1. Isolasi plasmid dari bakteri E. coli untuk menentukan urutan DNA sisipan. 2. Metode isolasi plasmid meliputi kultur bakteri, sentrifugasi, lisis sel, dan ekstraksi DNA plasmid. 3. Urutan DNA sisipan dianalisis menggunakan tabel kode genetik untuk mendapatkan asam amino.

1. rekre€k
ffi$#ffi*$m$qus$ffin
"lsolasi DNA plasmid dan penentuan urutan cDNA' v
ntuk menghasilkan gen tertentu
daritumbuhan atau
hewan, dalam jumlah
yang banyak (over-
express), pertama-tama
praktikan harus mengisolasi
gen yang diinginkan dalam
bentuk cDNA. cDNA yang
telah diperoleh kemudian
diamplifikasi dengan PCR, dan
selanjutnya disisipkan ke
dalam vektor plasmid. Plasmid
rekombinan yang telah
dihasilkan selanjutnya
ditra nsformasikan ke da lam
sel bakteri atau host cell lain
sesuai kebutuhan.
EcoRl Hindlll
Ampiclllin
resistance
Pstl
Origin of DNA
repllcation
flrlr10.16 trelrolotyoti4krc.|ril.n.l !/.
S r006PuH Prn{o tLl,lrc
Tetracycllne
reslstance
I {+} ori Pada praktikum kali iniakan dilakukan
isolasi plasmid pBluescript dari bakteri
transforman E.colistrain DH5q dan
melakukan konfirmasi sekuen DNA
sisipan pada plasmid tersebut.
ornpicillin
Clal
pBlue*cript St+
s"fi kb

2. Biologi Sel don Molekuler lsolasi p)osmid dan penentuan urutan cDNA
<,
1 . Kultur bakteri E coli DH5q yang mengandung plasmid
pBluescript SK pada medium LB cair + ampisilin @ 4 mL
2. Mikrosentrifuga
3. Vorteks
4. Tabung sentrifugasi/ tabung eppendorf berukuran 1,5 mL @ 5
5. Rak mikrosentrifuga @ 1
6. Mikropipet ukuran 100-1000 UL @ 1
7. Tips mikropipet ukuran 200-1000 prl
8. GET buffer (didalam tabung eppendorf 1,5 mL) @ 0,5 mL
9. 1Oo/o Sodium Dodecyl Sulphate (di dalam tabung eppendorf 1,5 mL)
@ 0,5 mL
10. 2 N NaOH (didalam tabung eppendorf 1,5 mL)@ 0,5 mL
1 1 . 3 M Potassium 5 M Acetate (di dalam tabung eppendorf 1,5 mL)@
0,5 mL
12. Etanol 95o/o (di dalam tabung falcon) @ 3 mL
13. Aquades (tabung falcon) @ 3 mL
14. Timer (pencatat waktu)
15. Label
16. Spidol marker

3. Biologi Sel dan Molekuler lsolasi plasmid dan penentuan urutan cDNA
A.lsolasi Plasmid dan Menentukan
Urutan DNA
(1) Pipet 1,5 mL kultur bakteri ke dalam
2 tabung mikrosentifugel,5 mL
(2) Masukkan tabung sentrifuge ke
da lam benchtop mi krosetrifuga
selama 1 menit - pastikan rotor
sentrifugasi dalam keadaan
setimbang.
(3) Buang supernatan
(4)Tambahkan 100 L GET (Glucose-
EDTA-Tris) buffer pH7,9 ke dalam
pellet sel (tabung tidak perlu
ditutup) - Vortek secara hati-hati
untuk mensuspensi pellet dan
biarkan pada ruangan dengan suhu
kamar selama 5 menit
(5) Dalam 1,5 mL tabung
mikrosentrifuga yan g berbeda,
buatlah campuran 1olo SDS dan 0,2 N
NaOH dalam air dengan volume
akhir 1 mL
(6) Ke dalam setiap tabung (tube) dari
tahap nomor 4 di atas, tambahkan
200 pL campuran yang baru dibuat
yang terdiridari 1olo SDS dan 0,2 N
NaOH- tutup tube-tube tersebut
dan baliklah 4-5 kali
(7) lnkubasikan pada suhu kamar
selama 3 menit
(8) Setiap tabung ditambahkan 150 prl
5 M KOAc (3 M kalium dan 5 M
acetat), tutuplah tube dan kocok
sebentar dengan tangan agar
tercampur
(9) lnkubasikan pada suhu kamar
selama 3 menit
(1 0) Sentrifugasilah tube tersebut
selama 3 menit dengan kecepatan
penuh- lngatlah bahwa rotor harus
setimbang.
(1 1) Beri label 2 tabung
mi krosentrifuga ya ng baru
(12) Pipetlah supernatant dari setiap
tube yang telah disentrifugasi ke
dalam tube yang bersih.
Simpanlah tube original yang
mana sekarang mengandung
pellet putih - lniadalah
kromosom DNA bakteri
(13) Tambahkan 800 prl 95olo etanol
pada setiap tube. Tutuplah, dan
kocoklah kuat-kuat dengan
tangan selama 10 detik dan
letakkan pada bench selama 10
menit
(1 4) Sentrifugasilah tube-tube selama
5 menit dengan kecepatan
maksimal.
(15) Buang supernatant dari setiap
tube. Amati dan dokumentasikan
pellet yang dihasilkan
(16) Percobaan anda dikatakan
berhasil jika memperoleh pellet
putih
(17) Selanjutnya anda akan
diberisekuen dari DNA sisipan.
DNA telah disekuen dengan T3
promoter. Data bisa dilihat di
bagian Lembar Pengamatan dan
Pertanyaan
(18) Cek sekuen anda dan jawablah
pertanyaan yang disediakan

