2. Вступ
Валідація аналітичної методики - це
експериментальний доказ того, що
методика придатна для розв'язання
поставлених завдань.
Усі методики і випробування, включені
у Фармакопею, є валідованими і
потребують проведення тільки
верифікації (перевірки). Верифікація
має підтвердити на підставі
експериментальних даних, що дана
лабораторія спроможна коректно
відтворити фармакопейну методику чи
випробування.
3. випробування на ідентифікацію;
кількісні випробування для визначення
домішок;
випробування на граничний вміст для
контролю домішок;
кількісні випробування для визначення діючої
речовини та інших компонентів у субстанціях
і готових лікарських засобах.
Аналітичні випробування і методики,
які підлягають валідації
4. Типові валідаційні характеристики
правильність;
прецизійність;
збіжність;
внутрішньолабораторна прецизійність;
специфічність;
межа виявлення;
межа кількісного визначення;
лінійність;
діапазон застосування.
робасність
• зміна у синтезі лікарської субстанції;
• зміна у складі готового лікарського засобу;
• зміна в аналітичній методиці.
• зміна у синтезі лікарської субстанції;
• зміна у складі готового лікарського засобу;
• зміна в аналітичній методиці.
5. Валідаційні характеристики відповідно до
рекомендацій ICH та фармакопеї США однакові.
ICH USP
• Accuracy
• Precision
• Repeatability
• Intermediate precision
• Reproducibility
• Specificity
• Detection Limit
• Quantitation Limit
• Linearity
• Range
• Robustness
• Accuracy
• Precision
• Specificity
• Detection Limit
• Quantitation Limit
• Linearity
• Range
• Robustness is not part of formal
validation
Типові валідаційні характеристики
7. 1. Специфічність — здатність однозначно
оцінювати аналізовану речовину у присутності
інших компонентів, які можуть бути присутніми у
зразку. Це можуть бути домішки, продукти
розкладу, допоміжні речовини і т.д.
Недолік специфічності випробування може
бути компенсований іншим (іншими) додатковими
випробуваннями.
8. 2. Правильність характеризує ступінь
відповідності між відомим справжнім значенням
або довідковою величиною і значенням, одержаним
за даною методикою.
застосування аналітичної методики до зразка з відомим ступенем
чистоти;
порівняння результатів аналізу, з результатами арбітражного методу,
правильність і прецизійність якого відомі;
висновок про правильність можна зробити після того, як установлені
прецизійність, лінійність і специфічність.
Подання даних. Правильність оцінюють не менше як для
дев'яти визначень та не менш ніж для трьох різних концентрацій,
охоплюючих увесь діапазон застосування, наприклад три концентрації і
три визначення для кожної. Визначення мають включати усі стадії
методики.
Правильність виражають у відсотках знайденого значення від
уведеної кількості або як різницю між середнім і справжнім значенням
з урахуванням відповідних довірчих інтервалів.
9. 3. Прецизійність аналітичної методики виражає
ступінь близькості (або ступінь розкиду) результатів
для серії вимірів, виконаних за даною методикою на
різних пробах одного і того самого однорідного
зразка.
не менше дев'яти визначень, охоплюючих діапазон
застосування методики (наприклад, три концент
рації/три повтори)
або
не менше шести визначень для зразків із вмістом
аналізованої речовини, близьким до номінального.
10. 3.1. Збіжність характеризує прецизійність
методики при її виконанні в одних і тих самих
умовах (зокрема, одним і тим самим аналітиком
або групою аналітиків) протягом невеликого про
міжку часу.
3.2. Внутрішньолабораторна прецизійність
характеризує вплив внутрішньолабораторних
варіацій: різні дні, різні аналітики, різне
обладнання і т.п.
3.3. Відтворюваність характеризує прецизійність у
міжлабораторному експерименті.
Подання даних. Стандартне відхилення, відносне
стандартне відхилення і довірчий інтервал.
15. 4. Межа виявлення для конкретної аналітичної
методики являє собою мінімальну кількість аналізованої
речовини у зразку, яка може бути виявлена (при цьому
не обов'язково має бути визначене точне значення).
5. Межа кількісного визначення для аналітичної
методики являє собою мінімальну кількість аналізованої
речовини у зразку, яка може бути кількісно визначена з
потрібною правильністю і прецизійністю. Межа
кількісного визначення є валідаційною
характеристикою методик кількісного визначення
малих концентрацій речовин у зразку і розглядається в
основному при визначенні домішок і/або продуктів
розкладання.
