Nghiên Cứu Chế Tạo Kit Chẩn Đoán Nhanh Streptococcus Suis Type 2 Lợn.doc

TẢI TÀI LIỆU KẾT BẠN ZALO 0973.287.149
Nhận viết đề tài trọn gói – ZL: 0973.287.149 – Luanvanmaster.com
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
LÊ QUỐC VIỆT
NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN
NHANH STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2
Ở LỢN
LUẬN ÁN TIẾN SĨ
NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP - 2019

HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
LÊ QUỐC VIỆT
NGHIÊN CỨU CHẾ TẠO KIT CHẨN ĐOÁN
NHANH STREPTOCOCCUS SUIS TYPE 2
Ở LỢN
Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi
Mã số:
: PGS.TS. Đinh Thn Anh Đào
9640102
Người hướng dẫn khoa học ị Bích Lân
PGS.TS. Bùi Trầ
NHÀ XUẤT BẢN HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP – 2019

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi, các kết quả
nghiên cứu được trình bày trong luận án là trung thực, khách quan và chưa từng
dùng để bảo vệ lấy bất kỳ học vị nào.
Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận án đã được cám
ơn, các thông tin trích dẫn trong luận án này đều được chỉ rõ nguồn gốc.
Hà Nội, ngày… tháng… năm 2019
Tác giả luận án
Lê Quốc Việt
ii

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án, tôi đã nhận
được sự hướng dẫn, chỉ bảo tận tình của các thầy cô giáo, sự giúp đỡ, động viên của
bạn bè, đồng nghiệp và gia đình.
Nhân dịp hoàn thành luận án, cho phép tôi được bày tỏ lòng kính trọng và biết
ơn sâu sắc PGS.TS. Đinh Thị Bích Lân và PGS.TS. Bùi Trần Anh Đào đã tận tình
hướng dẫn, dành nhiều công sức, thời gian và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình
học tập và thực hiện đề tài.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới Ban Giám đốc, Ban Quản lý đào tạo,
Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa Thú y - Học viện Nông nghiệp Việt Nam và Viện Công
nghệ Sinh học – Đại học Huế đã tận tình giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, thực hiện
đề tài và hoàn thành luận án.
Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể lãnh đạo, cán bộ viên chức Viện Công nghệ Sinh
học – Đại học Huế đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Đặc biệt, tôi xin chân thành cám ơn tác giả Hoàng Thị Thùy Nhung, Đinh Thị Bích
Lân, Đặng Thanh Long, Huỳnh Văn Chương, Lê Công Thịnh, Phùng Thăng Long,
Nguyễn Xuân Hòa, Lê Đức Thạo và Bùi Trần Anh Đào đã cho phép tôi sử dụng kết
quả nghiên cứu đã công bố vào một phần nội dung của luận án.
Xin chân thành cảm ơn gia đình, người thân, bạn bè, đồng nghiệp đã tạo mọi điều
kiện thuận lợi và giúp đỡ tôi về mọi mặt, động viên khuyến khích tôi hoàn thành luận án./.
Hà Nội, ngày ... tháng ... năm 2019
Nghiên cứu sinh
Lê Quốc Việt
iii

MỤC LỤC
Lời cam đoan ......................................................................................................................................... ii
Lời cảm ơn ............................................................................................................................................. iii
Mục lục.....................................................................................................................................................iv
Danh mục chữ viết tắt........................................................................................................................vii
Danh mục bảng....................................................................................................................................viii
Danh mục hình........................................................................................................................................ix
Trích yếu luận án....................................................................................................................................xi
Thesis abstract......................................................................................................................................xiii
Phần 1. Mở đầu.....................................................................................................................................1
1.1. Tính cấp thiết của đề tài .........................................................................................................1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài............................................................................................3
1.3. Phạm vi nghiên cứu..................................................................................................................3
1.4. Những đóng góp mới của đề tài .........................................................................................3
1.5. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài.........................................................................3
1.5.1. Ý nghĩa khoa học.....................................................................................................................3
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn......................................................................................................................3
Phần 2. Tổng quan tài liệu.............................................................................................................4
2.1. Tổng quan tình hình nghiên cứu...........................................................................................4
2.1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trong nước và trên
thế giới .........................................................................................................................................4
2.2. Một số đặc tính của liên cầu khuẩn lợn.............................................................................7
2.2.1. Đặc điểm hình thái ...................................................................................................................8
2.2.2. Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa...............................................................................................9
2.2.3. Sức đề kháng........................................................................................................................... 10
2.2.4. Cấu trúc kháng nguyên......................................................................................................... 11
2.2.5. Khả năng gây bệnh............................................................................................................... 13
2.3. Triệu chứng và bệnh tích của bệnh do vi khuẩn S. Suis gây ra ............................. 14
2.3.1. Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S. suis gây ra ở lợn ..................................... 14
2.3.2. Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S. suis gây ra ở người................................ 16
2.4. Chẩn đoán ............................................................................................................................... 17
iv

2.4.1. Chẩn đoán bằng phương pháp PCR............................................................................. 18
2.4.2. Chẩn đoán bằng phương pháp ELISA......................................................................... 19
2.5. Điều trị....................................................................................................................................... 19
2.5.1. Điều trị bằng thuốc kháng sinh .......................................................................................... 19
2.5.2. Điều trị bệnh bằng huyết thanh.......................................................................................... 20
2.6. Giới thiệu về hạt nano vàng và kỹ thuật sắc ký miễn dịch........................................ 20
2.6.1. Tổng quan về hạt nano vàng............................................................................................... 20
2.6.2. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch................................................................................................... 20
Phần 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu....................................................................... 26
3.1. Vật liệu nghiên cứu............................................................................................................... 26
3.2. Nội dung nghiên cứu............................................................................................................. 26
3.2.1. Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2................... 26
3.2.2. Nghiên cứu chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng Streptococcus suis type 2....... 27
3.2.3. Nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể kháng Streptococcus suistype 2...... 27
3.2.4. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus
suis type 2................................................................................................................................ 27
3.3. Phương pháp nghiên cứu.................................................................................................. 27
3.3.1. Phương pháp sản xuất kháng nguyên của Streptococcus suis type 2.............. 27
3.3.2. Phương pháp chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng S. suis type 2 ........................... 33
3.3.3. Phương pháp nghiên cứu chế tạo conjugate - kháng thể kháng
Streptococcus suis type 2................................................................................................ 37
3.3.4. Phương pháp đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh
3.3.5. Phương pháp phân tích số liệu........................................................................................ 40
Phần 4. Kết quả và thảo luận.................................................................................................... 41
4.1. Nghiên cứu sản xuất kháng nguyên Streptococcus suis type 2........................... 41
4.1.1. Tình hình nhiễm Streptococcus suis type 2 ở lợn giết mổ .................................... 41
4.1.2. Phân lập và xác định đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn S. suis type 2... 44
4.1.3. Chế tạo kháng nguyên thô từ vi khuẩn S. suis type 2............................................... 55
4.2. Kết quả nghiên cứu sản xuất kháng thể đa dòng kháng S. Suis type 2 ............. 57
4.2.1. Kết quả xác định tính sinh miễn dịch của kháng nguyên .......................................... 57
v

4.2.2. Kết quả xác định lượng kháng nguyên thích hợp cho khả năng đáp ứng
miễn dịch ở chuột SA........................................................................................................... 60
4.2.3. Kết quả xác định chất bổ trợ thích hợp cho khả năng sinh miễn dịch của
chuột SA................................................................................................................................... 63
4.2.4. Chế tạo, tách chiết và định lượng kháng thể IgG kháng S. suis type 2 .............. 66
4.2.5. Xác định hiệu giá kháng thể sau tinh chế ....................................................................... 71
4.3. Kết quả nghiên cứu chế tạo Conjugate – kháng thể kháng S. Suis type 2.......... 72
4.3.1. Xác định pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể với hạt
vàng nano ................................................................................................................................. 72
4.3.2. Xác định nồng độ kháng thể kháng S. suis type 2 tối ưu để gắn với hạt vàng
nano............................................................................................................................................ 74
4.3.3. Kết quả chế tạo kháng thể cộng hợp................................................................................ 77
4.4. Kết quả đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của kit chẩn đoán nhanh
4.4.1. Kết quả xác định nồng độ kháng thể bắt vi khuẩn thích hợp................................... 79
4.4.2. Kết quả xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT.................................................... 81
Phần 5. Kết luận và kiến nghị................................................................................................... 87
5.1. Kết luận..................................................................................................................................... 87
5.2. Kiến nghị .................................................................................................................................. 88
Danh mục các công trình đã công bố liên quan đến luận án .............................................. 89
Tài liệu tham khảo............................................................................................................................... 90
Phụ lục..................................................................................................................................................103
vi

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt Diễn giải
6PGD : 6-phosphogluconate-dehydrogenase
ADN : Acid deoxyribo nucleic
ARN : Axit ribonucleic
Bp : Base pair
dNTP : deoxyribonucleotide triphosphate
E. coli : Escherichia coli
ELISA : Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay/
xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme
ICT : Immunochromatographic test/
Kỹ thuật sắc ký miễn dịch
IPTG : Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside
kb : Kilobase
kDa : Kilodalton
NC : Nitrocellulose
PBS : Phosphat Buffer Saline
PCR : Polymerase Chain Reaction/ phản ứng khuếch đại gene
S. suis : Streptococcus suis
SDS : Sodium dodecyl sulfate
X-gal : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galacto- pyranoside
vii

DANH MỤC BẢNG
TT Tên bảng Trang
3.1. Thành phần phản ứng PCR phát hiện S. suis type 2............................................... 29
3.2. Chu trình nhiệt cho PCR phát hiện mẫu dương tính............................................... 29
3.3. Thành phần PCR nhân đoạn gene 6PGD................................................................... 30
3.4. Chu trình nhiệt cho phản ứng nhân gene 6PGD......................................................... 31
3.5. Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tạo dòng............................ 31
3.6. Bố trí thí nghiệm xác định lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối
miễn dịch ............................................................................................................................... 34
3.7. Bố trí thí nghiệm xác định chất bổ trợ thích hợp để gây tối miễn dịch.............. 34
3.8. Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh............................ 39
4.1. Tỷ lệ nhiễm liên cầu lợn type 2 ở lợn tại một số lò mổ trên địa bàn Thừa
Thiên Huế.............................................................................................................................. 42
4.2. Kết quả sinh hóa chủng vi khuẩn THHSS2................................................................. 50
4.3. Sự sai khác của gene 6PGD của vi khuẩn S. suis type 2 chủng TTHSS2
phân lập được với gene 6PGD của vi khuẩn S. suis type 2 chủng SC 19 trên
ngân hàng gene .................................................................................................................... 54
4.4. Kết quả đánh giá khả năng sinh miễn dịch của kháng nguyên .......................... 58
4.5. Ảnh hưởng của liều lượng kháng nguyên đến đáp ứng miễn dịch của
chuột SA ................................................................................................................................ 61
4.6. Ảnh hưởng của chất bổ trợ đến đáp ứng miễn dịch của chuột SA .................... 64
4.7. Kết quả chế tạo kháng thể kháng S. suis type 2 ....................................................... 67
4.8. Kết quả phát hiện vi khuẩn S. suis type 2 ở các nồng độ kháng thể bắt
khác nhau............................................................................................................................... 81
4.9. Ngưỡng phát hiện của KIT phát hiện nhanh vi khuẩn S. suis type 2................. 83
4.10. Đánh giá độ đặc hiệu của KIT ....................................................................................... 85
4.11. Kết quả xác định độ đặc hiệu và độ nhạy của KIT................................................. 86
viii