4. Biologi Sel dan Molekuler lsolasi plasmid dan penentuan urutan cDNA
B. Cara Menggunakan Mikropipet
Cara mengatur volume
Tekan plunger untuk mengatur
volume, yang dapat dilihat pada
jendela display. lngat: setiap
mikropipet hanya bisa kisaran volume
tertentu saja. Jangan keluar dari
kisaran tersebut.
Cara menggunakan
(3) Angkat pipet dari larutan.
Pindahkan larutan ke tabung lain
dengan cara menekan plunger ke
stop pertama, lalu tekan terus ke
stop ke dua hingga seluruh larutan
keluar.
Angkat pipet daritabung dan lepaskan
plunger. Lepaskan tips kekotak untuk
membuang tips dengan cara menekan
tip-ejector.
(1)
(2)
Pasang tips. Perlahan-lahan tekan
plunger ke stop pertama.
Masukkan ujung tips 2-4 mm ke
dalam larutan. Lepaskan plunger
perlahan-lahan hingga balik ke
posisisemula.
3llpH"
ttrEd
t$*!ftepE f*&-l$sspL r l34
*km*ar
tts**re*qr
n*&#ffif#d*
fAf*g*r

5. Biologi Sel dan Molekuler lsolasi plasmid dan penentuan urutan cDNA
(1)
C. Cara Menggunakan Mikrosentrifuga
PENTING! Diskusikan terlebih dahulu
cara penggunaan mikrosentrifuga
dengan asisten lab. Di bawah ini
dijelaskan secara umum cara
pengg u naan mikrosentrifuga.
Tekan tombol OPEN pada bagian
kanan atas pada panel operasi (no 1
pada gambar) untuk membuka
penutup/lid (2) sentrifuga.
Rotor dilindungi oleh tutup plastik
(plastic cap) (3). Untuk melepaskan
cap tersebut, tahan cap dengan
salah satu tangan, dan putar
poros/baut ditengah (4)
berlawanan arah jarum jam dengan
tangan yang lain
Ada 24 lubang di dalam rotor.
Susun tabung sampel dalam posisi
yang simetris, untuk menjaga
keseimbangannya
Pasang kembali rotor cap. Putar
baut/porosnya (4) searah jarum jam
Tutup sentrifuga dengan hati-hati.
Praktikan akan mendengarkan
suara "beep" yang menunjukkan
penutupan telah dilakukan dengan
baik
(2)
(6)
(3)
(4)
(s)
Kecepatan (140x 100 rotasi per
menit)dan waktu (3 menit)
sentrifugasi diperlihatkan pada
layar (5)dan (7). Praktikan dapat
mengaturnya sesuai kebutuhan.
Tekan tombol DISP/CE (6) untuk
meng konfirmasi/menjaga set
pengaturan, setelah itu tekan
tombol START (8) untuk memulai
sentrifugasi
Setelah sentrifugasi selesai,
penutup (lid) akan otomatis
terbuka. Kemudian, buka
sepenu hnya penutup sentrifuga
dan angkat kembali rotor cap
Agar tidak mengganggu endapan
yang dihasilkan, ambil tabung
sampel dengan hati-hati dari rotor.
Letakkan pada tempat tabung
Pasang kembali rotor cap, dan
tutuplah sentrifuga
(7)
(8)
(e)

