trong đó: y là LOD hoặc tín hiệu ứng với LOD.

45. 41
yB là tín hiệu đo mẫu trắng.
B (hay SB) là độ lệch chuẩn của tín hiệu đo mẫu trắng.
Biết tín hiệu y sẽ tính đƣợc LOD từ phƣơng trình đƣờng hồi quy tuyến tính:
y = a + b.x 
(y a)
LOD x
b

  (2.3)
yB và SB đƣợc xác định nhƣ sau: Tiến hành thí nghiệm để thiết lập phƣơng
trình đƣờng chuẩn y = a + bx. Từ đó xác định yB và SB bằng cách chấp nhận yB (tín
hiệu mẫu trắng) là giá trị của y khi x = 0  yB = a (đoạn cắt trên trục tung của
đƣờng chuẩn hồi quy tuyến tính) và SB = Sy (độ lệch chuẩn của tín hiệu y trên
đƣờng chuẩn):
n
2
i i
i 1
B y
(y Y )
S S (2.4)
n 2


 


Ở đây: yi là giá trị thực nghiệm của y
Yi là các giá trị tính từ phƣơng trình đƣờng chuẩn của y.
Sau đó, tính tín hiệu ứng với LOD theo (2.2):
y = yB + 3SB = a + 3Sy (2.5)
Thay y ở (2.5) vào (2.3), ta sẽ đƣợc công thức tính LOD:
y3S
LOD (2.6)
b

Trong đó: b là độ dốc của đƣờng hồi quy tuyến tính và b cũng chính là độ
nhạy của phƣơng pháp (b =
Δy
ΔC
).
Khi xác định LOD thông thƣờng ngƣời ta xây dựng đƣờng hồi quy tuyến tính
sao cho càng gần gốc tọa độ càng tốt hay trong khoảng hẹp của nồng độ các chất ở
gần gốc tọa độ.
Giới hạn định lƣợng (LOQ – Limit of quantitation) là tín hiệu hay nồng độ
thấp nhất trên một đƣờng chuẩn tin cậy và ngƣời ta thƣờng chấp nhận:
yS
LOQ (9 12) hay LOQ (3 4)LOD
b
    (2.7)

46. 42
2.2.4.5. Độ lặp lại [20], [36], [43]
Độ lặp lại đƣợc xác định thông qua độ lệch chuẩn tƣơng đối (RSD):
tb
S
RSD (%) .100 (2.8)
x

Trong đó: S: Độ lệch chuẩn của kết quả phân tích
xtb: Giá trị trung bình
Khi phân tích một nồng độ xác định (C), có thể ƣớc lƣợng sai số phân tích ở
nồng độ đó có chấp nhận đƣợc hay không, bằng cách dựa vào phƣơng trình
Horwitz:
RSDHorwitz (%) = 21-0,5logC
(2.9)
Trong đó: RSDHorwitz là độ lệch chuẩn tƣơng đối khi phân tích nồng độ đó ở
các phòng thí nghiệm khác nhau (dùng bất kì phƣơng pháp phân tích nào).
C là nồng độ phân tích đƣợc biểu diễn dƣới dạng phân số.
Theo Horwitz, khi phân tích nồng độ chất nào đó trong nội bộ phòng thí
nghiệm nếu độ lặp lại RSDPTN ≤ ½.RSDHorwitz là đạt yêu cầu.
2.2.4.6. Độ đúng [8], [20], [36]
Độ đúng của phƣơng pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị
trung bình của kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị đƣợc chấp nhận là
đúng. Đối với đa số mẫu phân tích, giá trị thực không thể biết một cách chính xác,
tuy nhiên nó có thể có một giá trị quy chiếu đƣợc chấp nhận là đúng (gọi chung là
giá trị đúng).
Để đánh giá độ đúng (accuracy) của phƣơng pháp phân tích bất kỳ, ngƣời ta
có thể tiến hành 1 trong 3 hoặc cả 3 cách sau:
 Phân tích mẫu chuẩn CRMs (Certified Refference Materials).
 Thông qua độ thu hồi bằng cách thêm chất phân tích vào mẫu đƣợc tính
theo công thức sau:
2 1
0
C C
Rev (%) 100 (2.10)
C


Trong đó: C0 là nồng độ chất chuẩn thêm vào mẫu.
C1 là nồng độ chất phân tích trong mẫu.