DANH MỤC HÌNH
TT Tên hình Trang
2.1. Hình ảnh nhuộm gram vi khuẩn S. suis ...................................................................... 8
2.2. Cấu trúc KIT chẩn đoán nhanh .....................................................................................22
2.3. Cơ chế hoạt động của KIT chẩn đoán nhanh............................................................24
3.1. Cấu trúc vector pGEM®
-T Easy Vector Systems (Promega)................................32
4.1. Kết quả PCR kiểm tra mẫu dương tính với S. suis type 2..................................42
4.2. Kết quả phân lâp vi khuẩn Streptococcus suis trên môi trường thạch máu
cừu 5% .....................................................................................................................................44
4.3. Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn Streptococcus suis từ khuẩn lạc .................45
4.4. Kết quả nhuộm Gram vi khuẩn Streptococcus suis từ canh khuẩn..............46
4.5. Kết quả kiểm tra Streptococcus spp trên môi trường Bile Esculin agar.......47
4.6. Kết quả lên men đường glucose và lactose của vi khuẩn S. suis......................48
4.7. Kết quả kiểm tra tính di động của vi khuẩn..............................................................48
4.8. Kiểm tra khả năng sinh indol của vi khuẩn S. suis...............................................49
4.9. Kết quả PCR kiểm tra chủng vi khuẩn TTHSS2 ....................................................50
4.10. Kết quả PCR nhân đoạn gen 6PGD của chủng TTHSS2.....................................51
4.11. Kết quả biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E. coli Top 10 ..........52
4.12. Kết quả PCR nhân gen 6PGD trực tiếp từ khuẩn lạc trắng và kết quả các
khuẩn lạc trắng PCR cùng cặp mồi M13 ...................................................................53
4.13. So sánh mức độ tương đồng của amino acid mã hóa từ đoạn gene 6PGD
của chủng TTHSS2 và đoạn gene đã được công bố WP_012028448.1 ...........54
4.14. Kết quả cấy vi khuẩn TTHSS2 bất hoạt cấy trên môi trường thạch máu
cừu 5% .....................................................................................................................................56
4.15. Kết quả đánh giá tính an toàn của kháng nguyên TTHSS2................................59
4.16. So sánh đáp ứng chuột khi được tiêm kháng nguyên S. suis type 2 với các
liều khác nhau .......................................................................................................................62
4.17. Đáp ứng miễn dịch của chuột được tiêm kháng nguyên S. suis type 2 phối
trộn với các chất bổ trợ khác nhau...............................................................................65
4.18. Gel nhuộm màu Coomassie Blue SDS-PAGE của các mẫu kháng thể đã
tinh sạch...................................................................................................................................68
ix

4.19. Kết quả xác định nồng độ protein kháng thể bằng Pierce BCA Protein
Assay Kit ..................................................................................................................................69
4.20. Đồ thị đường chuẩn BSA...................................................................................................69
4.21. Kết quả xác định nồng độ kháng thể sau tinh sạch ................................................70
4.22. Kết quả ELISA xác định hiệu giá kháng thể sau tinh sạch .................................71
4.23. Kết quả xác định pH của dung dịch gold colloid thích hợp để gắn kháng thể
với hạt vàng nano.................................................................................................................72
4.24. Kết quả xác định pH dung dịch gold colloid thích hợp.........................................73
4.25. Kết quả xác định nồng độ kháng thể thích hợp để gắn vàohạt vàng nano....75
4.26. Kết quả xác định nồng độ kháng thể thích hợp để gắn với dung dịch gold
colloid........................................................................................................................................75
4.27. Kết quả sản xuất kháng thể cộng hợp..........................................................................78
4.28. Kết quả chế tạo đệm conjugate kháng thể (conjugate pad) ................................78
4.29. Kết quả xác định nồng độ kháng thể bắt thích hợp................................................80
4.30. Kết quả xác định độ nhạy của Kit .................................................................................83
4.31. Kết quả xác định độ đặc hiệu của Kit ..........................................................................85
x

TRÍCH YẾU LUẬN ÁN
Tên tác giả: Lê Quốc Việt
Tên Luận án: Nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 ở lợn
Chuyên ngành: Bệnh lý học và chữa bệnh vật nuôi Mã số: 9.64.01.02
Tên cơ sở đào tạo: Học viện Nông nghiệp Việt
Nam Mục đích nghiên cứu
Chế tạo được KIT phục vụ công tác chẩn đoán nhanh vi khuẩn Streptococcus
suis type 2 (streptococcosis) ở lợn.
Phương pháp nghiên cứu
Để nghiên cứu các nội dung: nghiên cứu sản xuất kháng nguyên của Streptococcus
suis type 2; Nghiên cứu chế tạo kháng thể đặc hiệu kháng Streptococcus suis type 2;
Nghiên cứu chế tạo conjugate-kháng thể chống Streptococcus suis type 2 và đánh giá độ
nhạy, độ đặc hiệu của KIT chẩn đoán nhanh Streptococcus suis type 2 (S. suis type 2).
Luận án sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu CPS2 để xác định tình hình
nhiễm vi khuẩn Streptococcus suis type 2 ở lợn khỏe tại một số địa điểm giết mổ trên
địa bàn Thừa Thiên Huế.
Vi khuẩn S. suis type 2 thuần chủng được phân lập bằng phương pháp cấy trên
môi trường thạch máu cừu 5%, định danh bằng các phản ứng sinh hóa và phương
pháp PCR với cặp mồi CPS2. Đặc tính sinh học phân tử của vi khuẩn S. suis type 2
phân lập được được xác định dựa trên gene bảo thủ 6PGD bằng phương pháp PCR
và tạo dòng gene trong vector pGem T easy.
Vi khuẩn S. suis type 2 thuần được bất hoạt để chế tạo kháng nguyên thô bằng
dung dịch formaldehyte 1%. Kháng thể kháng S. suis type 2 được chế tạo bằng
phương pháp tiêm kháng nguyên và chất bổ trợ vào phúc mạc của chuột nhắt trắng
Swiss abino. Kháng thể kháng S. suis type 2 thu từ huyết thanh chuột được tinh sạch
bằng KIT Econo-Pac protein A (Bio-rad).
KIT phát hiện nhanh vi khuẩn được chế tạo dựa trên phương pháp sắc ký miễn
dịch với kháng thể cộng hợp được chế tạo bằng dung dịch gold colloid (DCN, 40nm)
kết hợp với kháng thể kháng S. suis type 2. Kháng thể kháng S. suis type 2 và kháng
thể dê kháng chuột được phun lên màng nitrocellulose ở đường kiểm tra và đường đối
chứng bằng máy Biodot XYZ3060D0003.
xi

Kết quả chính và kết luận
Với kết quả PCR, kết quả xác định vi khuẩn S. suis type 2 trên lợn khỏe tại Thừa
thiên Huế cho thấy tỷ lệ nhiễm liên cầu lợn type 2 của lợn phân lập tại lò mổ Bạch Yến là
13,33%, lò mổ Bãi Dâu là 7,50% và lò mổ Xuân Phú là 6,67%. Như vậy, tính tổng tỷ
lệ nhiễm S. suis type 2 trên địa bàn Thừa Thiên Huế là 9,00%.
Kết quả xác định đặc tính sinh học của vi khuẩn S. suis type 2 dựa trên gene
bảo thủ 6PGD cho thấy đoạn gen 6PGD phân lập được có độ dài 1428 bp và có độ
tương đồng 99% với gen 6PGD đã được công bố (gb|CP000407.1|).
Chủng vi khuẩn S. suis type 2, đặt tên là TTHSS2 được bất hoạt bằng dung dịch
formaldehyte 1% để chế tạo kháng nguyên. Kết quả nghiên cứu cho thấy kháng
nguyên TTHSS2 có tính sinh miễn dịch cao, lượng kháng nguyên thích hợp để gây tối
miễn dịch ở chuột nhắt trắng swiss abino là 1,5x108
CFU/chuột và chất bổ trợ thích hợp
là Freund với liều tiêm là 400 µl/chuột (200 µl kháng nguyên+ 200 µl chất bổ trợ).
Kết quả điện di SDS-PAGE cho thấy kháng thể kháng S. suis type 2 có nồng độ
và độ tinh sạch cao. Hàm lượng kháng thể thu được cao nhất là 2000 µg/ml và thấp
nhất là 100 µg/ml. Kết quả ELISA xác định hiệu giá kháng thể sau tinh sạch cho thấy,
hiệu giá các mẫu kháng thể kháng vi khuẩn S. suis type 2 (nồng độ 1000 µg/ml, pha
loãng ban đầu 10 lần) tương đối đồng đều, dao động từ 7log2 đến 8log2.
Kết quả chế tạo kháng thể cộng hợp cho thấy pH của dung dịch gold colloid thích
hợp để gắn kháng thể với hạt vàng nano pH 8.0 và nồng độ kháng thể thích hợp là 360
µg/µl. Nồng độ kháng thể bắt vi khuẩn thích hợp phun lên màng nitrocellulose là 2000
µg/ml. Nồng độ vi khuẩn tối thiểu trong mẫu KIT có thể phát hiện là 5x 106
CFU/ml (5x
105
CFU trong 100 µl mẫu). KIT có độ đặc hiệu cao, không phản ứng chéo với các loài
E. coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835, Staphylococcus aureus
ATCC 25923 và các chủng liên cầu không phải type 2. Độ nhạy và độ đặc hiệu của
KIT lần lượt là 93,33% và 100,00% khi được so sánh với phương pháp PCR.
xii

THESIS ABSTRACT
PhD candidate: Le Quoc Viet
Thesis title: Development of rapid KIT for identification of Streptococcus suis type 2 in pig.
Major: Veterinary pathology and Therapeutics of the diseases of domestic animals
Code: 9.64.01.02
Educational organization: Vietnam National University of Agriculture (VNUA)
Research Objectives
Manufacture KIT for rapid detection Streptococcus suis type 2 in pig.
Materials and Methods
The dissertation focuses on the following subjects: Production of Streptococcus
suis type 2 antigen; Production of Streptococcus suis type 2 (S. suis type 2) specific
antibody; Development conjugate-antibody against S. suis type 2 and evaluation its
sensitivity, specificity of rapid diagnosis KIT for S. suis type 2. In order to perform
above subjects, PCR method using CPS2 specific primers was carried out to determine
the prevalence of S. suis type 2 infection in healthy pigs in some slaughter sites in Thua
Thien Hue.
S. suis type 2 was isolated by culture on 5% sheep blood agar, biochemical
properties were characterized and PCR assay was performed using CPS2 primer.
Molecular identification of S. suis type 2 isolates was determined base on highly
conserved 6PGD gene by PCR and gene was cloned in the pGem-T easy vector.
S. suis type 2 was inactivated to produce crude antigen with 1% formaldehyde
solution. S. suis type 2 antibodies were prepared by injection of antigen plus adjuvant
to the peritoneal mucosa of the Swiss abino mice. Antibody against S. suis type 2 in
serum mice was purified by KIT Econo-Pac protein A (Bio-rad).
S. suis type 2 rapid detection KIT was developed through immuno-affinity
chromatography with conjugate-antibody created from a gold colloid solution (DCN,
40nm) supplemented S. suis type 2 antibodies. S. suis type 2 antibodies and Anti-
Mouse IgG antibody produced in goat were sprayed onto the nitrocellulose membrane in
the test line and control line by Biodot XYZ3060D0003 instrument.
xiii

