Dokumen tersebut membahas tentang teknologi DNA rekombinan yang meliputi prinsip kloning gen, vektor plasmid, enzim restriksi, ligasi, transformasi, seleksi transforman, dan deteksi keberadaan DNA sisipan."

1. PRINSIP TEKNOLOGI
DNA REKOMBINAN
DEBBIE S. RETNONINGRUM
SEKOLAH FARMASI
INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 1

2. PUSTAKA
1. Glick, BR and JJ Pasternak, 2003, Molecular
Biotechnology: Principles and Applications of
Recombinant DNA,hal. 47-89 dan 101-110
2. Groves MJ, 2006, Pharmaceutical
Biotechnology, hal. 44-55
3. Brown TA, 2006, Gene Cloning & DNA analysis,
hal. 3-6 dan 8-12; 54-80 dan 87-97
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 2

3. TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
• Rekombinasi antara molekul DNA dari organisme
berbeda: fenomena umum di alam.
• Corynebacterium diphtheriae yang diinfeksi oleh virus β
menghasilkan toksin yang bertanggung jawab terhadap
gejala difteri.
• Perubahan genetik dalam bakteri ini disebabkan oleh
virus dan merupakan suatu rekayasa genetik dalam
alam.
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 3

4. TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN
• Duplikasi fenomena alam di laboratorium
• Mengembangkan metode introduksi berbagai informasi
genetik ke dalam suatu organisme.
• Manipulasi genetik
E. coli dan Bacillus subtilis (bakteri)
Saccharomyces cerevisiae (ragi)
• Produksi bahan mahal atau tidak mungkin dibuat secara
tradisional.
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 4

5. CONTOH PRODUK REKOMBINAN
– ANTIBODI REKOMBINAN
– PROTEIN TERAPEUTIK: insulin, interferon, albumin serum
manusia, hormon pertumbuhan manusia, aktivator plasminogen
jaringan, antithrombin, faktor pembekuan darah, limfokin, faktor
nekrosis tumor, dismutase superoksida, dan gonadotropin
manusia
– VAKSIN: hepatitis B, herpes, influenza, malaria
– VAKSIN DNA
– TERAPI GEN
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 5

6. CONTOH PRODUK REKOMBINAN
– PRODUK PERTANIAN: tanaman tahan penyakit,
resistensi pestisida, bioinsektisida, fiksasi nitrogen
– PRODUK BIOREMEDIASI: pengurai lemak/minyak,
penghilangan herbisida, pendegradasi pestisida
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 6

7. TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)
• PENYEDIAAN DNA: SISIPAN DAN VEKTOR (Ex: PLASMID)
• LIGASI: PENGGABUNGAN DNA SISIPAN DAN VEKTOR
(= VEKTOR REKOMBINAN)
• TRANSFORMASI: TRANSFER INFO GENETIK KE SEL INANG
& PERBANYAKAN DNA
• SELEKSI: SEL YG MENGANDUNG PLASMID/ VEKTOR
REKOMBINAN
• DETEKSI: KEBERADAAN DNA SISIPAN, KEBENARAN DNA
SISIPAN (UKURAN DAN URUTAN NUKLEOTIDA)
1972 Stanley Cohen dan
Herbert Boyer
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 7

8. TEKNOLOGI DNA REKOMBINAN (KLONING GEN)
DNA
kromosom
DNA Potong dengan enzim restriksi
plasmid
ligasi
DNA rekombinan
transformasi sel
transforman
1 sel tumbuh jadi 1 koloni
klon
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 8

9. Kloning DNA ke Plasmid
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 9

10. SUMBER DNA SISIPAN
• TIGA PENDEKATAN:
– KEPUSTAKAAN DNA (DNA LIBRARY): DNA
GENOMIK
– PRODUK PCR
– mRNA cDNA (eukariot)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 10

11. Kepustakaan genomik (genomic library)
• Koleksi klon yang jumlahnya cukup mencakup
semua gen dari suatu organisme
• Contoh ukuran genom:
– Bacillus anthracis: 5,1 – 5,2 Megabasa
– Escherichia coli: 4 Megabasa
– Pseudomonas putida: 6,0 – 6,1 Megabasa
– Staphylococcus aureus: 2,9 Megabasa
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 11

12. KROMOSOM vs PLASMID
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 12

13. PLASMID
• DNA UNTAI GANDA
• BERBENTUK LINGKARAN
• BERSALINAN TINGGI
• BERUKURAN KECIL (MUDAH DIMANIPULASI)
• DAPAT BEREPLIKASI SENDIRI DI DALAM SEL
• DAPAT DISISIPI DNA ASING (DNA SISIPAN)
• ADA DUA GEN MARKER:
– UNTUK MENDETEKSI ADANYA VEKTOR
– UNTUK MENDETEKSI ADANYA DNA SISIPAN
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 13

14. VEKTOR (Plasmid)
• VEKTOR KLONING
HANYA UNTUK MENDAPATKAN DNA
• VEKTOR EKSPRESI
UNTUK MENDAPATKAN PROTEIN (tambahan
komponen untuk mempermudah proses “downstream”/pemurnian)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 14

15. Beberapa contoh vektor kloning
Nama Tipe Sel inang Keterangan
pBR322 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, tetrasiklin.
Vektor untuk tujuan umum
pUC8 Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining
lac. Vektor untuk tujuan umum
pBluescript Plasmid E. coli Resistensi terhadap ampisilin, skrining
lac.
λgt10 Bakteriofaga E. coli Kloning cDNA
YEp24 Plasmid E. coli/ragi Resistensi ampisilin. Vektor ragi shuttle
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 15

