Tugas mata kuliah Teknik Penelitian Biokimia membahas metode ELISA sandwich dan indirect untuk mengukur hemoglobin A2 dan mengidentifikasi pembawa beta talasemia. Metode tersebut melibatkan imobilisasi antigen di plate, inkubasi dengan antibodi primer dan sekunder terkonjugasi enzim, penambahan substrat, dan deteksi sinyal warna."
Penentuan Konsentrasi Kritis Misel (CMC) Surfaktan bertujuan untuk mengukur nilai konsentrasi misel kritis (CMC) pada berbagai surfaktan. Prinsip dari tegangan permukaan adalah energi tarik menarik antar partikel, sedangkan prinsip dari turbiditas adalah penghamburan cahaya oleh molekul koloid. Metode yang digunakan adalah pengukuran tegangan permukaan dengan metode pipa kapiler dan turbiditas dengan turbidimetri. Hasil yang diperoleh adalah nilai turbiditas surfaktan akan berbanding lurus dengan konsentrasinya, dan nilai tegangan permukaan akan berbanding terbalik dengan konsentrasinya.
Titrasi nitrimetri menggunakan NaNO2 sebagai titran untuk menitrasi zat yang mengandung gugus amina aromatis atau dapat dihidrolisis menjadi amina aromatis. NaNO2 akan membentuk asam nitrit yang bereaksi dengan sampel membentuk garam diazonium. Titik akhir dapat ditentukan secara visual menggunakan indikator dalam atau luar, atau secara elektrometri menggunakan elektroda. Katalis seperti
Dokumen tersebut membahas tentang penetapan potensi antibiotik secara mikrobiologi. Metode yang digunakan adalah metode lempeng silinder dan turbidimetri untuk menentukan kadar hambatan minimum (KHM) antibiotik terhadap mikroba patogen. Dokumen ini juga menjelaskan prosedur pengujian potensi antibiotik secara mikrobiologi mulai dari persiapan bahan sampai perhitungan hasil.
Kromatografi peertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani Rusia Michael Tswett pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas yang berisi kalsium karbonat (CaCO3). (Gandjar, 2007)
Kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umumdan paling sering digunakan dalam bidang kimia analisis karena dapat dimanfaatkan untuk melakukan analisis baik secara kuantitatif, kualitatif atau preparatif dalam bidang farmasi, lingkungan, industri dan sebagainya. (Gandjar, 2007)
Penentuan Konsentrasi Kritis Misel (CMC) Surfaktan bertujuan untuk mengukur nilai konsentrasi misel kritis (CMC) pada berbagai surfaktan. Prinsip dari tegangan permukaan adalah energi tarik menarik antar partikel, sedangkan prinsip dari turbiditas adalah penghamburan cahaya oleh molekul koloid. Metode yang digunakan adalah pengukuran tegangan permukaan dengan metode pipa kapiler dan turbiditas dengan turbidimetri. Hasil yang diperoleh adalah nilai turbiditas surfaktan akan berbanding lurus dengan konsentrasinya, dan nilai tegangan permukaan akan berbanding terbalik dengan konsentrasinya.
Titrasi nitrimetri menggunakan NaNO2 sebagai titran untuk menitrasi zat yang mengandung gugus amina aromatis atau dapat dihidrolisis menjadi amina aromatis. NaNO2 akan membentuk asam nitrit yang bereaksi dengan sampel membentuk garam diazonium. Titik akhir dapat ditentukan secara visual menggunakan indikator dalam atau luar, atau secara elektrometri menggunakan elektroda. Katalis seperti
Dokumen tersebut membahas tentang penetapan potensi antibiotik secara mikrobiologi. Metode yang digunakan adalah metode lempeng silinder dan turbidimetri untuk menentukan kadar hambatan minimum (KHM) antibiotik terhadap mikroba patogen. Dokumen ini juga menjelaskan prosedur pengujian potensi antibiotik secara mikrobiologi mulai dari persiapan bahan sampai perhitungan hasil.
Kromatografi peertama kali dikembangkan oleh seorang ahli botani Rusia Michael Tswett pada tahun 1903 untuk memisahkan pigmen berwarna dalam tanaman dengan cara perkolasi ekstrak petroleum eter dalam kolom gelas yang berisi kalsium karbonat (CaCO3). (Gandjar, 2007)
Kromatografi merupakan teknik pemisahan yang paling umumdan paling sering digunakan dalam bidang kimia analisis karena dapat dimanfaatkan untuk melakukan analisis baik secara kuantitatif, kualitatif atau preparatif dalam bidang farmasi, lingkungan, industri dan sebagainya. (Gandjar, 2007)
Dokumen tersebut membahas tentang pengertian antibodi, struktur, fungsi, jenis-jenis, dan variabilitas antibodi. Juga disebutkan beberapa penyakit yang terkait dengan antibodi seperti diabetes melitus tipe 1, rheumatoid arthritis, psoriasis, graves disease, dan lupus.
Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui onset kerja strychnine pada tikus melalui berbagai jalur pemberian, yaitu oral, subkutan, dan intraperitoneal. Strychnine diberikan pada tikus dengan dosis 10 mg/kg dan diukur waktu onset konvulsi dan kematian. Hasilnya menunjukkan onset konvulsi dan kematian tercepat melalui jalur intraperitoneal, diikuti subkutan, sedangkan paling lambat melalui oral.
BIOFARMASI SEDIAAN YANG DIBERIKAN MELALUI KULITSurya Amal
Transdermal drug delivery system includes all topically administered drug formulations intended to deliver the active ingredients into the circulation. They provide controlled continuous delivery of drugs through the skin to the systemic circulation. The drug is mainly delivered through the skin with the aid of transdermal patch.
Makalah analisa farmasi kuantitatif spektro uv vis dan fluorometri FARMASI UNSRIElvarinna Permata
Makalah ini membahas tentang spektrofotometri UV dan flouresensi. Dibahas mengenai faktor-faktor yang mempengaruhi serapan dalam spektrofotometri UV-VIS, pengaruh polaritas pelarut, dan metode kurva kalibrasi dan satu titik dalam analisis kuantitatif menggunakan spektrofotometri."