Main findings and conclusions
PCR results showed that the prevalence of S. suis type 2 infection in healthy pigs
collected at slaughterhouse in Thua Thien Hue were 9,00% (13.33%, 7,50% and 6,67%
from Bach Yen, Bai Dau and Xuan Phu laughterhouse, respectively).
Results on determination the molecular identification of S. suis type 2 isolated
based on 6PGD gene showed that that the 6PGD gene was 1428 bp long and had 99%
similarity with the 6PGD gene on GenBank database (gb |CP000407.1|).
The S. suis type 2 strain, named TTHSS2, was inactivated with a 1%
formaldehyde solution to produce antigen. The results showed that the antigen had
highly immunogenicity. Appropriate amount of antigen and adjuvant for hyperimunity
in swiss abino mice was 1,5x108
CFU/mice and Freund with injection dose of 400
μl/mice (200 μl antigen + 200 μl adjuvant).
SDS-PAGE showed that S. suis type 2 antibodies had high concentration and
purity. The highest antibody concentration was 2000 μg / ml and the lowest was
100 μg/ml. The ELISA analysis indicated that titers of purified S. suis type 2
antibodies (concentration 1000 μg/ml, initial dilution 10 times) was similar, ranged
from 7log2 to 8log2.
Conjugate-antibody production resulted in suitable pH of the gold colloid solution and
S. suis type 2 antibody concentration for binding between S. suis type 2 antibodies and
gold nano were 8.0 and 360 µg/ml. The appropriate conjugated antibodies
concentration spray in nitrocellose membrane was 2000 μg/ml. Minimum bacterial
concentrations in sample could be detected by KIT was 5x106
CFU/ml (5x105
CFU in
100 μl samples). The KIT had high sensitivity and specificity with no cross-reaction
between E. coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27835,
Staphylococcus aureus ATCC 25923. Similar results were observed on other S. suis
serotype. The sensitivity and specificity of the KIT were 93.33% and 100,00%,
respectively in compared to PCR method.
xiv

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.1. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Một trong những căn bệnh lây nhiễm từ thịt lợn có thể gây nguy hiểm cho
con người là bệnh liên cầu khuẩn lợn. Đây là một bệnh truyền nhiễm do loại liên
cầu khuẩn Streptococcus suis (S. suis) gây ra. Bệnh có thể xảy ra ở hầu hết các
loài động vật máu nóng, trong đó lợn và người là chủ yếu.
Dựa vào đặc điểm của các polysaccharid ở lớp vỏ bọc vi khuẩn, xác định
vi khuẩn liên cầu lợn có 35 type huyết thanh. Trong đó, S. suis type 2 thường
gây bệnh ở người và động vật (Smith et al., 1999).
Vi khuẩn liên cầu lợn có khắp nơi trong tự nhiên, ổ chứa là lợn nhà. Cả
lợn rừng, ngựa, chó, mèo và chim cũng có thể mang vi khuẩn liên cầu lợn.
Những loài động vật này mang mầm bệnh nhưng chúng không gây bệnh hoặc
chỉ gây bệnh nhẹ, khi gặp điều kiện thuận lợi chúng mới gây nguy hiểm
(Nguyễn Vĩnh Phước, 1987; Nguyễn Như Thanh và cs., 2001).
Bệnh ở lợn biểu hiện bằng viêm màng não, nhiễm khuẩn huyết, viêm
phổi, viêm nội tâm mạc và viêm khớp. Thông thường người bị nhiễm vi khuẩn
do tiếp xúc trực tiếp với lợn bệnh, lợn chết hoặc ăn tiết canh lợn, thịt lợn bệnh,
lợn chết chưa được nấu chín kỹ (Lê Văn Tạo, 2005).
Con đường lây truyền từ lợn sang người có thể qua vết thương ở da,
đường hô hấp, tiếp xúc với máu, các dịch tiết ở lợn bệnh hoặc qua đường ăn
uống. Ruồi, gián, chuột là những động vật trung gia làm phát tán mầm bệnh
(Vecht et al., 1992).
Vi khuẩn liên cầu lợn gây ra hai bệnh cảnh chính là viêm màng não và nhiễm
khuẩn huyết, nặng có thể gây sốc nhiễm khuẩn, suy đa phủ tạng, viêm nội tâm
mạc... Nếu không được phát hiện bệnh sớm và điều trị kịp thời, người bệnh có thể
tử vong. Cho dù bệnh nhân hồi phục, bệnh vẫn có thể để lại những di chứng nặng
nề như bị ù tai, giảm thính lực, điếc hoàn toàn… (Vecht et al., 1992).
Thời gian ủ bệnh ngắn, từ vài giờ đến 3 ngày. Khi khởi phát, người bệnh có
các triệu chứng như sốt cao có thể kèm theo rét run; mệt, đau mỏi người; đau đầu,
buồn nôn và nôn, đau bụng, tiêu chảy; có thể mê sảng, ngủ gà, hôn mê. Những
trường hợp nhiễm khuẩn huyết có thể xuất huyết dưới da, ban xuất huyết
1

hoại tử lan rộng ở mặt, ngực, chân, tay và đầu các chi (Arends and Zanen,
1988; Tan et al., 2008b).
Các phương pháp chẩn đoán bệnh do liên cầu khuẩn lợn gây ra thường
dùng là phương pháp nhuộm gram, phương pháp phân lập vi khuẩn trên các môi
trường chuyên dụng, phương pháp PCR. Không dừng lại ở đó, việc ứng dụng và
phát triển công nghệ ADN tái tổ hợp đã mở ra cho các nhà khoa học rất nhiều
hướng đi trong việc tìm phương pháp chẩn đoán cũng như xây dựng các hệ
thống phòng bệnh một cách hiệu quả hơn. Các vùng gene chỉ thị của S. suis type
2 được biểu hiện thành các protein tái tổ hợp. Tiếp theo đó, dựa trên cơ sở tính ưu
việt của phản ứng miễn dịch là sự liên kết đặc hiệu của kháng nguyên và kháng thể
để phát triển các phương pháp chẩn đoán có độ nhạy và độ đặc hiệu cao. Các
phương pháp ELISA, phương pháp dot blot đã được ứng dụng rộng rãi trong
việc chẩn đoán căn bệnh này ở các nước trên thế giới (Torremorell et al., 1997;
Okwumabua and Chinnapapakkagari, 2005; Mandanici et al., 2010). Trong
những năm gần đây, trên thế giới đã phát triển loại KIT chẩn đoán nhanh dựa
trên phương pháp sắc kí miễn dịch (ICT). KIT có độ đặc hiệu, độ chính xác cao,
không cần phòng thí nghiệm, không cần thiết bị và kỹ thuật viên có trình độ cao,
giúp phát hiện bệnh sớm, điều trị kịp thời, giảm thiểu được thiệt hại cho người,
động vật bị bệnh. Nhiều nhà khoa học đã nghiên cứu phát triển KIT chẩn đó nhanh
như Sheng et al. (2012) đã nghiên cứu chế tạo KIT phát hiện khối u ở cá, Wang et
al. (2014) với nghiên cứu chế tạo KIT phát hiện kháng thể kháng giun tròn
Paragonimiasis skrjabini. Tại Việt Nam, một số nhà nghiên cứu đã ứng dụng kĩ
thuật ICT để chế tạo KIT phát hiện nhanh kháng nguyên và kháng thể như Đinh
Thị Bích Lân và cs. (2009) với công trình nghiên cứu KIT chẩn đoán nhanh phát
hiện kháng thể kháng kí sính trùng Toxoplasma gondii. Nguyễn Hoàng Lộc và cs.
(2015) với công trình nghiên cứu KIT phát hiện kháng nguyên bám dính F4. Thế
nhưng chưa có tác giả nào nghiên cứu chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh do liên
cầu khuẩn type 2 ở người và động vật. Vì vậy, chế tạo KIT chẩn đoán nhanh bệnh
do liên cầu khuẩn type 2 mang tính cấp thiết và có ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực
tiễn. KIT chẩn đoán nhanh sẽ đáp ứng tốt nhu cầu phát hiện bệnh sớm cũng như
kiểm soát tình trạng mang mầm bệnh ở gia súc, kịp thời có biện pháp bảo vệ sức
khỏe cho cộng đồng, nâng cao hiệu quả chăn nuôi.
2

1.2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU CỦA ĐỀ TÀI
Chế tạo được KIT phục vụ công tác chẩn đoán nhanh vi khuẩn
Streptococcus suis type 2 ở lợn.
1.3. PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu: lợn tại các lò giết mổ; vi khuẩn Streptococcus
suis type 2 phân lập được từ mẫu dịch mũi lợn.
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 12/2014 đến tháng 12/2017.
Địa điểm nghiên cứu:
+ Các lò giết mổ lợn trên địa bàn Thừa Thiên Huế;
+ Bộ môn Bệnh lý thú y, Khoa thú y, Học viện Nông nghiệp Việt Nam;
+ Phòng thí nghiệm thuộc Bộ môn Miễn dịch học và Vắc xin, Viện Công
nghệ Sinh học, Đại học Huế.
1.4. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA ĐỀ TÀI
Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu tình hình nhiễm vi khuẩn S. suis type
2 trên lợn giết mổ tại địa bàn Thừa Thiên Huế. Mẫu vi khuẩn S. suis type 2
phân lập được phân tích đặc tính sinh học và sinh học phân tử. KIT chẩn đoán
S. suis type 2 do đề tài nghiên cứu có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, cho kết quả
tương tự với KIT chẩn đoán S. suis type 2 do Ju et al. (2010) đã công bố.
1.5. Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI
1.5.1. Ý nghĩa khoa học
Kết quả nghiên cứu là tài liệu tham khảo dùng trong giảng dạy và nghiên
cứu về bệnh do vi khuẩn S. suis type 2 gây ra ở lợn trong các Trường, Viện
nghiên cứu chuyên ngành thú y.
1.5.2. Ý nghĩa thực tiễn
Đề tài đã thu thập mẫu phân tích tình hình nhiễm S. suis type 2 trên lợn
khỏe tại các lò giết mổ lợn trên địa bàn Thừa Thiên Huế, đây là cơ sở để đánh
giá mức độ nguy hiểm và nguy cơ lây nhiễm bệnh do vi khuẩn liên cầu lợn type
2 gây ra ở người và động vật. Sản phẩm KIT chẩn đoán vi khuẩn S. suis type
2 có độ nhạy và độ đặc hiệu cao thích hợp cho công tác chẩn đoán lâm sàng
trên thực địa, từ đó cán bộ thú y và người làm công tác dịch tễ có thể đưa ra
chương trình phù hợp cho việc phòng tránh lây nhiễm bệnh do liên cầu lợn type
2 từ lợn và các sản phẩm của lợn.
3

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
2.1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trong nước
và trên thế giới
2.1.1.1. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trên thế giới
Bệnh liên cầu khuẩn lợn do Streptococcus suis (S. suis) gây nên, bệnh
xảy ra ở nhiều nơi trên thế giới và gây tổn thất lớn về kinh tế. Bệnh liên cầu lợn
cũng có thể lây cho người. Chính vì vậy nó được xếp vào nhóm các bệnh chung
của người và động vật.
Windsor and Elliott (1975) đã phân lập được chủng Streptococcus tương
ứng với nhóm R do Moor phân lập và đề nghị gọi là Streptococcus suis type 2.
Những chủng có phản ứng với huyết thanh của cả type 1 và 2 được gọi là type ½.
S.suis được phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới tại những nơi chăn nuôi
lợn như: Hồng Công, Hà Lan, Anh, Thái Lan và Trung Quốc… (Vecht et al.,
1985; Touil et al., 1988; Yu et al., 2006).
Từ năm 1983 đến năm 1995 đã có 32 trong số 35 type Streptococcus
được phân lập. Hầu hết các chủng phân lập được từ lợn bệnh chỉ thuộc một số
type nhất định, từ 1 – 8. Mặc dù type 2 phân lập được ở hầu hết các nước
nhưng tỷ lệ có sự sai khác giữa các vùng địa lý. Chẳng hạn, ở Canada tỷ lệ
phân lập được S. suis type 2 tương đối thấp (dưới 25%) (Higgins and
Gottschalk, 2001). Ở Nhật, tỷ lệ phân lập S. suis type 2 cao nhất (28%)
(Kataoka et al., 1993); ở Châu Âu thì tỷ lệ này thấp nhất tại các nước Pháp, Ý
và Tây Ban Nha (Smith et al., 1999; Gottschalk et al., 2007).
Bệnh do vi khuẩn liên cầu lợn gây ra ở người với 2 trường hợp viêm màng
não và 1 trường hợp nhiễm trùng nặng đến mức tử vong đã được mô tả lần đầu
tiên tại Đan Mạch (Perch et al., 1968). Sau đó, bệnh do vi khuẩn này dần được
báo cáo tại Hà Lan, Anh và nhiều nước khác. Từ đó đến nay, vi khuẩn này đã thu
hút sự quan tâm nghiên cứu của nhiều nhà khoa học ở nhiều nước trên thế giới.
Các trường hợp người mắc bệnh đã được thông báo ở các nước trên thế
giới: Hà Lan, Đan Mạch, Đức, Bỉ, Anh, Pháp, Tây Ban Nha, Thụy Điển, Úc,
Hungari, Hồng Kông, Croatia, Nhật, Singapore, Đài Loan, New Zealand,
4