6. Biologi Sel don Molekuler lsolosi plasmid don penentuan urutan cDNA
Lembar Pengamatan
Dibawah ini ditampilkan sekuen cDNA dari gen X yang disisipkan ke plasmid
pBluescript
{ 1. Site enzim yang anda kloningkan pada fragmen DNA adalah:
{ Catatan: Huruf pertama nama enzim terletak di atas nukleotida pertama dari urutan pengenalan
'-2
Z. Daftar 20 nukleotida pertama dari fragmen DNA anda (tidak termasuk sekuen tempat restriksi
z
:
3. Temukan kodon start pertama. Dengan menggunakan tabel kode genetik yang terdapat pada halaman 7,
dan dimulai dengan kodon start, translasi nukleotida 21 pertama ke dalam asam amino yang sesuai/cocok
Catatan: Asarir amino kodon start hanya satu pada polipeptida hasil translasi gen X
<
T,
fi
i
'r
1
E
ii
"B
f
I
f
f
$
'+
f!l
;.i
't
*
1i"
i
6AA TTC
6CA CGA GAG TGA A{C EAC ATT GCA AAC AAC CT6 AT(
ATG ATC AG( CTG TCG TTC 6Ti CT6 fTA GCT GTT GCC CA( 6€T
CTC GT6 TG( C*G GCG TCA C'G GEf, AAG A*G ATT CTG CTi GTC 16T
GAC GtG GAG GGT CTG TGT GAG GAT CTG A-'IA TTG GAA AAA CCA GAA
G€C AGT AAA C(C GTC ATA AT* ATA ATA A*G GTT TGA
GTT ThT TTT TGC AAA ATT TGC AAA ATT GCT TGC AGA CGT GTT TGA
TTG CAC GCG CAT ACI ATA AAG AGC TTA TTA TAA TTA ATA *AA iAA
AAA IAI TTE AtrA AAT A*A AAA
CTC GAG
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 t3 14 15 16 17 l8 19 20
Nukleotida
Asam
amino
1 2 3 4 5 6 7 I 9 10 1T 12 t3 14 1t t6 17 t8 19 20 21
Hukleotida

7. Biologi Sel dan Molekuler lsolasi plasmid dan penentuan urutan cDNA
UUU fh#FFhmylalania* iLlG,J {Eerf$Be*nr
UUfi Sf?E Fpte*6dmin* illffi {S*d$}6*liae
U,
UUn G-**rlt-)t-u*io" itrea (Ssrr$Ferkre
tlUG$-*tdQl*uei*e itlGB{5erfE}$*ina
,dlJU{f*fs6l*uri*E
Tabel Kode Genetik
*AGJ$krfTphr*cnine
iAeGffkflfihr**nina
iAe{ fihrfnThnsnins
t-
iAffiflhrfIlThr*mina
i&tE$aS*al*uc***
ni****rtcunlnE
CSt]{tugffiHrginitrs
C€CfArgffitugi*ins
CG&ffiCp!*rgin&'tc
*CG {tugffigtut'in*
rt€B{$e#$}$ednc
AGSStrf$)S*i*e
AC*f{dR}tu#r*na
ASS{Frgffirgk*lt*i AIJS {M*tf ffi r*athionin*
6SlSlalASlanina
SCC {AldlgAler*ir:
GGft{AlafA$}a**na
SCG {lEtelA}Alx*ne
PUSTAKA
IBO 18th Saskatoon Canada July 2010, Practical Examination lV: Genetics,Task A:
Sequencecofirmation of a cDNA
{Iyr/YlTymsi*e
{ftffiTyno****
{J*AGdue{.3ffi
**nb*r{8fry}
tlGuffi#Qf,!$e,ina
1J#* {Gy*fC}eysrci*e
ucefrpd{6fry}
UES {frpr!fi*Trysaptnn
Cfl$frmlP$**ira
ffi pmJPpr**ine
Cf&pmtPlFholin*
CffiflrulFlFraline
ftfiffiHists'&lr
ffi*ffikrid*e
{S*rQFlut*mine
{$#C}Hutar$na
frtt#!{tup*agin*
E*#,f{}qsprysgin*
{LysflSly*inr
fty*ffiLysiae
{*rpiD}4ry*tieadd
F,e#o1*****o
SlsffikEaflres erid
{GhrHGlrS*m}Eadd
ffiU {G*yfGplycinr
€GG {C&s$}Clrci*e
CSA{tryfffily**na
€GG{BylGpydn*
;GtftJ {Vdl!&rfilir+r
ieue guxrvlv*t*n*
FI
"leu+Ev*tlryalrtc
i6[.nB fir*[,{r}vaii+e
|SUUftadl[rut!**I
lCuC {Laull}Leu#na
l.i* lCtH$-eufulla{rsine
i
i*Ue &erfQl*uc+ne