Dokumen tersebut merangkum pengertian spektrofotometer Fourier transform infra merah (FTIR), prinsip kerjanya yang memanfaatkan interferometer Michelson, dan aplikasinya untuk mengidentifikasi jenis narkoba melalui deteksi gugus fungsionalnya.
Laporan praktikum musrin salila pps UnnesMusrin Salila
Dokumen tersebut membahas tentang penggunaan spektrofotometer UV-Vis untuk menentukan kadar parasetamol dalam sediaan obat. Prinsip kerja spektrofotometer UV-Vis dan teori terkait spektroskopi serta struktur kimia parasetamol dijelaskan sebagai dasar untuk menganalisis kadar parasetamol.
Dokumen tersebut membahas tentang pedoman penerapan kajian farmakoekonomi di Indonesia. Kajian farmakoekonomi dipandang penting untuk mengendalikan biaya pelayanan kesehatan secara efektif dan efisien sejalan dengan upaya pencapaian target MDGs dan reformasi sistem kesehatan nasional. Pedoman ini bertujuan memberikan panduan praktis bagi pengambil keputusan kesehatan dalam mengadopsi prinsip-prinsip farmakoekonomi untuk mend
Laporan praktikum mengenai absorpsi dan ekskresi obat melalui saliva dan urin. Mahasiswa melakukan uji klinik dengan memberikan kapsul KI kepada probandus dan mengukur kadar KI dalam saliva dan urin setiap 15 menit selama 90 menit. Hasil menunjukkan puncak kadar KI tereliminasi melalui saliva dan urin terjadi pada menit ke-75.
Tugas ini membahas obat golongan makrolida. Makrolida adalah antibiotik yang bekerja dengan menghambat sintesis protein bakteri dengan mengikat subunit 50S ribosom. Obat utama golongan ini adalah eritromisin, klaritromisin, dan azitromisin. Eritromisin dan klaritromisin memiliki mekanisme kerja yang sama yaitu menghambat sintesis protein bakteri, namun klaritromisin memiliki waktu paruh yang lebih panjang.
The poem is about Mr. Nobody, an invisible man who is blamed for all the little mishaps and mistakes around the house. In three stanzas, the narrator lists various annoyances like broken plates, torn books, muddy footprints and spilled ink that are actually caused by Mr. Nobody. While no one ever sees his face, everyone agrees he is responsible for the messes and problems attributed to him.
Sergio Dalma is a famous Spanish singer born in 1964 in Catalonia, Spain. He is known for his great songs and unique style. While he keeps his private life closed, he is described as polite, cheerful when singing, and warm towards his fans. He has been singing since the 1990s and maintains a classic vocal style while presenting a modern appearance.
Dokumen tersebut membahas tentang pengertian antibodi, struktur, fungsi, jenis-jenis, dan variabilitas antibodi. Juga disebutkan beberapa penyakit yang terkait dengan antibodi seperti diabetes melitus tipe 1, rheumatoid arthritis, psoriasis, graves disease, dan lupus.
Praktikum ini bertujuan untuk mengetahui onset kerja strychnine pada tikus melalui berbagai jalur pemberian, yaitu oral, subkutan, dan intraperitoneal. Strychnine diberikan pada tikus dengan dosis 10 mg/kg dan diukur waktu onset konvulsi dan kematian. Hasilnya menunjukkan onset konvulsi dan kematian tercepat melalui jalur intraperitoneal, diikuti subkutan, sedangkan paling lambat melalui oral.
BIOFARMASI SEDIAAN YANG DIBERIKAN MELALUI KULITSurya Amal
Transdermal drug delivery system includes all topically administered drug formulations intended to deliver the active ingredients into the circulation. They provide controlled continuous delivery of drugs through the skin to the systemic circulation. The drug is mainly delivered through the skin with the aid of transdermal patch.
Makalah analisa farmasi kuantitatif spektro uv vis dan fluorometri FARMASI UNSRIElvarinna Permata
Makalah ini membahas tentang spektrofotometri UV dan flouresensi. Dibahas mengenai faktor-faktor yang mempengaruhi serapan dalam spektrofotometri UV-VIS, pengaruh polaritas pelarut, dan metode kurva kalibrasi dan satu titik dalam analisis kuantitatif menggunakan spektrofotometri."
Dokumen tersebut merangkum pengertian spektrofotometer Fourier transform infra merah (FTIR), prinsip kerjanya yang memanfaatkan interferometer Michelson, dan aplikasinya untuk mengidentifikasi jenis narkoba melalui deteksi gugus fungsionalnya.
Laporan praktikum musrin salila pps UnnesMusrin Salila
Dokumen tersebut membahas tentang penggunaan spektrofotometer UV-Vis untuk menentukan kadar parasetamol dalam sediaan obat. Prinsip kerja spektrofotometer UV-Vis dan teori terkait spektroskopi serta struktur kimia parasetamol dijelaskan sebagai dasar untuk menganalisis kadar parasetamol.
Dokumen tersebut membahas tentang pedoman penerapan kajian farmakoekonomi di Indonesia. Kajian farmakoekonomi dipandang penting untuk mengendalikan biaya pelayanan kesehatan secara efektif dan efisien sejalan dengan upaya pencapaian target MDGs dan reformasi sistem kesehatan nasional. Pedoman ini bertujuan memberikan panduan praktis bagi pengambil keputusan kesehatan dalam mengadopsi prinsip-prinsip farmakoekonomi untuk mend
Laporan praktikum mengenai absorpsi dan ekskresi obat melalui saliva dan urin. Mahasiswa melakukan uji klinik dengan memberikan kapsul KI kepada probandus dan mengukur kadar KI dalam saliva dan urin setiap 15 menit selama 90 menit. Hasil menunjukkan puncak kadar KI tereliminasi melalui saliva dan urin terjadi pada menit ke-75.
Tugas ini membahas obat golongan makrolida. Makrolida adalah antibiotik yang bekerja dengan menghambat sintesis protein bakteri dengan mengikat subunit 50S ribosom. Obat utama golongan ini adalah eritromisin, klaritromisin, dan azitromisin. Eritromisin dan klaritromisin memiliki mekanisme kerja yang sama yaitu menghambat sintesis protein bakteri, namun klaritromisin memiliki waktu paruh yang lebih panjang.