16. 6. Лінійність це здатність методики (у межах
діапазону застосування) давати величини, прямо
пропорційні концентрації (кількості) аналізованої
речовини у зразку.
Для підтвердження лінійності
використовують не менше п'яти концентрацій. Інші
підходи мають бути обґрунтовані.
7. Діапазон визначення аналітичної методики є
інтервал між мінімальною і максимальною
концентраціями (кількостями) аналізованої
речовини у зразку (включаючи ці концентрації), для
якого показано, що аналітична методика має
потрібну прецизійність, правильність і лінійність.
17. 8. Робасність - це здатність аналітичної
методики не зазнавати впливу малих
контрольованих аналітиком змін в умовах
виконання методики. Робасність є
показником надійності методики при її
використанні у зазначених умовах.
18. Робасність
Типові приклади параметрів, які вивчаються:
— стійкість у часі аналітичних розчинів;
— час екстракції.
У разі рідинної хроматографії:
— рН рухомої фази;
— склад рухомої фази;
— колонки (різні серії і/або постачальники);
— температура;
— швидкість рухомої фази.
У разі газової хроматографії:
— колонки (різні серії і/або постачальники);
— температура;
— швидкість газу-носія.
19. РЕКОМЕНДАЦІЇ ЩОДО КРИТЕРІЇВ
ПРИ ПРОВЕДЕННІ ВАЛІДАЦІЇ ДЛЯ
МЕТОДИК КІЛЬКІСНОГО АНАЛІЗУ
• Вимоги до невизначеності аналізу.
• Критерії незначущості.
• Нормалізовані координати.
22. Реакція ідентифікації рибофлавіну розчином
срібла нітрату
№
р-ну
Мод.
розчин,
%
C,
мг/мл
0,02 % ізотонічний розчин рибофлавіну
Лаб. № 1 Лаб. № 2 Лаб. № 3
R, %
nk
α1
Р(Сk
) nk
α1
Р(Сk
) nk
α1
Р(Сk
)
1. 70 0.14 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 100
2. 85 0.17 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 100
3. 100 0.20 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 100
4. 115 0.23 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 100
5. 130 0.26 0 0 1 0 0 1 0 0 1 1 100
6. холост. 0 20 1 0 20 1 0 20 1 0 0 0
Результати дослідження ймовірності виявлення рибофлавіну за реакцією з срібла
нітратом у присутності натрію хлориду
Реакція зі срібла нітратом Модифікація методу
До 2 –3 мг рибофлавіну додають
2 мл води та 5-6 кр. срібла
нітрату, поступово утворюється
оранжево-червоне забарвлення.
Вивчення співвідношення лікарської форми та
реагенту: 1 мл (0.2 мг/мл) + 0.01 мл розчину
срібла нітрату. Вивчення специфічності реакції у
присутності натрію хлориду. Валідація методики
для розчинів аптечного виготовлення. у
концентраційному діапазоні 70 – 130 %.
)( kCP
Запропоновано методику
для ідентифікації
рибофлавіну у розчинах
аптечного виготовлення
в умовах аптек та
лабораторій з аналізу
23. Ідентифікація рибофлавіну за флуоресценцією
Опис існуючого методу Проведені дослідження
Спостереження флуоресценції у відбитому
світлі або світлі УФ лампи, її зникнення
після додавання розчину лугу чи кислоти.
Підбір пробопідготовки, 2∙10-5
г/мл . У ході валідації досліджено
достовірність ефекту реакції для 0.02 % та ізотонічного розчинів
рибофлавіну у діапазоні визначення 70 – 130 %.
№
р-ну
Мод.
р-н, %
C,
мг/мл
ізотонічний 0.02 % розчин рибофлавіну
Лаб. № 1 Лаб. № 2 Лаб. № 3
nk
α1
Р(Сk
) nk
α1
Р(Сk
) nk
α1
Р(Сk
)
1. 70 0.014 0 0 1 0 0 1 0 0 1
2. 85 0.017 0 0 1 0 0 1 0 0 1
3. 100 0.020 0 0 1 0 0 1 0 0 1
4. 115 0.023 0 0 1 0 0 1 0 0 1
5. 130 0.026 0 0 1 0 0 1 0 0 1
6. хол. 0 20 1 0 20 1 0 20 1 0
7. контр. 0.01 0 0 1 0 0 1 0 0 1
Опис існуючого методу Проведені дослідження
До 5 мл розведення 1∙10-5
г/мл додають 0.02 г
натрію гідросульфіту після чого зникає забарвлення
та флуоресценція розчину, які відновлюються при
струшуванні розчину на повітрі.