Argenetina, Trung Quốc… Trên thế giới đã phát hiện khoảng 490 ca bệnh liên
cầu lợn ở người, trong đó tỷ lệ tử vong là 17,5% (Sihvonen et al., 1988; Touil
et al., 1988).
S. suis là vi sinh vật thường xuyên cư trú ở niêm mạc và các hốc tự nhiên
của cơ thể lợn, đồng thời nó cũng được phân bố rất rộng rãi trong môi trường
thiên nhiên, giữa vi khuẩn và động vật có trạng thái cân bằng (Wei et al., 2009).
Theo Perch et al. (1983), vi khuẩn Streptococcus suis xâm nhập vào các đàn
mới bởi các lợn khỏe mang mầm bệnh trong amidan hay trong đường mũi. Lợn
khỏe có thể bị bệnh viêm màng não sau vài tháng đã mang mầm bệnh trong
amidan. Việc nhập các lợn khỏe mang mầm bệnh (lợn cái giống, lợn đực giống và
lợn cai sữa) hoặc lợn sinh ra ở những đàn mang bệnh lan truyền vi khuẩn S. suis
cho lợn con. Lợn con mang mầm bệnh này khi phân vào chuồng nuôi sẽ gây nhiễm
cho những lợn khác. S. suis ảnh hưởng tới lợn mọi lứa tuổi. Nhưng hầu hết các
trường hợp xảy ra ở lợn đều nằm giữa 3-12 tuần tuổi và đặc biệt là sau khi lợn cai
sữa được nhốt chung với nhau. Các nhà nghiên cứu Anh phát hiện thấy đàn lợn
giống có thể mang S. suis trong amidan ít nhất 5-12 ngày.
Vecht et al. (1985) đã nghiên cứu các phương thức thông thường làm
lan truyền vi khuẩn S. suis giữa các đàn lợn là thông qua nhập lợn mang bệnh,
vật môi giới và các xác chết mang vi khuẩn. S. suis sống trong ruồi ít nhất 5
ngày. Khi ruồi tiếp xúc với thức ăn, nước uống của lợn hay giữa các đàn lợn
với nhau. Ruồi là môi giới truyền bệnh rất nguy hiểm. Theo Windsor (1977),
ruồi tự bay xa và có thể bám trên các phương tiện “xe cộ” để đi xa nhiều hơn
nữa, đó chính là điều kiện thuận lợi cho bệnh dịch lây lan.
Trước những yếu tố gây lây lan mầm bệnh, biện pháp phòng bệnh bằng khâu
vệ sinh chuồng trại chăn nuôi, chăm sóc nuôi dưỡng và quản lý đàn là yếu tố vô
cùng quan trọng đối với công việc chăn nuôi lợn (Vasconcelos et al., 1994).
Do tính chất nghiêm trọng của bệnh, trên thế giới đã có rất nhiều công
trình nghiên cứu về bệnh do liên cầu lợn gây ra. Với công trình nghiên cứu tạo
dòng và biểu hiện kháng nguyên bề mặt của liên cầu lợn type 2 vào năm 2008.
Tan et al. (2009) đã nghiên cứu thành công vắc xin phòng chống liên cầu lợn
type 2 gây bệnh ở lợn.
Với mục đích phòng chống bệnh do liên cầu lợn gây ra, nhiều công trình
nghiên cứu đã tập trung vào việc nghiên cứu phương pháp xâm nhập của vi
5

khuẩn S. suis vào tế bào não lợn (Vanier et al., 2004).
Đặc biệt, để đáp ứng nhu cầu phát hiện nhanh kháng thể kháng kháng S. suis
type 2, Yang et al. (2007), đã phát triển kỹ thuật sắc ký miễn dịch (ICT) với nguồn
nguyên liệu điều chế kháng thể kháng S. suis type 2 là lớp vỏ polysaccharide của vi
khuẩn. KIT phát hiện nhanh kháng thể kháng S. suis type 2 có độ nhạy và độ đặc
hiệu là 97,1% và 86,3% khi so với phương pháp ELISA.
Cũng với mục đích phát hiện vi khuẩn S. suis type 2 gây bệnh ở lợn, Ju
et al. (2010) đã thành công trong việc chế tạo KIT chẩn đoán nhanh dựa trên
kỹ thuật sắc ký miễn dịch.
Hiện nay, đã có một số tác giả trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu vắc
xin tái tổ hợp, vắc xin thô để phòng bệnh liên cầu khuẩn như: Li et al. (2006);
Tan et al. (2009)... Tuy nhiên hiệu quả chưa được đánh giá đầy đủ.
2.1.1.2. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn Streptococcus suis trong nước
Trước khả năng gây bệnh nguy hiểm của vi khuẩn liên cầu lợn, nhiều nhà
nghiên cứu Việt Nam đã tiến hành nghiên cứu nơi cư trú của vi khuẩn, sự lưu
hành hay khả năng gây bệnh của vi khuẩn.
Nguyễn Như Thanh và cs. (2001) đã xác định nơi cư trú của liên cầu lợn
ở lợn là đường tiêu hoá và sinh dục. Vi khuẩn S. suis cũng thường xuyên phân
lập được ở vòm họng và đường hô hấp trên của lợn khỏe, có thể tồn tại ở họng,
xoang mũi. Những lợn khỏe mạnh mang trùng này khi nhốt chung với một đàn
lợn mới chưa bị bệnh, có thể bệnh phát ra, lợn mẹ truyền cho lợn con qua
đường hô hấp, từ đó truyền cho những con khác lúc nhập đàn hay cai sữa.
Trong nghiên cứu biện pháp phòng bệnh do S. suis Phạm Sĩ Lăng và cs.
(2002) đã chỉ ra rằng, để phòng bệnh, việc xác định và loại thải những lợn nái
mang bệnh hoặc chia đàn, phân ô chuồng của một trang trại là rất cần thiết. Cần
chia lợn cai sữa thành các ô chuồng nhỏ để đạt được độ tăng trưởng tối đa của
chúng. Việc diệt trừ tận gốc mầm bệnh bằng cách giảm mật độ và nuôi trong các ô
chuồng sạch sẽ là điều kiện cần thiết và có hiệu quả. Nên định kỳ di chuyển lợn
ở các ô chuồng nuôi, kết hợp với tẩy uế chuồng trại là rất cần thiết và vô cùng quan
trọng trong công tác phòng chống bệnh. Trong biện pháp quản lý đàn phải hạn chế
tối đa các tác động do mật độ quá đông và hệ thống thông gió kém. Chỉ số về sự
thông gió và sự lưu thông không khí trong các ô chuồng phải thích hợp
6

với mật độ đàn nuôi trong chuồng. Nếu chỉ số thông gió kém thì chỉ số mắc
bệnh sẽ cao.
Khi có dịch xảy ra phải cách ly và phân chia riêng biệt thành khu vực lợn
khỏe và lợn ốm để tránh lây lan. Trong quá trình cách ly theo dõi, những lợn già
yếu, ốm yếu không có hy vọng chữa khỏi thì phải loại sớm để tạo điều kiện thu
hẹp và thanh toán sớm được đàn lợn bị bệnh. Trong quá trình theo dõi, cách ly
tuyệt đối không được nhập lợn mới vào, phải thường xuyên tiêu độc, tẩy uế
chuồng trại bằng các loại sát trùng Crezil, dung dịch xút (Nguyen Thi Hoang
Mai et al., 2008; Tran Vu Thieu Nga et al., 2011).
Hiện có 2 type liên cầu lợn thường gây bệnh ở lợn, type 1 hay gây dịch
bệnh lẻ tẻ ở các đàn lợn dưới 8 tuần tuổi, type 2 gây bệnh ở nhiều lứa tuổi khác
nhau. Cả 2 type này đều cư trú ở amidal. Lợn trưởng thành có tỷ lệ mang vi
khuẩn cao nhất (Nguyễn Vĩnh Phước, 1987; Nguyễn Như Thanh và cs., 2001).
Lê Văn Tạo (2005) đã công bố nghiên cứu về sự lan của vi khuẩn S. Suis
type 2 từ lợn bệnh sang người và cho rằng S. suis type 2 có thể tồn tại kéo dài
hơn 1 năm tại amiđan của lợn mang mầm bệnh kể cả khi được điều trị bằng
penicilline.
Vi khuẩn S. suis thường xuyên được phân lập trên lợn khỏe là một trong
những cảnh báo về khả năng lây nhiễm bệnh từ lợn cho người chăn nuôi,
người tham gia công tác giết mổ, cũng như người tiêu dùng.
Hiện nay, các nghiên cứu tại tỉnh Thừa Thiên Huế chỉ có báo cáo về sự lưu
hành của vi khuẩn S. suis trên lợn khỏe. Theo Bùi Thị Hiền và cs. (2016), tỷ lệ
nhiễm S. suis trên lợn khỏe là 17,31%.
2.2. MỘT SỐ ĐẶC TÍNH CỦA LIÊN CẦU KHUẨN LỢN
Vào thập niên 1950, tại Anh và Hà Lan, các nhà nghiên cứu thuộc ngành thú
y phát hiện được một tác nhân thuộc nhóm vi khuẩn S. suis gây viêm màng não và
viêm khớp ở lợn (Vecht et al., 1985; Sihvonen et al., 1988). Đây là nhóm liên cầu
được xếp vào nhóm D theo phân loại của Lancefied và được đặt tên là
Streptococcus suis (Streptococcus nghĩa Latin là liên cầu khuẩn, suis nghĩa là
lợn). Ngày nay, nhiễm Streptococcus suis ở lợn được ghi nhận tại Mỹ, Canada,
các nước Tây Âu, Nhật, Trung Quốc, Hồng Công... Streptococcus suis gây bệnh
ở lợn bao gồm triệu chứng viêm màng não mủ, nhiễm trùng huyết, viêm phổi,
7

viêm nội tâm mạc và viêm khớp (Trịnh Quang Hiệp và cs., 2004). Năm 1968,
những trường hợp nhiễm S. suis ở người được mô tả lần đầu tại Đan Mạch. Sau
đó, bệnh được ghi nhận ở người như là một bệnh lây truyền từ động vật sang
người tại nhiều nơi trên thế giới. Tính đến năm 2007, trên toàn thế giới ghi nhận
được khoảng 400 trường hợp người nhiễm S. suis, hầu hết là ở châu Âu và Châu
Á (Yu et al., 2006).
2.2.1. Đặc điểm hình thái
Vi khuẩn S. suis có hình cầu, hình trứng, đường kính có khi đến 1 μm,
chúng được xếp thành chuỗi như chuỗi hạt, có độ dài ngắn không đều nhau.
Hình 2.1. Hình ảnh nhuộm gram vi khuẩn S. suis
Nguồn: Hughes et al. (2009)
Các vi khuẩn được nuôi cấy sau 18 giờ chủ yếu là dưới dạng hình cầu. Ở
môi trường nuôi cấy có 5% huyết thanh hình thái chuỗi được nhìn thấy rõ nhất.
Vi khuẩn làm tiêu bản trực tiếp từ động vật có hình cầu. Nhưng ở môi trường
phân lập ban đầu, có thể nhầm với trực khuẩn ngắn. Vi khuẩn bắt màu dễ dàng
với một số loại thuốc nhuộm thông thường, với thuốc nhuộm Gram, chúng bắt
màu Gram (+) (Mahon et al., 2000; Tan et al., 2008a).
8