The poem is about Mr. Nobody, an invisible man who is blamed for all the little mishaps and mistakes around the house. In three stanzas, the narrator lists various annoyances like broken plates, torn books, muddy footprints and spilled ink that are actually caused by Mr. Nobody. While no one ever sees his face, everyone agrees he is responsible for the messes and problems attributed to him.
Sergio Dalma is a famous Spanish singer born in 1964 in Catalonia, Spain. He is known for his great songs and unique style. While he keeps his private life closed, he is described as polite, cheerful when singing, and warm towards his fans. He has been singing since the 1990s and maintains a classic vocal style while presenting a modern appearance.
1. Online shopping habits have changed significantly since the pandemic, with more consumers doing more of their shopping online.
2. Retailers have adapted by offering services like buy online pickup in store, curbside delivery, and same-day delivery to meet customer demands.
3. Customers now use their phones to browse, research, and share information more than ever before, so retailers must have strong digital and mobile presences.
Digital Brand Marketing Survey Results (infographic)Denise Zimmerman
Digital Brand Marketing Survey Results
Top marketing professionals provide rich insights into their thinking on digital marketing and the current challenges for brands to succeed.
The event is a park cleanup called "It's My Park Day" that will take place on March 15th from 9:00am to 12:00pm at Bohls Park in Pflugerville, Texas. Participants should dress for the weather and wear closed-toed shoes. The purpose is to pick up trash around the park. More information can be found at the provided website.
This document discusses using yoga to help relieve arthritis pain, mentioning that asanas or hatha yoga can channelize breathing and stretch joints, while shavasana or corpse pose can calm the mind and help relieve pain. It also notes that single leg exercises can stretch abdominal muscles and ease lower back pain.
The document introduces the eDrive Chile project, which aims to promote electric mobility in Chile by establishing partnerships between companies, government, and research centers. The project will analyze Chile's potential for renewable energy and storage resources to support electric transportation. It will also work to increase awareness of electric vehicle technology among the Chilean community and provide information on different transportation systems. Initial efforts include exploring Chile's history with electric mobility, reviewing pilot projects, and attending seminars. The long-term 3-year project is divided into quarterly stages focused on scouting, sharing trials and adapting best practices from other countries to Chile's conditions. The goal is to support innovative development and industrial planning for increased electric mobility in Chile.
The number one challenge facing the Customer Success profession right now is that supply does not meet demand for professionals with Customer Success Management experience. But that's okay, in this presentation you'll find out that experience is all relative and only accounts for a small part of being a successful CSM. Customer DNA at our core, alignment to company purpose and with company culture plus soft skills fit are far more important that the title CSM on the resume.
Corfu is a Greek island in the Ionian Sea that has the shape of a sickle. The document provides a map of Corfu town with landmarks like the old fortress, Asian Art Museum, Archaeological Museum, and Palace. It asks questions about directions between locations, where to find ferry tickets and mail letters, and where cricket players train.
This presentation provides an idea of what I do.Arnoud Willems
The document discusses how companies can use global trade rules and agreements to resolve business problems and create opportunities. It provides examples of how trade rules regarding customs valuation, remanufactured goods, legislation affecting markets, and access to raw materials can shape business strategy and be used to address trade barriers or violations. The document argues that understanding trade agreements allows companies to incorporate relevant rules into planning, mitigate risks, resolve issues that cost money, and take advantage of benefits the rules provide.
Художественная интернет выставка художников из Украины, города Черкассы (1 ча...socdomgppu
(1 ЧАСТЬ) 29 октября в клубе «Общения студентов» прошла необычная встреча. В этот вечер, в 21:00 интернет-комнату факультета ДО посетили творческие люди и подарили выставку своих работ. Это были художники из Украины, города Черкассы. Группа художников не по профессии, а по призванию, представили презентацию картин. Аленина Галина, Наталья Козлова, Мария Передеренко и Логачева Лариса поведали всем участникам вечера, как каждый из них нашёл свой путь в мир искусства. Дороги у каждого были разные, своя история, но в итоге их всех объединила любовь к живописи.
Каждый из ведущих-художников рассказывал про себя, своих коллег-художников, про первые взмахи кисточек и историю рождения картин. Слушая их истории и видя перед собой результаты трудов, мы понимали, что имея желание и упорство, можно добиться многого. Работы были очень разнообразны и ценны своей неповторимостью и это понимали все, когда на слайдах появлялась новая картина. Участникам интернет-выставки показывали разные техники, стили живописи.
В процессе показа прекрасных работ художников, ведущие читали стихи, которые были специально написаны на каждую работу поэтом Александром Бондаренко. Все буквально затихали, прислушиваясь к каждой строчке. Стихи были проникновенными, затрагивали чувственные струны души. Как только заканчивалось одно стихотворение, появлялись сообщение за сообщением в чате с просьбами прочесть ещё. Также слух участников усладили стихи, прочитанные на украинском языке, автором которых была Наталья Козлова, одна из приглашённых художников.
Встреча длилась более 2 часов, но даже в конце никому не хотелось расходиться. На вечере царило хоро
The document discusses various sports that are included in the Olympics and provides information about track and field events like running, hurdles, high jump, pole vault, discus throw, javelin throw, hammer throw, and shot put. It also mentions other sports like football, basketball, volleyball, tennis, gymnastics, swimming, diving, water polo, sailing, and taekwondo. It includes some exercises testing memory and filling in gaps about different events.
The document discusses several key concepts related to data warehousing and business intelligence. It describes the entity relational data model, which divides data into discrete entities with relationships. It also describes extract, transform, and load (ETL) processes, data cleansing, and operational data stores. Dimensional data models are discussed as well, including how they are designed to easily retrieve information and integrate heterogeneous source systems. The levels of business intelligence from strategic to operational are outlined. Finally, frameworks for business value and scope from opportunistic to pervasive are presented.