47. 43
C2 là nồng độ chất phân tích trong mẫu đã đƣợc thêm chuẩn.
Giá trị Rev đƣợc AOAC, IUPAC chấp nhận rằng:
- Khi nồng độ C cỡ ppm – 10 ppb, Rev = 80 – 110% là chấp nhận đƣợc.
- Khi nồng độ C cỡ 1 – 10 ppb, Rev = 60 – 120% là chấp nhận đƣợc.
Một cách gần đúng, khi Horwitz
1
100-Rev .RSD
2
 là chấp nhận đƣợc.
 Phân tích bằng phƣơng pháp chuẩn khác hoặc phƣơng pháp có hiệu lực
để so sánh kết quả đo đƣợc với kết quả đo của phƣơng pháp nghiên cứu.
Trong luận văn này, do không có mẫu chuẩn CRMs nên độ đúng của phƣơng
pháp đƣợc xác định bằng cách phân tích mẫu thêm chuẩn ở các nồng độ 0,4 ppm,
0,5 ppm, 0,6 ppm rồi tính độ thu hồi (Rev).
2.2.5. Áp dụng phƣơng pháp để định lƣợng vitamin A trong một số mẫu trứng
gia cầm trên địa bàn Thừa Thiên Huế
Khảo sát hàm lƣợng vitamin A trong 10 mẫu trứng gia cầm của 3 loại: trứng
gà, trứng vịt và trứng cút ở Quảng Điền, Hƣơng Thủy, tỉnh Thừa Thiên Huế mỗi
loại khảo sát 3 lần, lấy kết quả trung bình.
Hàm lƣợng vitamin A trong mẫu trứng gia cầm đƣợc tính theo công thức:
(S a) DPL
C ( g/100g) = . .100 (2.11)
b m


Trong đó: C là hàm lƣợng chất phân tích trong mẫu (µg/100g).
S là diện tích của peak.
a, b là các hệ số trong phƣơng trình hồi quy tuyến tính.
DPL là độ pha loãng dung dịch.
m là khối lƣợng mẫu tƣơi (g).
Sau khi tiến hành phân tích hàm lƣợng vitamin A trong mẫu thực tế, tiến
hành xử lý kết quả để đánh giá:
- Hàm lƣợng vitamin A có nhiều nhất trong loại trứng nào.
- Quy mô nuôi và địa bàn lấy mẫu có ảnh hƣởng nhƣ thế nào đến kết quả
phân tích.
Chúng tôi sử dụng biểu đồ và ANOVA một yếu tố để đánh giá 2 yếu tố trên.
 ANOVA một yếu tố: để thực hiện phƣơng pháp ANOVA một yếu tố,

48. 44
cần tiến hành thí nghiệm theo một kế hoạch xác định, rồi xử lý số liệu thí nghiệm.
Bảng 2.1. Ma trận thực nghiệm để phân tích ANOVA một yếu tố
Số thí
nghiệm
Các mức của yếu tố khảo sát
1 2 … i … k
1 x11 x21 … xi1 … xk1
2 x22 x22 … xi2 … xk2
… … … … … … …
j x1j x2j … xij … xkj
… … … … … … …
n x1n x2n … xin … xkn
Mỗi kết quả thí nghiệm đều chịu tác động của hai nguồn sai số (hay hai
nguồn phƣơng sai): sai số do các mức khác nhau của yếu tố khảo sát gây ra ( 2
AS ) và
sai số do bản thân phƣơng pháp phân tích gây ra ( 2
TNS ).
Giả thiết thống kê H0 là: Hai phƣơng sai 2
AS và 2
TNS không khác nhau ( 2
AS 
2
TNS ) hay các giá trị trung bình không khác nhau.
Tính toán theo ANOVA một yếu tố: để tính đƣợc phƣơng sai 2
AS và 2
TNS cần
lập bảng phân tích phƣơng sai nhƣ sau:
Bảng 2.2. Bảng phân tích phương sai theo ANOVA một yếu tố
Nguồn
phƣơng sai
Tổng
bình phƣơng
Bậc tự do
(f)
Phƣơng sai
(S2
)
Giữa các mức của
yếu tố khảo sát
2
i
i
n (x x) Af k 1 
2
i
2 i
A
n (x x)
S
k 1