2.2.2. Đặc tính nuôi cấy và sinh hóa
Vi khuẩn S. suis là những vi khuẩn hiếu khí hay yếm khí tùy tiện, liên cầu
khuẩn lợn mọc thành những khóm nhỏ với đường kính khoảng 0,5-1 mm, màu
xanh nhạt hay trong suốt và nhầy nhưng không mọc được trong dung dịch có
chứa 6,5% NaCl… (Đỗ Ngọc Thuý và cs., 2009).
Vi khuẩn S. suis gây bệnh thích hợp ở nhiệt độ 37ºC (có thể phát triển rộng
từ 10ºC - 45º C, pH thích hợp từ 7 – 7.2) và phát triển trên nhiều loại môi trường:
- Môi trường nước thịt: Vi khuẩn S. suis hình thành hạt hoặc những bông,
rồi lắng xuống đáy ống. Sau 2 giờ nuôi cấy môi trường trong, đáy ống có cặn.
- Môi trường thạch thường: Vi khuẩn S. suis hình thành khuẩn lạc dạng
S, khuẩn lạc nhỏ, tròn, lồi, bóng, màu hơi xám.
- Trên môi trường đặc: Có thể quan sát thấy khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi
cấy với kích thước khoảng 1 - 2 mm. Sau 72 giờ thì kích thước khuẩn lạc lớn
nhất, có thể đạt tới 3 - 4 mm. Nếu được nuôi trong điều kiện có 5 - 10% CO2
thì khuẩn lạc sẽ phát triển nhanh hơn và rộng hơn. Khuẩn lạc thường tạo chất
nhầy mạnh, độ nhầy càng rõ và tăng nếu như vi khuẩn được nuôi cấy vài giờ
vào môi trường 32 nước thịt có bổ sung huyết thanh trước khi cấy sang môi
trường đặc hoặc thạch máu. Dạng khuẩn lạc trên môi trường thạch thường
nhỏ và khô hơn trên môi trường có bổ sung dinh dưỡng (Nguyễn Như Thanh
và cs., 2001; Phạm Sỹ Lăng và cs., 2005).
- Trên môi trường MacConkey: Vi khuẩn mọc tốt, sau 24 giờ nuôi cấy,
hình thành các khuẩn lạc nhỏ bằng đầu đinh ghim (Trịnh Phú Ngọc và cs.,
1999; Phạm Sỹ Lăng và cs., 2005).
- Trên môi trường thạch máu: Vi khuẩn hình thành khuẩn lạc tròn, gọn, hơi
vồng, sáng trắng, mịn, dung huyết sau 24 giờ nuôi cấy. Đặc biệt, trên môi trường
này, dựa vào tính chất dung huyết, người ta thấy liên cầu có 3 type khuẩn lạc khi
quan sát ở độ phóng đại gấp 60 lần (Nguyễn Như Thanh và cs., 2001).
+ Type anpha (α): khuẩn lạc được bao quanh một vòng hồng cầu còn
nguyên hình nhưng màu xanh, xa khuẩn lạc một chút có một vong tròn tan máu;
+ Type beta (β): bao quanh khuẩn lạc là một vòng tan máu hoàn toàn
trong suốt có bờ rõ ràng;
9

+ Type gama (γ): xung quanh khuẩn lạc không có sự thay đổi nào, hồng
cầu trong thạch vẫn giữ màu hồng nhạt.
Ở môi trường đặc có thể nhìn thấy khuẩn lạc sau 24 giờ nuôi cấy, kích
thước từ 1 - 2 mm và khuẩn lạc lớn nhất sau 72 giờ, các khuẩn lạc này thường
đạt tới 3-4 mm. Nếu được nuôi cấy trong điều kiện có 10% CO2 thì khuẩn lạc
sẽ phát triển nhanh hơn và rộng hơn (Trịnh Phú Ngọc và cs., 1999).
Dạng khuẩn lạc trên môi trường thạch thường nhỏ và khô hơn trên môi
trường có bổ sung chất dinh dưỡng. Khuẩn lạc mọc trên môi trường thạch máu
dạng nhỏ hơi vồng trắng trong, rìa gọn, màu vàng chanh hoặc vàng thẫm. Đa số
vi khuẩn gây bệnh cho lợn đều gây dung huyết khi nuôi cấy trên thạch máu cừu,
bò, dê, S. suistạo dung huyết dạng α và β (Biền Văn Minh, 2003).
Vi khuẩn S. suis có khả năng lên men các loại đường glucoza, lactoza,
saccaroza, trehaloza, maltoza, fructoza, không lên men các loại đường: sorbit,
dextroza, mannit, xyloza, glycerol, innulin. Tính chất không lên men đường
innulin là đặc tính để phân biệt tính chất độc của chủng gây bệnh (Smith et al.,
1999).
S. suis có thể tăng trưởng ở kỵ khí hoặc hiếu khí, nhưng không thể tăng
trưởng ở 6,5% dung dịch NaCl. S. suis không chứa men catalaza và oxidaza vì
vậy phản ứng catalaza (-), oxidaza (-), phản ứng indol (-). Vi khuẩn không di
động. Vi khuẩn có kháng nguyên giáp mô và sinh ra hai loại men streptokinaza
(diệt bạch cầu), hyaluronidaza phân hủy acid hyaluronic gây nhão mô (Biền Văn
Minh, 2003).
2.2.3. Sức đề kháng
Enright et al. (1987) khẳng định rằng nhóm vi khuẩn không hình thành nha
bào, đa số hình thành giáp mô, sự hình thành giáp mô có thể xác định được khi
vi khuẩn sinh sống trong các mô hoặc mọc trong các môi trường nuôi cấy có
chứa huyết thanh.
S. suis có thể sống được ở điều kiện nhiệt độ 60o
C trong vòng 10 phút, ở
nhiệt độ 50o
C trong 2 giờ và sống trong xác súc vật đến 6 tuần ở 10o
C. S. suis type
2 có thể tồn tại trong phân, trong bụi. Ở 0o
C tồn tại trong phân đến 104 ngày và
tồn tại trong bụi 54 ngày. Khi nhiệt độ ở 9o
C sống trong phân là 10 ngày và sống
trong bụi là 25 ngày. Nhưng vi khuẩn S. suis type 2 này không thể tồn tại
10

trong bụi ở nhiệt độ phòng lâu tới 24 giờ. Các chất sát trùng thông thường nồng
độ thấp có thể làm cho vi khuẩn Streptococcus chết nhanh chóng hơn so với các
vi khuẩn thông thường khác (Lun et al., 2007). Cụ thể là các chất sát trùng như:
Phenol, iod, hypochloride, acid phenic 3-5%, vi khuẩn bị diệt trong vòng 3-5
phút, formol 1% vi khuẩn bị diệt trong vòng 60 phút; cồn nguyên chất không có
tác dụng đối với vi khuẩn. Cồn 70o
vi khuẩn bị diệt trong vòng 30 phút, tím
Genetian 1/300.000 có tác dụng diệt vi khuẩn (Trịnh Phú Ngọc và cs., 1999).
Vi khuẩn S. suis rất mẫn cảm với các loại thuốc kháng sinh: penicillin,
oreomycin, tetracylin, sulfadiazin, optoclin. Vi khuẩn sống lâu trong đờm, chất
bài xuất có protein, trái lại vi khuẩn chết nhanh chóng trong môi trường nuôi
cấy, vì vậy cần phải cấy chuyển luôn khi cần giữ giống cho nghiên cứu, sản
xuất (Nguyễn Vĩnh Phước, 1987).
2.2.4. Cấu trúc kháng nguyên
Liên cầu có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp. Có rất nhiều loại kháng
nguyên đã tìm thấy ở các liên cầu khuẩn. S. suis được xếp vào nhóm D theo phân
loại của Lancefied. Có tổng cộng 35 type đã được mô tả, dựa trên phản ứng huyết
thanh học chống lại polysaccharide. Type 2 được xem xét độc nhất và thường
xuyên nhất. Các chủng S. suis đã được mô tả, dựa trên cấu trúc kháng nguyên
polysaccharide của giáp mô (ký hiệu từ 1 đến 34 và 1/2) (Mahon et al., 2000).
Trước đây có một số nhầm lẫn đến danh pháp của nhóm R và S sau nhận ra
nó thuộc nhóm D theo Lancefield và phân loại lại đó là S. suis type 1 (nhóm S
trước đây) và S. suis type 2 (nhóm R trước đây). Vài năm sau khi này, nhóm RS
và T cũng đã được phân loại lại như type 1/2 và 15 (Rappuoli et al., 2002).
• Kháng nguyên thân
Kháng nguyên này do Lancefield phát hiện năm 1928 (Perch et al., 1983),
những liên cầu khác nhau có cấu tạo Polyozit hay chất “C” khác nhau, dựa vào
đó người ta chia liên cầu thành các nhóm A, B, C, D… R.
Nhóm huyết thanh gây bệnh phổ biến ở người là là nhóm A, B, C, D và G,
hiếm gặp là nhóm E, L, P, U và V.
Liên cầu A: loại vi khuẩn hay gặp nhất, thường cư trú ở họng vật chủ.
Liên cầu B: Cư trú ở họng, âm đạo, ruột gây nhiễm trùng nghiêm trọng cho
11

trẻ sơ sinh, lây truyền từ mẹ sang con hoặc trẻ này sang trẻ khác (Jacques et al.,
1990).
Liên cầu C: Cư trú ở họng, da, âm đạo, gây viêm hầu họng. Một số gây
nhiễm trùng nghiêm trọng: Nhiễm trùng huyết, viêm màng trong tim, màng não,
xương khớp (Fittipaldi et al., 2009).
Liên cầu D: Cư trú ở ruột, đề kháng với nhiều loại kháng sinh, gây nhiễm
trùng đường tiết niệu, viêm màng não, màng trong tim bán cấp, viêm tai, viêm
xoang, viêm màng phổi (Reams et al., 1994).
Liên cầu G: Cư trú vùng hầu họng, da, âm đạo, gây nhiễm trùng sau đẻ,
vết thương, viêm màng trong tim (Reams et al., 1994).
Thành phần kháng nguyên thân có ý nghĩa quan trọng, quyết định tính độc
lực của vi khuẩn S. suis và nó nằm ở thành vi khuẩn. Thành tế bào vi khuẩn gồm
3 lớp (Reams et al., 1994).
+ Lớp ngoài chứa acid và Protein là kháng nguyên M, T, R…, Map (M-
a otated protein) SOF (Serua oparty faetor). Phía ngoài cùng của lớp này thường
chứa các fimbriae;
+ Lớp giữa có chứa Polysaccharide;
+ Lớp trong cùng là Peptidoglycan.
• Kháng nguyên giáp mô
Ở nhóm A: Giáp mô chứa acid Hyaluronic bao gồm N - axetyl glucosamine
và acid glucoronic.
Ở nhóm O: Giáp mô có thành phần Polysaccharide theo phân loại huyết
thanh học gọi là Ia, Ig, II và III.
• Kháng nguyên bám dính
Theo Jacques et al. (1990) Vi khuẩn S. suis là một trong số ít các loại vi
khuẩn Gram dương có mang cấu trúc này. So với các loại vi khuẩn khác thì
kháng nguyên bám dính của vi khuẩn S. suis có cấu trúc mỏng, ngắn, đường
kính khoảng 2 nm, và dài lên đến 250 nm.
Fimbriae: có Lipoteibic acid (LTA) giúp vi khuẩn bám dính vào tế bào biểu
mô và ở tế bào lympho đa nhân (P & N) có điểm tiếp nhận (receptor) tương ứng
12