This document discusses the benefits of unified IT monitoring over monitoring individual components separately. Unified monitoring provides a single view of an organization's entire IT infrastructure, including networks, servers, applications and services. It improves visibility, performance, issue detection and root cause analysis. Some key benefits mentioned are earlier issue detection, better reports, lower costs and consolidated management across silos. The document promotes the Ipswitch WhatsUp Gold product as a solution for unified monitoring.
The document analyzes greenhouse gas emissions data from 2010-2013 for the world's 500 largest public companies by revenue (Global 500). It finds that:
- The Global 500's total GHG emissions increased 3.1% from 2010-2013, rather than decreasing as needed to keep global warming below 2 degrees Celsius.
- The top 50 emitting companies accounted for 79% of the Global 500's emissions in 2013.
- Individual company emissions increased or decreased due to factors like acquisitions, divestments, energy efficiency improvements, and changes in business mix.
Ini daftar nama korban meninggal dan lukayance iyai
Dokumen tersebut memberikan daftar nama 19 korban meninggal dan 31 korban luka-luka akibat kejadian luar biasa di Kabupaten Nabire, Papua. Kebanyakan korban adalah perempuan dan anak-anak.
This document summarizes a listing for a 1,400 square foot bungalow located at 176 Ardmore in Ferndale, Michigan. The classic craftsman home has been updated with features like a new kitchen, plumbing, electrical, windows, and flooring. It is walking distance to downtown Ferndale and offers amenities such as a partially fenced yard, covered porches, screened porch, and two car garage. The home is listed for $209,900.
1. ELISA dapat mendeteksi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel dan digunakan untuk menentukan konsentrasi antibodi dalam serum atau mendeteksi kehadiran antigen.
2. Metode ini juga digunakan dalam industri makanan dan toksikologi.
3. Kelebihannya antara lain teknik yang sederhana, ekonomis, dan sensitif.
ELISA adalah teknik biokimia yang digunakan untuk mendeteksi kehadiran antigen dan antibodi dalam suatu sampel dengan memanfaatkan ikatan spesifik antara antigen dan antibodi. Metode ini memiliki berbagai penerapan, seperti untuk menentukan konsentrasi antibodi dalam serum dan mendeteksi kehadiran allergen dalam makanan.
BUKU PENUNTUN PRAKTIKUM IMUNOSEROLOGI II (1).pdfDdokebi18
Buku penuntun praktikum Imunoserologi II ini memberikan panduan lengkap tentang 8 materi praktikum, meliputi pemeriksaan RPR, TPHA, ELISA untuk Dengue dan HBsAg, serta pemeriksaan HIV menggunakan ELISA dan imunokromatografi. Buku ini disusun untuk membantu mahasiswa mempelajari materi praktikum secara mandiri sesuai kurikulum.
Dokumen tersebut membahas tentang berbagai pemeriksaan laboratorium untuk diagnosis dan pemantauan infeksi HIV, termasuk pemeriksaan serologis seperti ELISA dan rapid test, pemeriksaan virologis seperti viral load dan resistensi obat, serta pemeriksaan imunologis seperti CD4.
Dokumen tersebut membahas tentang pemeriksaan ANA dengan metode imunofluoresens indirek. Metode ini digunakan untuk mendeteksi berbagai jenis antibodi antinuklear yang ada dalam serum pasien dengan pola fluoresensi nukleus berupa homogen, perifer, bercak atau nukleolar. Teknik TITERPLANE dari EUROIMMUN digunakan untuk standardisasi pemeriksaan ini dengan menggunakan substrat HEp-20-10 dan hati primata serta dil
Materi presentasi mata kuliah Bioteknologi tentang macam-macam jenis immunoassay, mulai dari Fluorescence, Chemiluminescence, dan Homogenous immunoassay.
Dokumen tersebut memberikan penjelasan mengenai prinsip dasar dan prosedur elektroforesis protein. Terdapat penjelasan mengenai komponen sistem elektroforesis, prinsip migrasi partikel bermuatan, faktor yang mempengaruhi kecepatan migrasi dan resolusi, serta prosedur elektroforesis mulai dari persiapan sampai pembacaan hasil.
Dokumen ini membahas tentang elektroforesis protein. Metode ini memanfaatkan perbedaan muatan dan ukuran molekul protein untuk memisahkannya. Protein akan bergerak di dalam media penyangga sesuai dengan muatannya menuju kutub yang berlawanan. Dokumen ini menjelaskan prinsip, komponen, prosedur, dan pembacaan hasil elektroforesis protein.
Dokumen tersebut membahas berbagai jenis immunoassay seperti immunoassay berlabel enzim, fluoresens, dan radioisotop. Termasuk didalamnya adalah penjelasan mengenai prinsip kerja dan tahapan melakukan ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) untuk mendeteksi interleukin-5 (IL-5).
Dokumen tersebut merupakan modul praktikum mikrobiologi dan imunologi penyakit infeksi yang membahas dua praktikum yaitu tes presipitasi lateral flow untuk mendeteksi antibodi IgM Salmonella Typhi dan tes aglutinasi MLPA untuk mendeteksi antibodi IgM Mycobacterium leprae. Dua praktikum tersebut menggunakan prinsip reaksi antara antigen spesifik dengan antibodi untuk diagnosis penyakit.
Metode CMIA adalah modifikasi dari ELISA yang menggunakan konjugat akridinium dan mikropartikel paramagnetik. CMIA memiliki sensitivitas tinggi untuk mendeteksi berbagai analit seperti antigen virus, metabolit, dan penanda tumor. CMIA cocok untuk pemeriksaan skrining massal meskipun membutuhkan peralatan khusus dan biaya yang lebih tinggi.
1. TUGAS MATA KULIAH
TEKNIK PENELITIAN BIOKIMIA
(BIK 504)
OLEH :
SOGANDI
G851130241
PROGRAM STUDI BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
SEKOLAH PASCASARJANA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2014
3. Gambar 1. Gambaran umum teknik ELISA
Dalam uji tersebut, antigen yang menarik bergerak oleh adsorpsi langsung
ke pelat uji atau dengan terlebih dahulu melekatkan antibodi capture ke
permukaan plate. Deteksi antigen kemudian dapat dilakukan dengan
menggunakan antibodi enzim-terkonjugasi primer (deteksi langsung) atau
mencocokan satu set dari antibodi primer berlabel dan enzim-terkonjugasi
sekunder (deteksi tidak langsung).