Підбір аліквот для аналізу. 0.2 мл ЛФ розводять до 2
мл водою Р та додають 0.01 г натрію гідросульфіту.
Вивчення достовірності ефекту реакції у діапазоні
визначення 70 – 130 %.
Реакція з натрію гідросульфітом
Вивчення достовірності ефекту реакції у концентраційному діапазоні
Специфічні випробування, що
дозволяють відрізнити
рибофлавін від речовин зі
схожими фізико-хімічними
властивостями в умовах аптеки.
Запропоновані для
впровадження в роботу аптек та
лабораторій.
24. Результати валідації методик ідентифікації кислоти
аскорбінової у порошках аптечного виготовлення
Рис. Крива ефективності реакції кислоти
аскорбінової з мідно-тартратним розчином
№
досліду
m(к-ти аск.),
мг/мл
Порошок кислоти
аскорбінової
Р(Сk
) R, %
1. 1 1 100
2. 1.5 1 100
3. 2 1 100
4. 2.5 1 100
5. 3 1 100
холост. 0 0 0
контр. 2 1 100
Достовірність ефекту реакції кислоти аскорбінової з
розчином 2,6-дихлорфеноліндофенолу
Для порошків з глюкозою:
•через можливість виявлення хибно-позитивного ефекту реакції ідентифікацію кислоти аскорбінової не
проводять з розчином срібла нітрату та мідно-тартратним розчином;
•використовують для ідентифікації реакції з розчином калію перманганату, 0.05 М розчином йоду,
2,6-дихлорфеноліндофенолу титрованим розчином.
Запропоновано для ідентифікації кислоти аскорбінової у порошках аптечного виготовлення
25. Методи кількісного визначення кислоти аскорбінової у
простих порошках
Критерії
прийнятності
Прописана маса простого порошку, г (Наказ МОЗ України № 626)
0.1 0.2 0.5 1.0
допуски вмісту, % ± 10 ± 10 ± 5 ± 3
max ΔAs
, % 3.2 3.2 1.6 0.96
max δRL(80, 120)
, % 2.14 2.14 1.07 0.64
max So
, % 1.0433 1.0433 0.5216 0.3130
min r 0.9988 0.9988 0.9993 0.9997
RSD range 21.9577 21.9577 14.6385 14.6385
max a 5.12 5.12 2.56 1.536
Критерії прийнятності валідаційних характеристик методик кількісного визначення кислоти аскорбінової
у простих порошках
За загальною статтею ДФУ «Приготування порошків «ex tempore» відхилення вмісту діючих речовин мають
становити не більше ± 10 % від вмісту.
Метод Опис обраних методів
Прогноз невизначеності
аналізу, %
Йодометричний розчин крохмалю Р, 0,05 М розчин йоду 0.97
Алкаліметричний розчин фенолфталеїну Р, 0,1 М розчин натрію гідроксиду 0.91
Йодохлорометричний розчин крохмалю Р, 0.05 М, розчин йодмонохлориду 0.97
Йодатометричний
розчин кислоти хлористоводневої, 1% розчин калію йодиду,
розчин крохмалю Р, 0.0167 М розчин калію йодату
0.97
26. Порівняння метрологічних характеристик титриметричних методик
кількісного визначення кислоти аскорбінової у простих порошках
Валідаційні
параметри
Йодометричний
метод
Алкаліметричний
метод
Йодохлорометричний
метод
Йодатометричний
метод
Лаб.1 Лаб.2 Лаб.1 Лаб.2 Лаб.1 Лаб.2 Лаб.1 Лаб.2
Вивчення точності та правильності
Z, % 100.23 100.45 100.37 99.83 101.39 101.66 99.62 99.77
Sz
, % 0.6766 0.2637 0.4922 0.6083 0.5242 0.4247 0.8499 0.5827
Δz
, % 1.1917 0.4645 0.8669 1.0714 0.9233 0.7480 1.4969 1.0263
δ, % 0.23 0.45 0.37 0.17 1.39 1.66 0.38 0.23
Вивчення лінійності
b 0.9870 0.9994 1.0269 1.0267 1.0401 1.0203 1.0204 1.00896
a 1.0298 0.5086 2.2815 2.7907 2.5693 0.3585 2.3830 1.1014
Вивчення відтворюваності
Zintra
, % 100.34 100.10 101.53 99.70
SDz
, % 0.5253 0.6191 0.4895 0.7356
Δintra
, % 0.3263 0.3846 0.3041 0.4569
Інформаційний лист № 192 – 2009 “Контроль якості порошків аптечного виготовлення, які містять
кислоту аскорбінову”, на який отримано 11 актів впроваджень.