với LTA trong quá trình thực khuẩn (phagocitosin). Protein M là yếu tố độc lực
chống lại quá trình thực khuẩn và là kháng nguyên đặc hiệu của S. suistype A.
Kháng nguyên T và R là yếu tố ức chế rất quan trọng trong phân loại S. suis
(Sihvonen et al., 1988).
2.2.5. Khả năng gây bệnh
2.2.5.1. Nguồn bệnh
Liên cầu lợn luôn có mặt trong môi trường và ký sinh bình thường ở lợn
nhưng không gây bệnh, hoặc chỉ gây các bệnh viêm nhiễm không thành dịch như
viêm họng, nhiễm trùng mủ, nhiễm trùng phổi. Liên cầu lợn chủ yếu sống ở các
loài lợn đã thuần hoá, nhưng đôi khi cũng tìm thấy ở các loài lợn rừng, ngựa,
chó, mèo và chim.
Nơi cư trú của liên cầu lợn ở lợn là ở đường hô hấp trên đặc biệt là ở
mũi, đường tiêu hoá và sinh dục. Hiện có 2 type liên cầu lợn thường gây bệnh ở
lợn, type 1 hay gây dịch bệnh lẻ tẻ ở các đàn lợn dưới 8 tuần tuổi, type 2 gây
bệnh ở nhiều lứa tuổi khác nhau. Cả 2 type này đều cư trú ở amidal. Lợn
trưởng thành có tỷ lệ mang vi khuẩn cao nhất (Nguyễn Vĩnh Phước, 1987;
Nguyễn Như Thanh và cs., 2001).
Vi khuẩn S. suis cũng thường xuyên phân lập được ở vòm họng và
đường hô hấp trên của lợn khỏe, có thể tồn tại ở họng, xoang mũi. Những lợn
khỏe mạnh mang trùng này khi nhốt chung với một đàn lợn mới chưa bị bệnh,
có thể bệnh phát ra, lợn mẹ truyền cho lợn con qua đường hô hấp, từ đó truyền
cho những con khác lúc nhập đàn hay cai sữa (Almeida et al., 2006).
2.2.5.2. Đường lây truyền
Vi khuẩn liên cầu lợn có thể tồn tại lâu trong phân, nước, rác. Vì thế, môi
trường đóng vai trò quan trọng trong quá trình truyền bệnh của vi khuẩn. Bệnh
lây truyền qua đường hô hấp do lợn khoẻ hít thở không khí có mầm bệnh, do tiếp
xúc giữa lợn ốm và lợn khoẻ, do lợn ăn phải thức ăn và nước uống có mầm bệnh.
Ngoài ra, vi khuẩn cũng có thể xâm nhập qua các vết thương, các vết trầy xước để
gây bệnh. Dịch bệnh ở lợn thường bùng phát khi có các yếu tố thuận lợi như
chuồng trại quá chật chội, đàn lợn quá đông, thiếu thông khí hoặc khi lợn cai sữa.
Tình trạng lợn lành mang mầm bệnh không có bất cứ triệu chứng gì có thể là
nguyên nhân gây lây lan dịch bệnh thầm lặng và nguy hiểm. Một con đường lây
13

lan khác cũng rất hay gặp là thông qua ruồi, ruồi có thể bay từ trang trại nọ
sang trang trại kia và mang theo các tác nhân gây bệnh khác nhau bao gồm cả
Streptococcus suis. Điều cần đặc biệt quan tâm là bệnh liên cầu khuẩn có thể
lây truyền từ lợn ốm sang người và ngược lại. Vi khuẩn xâm nhập cơ thể
người nếu có sự tiếp xúc với lợn, thịt lợn nhiễm vi khuẩn chưa được nấu chín
kỹ. Vi khuẩn liên cầu lợn đi vào người qua các vết thương hở trên da hoặc
niêm mạc mũi, miệng. Như vậy, nguy cơ mắc bệnh cao gặp ở những người có
tiếp xúc trực tiếp hoặc tiếp xúc gần với lợn hoặc các sản phẩm tươi sống từ lợn
nhiễm khuẩn như thợ giết mổ lợn, công nhân lò mổ, người bán hàng thịt, người
chế biến thịt tươi, người ăn tiết canh lợn… (Vecht et al., 1992; Tan et al.,
2008a; Đỗ Ngọc Thuý và cs., 2009).
Hiện nay chưa có bằng chứng nào về việc bệnh liên cầu khuẩn có thể lây
trực tiếp từ người sang người (Tan et al., 2008a).
2.3. TRIỆU CHỨNG VÀ BỆNH TÍCH CỦA BỆNH DO VI KHUẨN S. SUIS
GÂY RA
2.3.1. Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S. suis gây ra ở lợn
Triệu chứng của các thể bệnh do vi khuẩn S. suis gây ra rất phức tạp,
khó nhận biết và khó phân biệt khi mà bệnh có hiện tượng bội nhiễm, kế phát
bởi một số vi khuẩn khác (Mahon et al., 2000).
Theo Sanford and Tilker (1982), S. suis gây dung huyết kiểu β thường
xuyên phân lập được từ phổi bị viêm của lợn lớn, lợn cai sửa và lợn con đang
bú, từ lợn bị viêm phế quản phổi, viêm màng não có triệu chứng thần kinh.
Ở Việt Nam, Nguyễn Thị Nội và Nguyễn Ngọc Nhiên (1993), đã điều tra
hệ vi khuẩn đường hô hấp của 162 lợn bị bệnh ho thở truyền nhiễm thấy tỷ lệ
nhiễm S. suis chiếm 74%.
Nghiên cứu trong gây bệnh thực nghiệm và quan sát trong các ổ dịch,
thường thấy lợn từ 1-3 tuần tuổi, lợn đang bú có triệu chứng ủ rủ, ăn kém sưng
hầu nuốt khó, đi lại khó khăn, lông khô dựng đứng, da mẩn đỏ và sốt. Lợn ở lứa
tuổi này thường gặp biểu hiện viêm màng não. Triệu chứng viêm màng não làm
cho con vật hoạt động khó khăn đi lại loạng choạng, khi nằm biểu hiện tư thế bơi
chèo, tê liệt. Tuy vậy sự thay đổi bệnh tích đại thể ở não không phải là luôn luôn
14

có. Triệu chứng viêm não ở lợn trưởng thành rất ít khi biểu hiện (Huang et al.,
2005).
Thể viêm khớp xảy ra ở lợn đang bú và lợn trưởng thành. Ở lợn trưởng
thành có hiện tượng viêm một khớp, khớp bị viêm thường là khớp bẹn, đầu gối
hoặc khớp bàn chân. Tổn thương đầu tiên bao gồm thủy thủng, sưng khớp và
màng khớp xung huyết, dịch khớp đục (Jiang et al., 2009). Bệnh có thể tiến triển
nặng hơn như hiện tượng sợi hóa và áp xe các tổ chức khớp nội, khớp bị thoái
hóa. Viêm khớp có mủ ở lợn con. Bệnh xảy ra đối với hệ thống xương thường
là thoái hóa ở các đốt sụn. Sau 15-30 ngày mắc bệnh có thể thấy các đốt sụn bị
hoại tử (Hoàng Văn Năm, 2009).
Nhiễm trùng máu Streptococcus suis ở lợn con mới sinh gây “hội
chứng ủ rủ”. Những lợn mới sinh hoàn toàn khỏe mạnh nhưng sau 1-2 ngày có
hiện tượng ngừng bú, sờ vào thấy lạnh và chết sau 12-24 giờ sau khi sinh. Hội
chứng “lợn ủ rủ” có thể nhầm lẫn với đói ăn (Hoàng Văn Năm, 2009).
Lợn giống nhiễm S. suis thường ít thấy triệu chứng, tuy nhiên một số
đàn giảm tỷ lệ đẻ từ 85% xuống 70%. Phân lập được S. suis từ phôi thai chết
lưu cũng như từ tử cung lợn nái bị nhiễm bệnh (Khương Thị Bích Ngọc, 1996).
Tóm lại, lợn bị liên cầu khuẩn có thể có các biểu hiện sau: da lợn có thể
có các màng đỏ, sần, các hạch lympho bị sưng, sung huyết, bao khớp dày lên,
khớp bị sưng và có dịch, màng não và não có thể bị tổn thương dạng phù nề,
dịch não tuỷ đục, phổi bị tổn thương với nhiều dạng khác nhau như đông đặc,
có mủ, viêm phế quản, viêm phổi. Vi khuẩn có thể gây các bệnh ở lợn là viêm
màng não, viêm nội tâm mạc, viêm phổi, bại huyết, bệnh đường tiêu hoá, viêm
khớp, xuất huyết ở da, gây sẩy thai và gây chết đột tử ở lợn. Lợn mắc bệnh
thường có triệu chứng sốt cao 40 – 41,5o
C, lợn trở nên ủ rũ, biếng ăn, có biểu
hiện thần kinh như run rẩy, đứng không vững, liệt, ngoài ra còn có biểu hiện
khác như viêm khớp, viêm khí quản, viêm phổi và bị chết đột ngột. Các lợn
bệnh này khi mổ khám xét nghiệm, thấy toàn bộ cơ quan nội tạng xuất huyết, tụ
huyết, viêm dính (Tan et al., 2008a).
Các thể bệnh và bệnh tích của bệnh do các type khác nhau gây ra là không
giống nhau (Vasconcelos et al., 1994). Các biến đổi về bệnh tích vi thể không có
sự sai khác giữa các type gây bệnh và thường tập trung ở não, phổi, tim và các
15

khớp. Các tổn thương quan sát thấy như viêm màng não, viêm não, viêm
phổi - màng phổi có mủ hoặc viêm phổi kẽ (Reams et al., 1994).
Vi khuẩn S. suis sau khi vào cơ thể bệnh tích gây ra ở các thể bệnh
thường thấy là:
- Thể nhiễm trùng huyết: da đỏ tím từng mảng, tụ huyết và xuất huyết ở
một số phủ tạng (lách, thận, hạch lâm ba);
- Thể viêm não tuỷ: màng não tụ huyết và xuất huyết, dịch não và tủy vẩn đục;
- Thể viêm họng, viêm phế quản, viêm phổi: hạch amidan sưng, tụ máu, niêm
mạc phế quản tụ huyết, niêm mạc mũi có màng giả, tiểu phế quản và phế nang viêm có
dịch thẩm xuất, có mủ và bọt khí; hạch phổi sưng, tụ huyết. Lợn bị bệnh thể
phổi gây ra bệnh tích ở phổi có các mức độ biểu hiện khác nhau từ viêm phổi -
màng phổi dạng nhục hoá đến viêm phổi dạng fibrin có mủ (Lê Văn Tạo, 2007);
- Thể viêm hạch: hạch hầu, hạch trước vai, trước đùi sưng tụ huyết ở giai
đoạn đầu, giai đoạn cuối viêm bã đậu.
Lợn chết do Streptococcus suis type 2, bệnh tích đại thể, vi thể bao gồm
một hoặc nhiều ổ viêm tương mạc hóa mủ, viêm phổi và màng phổi xuất huyết
hoặc viêm tơ huyết, viêm màng não mủ, viêm cơ tim thoái hóa xuất huyết, viêm
van tim hai lá (Tan et al., 2008b). Trong trường hợp viêm màng não, dịch não tủy
bị đục, xung huyết và viêm màng não tích tụ thể trắng, ổ mủ ở vùng dưới nhện.
Hầu hết các trường hợp dưới võng mạc nội mô bị ảnh hưởng nặng, các mạch máu
ở tâm thất, não và tủy sống bị tắc nghẽn do dịch thẩm xuất, nhiều khi gây ra phù
não. Mô thần kinh của tủy sống, tiểu não và cuống não có biểu hiện thoái hóa
dạng lỏng (Lê Văn Tạo, 2005).
2.3.2. Triệu chứng và bệnh tích do vi khuẩn S. suis gây ra ở người
Nhiễm Streptococcus suis có thể gây ra những bệnh rất nặng và nguy
hiểm đến tính mạng bệnh nhân. S. suis không chỉ là tác nhân gây bệnh nhiễm
trùng máu, viêm màng não, viêm khớp ở lợn mà còn gây viêm nội tâm mạc ở
người, một số trường hợp tiến triển tối cấp rất nhanh dẫn đến sốc nhiễm độc
khuẩn gây suy đa phủ tạng và tử vong mà không kịp điều trị gì. Thời kỳ ủ bệnh
kéo dài từ vài giờ đến 3 ngày. Người mắc liên cầu lợn chủ yếu chia làm hai thể
là thể tối cấp và thể viêm màng não (Arends and Zanen, 1988).
16