Dalam penelitian ini peneliti menggunakan dua metode ELISA, yaitu
metode Indirect ELISA dan Sandwich ELISA.
Indirect ELISA
Teknik ELISA indirect ini pada dasarnya juga merupakan teknik ELISA
yang paling sederhana, hanya saja dalam teknik ELISA indirect yang dideteksi
dan diukur konsentrasinya merupakan antibodi. ELISA indirect menggunakan
suatu antigen spesifik (monoklonal) serta antibodi sekunder spesifik yang tertaut
enzim signal untuk mendeteksi keberadaan antibodi yang diinginkan pada sampel
yang diuji.
Gambar 2. Gambaran umum teknik indirect ELISA
4. Tahapan pada Indirect ELISA :
1. Coating plate ELISA
Coating dicapai melalui adsorpsi pasif antigen ke plate uji. Metode yang
paling umum untuk lapisan plate melibatkan penambahan 2-10 pg/ml dari
protein yang dilarutkan dalam buffer basa seperti phosphate-buffered saline
(pH 7,4) atau karbonat- buffer bikarbonat (pH 9,4). Pertama mikrotiter diisi
dengan larutan yang mengandung antigen spesifik, sehingga antigen spesifik
tersebut dapat menempel pada bagian dinding lubang mikrotiter selama
inkubasi dalam inkubator pada 370
C selama semalam. Dalam penelitian ini
peneliti menggunakan 10μg/mL Hbs sebagai antigennya dengan buffer
bikarbonat pH 9,6.
2. Langkah pencucian
Selanjutnya mikrotiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak
menempel pada dinding lubang mikrotiter dengan cara mengisi dan
mengosongkan sumur dengan buffer fosfat salin netral (PBS) yang
mengandung 0,05% Tween 20 sebanyak 4 kali pembilasan.
3. Penambahan Buffer Blocked
Buffer blocking yang ideal akan mengikat semua lokasi yang potensial
untuk interaksi nonspesifik, buffer blocked efektif meningkatkan sensitivitas
assay dengan mengurangi sinyal pengganggu dan meningkatkan rasio signal-
to-noise. Tween 20 (0,05%) lebih efektif memblokir daripada protein yang
diuji, bovine serum albumin (BSA 2%) merupakan buffer blocking.
4. Penambahan Antibodi Primer
Langkah ini melibatkan penambahan pendeteksi antibodi (larutan sampel)
yang diarahkan terhadap couting antigen. Larutan sampel yang mengandung
antibodi yang diinginkan dimasukkan ke dalam lubang-lubang mikrotiter,
sehingga terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang
diinginkan. Antibodi biasanya diencerkan dalam buffer blocked untuk
mencegah penempelan protein nonspesifik, peneliti menggunakan larutan 2%
BSA-PBS. Kemudian diinkubasi pada suhu 370
C selama satu jam. Selanjutnya,
mikrotiter kembali dibilas untuk membuang antibodi yang tidak berinteraksi
5. dengan antigen spesifik. Peneliti menggunakan 0,05% Tween-PBS sebanyak 4
kali.
Gambar 3. Proses pembilasan mikrotiter
5. Penambahan antibodi sekunder (konjugasi enzim antibodi)
Langkah selanjutnya adalah penambahan antibodi sekunder, yang
diencerkan dalam buffer block dan ditujukan terhadap antibodi primer. Diikuti
dengan inkubasi sampai terjadi pengikatan antibodi sekunder dengan enzim-
terkonjugasi. Pilihan antibodi enzim konjugasi ditentukan oleh tujuan dari
pengujian tersebut. Antibodi tersebut diproduksi terhadap imunoglobulin (Ig)
spesies di mana antibodi mendeteksi diproduksi dan disebut konjugasi anti-
spesies. Dengan demikian, jika mendeteksi antibodi yang diproduksi pada
kelinci, antibodi berlabel enzim akan menjadi anti-kelinci Ig di alam. Ini
memungkinkan fleksibilitas yang lebih besar dalam penggunaan konjugat anti-
spesies dalam kekhususan yang berbeda dari konjugasi dapat digunakan untuk
mendeteksi Ig tertentu yang mengikat dalam pengujian tersebut. Misalnya,
konjugat anti-spesies bisa menjadi anti-IgM, IgG1, IgG2 dan sebagainya.
Enzim dapat dihubungkan dengan protein seperti streptavidin jika antibodi
primer adalah berlabel biotin. Enzim yang paling umum digunakan (HRP) dan
alkaline phosphatase (AP). Enzim lain telah digunakan juga, tetapi mereka
belum diterima secara luas karena pilihan substrat terbatas. Ini termasuk β-
galaktosidase, acetylcholinesterase dan katalase. Dalam penelitian ini, peneliti
6. menggunakan immunoglobin anti-tikus horseradish peroxidase (HRP) sebagai
konjugat antispesiesnya.
6. Langkah pencucian
Selanjutnya mikrotiter dibilas lagi untuk membuang antibodi sekunder
tertaut enzim signal yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik dengan
buffer fosfat salin netral (PBS) yang mengandung 0,05% Tween 20 sebanyak 4
kali pembilasan.
7. Penambahan substrat
Substrat sangat penting untuk deteksi dan visualisasi dalam teknik ELISA.
Pada tahap akhir ELISA indirect, ditambahkan substrat yang dapat bereaksi
dengan enzim signal, lalu enzim yang tertaut dengan antibodi sekunder spesifik
yang telah berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan
substrat dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Langkah ini melibatkan
penambahan larutan substrat yang cocok untuk enzim konjugasi antibodi.