Sai số thí nghiệm
2
ij j
i j
(x x ) TNf k(n 1) 
2
ij j
i j2
TN
(x x )
S
k(n 1)




Tổng cộng
2
ij
i j
(x x) f kn 1  
2
ij
i j2
(x x)
S
nk 1






49. 45
Sử dụng F – test để kiểm tra giả thiết H0.
2
A
tính 2
TN
S
F (2.12)
S

So sánh Ftính với F (p = 0,95, fA = k -1, fTN = k(n – 1)) với n là số lần đo đối
với một mẫu, k là số yếu tố khảo sát.
- Nếu Ftính < F (p = 0,95, fA = k -1, fTN = k(n – 1)): thì chấp nhận giả thiết H0,
tức là các giá trị trung bình là nhƣ nhau hay yếu tố khảo sát không ảnh hƣởng đến
kết quả (p > 0,05).
- Nếu Ftính > F (p = 0,05, fA = k -1, fTN = k(n – 1)): thì loại bỏ giả thiết H0, tức
là các giá trị trung bình khác nhau hay yếu tố khảo sát ảnh hƣởng đến kết quả phân
tích (p < 0,05).
2.2.6. Phƣơng pháp xử lý số liệu thực nghiệm
Các số liệu thực nghiệm đều đƣợc xử lý thống kê bằng toán học. Tính toán
và xử lí số liệu trên phần mềm Excel 2010, các đồ thị đƣợc biểu diễn trên phần
mềm Origin 8.5.
2.3. Kỹ thuật thực nghiệm
2.3.1. Hóa chất
Tất cả hóa chất đều là loại tinh khiết phân tích.
- Chất chuẩn Retinyl panmitat của Viện Kiểm nghiệm Hà Nội.
- Etanol 95%, Merck (Đức).
- 2 – propanol, Merck (Đức).
- Axit ascorbic, Merck (Đức).
- Axit axetic, Merck (Đức).
- Tetrahyđrofuran (THF), Merck (Đức).
- Metanol, Merck (Đức).
- n – hexan, Merck (Đức).
- THF – etanol (50:50, v/v): Kết hợp 500 mL tetrahyđrofuran và 500 mL
etanol 95%, lắc đều.
- Dung dịch kali hyđroxit 50% (KOH 50%): Cân 500 g KOH dạng viên.
Thêm từ từ lƣợng KOH này vào 500 mL nƣớc chứa trong bình nhựa có dung tích 1

50. 46
L, trộn và làm nguội dung dịch.
- Nƣớc cất 2 lần đã đƣợc loại bỏ ion.
2.3.2. Thiết bị và dụng cụ
Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Series 20A của hãng Shimadzu, Nhật Bản: 4
kênh dung môi, bơm mẫu tự động, có buồng gia nhiệt cột, detector RF.
Cột sắc ký pha đảo C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 μm) của hãng GL Sciences
Inc, Nhật Bản.
Cân phân tích AUW220D (± 0,1 mg) của hãng Shimadzu, Nhật Bản.
Thiết bị lọc nƣớc siêu sạch của hãng Barnstead International, USA.
Bộ dụng cụ đun hồi lƣu có gắn ống sinh hàn, bếp điện, nồi cách thủy có thể
duy trì nhiệt độ đến 400
C.
Các dụng cụ thủy tinh nhƣ: Bình định mức các loại của hãng ISO LAB Đức,
pipet vạch và pipet bầu các loại của hãng Herka Intercolor Đức, cốc, bình tam giác
các loại của hãng Bomex...
Micropipet: 10 μL; 100 μL; 500 μL,… của hãng Hirschmann, Đức
Màng lọc 0,45 μm của hãng Sartoríu Stedim, Đức.
Phễu lọc, giấy lọc, ống đong.