Ở thể tối cấp, bệnh nhân thường bị nhiễm trùng huyết, sốt cao, nhanh
chóng xuất hiện các tử ban (xuất huyết hoại tử dưới da). Các tử ban này nhanh
chóng lan khắp người kèm theo tình trạng choáng, sốc, tụt huyết áp, suy chức năng
hô hấp, tuần hoàn, thận, gan và nhanh chóng tử vong. Từ khi xuất hiện dấu hiệu
bệnh đến khi tử vong có thể chỉ từ 1 – 2 ngày (Arends and Zanen, 1988).
Hội chứng sốc nhiễm độc có thể xảy ra đối với bệnh nhân nhiễm liên cầu
lợn, gây tổn thương nghiêm trọng các cơ quan nội tạng trong cơ thể như gan,
thận, hệ tuần hoàn, ảnh hưởng rất xấu tới việc cứu sống bệnh nhân. Hội chứng
sốc nhiễm độc chỉ có thể điều trị được với kháng sinh và trong điều kiện chăm
sóc đặc biệt. Bệnh nhân mắc thể viêm màng não thường có biểu hiện sốt cao,
đau đầu, nôn (Arends and Zanen, 1988).
Kiểm tra dịch ở tủy thấy nước đục. Bệnh nhân có thể đi vào hôn mê,
không thấy xuất huyết bên ngoài. Những bệnh nhân viêm màng não, nếu phát
hiện sớm có thể điều trị kịp thời, nhưng nếu để muộn có thể dẫn đến phù não, tử
vong hoặc để lại các di chứng thần kinh nặng nề như động kinh, ngớ ngẩn…
(Tan et al., 2008a).
2.4. CHẨN ĐOÁN
Đối với đàn lợn bị bệnh, chẩn đoán chủ yếu dựa vào các biểu hiện trên
lâm sàng cũng như đặc điểm dịch tễ học có thể gợi ý nhiễm trùng do liên cầu
lợn. Đối với người bệnh, chẩn đoán lâm sàng chủ yếu dựa vào các yếu tố dịch
tễ học và triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng để có hướng xử trí kịp thời.
Các triệu chứng lâm sàng thường thấy là: sốt cao, chết đột ngột, khó thở,
có triệu chứng thần kinh do viêm não, mắt đỏ và đặc biệt là đi lại khó khăn do
viêm khớp.
Mổ khám thường thấy phù thủng ở não, tụ máu ở não và màng não, có
nhiều dịch não tủy màu đục. Xác chết thường có màu đỏ, nhu mô và các hạch
bạch huyết sưng; viêm đa khớp có mủ, bao hoạt dịch có dày lên; viêm nội tâm
mạc; viêm phổi (Bộ Khoa học và Công nghệ, 2018).
Chẩn đoán phòng thí nghiệm về vi sinh vật học đối với liên cầu lợn hiện nay
vẫn còn nhiều khó khăn. Phương pháp chủ yếu là chẩn đoán trực tiếp, tiến hành
lấy bệnh phẩm ở lợn bệnh như máu, dịch mũi, dịch não tủy, dịch ổ khớp… để
nuôi cấy và phân lập vi khuẩn. Tiến hành khảo sát trực tiếp bằng phương pháp
nhuộm Gram, phát hiện cầu khuẩn Gram dương xếp thành chuỗi hoặc đứng đôi.
17

Sau khi chẩn đoán xác định vi khuẩn, có thể cần tiến hành thử nghiệm PCR
(TCVN 8400-2:2010).
2.4.1. Chẩn đoán bằng phương pháp PCR
Phương pháp PCR đã được Silva et al. (2006) sử dụng với cặp mồi CPS2
đặc hiệu cho việc xác định đoạn gene có kích thước 498 bp để xác định vi khuẩn
Streptococcus suis type 2 trong mẫu bệnh phẩm.
Với sự phát triển của ngành công nghệ sinh học, việc áp dụng kĩ thuật
polymerase chain reaction (PCR) để chẩn đoán bệnh cho động vật ngày càng
rộng rãi, phương pháp này cho sự chính xác cao (Nguyễn Hoàng Lộc và cs.,
2007).
PCR là một kỹ thuật được sử dụng phổ biến trong công nghệ sinh học hiện
đại và đã đóng góp rất lớn cho những tiến bộ về sinh học phân tử, đánh dấu
một bước tiến vô cùng quan trọng.
PCR dựa trên cơ sở phản ứng mở rộng primer nhờ enzyme Taq polymerase
để khuếch đại in vitro các nucleic acid đặc trưng. PCR cho phép khuếch đại theo
hàm mũ lên đến hàng triệu lần các đoạn ADN có chiều dài từ 200 - 3.000 bp. Đoạn
ADN được khuếch đại (ADN đích) được nhận diện nhờ cặp primer đặc trưng
(Oligonucleotide) thường có chiều dài khoảng 20 nucleotide.
Nguyên tắc của PCR
Taq polymerase là một loại enzyme DNA polymerase chịu nhiệt (có ở vi
khuẩn chịu nhiệt độ cao Thermus aquaticus) được dùng để tổng hợp các đoạn
ADN mới trong môi trường có 4 loại deoxyribonucleotide (dATP, dCTP, dGTP
và dTTP) và hai primer, trên cơ sở khuôn mẫu của một đoạn ADN nhất định
đã biết hoặc chưa biết trình tự. Các đoạn ADN mới hình thành lại được sử
dụng làm khuôn mẫu. Sau nhiều chu kỳ, số lượng đoạn ADN nói trên được
nhân lên gấp nhiều lần, nhờ vậy có thể đủ số lượng để tách ra, phân tích trình
tự hoặc tạo dòng... Primer ở bên trái tác động trên sợi ADN 3’5’ được gọi
là primer thuận (forward primer-ký hiệu là F). Primer ở bên phải tác động
trên sợi ADN 5’3’ được gọi là primer ngược (reverse primer-ký hiệu là R).
Phương pháp PCR được ứng dụng nhiều trong việc chẩn đoán bệnh do liên
cầu lợn type 2 gây ra như Silva et al. (2006) đã ứng dụng phương pháp PCR để
xác định vi khuẩn S. suis type 2 trong mẫu với cặp mồi đặc hiệu CPS2. Trong một
nghiên cứu khác về phương pháp chẩn đoán, Tran Vu Thieu Nga et al.
18

(2011) đã sử dụng phương pháp Real time PCR với cặp mồi đặc hiệu CPS2J
để phát hiện vi khuẩn S. suis type 2 trong dịch não tủy của người bệnh.
Phương pháp PCR còn được ứng dụng để tạo nguồn gene phục vụ cho
nghiên cứu phát triển vắc xin phòng bệnh do liên cầu lợn type 2 như trong
nghiên cứu của Tan et al. (2008b, 2009) đã phát triển vắc xin tái tổ hợp từ
gene 6PGD của vi khuẩn S. suis type 2. Để nghiên cứu chế tạo vắc xin, Li et
al. (2006) đã sử dụng phương pháp PCR với cặp mồi P1 để khuếch đại một
đoạn gene mã hóa protein Sao có trọng lượng 110 kDa. Cũng với nghiên cứu
vắc xin Li et al. (2011) đã sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại đoạn
gene mã hóa protein bề mặt HP0245 của vi khuẩn S. suis type trong nghiên cứu
chế tạo vắc xin tái tổ hợp.
2.4.2. Chẩn đoán bằng phương pháp ELISA
Việc sử dụng phương pháp ELISA để chẩn đoán bệnh đã được áp dụng
rộng rãi từ lâu trong nước và trên thế giới. ELISA có nhiều loại nhưng nhìn
chung đều dựa theo nguyên lý kết hợp đặc hiệu kháng nguyên – kháng thể.
Người ta dùng kháng thể hoặc kháng kháng thể gắn enzyme, rồi cho kết hợp trực
tiếp hay gián tiếp với kháng nguyên (Tan et al., 2008b).
Hiện nay, trên thị trường thế giới đã có một số công ty cung KIT ELISA
chẩn đoán bệnh S. suis type 2 như Wuhan Unibiotest Co.,Ltd; công ty
antibodies-online.
2.5. ĐIỀU TRỊ
2.5.1. Điều trị bằng thuốc kháng sinh
Trước hết là điều trị hỗ trợ với các biện pháp hồi sức tích cực.
Bệnh Liên cầu lợn là bệnh do vi khuẩn gây ra nên kháng sinh vẫn là thuốc
điều trị đặc hiệu, trong đó penicillin là thuốc được lựa chọn để điều trị bệnh
này. Tuy nhiên tình trạng kháng penicillin của vi khuẩn cũng đã được ghi nhận.
Trong trường hợp vi khuẩn đã kháng penicillin, các kháng sinh khác thuộc
nhóm beta lactamin được thay thế để điều trị cho bệnh nhân (Tan et al., 2008b).
Trong thực tế dùng kháng sinh để điều trị bệnh luôn đem lại kết quả tốt. Khi
dùng kháng sinh để điều trị bệnh phải dùng sớm, chỉ có hiệu quả tốt khi con vật
chưa có biểu hiện triệu chứng lâm sàng nặng. Nếu điều trị muộn thì hiệu quả sẽ
19

rất kém hoặc không có hiệu quả (Phạm Sĩ Lăng và cs., 2002; Hoàng Văn Năm,
2009).
2.5.2. Điều trị bệnh bằng huyết thanh
Ngoài việc dùng kháng sinh và các hóa dược để điều trị bệnh do
Streptococcus suis gây ra, thì việc dùng huyết thanh đặc hiệu để điều trị đã
được các nhà khoa học trên thế giới đề cập đến từ lâu và nhiều nước đã dùng
huyết thanh đặc hiệu điều trị bệnh do S. suis gây ra có hiệu quả tốt (Khương
Thị Bích Ngọc, 1996).
Huyết thanh đặc hiệu dùng để điều trị bệnh thường giá thành rất cao, cho
nên trong chăn nuôi, huyết thanh thường được dùng điều trị trong những
trường hợp cần thiết và đối với những con vật quý, hiếm, có giá trị kinh tế cao
(Lê Văn Tạo, 2005).
2.6. GIỚI THIỆU VỀ HẠT NANO VÀNG VÀ KỸ THUẬT SẮC KÝ MIỄN DỊCH
2.6.1. Tổng quan về hạt nano vàng
Khi vàng khối thông thường được chế tạo ở kích thước nhỏ mức nano mét,
chúng được gọi là các cấu trúc nano vàng. Hạt nano vàng là các hạt nano tồn tại
ở dạng dung dịch huyền phù có độ bền cao với các kích thước nằm trong khoảng
1- 100 nm. Khi ở kích thước nano mét, hạt nano vàng sở hữu nhiều tính chất lý
hóa khác nhau so với vật liệu vàng khối (Alivisatos, 1996; Vanden, 2002). Khi
được chia nhỏ ở trạng thái phân tử có kích thước vài nanomet (nm), nguyên
tố này có rất nhiều đặc tính riêng biệt. Trước tiên chúng sẽ thay đổi màu
sắc, chuyển từ màu vàng sang màu đỏ hoặc tím nhạt. Sự chuyển màu này có
được là do trong phân tử nano vàng không hấp thụ ánh sáng có bước sóng
nằm trong vùng quang phổ như các miếng vàng khối thông thường.
2.6.2. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch
2.6.2.1. Giới thiệu
Kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatographic assay (ICA)) dựa trên
nguyên lý kết hợp kháng nguyên - kháng thể mà một trong hai thành phần này được
gắn cộng hợp (conjugate) để phát hiện thành phần kia, sau đó nhờ phức hợp này
chuyển dịch do tác dụng mao dẫn trên màng, để rồi được tóm bắt bằng kháng thể
(hoặc kháng nguyên) đã bố trí sẵn tại vạch phát hiện. Đây là công nghệ được
20