Для порошку 1.0: max ΔAs
= 0.96 %, max δ= 0.64 %, max So
= 0.3130 %, min r = 0.9997, RSD range=14.6385, max a=1.534.
27. Розробка та валідація спектрофотометричної методики
кількісного визначення піридоксину г/хл
0.0000
0.2500
0.5000
0.7500
275.00 300.00 325.00 350.00 375.00
291.00nm, 0.8817A
Absorbance
A
nm
Рис. 6. Спектр поглинання піридоксину
гідрохлориду у 0.1 М кислоті
хлористоводневій
Z, % 100.38
Szi
, % 0.33
Δintra
, % 0.04
max ΔAs
, % 2.56
δZintra 0.38
δmax 0.82
Таблиця 15
Результати вивчення
відтворюваності
аналітичної методики
№
р-ну
середнє RSDt
,% Δt, % δmax
, %
Аst
* 0.3975 0.31 0.66
0.82
Ах
* 0.4001 0.32 0.68
Таблиця 14
Вивчення стабільності аналітичного розчину та
розчину стандарту протягом 60 хв.
Патент на корисну модель № 55080
Опис існуючого методу Розробка та дослідження
Спектрофотометрія в УФ та видимій областях
для 5 % розчину, МПП, АДХ 292 нм. Вивчено
лінійність у діапазоні 2∙10-5
-7.5∙10-5
г/мл,
розчинник вода Р.
МС, АДХ 292 нм. Розрахунок невизначеності та підбір порядку та схеми
розведення, Δsp =1.1 %. Робасність, заміна розчинника 0.1 М HCl та
розведення 1∙10-5
г/мл. Дослідження лінійності у діапазоні 0.8∙10-5
-1.2∙10-5
г/мл.
Валідація для 0.2 % розчину піридоксину гідрохлориду. СФ-46, Specord-200.
Таблиця 13
Стійкість оптичної густини до зміни
значення рН водного розведення 1∙10-5
г/мл
Рис. 5. Спектр поглинання піридоксину
гідрохлориду у воді Р
0.0000
0.1000
0.2000
0.3000
0.4000
0.5000
0.6000
275.00 300.00 325.00 350.00 375.00
292.00nm, 0.5816A
324.00nm, 0.2802A
Absorbance
A
nm
80,00
85,00
90,00
95,00
100,00
105,00
110,00
115,00
120,00
125,00
80,00 90,00 100,00 110,00 120,00
Хі, %
Yi,%
Xi, % Спектрофотометричний метод
Рис. 7. Графік лінійної залежності
оптичної густини від
концентрації піридоксину
гідрохлориду у нормалізованих
координатах
рН
розчину
А, оптична густина ΔpH
4.53 0.690 0.689 0.687
48.9 %
>>δmax
4.05 0.619 0.615 0.617
5.10 0.373 0.373 0.374
28. Вибір прийнятної об’ємної методики кількісного визначення
піридоксину г/хл
80,00
85,00
90,00
95,00
100,00
105,00
110,00
115,00
120,00
125,00
80,00 90,00 100,00 110,00 120,00
Хі, %
Yi,%
Xi, %
Yi=0,9897xi+0,7735 (індикатор - бромфеноловий синій)
Yi=1,015854xi+2,6754 (індикатор - калію хромат)
80,00
85,00
90,00
95,00
100,00
105,00
110,00
115,00
120,00
125,00
80,00 90,00 100,00 110,00 120,00
Хі, %
Yi,%
Хі, %
Yi=1,019702xi-1,3099 (лаб. №1)
Yi=0,98142xi+2,6898 (лаб. №2)
Рис. Графік лінійної залежності методу алкаліметрії Рис. Графік лінійної залежності методу аргентометрії
Таблиця 16
Результати вивчення метрологічних характеристик
18
Метод S δ
Алкаліметричний 100.64 0.54 0.14 0.24 0.64 100.64±0.24
Аргентометричний (інд. калію
хромат) Мора
104.27 1.11 0.29 0.51 4.27 104.27±0.51
Аргентометричний (інд.
бромфеноловий синій) Фаянса
99.76 0.48 0.12 0.22 0.24 99.76±0.22
,%
__
X X
s X
∆ ,%X
X ∆+
Критерії прийнятності, %
Допуски за
АНД
±8
maxΔAs 2.56
δmax 1.64
S0 1.45
Rc 0.9951
а 4.096
Алкаліметричний та аргентометричний методи запропоновані для використання в умовах
аптек та лабораторій з аналізу якості