Tujuannya adalah untuk memungkinkan pengembangan reaksi warna melalui
katalisis enzim. Sebuah pilihan substrat yang tersedia untuk melakukan ELISA
dengan HRP atau AP konjugasi. TMB (3, 3 ', 5, 5'-tetrametil benzidin)
merupakan substrat yang paling umum digunakan untuk horseradish
peroksidase enzim (HRP). Substrat dari alkaline phosphatase (AP), 4-
Methylumbelliferyl fosfat (MUP) dan pNPP (p Nitro-fenil-fosfat) tidak
beracun dan relatif stabil. Dalam penelitian ini peneliti menggunakan substrat
TMB (3,3', 5,5'-tetrametil benzidin) Pemilihan substrat tergantung pada
sensitivitas uji yang diperlukan dan instrumentasi tersedia untuk sinyal deteksi
(spektrofotometer, fluorometer atau luminometer).
8. Larutan penghenti reaksi
Reaksi dibiarkan berjalan untuk jangka waktu tertentu setelah reaksi
dihentikan dengan mengubah pH sistem. Larutan penghenti digunakan untuk
mengakhiri reaksi enzim substrat dalam teknik ELISA setelah mencapai
intensitas warna yang diinginkan yang merupakan indikasi dari tingkat analit.
Misalnya untuk substrat TMB bereaksi dengan horseradish peroxidase (HRP)
7. antibodi sekunder terkonjugasi untuk menghasilkan warna biru. Pada penelitian
ini reaksi dihentikan oleh 1 M HCl yang diukur pada pembacaan 450 nm.
Kuantifikasi
Spektrofotometer yang dirancang khusus untuk dapat melalui sumur
mikrotiter baik secara tunggal atau dalam baris. Beberapa pembaca plat ELISA
yang tersedia, dengan meningkatnya tingkat kecanggihan. Beberapa di
antaranya menyediakan pengukuran densitas optik sementara beberapa tabulasi
data menerapkan analisis statistik. Kompatibilitas dengan komputer kecil, dan
ketersediaan program yang sesuai untuk memproses hasil dan mengubah
pembacaan densitas optik ke konsentrasi protein adalah hal-hal tambahan yang
penting untuk dicari ketika memilih instrumen. Sebagian besar pembaca
ELISA dapat diatur untuk mengukur absorbansi warna yang dihasilkan oleh
reaksi enzim-antibodi terkonjugasi pada substrat masing-masing pembaca
lempeng yang bekerja dengan sebuah sinar jenis tertentu dari cahaya pada
masing-masing sampel dalam lempeng sumur mikro. Mode deteksi yang umum
untuk tes lempeng adalah absorbansi, intensitas fluoresensi, luminescence,
waktu diselesaikan fluoresensi dan fluoresensi polarisasi. Sebuah sumber
cahaya menerangi sampel menggunakan panjang gelombang tertentu (dipilih
oleh filter optik, atau monokromator), dan detektor cahaya yang terletak di sisi
lain dari langkah-langkah awal (100%) cahaya yang disebarkan melalui
sampel, jumlah cahaya yang ditransmisikan biasanya akan berhubungan
dengan konsentrasi molekul terikat, ini disebut deteksi penyerapan. Kisaran
aplikasi deteksi intensitas fluoresensi jauh lebih luas daripada saat
menggunakan deteksi absorbansi, tapi instrumentasi biasanya lebih mahal.
Kelemahan metode indirect ELISA
Membutuhkan waktu pengujian yang relatif lebih lama daripada ELISA
direct karena pada ELISA indirect membutuhkan 2 kali waktu inkubasi yaitu pada
saat terjadi interaksi antara antigen spesifik dengan antibodi yang diinginkan dan
antara antibodi yang diinginkan dengan antibodi sekunder tertaut enzim signal,
sedangkan pada ELISA direct hanya membutuhkan 1 kali waktu inkubasi yaitu
8. pada saat terjadi interaksi antara antigen yang diinginkan dengan antibodi spesifik
tertaut enzim signal.
Kelebihan metode indirect ELISA
1. Terdapat berbagai macam variasi antibodi sekunder yang dijual bebas.
2. Immunoreaktivitas dari antibodi yang diinginkan (target) tidak terpengaruh oleh
penautan enzim signal ke antibodi sekunder karena penautan dilakukan pada
wadah berbeda.
3. Tingkat sensitivitas meningkat karena setiap antibodi yang diinginkan memiliki
beberapa epitop yang bisa berinteraksi dengan antibodi sekunder
Sandwich ELISA untuk Kuantifikasi HbA2
Teknik ELISA nonkompetitif yaitu yang menggunakan dua antibodi
(primer dan sekunder). Pada teknik ELISA nonkompetitif, antibodi kedua
(sekunder) akan dikonjugasikan dengan enzim yang berfungsi sebagai signal.
Teknik ELISA nonkompetitif ini seringkali disebut sebagai teknik ELISA
sandwich.
Gambar 4. Gambaran umum teknik Sandwich ELISA
Pada dasarnya, prinsip kerja dari ELISA sandwich mirip dengan ELISA
direct, hanya saja pada ELISA sandwich, larutan antigen yang diinginkan tidak
perlu dipurifikasi. Namun, karena antigen yang diinginkan tersebut harus dapat
berinteraksi dengan antibodi primer spesifik dan antibodi sekunder spesifik tertaut
enzim signal, maka teknik ELISA sandwich ini cenderung dikhususkan pada
antigen yang memiliki minimal 2 sisi antigen (sisi interaksi dengan antibodi) atau
antigen yang bersifat multivalent seperti polisakarida atau protein. Pada ELISA
sandwich, antibodi primer seringkali disebut sebagai antibodi penangkap,
9. sedangkan antibodi sekunder seringkali disebut sebagai antibodi deteksi. Dalam
pengaplikasiannya, ELISA sandwich lebih banyak dimanfaatkan untuk
mendeteksi keberadaan antigen multivalent yang kadarnya sangat rendah pada
suatu larutan dengan tingkat kontaminasi tinggi. Hal ini disebabkan ELISA
sandwich memiliki tingkat sensitivitas tinggi terhadap antigen yang diinginkan
akibat keharusan dari antigen tersebut untuk berinteraksi dengan kedua antibodi.