16. PETA PLASMID
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 16

17. ENZIM RESTRIKSI
• MEMBATASI PERTUMBUHAN VIRUS PADA
INFEKSI VIRUS PADA BAKTERI
• TIPE II: DIGUNAKAN PADA DNA
REKOMBINAN
• MEMOTONG IKATAN FOSFODIESTERASE
• MENGENALI URUTAN PALINDROM
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 17

18. ENZIM RESTRIKSI & LIGASE
DNA (enzim restriksi) DNA (ligase)
5’- NNNGAATTCNNN -3’ 5’- NNNGOH PAATTCNNN -3’
3’- NNNCTTAAGNNN -5’
3’- NNNCTTAAP OHGNNN -5’
EcoRI
ligase
5’- NNNGOH PAATTCNNN -3’ 5’- NNNGAATTCNNN -3’
3’- NNNCTTAA P OHGNNN -5’ 3’- NNNCTTAAGNNN -5’
• Sisi pengenalan enzim restriksi
• Urutan nukleotida rantai atas =
Urutan nukleotida rantai bawah
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 18

19. CONTOH ENZIM RESTRIKSI
• EcoRI (Escherichia coli galur R): G↓AATTC (ujung lancip)
• BamHI (Bacillus amyloliquefaciens): G↓GATCC (ujung lancip)
• BglII (Bacillus globigii): A↓GATCT (ujung lancip)
• SalI (Streptomyces albus): G↓TCGAC (ujung lancip)
• PstI (Providencia stuartii 164): CTGCA↓G (ujung lancip)
• HindIII (Haemophilus influenzae): A↓AGCTT (ujung lancip)
• KpnI (Klebsiella pneumonia): GGTAC↓C (ujung lancip)
• XbaI (Xanthomonas bradii): T↓CTAGA (ujung lancip)
• HaeIII (Hemophilus aegyptius): GG↓CC (ujung tumpul)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 19

20. Kloning Produk PCR
PCR Ligasi
S. pyogenes M12 Gen ska pGEMT
rekombinan
SDM
Transformasi
E. coli XL-Blue pGEMT/ska
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 20

21. LIGASI PRODUK PCR KE pGEM-T
ligasi Transformasi
A A +
Gen ska
pGEM-T pGEM-T E. coli JM109
REKOMBINAN
Streptococcus pyogenes
Kontrol – Kontrol + E. coli pGEM-T REK
LB/Amp LB/Amp LB/Amp/X-Gal/IPTG
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 21

22. Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 22

23. Transformasi
• info genetik ditransfer ke sel inang dengan
metode transformasi
• Sel inang dibuat kompeten (siap menerima
“DNA asing”) → modifikasi struktur dinding sel
• Metode transformasi : heat shock/elektroporasi
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 23

24. Seleksi Transforman
Sel kompeten
Transformasi
Seleksi Biru-Putih
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 24

25. SELEKSI BIRU PUTIH
• MENGETAHUI APAKAH DNA SISIPAN SUDAH ADA?
• PADA MCS TERDAPAT GEN lacZ (MENGKODE
GALAKTOSIDASE)
• X-GAL → BIRU
• DNA SISIPAN AKAN MERUSAK GEN lacZ →
GALAKTOSIDASE TIDAK DIPRODUKSI →
X-GAL TIDAK DIURAIKAN → PUTIH
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 25

26. Deteksi keberadaan DNA sisipan
• Analisis migrasi
• Analisis restriksi Elektroforesis gel
• PCR
• Penentuan urutan DNA sisipan (sekuensing)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 26

27. ELEKTROFORESIS GEL
• Gel agarosa atau poliakrilamid
• DNA bermuatan negatif (ada gugus fosfat):
bergerak dari kutub negatif ke kutub positif
• DNA bermigrasi tergantung dari ukurannya:
migrasi DNA ukuran kecil > ukuran besar
• Visualisasi:
– etidium bromida / Syber Green (DNA berfluorosensi
dengan pemaparan UV)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 27

28. Elektroforesis Gel Agarosa
Joe Sambrook dan Bill Sugden: elektroforesis gel agarose untuk DNA
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 28

29. KONFIRMASI pGEM-T REKOMBINAN
1 2
Isolasi pGEM-T/ska
(kit Qiaprep, Qiagene)
Ukuran plasmid tanpa DNA sisipan < 1 = pGEM-T rekombinan
ukuran plasmid dengan DNA sisipan 2 = pGEM-T tanpa DNA sisipan
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 29

30. KONFIRMASI pGEM-T REKOMBINAN
Isolasi Plasmid Rekombinan Analisis Restriksi pGEM-T
rekombinan
1 2 3
1 2
Koloni Putih
Koloni pGEM-T (3000 bp)
Koloni Biru
Biru
1419 pb
881 pb
517 pb DNA sisipan
Elektrogram hasil isolasi plasmid
koloni biru dan putih :
1. Koloni biru
2. Koloni putih
3. Koloni biru Elektrogram hasil restriksi Nde/BamHI
1. Marka pUC19/HinfI
2. Hasil Pemotongan NdeI/BamHI
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 30

31. HASIL PENENTUAN URUTAN NUKLEOTIDA
DNA SISIPAN (DNA Sequencing)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 31

32. HASIL SEKUENSING
Bandingkan urutan hasil sekuensing dg urutan DNA sisipan asal
(Analisis homologi/kesamaan – program BLAST dari NCBI)
Sekolah Farmasi ITB Bioteknologi Farmasi-FA 4202 Prinsip Teknologi DNA Rekombinan 32