Gambar 5. Diagram skematik kompetitif immuno assay
10. Gambar 6. Format nonkompetitif immuno assay
Tahapan pada Sandwich ELISA :
1. Coating plate ELISA
Pada ELISA sandwich, pertama mikrotiter diisi dengan larutan yang
mengandung antibodi penangkap, sehingga antibodi penangkap tersebut dapat
menempel pada bagian dinding lubang mikrotiter. Dalam penelitian ini
antibodi penangkapnya menggunakan anti-HbA2 mAb ThalA2-1 sebanyak 10
μg/ml yang dilarutkan dalam buffer karbonat/bikarbonat pH 9,6 pada suhu 40
C
dan didiamkan selama semalam.
2. Tahap pencucian
Selanjutnya mikrotiter dibilas untuk membuang antibodi penangkap yang
tidak menempel pada dinding lubang mikrotiter dengan cara mengisi dan
mengosongkan sumur dengan buffer fosfat salin netral (PBS) yang mengandung
0,05% Tween 20 sebanyak 4 kali pembilasan.
11. Gambar 7. Proses pencucian plate
3. Penambahan Buffer Blocking
Buffer blocking yang ideal akan mengikat semua lokasi yang potensial
untuk interaksi nonspesifik, buffer blocked efektif meningkatkan sensitivitas
assay dengan mengurangi sinyal pengganggu dan meningkatkan rasio signal-
to-noise. Tween 20 (0,05%) lebih efektif memblokir daripada protein yang
diuji, bovine serum albumin (BSA 2%) merupakan buffer blocking. Dalam
penelitian ini menggunakan BSA 2%.
4. Penambahan larutan antigen
Larutan sampel yang mengandung antigen yang diinginkan dimasukkan ke
dalam lubang-lubang mikrotiter, sehingga terjadi interaksi antara antibodi
penangkap dengan antigen yang diinginkan. Dalam penelitian ini dengan
penambahan HbA2 yang telah dimurnikan dengan konsentrasi dari 3.125
sampai 100 μg/ml yang ada dalam hemolisat sampel. Kemudian diinkubasi
selama 1 jam pada suhu 370
C.
5. Tahap pencucian
Selanjutnya mikrotiter dibilas untuk membuang antigen yang tidak
berinteraksi dengan antibodi penangkap pada dinding lubang mikrotiter dengan
cara mengisi dan mengosongkan sumur dengan buffer fosfat salin netral (PBS)
yang mengandung 0,05% Tween 20 sebanyak 4 kali pembilasan.
12. 6. Penambahan Enzim Konjugat Antibodi
Lalu, kedalam lubang mikrotiter dimasukkan larutan yang berisi antibodi
detektor, sehingga pada lubang mikrotiter tersebut terjadi interaksi antara
antigen yang diinginkan dengan antibodi detektor. Dalam penelitian ini
menggunakan FITC-conjugated anti-HbA2 mAb ThalA2-2 dengan konsentrasi
10 μg/ml dan diinkubasi pada pada suhu 370
C selama satu jam untuk
membiarkan FITC-conjugated yang telah dilabel dengan antibodi berikatan
dengan molekul HbA2.
7. Tahapa pencucian
Selanjutnya mikrotiter dibilas lagi untuk membuang antibodi detektor
yang tidak berinteraksi dengan antibodi spesifik.
8. Penambahan substrat
Substrat sangat penting untuk deteksi dan visualisasi dalam teknik ELISA.
Pada tahap akhir ditambahkan substrat yang dapat bereaksi dengan enzim
signal, lalu enzim yang tertaut dengan antibodi sekunder spesifik yang telah
berinteraksi dengan antibodi yang diinginkan akan bereaksi dengan substrat
dan menimbulkan signal yang dapat dideteksi. Langkah ini melibatkan
penambahan larutan substrat yang cocok untuk enzim konjugasi antibodi.
Tujuannya adalah untuk memungkinkan pengembangan reaksi warna melalui
katalisis enzim. Sebuah pilihan substrat yang tersedia untuk melakukan ELISA
dengan HRP atau AP konjugasi. TMB (3, 3 ', 5, 5'-tetrametil benzidin)
merupakan substrat yang paling umum digunakan untuk horseradish
peroksidase enzim (HRP). Substrat dari alkaline phosphatase (AP), 4-
Methylumbelliferyl fosfat (MUP) dan pNPP (p Nitro-fenil-fosfat) tidak
beracun dan relatif stabil. Dalam penelitian ini peneliti menggunakan HRP-
conjugated rabbit anti-FITC antibody yang telah ditambahkan kedalam plate
dan pewarnaan dengan TMB substrat (3,3', 5,5'-tetrametil benzidin).
9. Penambahan larutan penghenti reaksi
Reaksi dibiarkan berjalan untuk jangka waktu tertentu setelah reaksi
dihentikan dengan mengubah pH sistem. Larutan penghenti digunakan untuk
mengakhiri reaksi enzim substrat dalam teknik ELISA setelah mencapai
13. intensitas warna yang diinginkan yang merupakan indikasi dari tingkat analit.
Pada penelitian ini reaksi dihentikan oleh 1 M HCl yang diukur pada
pembacaan 450 nm.
Gambar 8. Plate ELISA yang sudah terbetuk warnanya
Jumlah HbA2 dalam sampel yang diuji diperoleh dengan menerjemahkan
OD 450 nm untuk unit konsentrasi (μg/ml) dengan menggunakan kurva standar
yang dikembangkan di plate yang sama. Jumlah relatif HbA2 sebagai persentase
dari total Hb (% HbA2) kemudian dihitung menggunakan persamaan berikut :
[kadar HbA2 dalam mg/ml] / [Hemoglobin total dalam mg/ml] x 100
Dalam ELISA sandwich, terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi
tingkat sensitivitas dari hasil pengujian, antara lain: Banyak molekul antibodi
penangkap yang berhasil menempel pada dinding lubang mikrotiter dan Afinitas
dari antibodi penangkap dan antibodi detektor terhadap antigen. Sebenarnya,
teknik ELISA sandwich ini merupakan pengembangan dari teknik ELISA
terdahulu, yaitu ELISA direct.
Kelebihan teknik ELISA sandwich ini pada dasarnya berada pada tingkat
spesitifitasnya yang relatif lebih tinggi karena antigen yang diinginkan harus dapat
berinteraksi dengan 2 jenis antibodi, yaitu antibodi penangkap dan antibodi
detektor. Namun demikian, teknik ELISA sandwich ini juga memiliki kelemahan,
yaitu teknik ini hanya dapat diaplikasikan untuk mendeteksi antigen yang bersifat
14. multivalent serta sulitnya mencari dua jenis antibodi yang dapat berinteraksi
antigen yang sama pada sisi antigenic yang berbeda (epitopnya harus berbeda).
Interpretasi Kurva ELISA
Grafik diatas menunjukkan bahwa konsentrasi suatu sampel akan
berbanding terbalik dengan banyaknya jumlah antibodi yang terikat.
15. Hasil
Produksi dan karakterisasi mAbs menjadi HbA2
Untuk mengubah mAbs menjadi HbA2, dua tikus Balb/c diimunisasi
dengan HbA2 yang telah dimurnikan dengan interval 2 minggu. Setelah imunisasi
ketiga, respon antibodi poliklonal untuk HbA2 di kedua tikus itu cukup kuat (titer
[1:32,000). Seekor tikus dipilih untuk generasi hibridoma. Supernatan budaya
hyrbidomas yang dihasilkan diuji dengan indirect ELISA menggunakan berbagai
jenis Hbs sebagai antigen. Dua klon hibridoma menghasilkan antibodi yang dapat
mengenali HbA2 tapi tidak untuk Hbs. Kedua mAbs yang isotipe dengan IgG1.
Hasilnya menunjukkan bahwa mAbs ThalA2-1 dan ThalA2-2 khusus bereaksi
terhadap HbA2 dan dapat digunakan untuk membangun ELISA untuk kuantifikasi
HbA2.
Pengembangan sandwich ELISA untuk kuantisasi HbA2
Sebagai tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengembangkan ELISA
yang efektif untuk kuantifikasi HbA2, jenis ELISA terpilih menjadi sistem assay.
Dengan diproduksinya mAbs anti-HbA2, sandwich ELISA telah berhasil
dikembangkan. Anti-HbA2 mAb ThalA2-1 digunakan sebagai antibodi pertama
untuk lapisan plate sebagai penangkap molekul HbA2 dalam sampel. Yang kedua
anti-HbA2 mAb ThalA2-2 yang berlabel dengan FITC digunakan untuk
mendeteksi HbA2 yang terikat. HRP conjugate ditambahkan ke sistem untuk
mendeteksi pengikatan antibodi FITCl ke plate. Dengan sistem ini, kurva standar
mendeteksi HbA2 dalam kisaran 3,125-100 μg/ml mengikuti hukum Beer dengan
OD 450 nm berkisar 0,191-1,732 diperoleh gambar dibawah ini.
Kekhasan sandwich ELISA divalidasi menggunakan ELISA yang
dikembangkan untuk mengukur berbagai jenis Hbs. Hanya HbA2 yang dapat
dideteksi oleh ELISA.
16. Penilaian keandalan tingkat HbA2 ditentukan oleh sandwich dikembangkan
ELISA
ELISA yang dikembangkan telah digunakan untuk penentuan kadar HbA2
yang terdapat di hemolysates diperoleh dari berbagai penelitian. Analisis
hubungan jelas menunjukkan bahwa kadar HbA2 ditentukan oleh sandwich
ELISA berkorelasi sangat baik dengan yang ditentukan oleh metode HPLC.
Untuk memanfaatkan tingkat HbA2 untuk diagnosis thalassemia, cut-off poin dari
tingkat HbA2 dibuat dari nilai-nilai pada batas 2SD, yang berkisar masing-masing
2,5 dan 4,0% untuk sandwich ELISA dan HPLC. Sandwich ELISA yang
dikembangkan mampu mengukur kadar HbA2 dalam HbE-bearing (HbE sifat dan
homozigot HbE), yang tidak bisa dilakukan oleh HPLC konvensional.
ELISA yang dikembangkan kemudian diterapkan dalam penentuan tingkat
HbA2 di diketahui sampel darah rutin dan diagnosis yang diperoleh kemudian
dibandingkan dengan yang dihasilkan dengan metode HPLC. Analisis dari 112
sampel darah rutin menunjukkan bahwa teknik ELISA yang dikembangkan
memiliki kapasitas yang sebanding untuk mendeteksi heterozigot β-thalassemia
dengan teknik HPLC dengan sensitivitas 100%, 95% spesifisitas, akurasi 95%,
nilai prediksi 82,3% positif dan 100% nilai prediksi negatif .
17. Sebagai kesimpulan, penelitian ini telah berhasil mengembangkan ELISA
sandwich untuk kuantifikasi HbA2. Teknik ini sederhana, cepat dan dapat
digunakan untuk mengidentifikasi operator β-thalassemia. Oleh karena itu dapat
diadaptasi untuk skrining skala besar untuk β -thalassemia di daerah endemik.
Dengan demikian, peneliti mendorong penggunaan strategi ini dalam penyaringan
untuk β -thalassemia di negara-negara yang memiliki keterbatasan sumber daya.
Referensi
Graphad Prism. 2003. Step-by-Step Examples Nonlinear Standard Curves: RIA
and ELISA. Graphad software. San Diego, CA.
Ibrahim A. Darwish. 2006. Immunoassay Methods and their Applications in
Pharmaceutical Analysis: Basic Methodology and Recent Advances.
International journal of Biomedical science. vol. 2 no. 3 september 2006.
Kuntaruk, Surakit; Thanusak Tatu; Tiemjan Keowkarnkah et al. 2010. Sandwich
ELISA for hemoglobin A2 quantification and identification of β-
thalassemia carriers. Hematol journal. DOI 10.1007/s12185-009-0490-3.
SeraCare. 2013. Technical Guide for ELISA (Protocols & Troubleshooting). 800-
638-3167: www.kpl.com
Yang and Ma. 2009. Western Blotting and ELISA Techniques. Sciencepub journal.
1(2):67-86.