mở rộng từ kỹ thuật ngưng kết hạt latex lần đầu tiên được phát triển vào năm
1956 bởi Singer and Plotz (1956). KIT chẩn đoán nhanh thực chất là một thiết bị
dùng để kiểm tra thiết kế theo kiểu onestep và dễ dàng sử dụng. Ưu điểm nổi
bật của thiết bị này là thời gian kiểm tra nhanh, giá thành rẻ và đặc biệt người
sử dụng không đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao do đó nó phù hợp cho những ứng
dụng cách xa phòng thí nghiệm. Thiết bị KIT chẩn đoán nhanh cho kết quả của
phép thử có hoặc không. Hơn nữa, que thử có thể được bảo quản trong thời
gian dài mà không cần đến tủ lạnh, điều này mang lại hiệu quả đối với những
khu vực thiếu thốn thiết bị (Singer and Plotz, 1956).
Do tiện ích sử dụng, trên cơ sở kỹ thuật ICA, người ta đã xây dựng thành
bộ KIT ICT (immunochromatographic test), có hai loại KIT: loại sử dụng kháng
thể gắn cộng hợp phát hiện kháng nguyên và loại sử dụng kháng nguyên gắn
cộng hợp phát hiện kháng thể.
Ứng dụng kĩ thuật ICT, trên thế giới có rất nhiều nhà khoa học đã nghiên
cứu và chế tạo ra các loại KIT chẩn đoán nhanh phục vụ công tác phòng và trị
bệnh cho người và động vật như Krajaejun et al. (2009) với nghiên cứu KIT
phát hiện nhanh kháng thể kháng Pythium insidiosum gây bệnh ở. Sheng et al.
(2012) trong nghiên cứu KIT chẩn đoán nhanh virus gây khối u ở cá
(Lymphocystis disease virus). Wang et al. (2014) đã chế tạo KIT phát hiện
nhanh kháng thể kháng giun tròn Paragonimus skrjabini ký sinh ở người.
Tại Việt Nam hiện nay, việc nghiên cứu KIT phát hiện nhanh mầm bệnh
dựa trên kỹ thuật sắc ký miễn dịch đã được quan tâm. Nhiều công trình nghiên
cứu KIT chẩn đoán nhanh đã được thực hiện như Đinh Thị Bích Lân và cs.
(2009) với công trình nghiên cứu KIT chẩn đoán nhanh phát hiện kháng thể
kháng kí sính trùng Toxoplasma gondii. Nguyễn Hoàng Lộc và cs. (2015) với
công trình nghiên cứu KIT phát hiện kháng nguyên bám dính F4 của vi khuẩn E.
coli. Phạm Đức Minh và Hoàng Văn Lương (2016) đã thành công trong công
trình nghiên cứu KIT phát hiện độc tố vi khuẩn tả Vibrio cholera, KIT có độ
nhạy và độ đặc hiệu cao khi so sánh với phương pháp ELISA. Nguyễn Thị Tâm
Thư và cs. (2016) đã công bố công trình nghiên cứu KIT phát hiện vi khuẩn E.
coli trong nước thải sinh hoạt. Tuy nhiên, chưa có công trình nào nghiên cứu
về phương pháp chẩn đoán nhanh vi khuẩn S. suis type 2.
21

2.6.2.2. Cấu tạo của KIT chẩn đoán nhanh
Một que thử nhanh điển hình bao gồm có: màng nitroncellulose (NC), đệm
mẫu (sample pad), đệm kháng thể cộng hợp (conjugate pad) và đệm hút
(adsorbent pad). Màng NC được phun 2 loại kháng thể khác nhau tạo thành 2
đường song song là đường kiểm tra (vạch T) và đường đối chứng (vạch C). Có 3
loại kháng thể: i) Kháng thể 1 là kháng thể kháng lại với một epitope của kháng
nguyên cần phát hiện, sản xuất trên chuột; ii) Kháng thể 2 là kháng thể kháng lại với
một epitope khác của cùng kháng nguyên cần phát hiện; iii) Kháng thể 3 là kháng
thể kháng lại IgG của chuột, sản xuất trên dê (goat anti-mouse IgG antibody), có
khả năng kết hợp với bất kỳ kháng thể nào có bản chất cấu trúc là immunoglobulin
IgG. Ngoài ra, thành phần tham gia KIT còn có đệm kháng thể cộng hợp
(conjugate), đó là hạt vàng (colloidal gold particle), được gắn vào với cấu trúc
kháng thể 1. Đệm mẫu được xếp gối lên trên đệm kháng thể cộng hợp, rồi đệm
kháng thể cộng hợp được xếp chồng dính với màng nitrocellulose, đệm kháng thể
cộng được hợp bố trí một lượng kháng thể gắn cộng hợp với hạt vàng
ở dạng khô; tại vạch T bố trí cố định kháng thể 2 ở dạng khô; và tại vạch C
cũng được bố trí cố định kháng thể cũng ở dạng khô, bình thường cả hai vạch
này đều không nhìn thấy được (hình 2.2).
Hình 2.2. Cấu trúc KIT chẩn đoán nhanh
Nguồn: O’Farrell (2008)
22

2.6.2.3. Nguyên tắc hoạt động và đánh giá kết quả
Mẫu bệnh phẩm xử lý bằng dung môi phù hợp được nhỏ vào đệm mẫu
(sample pad). Toàn bộ huyễn dịch sẽ được chuyển dịch theo mao dẫn xuyên
qua tấm cộng hợp, đến vạch T và vạch C và đi về phía đệm hút (Hình 2.3).
Có 2 trường hợp kết quả sẽ xảy ra.
a) Nếu trong mẫu kiểm tra có kháng nguyên (KN) tương ứng thì kháng nguyên
sẽ kết hợp với kháng thể trong kháng thể cộng hợp (KT1(Au)) để tạo thành phức
hợp kháng thể cộng hợp-kháng nguyên (KT1(Au)KN). Sau đó huyễn dịch và phức
hợp KT1(Au)KN sẽ cùng chuyển dịch đến đường kiểm tra. Tại đường kiểm tra,
phức hợp này kết hợp tiếp với kháng thể 2 tạo thành phức hợp KT1(Au)KN+KT2,
nghĩa là kháng thể 2 được cố định ở vạch T đã tóm bắt được kháng nguyên có ở
phức hợp KT1(Au)KN làm cho hạt vàng cộng hợp với kháng thể 1 tích tụ lại và
hiển thị. Các phân tử kháng thể cộng hợp không được gắn với kháng nguyên còn lại
tiếp tục dịch chuyển đến vạch C, tại đây, phức hợp kháng thể 3+KT1(Au) được
hình thành do sự kết hợp giữa kháng thể là kháng thể kháng lại IgG của chuột với
kháng thể có bản chất là IgG của chuột. Hạt vàng cộng hợp với kháng thể 1 cũng
được tích tụ lại và hiển thị, về nguyên tắc, sự hiển thị này bao giờ cũng được hình
thành, cho dù bệnh phẩm có kháng nguyên hay
không có kháng nguyên.
b) Nếu trong mẫu kiểm tra không có kháng nguyên tương ứng (KN) thì
huyễn dịch dung môi trong mẫu bệnh phẩm vẫn sẽ hoạt hóa KT1(Au) và lúc
này, do không có KN để kết hợp với (KT1(Au)) nên phức hợp KN+KT1(Au)
không được tạo thành. KT1(Au) đi xuyên qua vạch T mà không bị KT2 giữ lại,
nên tiếp tục chuyển dịch đến vạch C. Tại vạch C, phức hợp KT3+KT1(Au)
được hình thành do sự kết hợp giữa KT3 là kháng thể kháng lại IgG của chuột
với KT1 có bản chất là IgG của chuột, có vai trò như là một kháng nguyên, do
đó, hạt vàng cộng hợp với KT1 được tích tụ lại và hiển thị.
Như vậy: khi cả hai vạch T và C hiển thị thì kết quả đánh giá là dương tính
và đã phát hiện sự có mặt của kháng nguyên trong mẫu bệnh phẩm; ii) khi chỉ có
một mình vạch C hiển thị thì kết quả đánh giá là âm tính do trong mẫu bệnh phẩm
không có mặt của kháng nguyên. Trường hợp cả hai vạch không hiển thị, phản
ứng không được đánh giá và cần thiết phải làm lại. Không để phản ứng quá
23

lâu (trên 30 phút) mới đánh giá, vì có thể phát sinh phản ứng phụ làm sai
lệch kết quả.
Toàn bộ thời gian thực hiện phản ứng chính thức chỉ khoảng 5-10 phút. Cho
dù là kháng nguyên hòa tan (dạng polypeptide) hay kháng nguyên liên kết bề mặt
của vi sinh vật, bộ sinh phẩm ICT đều cho phản ứng hoạt động chính xác.
Hình 2.3. Cơ chế hoạt động của KIT chẩn đoán nhanh
Nguồn: Lee et al. (2013)
Màng có thể được chế tạo từ nitrocellulose (Lönnberg and Carlsson, 2001;
Oku et al., 2001), polyethersulfone (Kalogianni et al., 2007) hoặc polyethylene
(Khlebtsov et al., 2003). Dạng màng phổ biến nhất được sử dụng là nitrocellulose
với kích thước ống nhỏ trong màng là 0,05 đến 12 µm. Đệm mẫu được gắn ở
phần cuối của màng và thường được làm từ cellulose hoặc cross-linked silica.
Đệm kháng thể cộng hợp được gắn ở vị trí tiếp xúc với đệm mẫu và màng. Chất
dùng để đánh dấu hoặc các thành phần dùng cho việc nhận biết mẫu
24

phân tích được làm khô trên khu vực này, sẽ tương tác đặc hiệu với vật liệu có
trong mẫu phân tích lỏng. Các chất đánh dấu cho việc phát hiện có thể là các hạt
nano vàng (Au), các hạt latex khô (Gussenhoven et al., 1997), selenium, carbon,
hoặc liposome (Zaytseva et al., 2004).
Việc sử dụng các hạt nano được công bố lần đầu tiên bởi Leuvering vào
năm 1980 và ngày nay chúng được sử dụng phổ biến cho việc đánh dấu. Đối
với việc phân tích một đối tượng cụ thể, hai vạch được cố định lên màng: một
vạch kiểm tra (test line) cho ra kết quả kiểm tra và vạch kiểm soát (control line)
dùng để xác nhận chất phân tích đã chảy qua màng phân tích. Đối với phép
kiểm tra cho nhiều đối tượng khác nhau, có thể sử dụng nhiều vạch kiểm tra
khác nhau. Chất lỏng di chuyển ngược lên màng do lực mao dẫn của màng và
dừng lại ở absorbent pad ở đầu cuối của màng (Leuvering et al., 1981).
25

Nghiên Cứu Chế Tạo Kit Chẩn Đoán Nhanh Streptococcus Suis Type 2 Lợn.doc

Nghiên Cứu Chế Tạo Kit Chẩn Đoán Nhanh Streptococcus Suis Type 2 Lợn.doc

Recommended

Recommended

More Related Content

Similar to Nghiên Cứu Chế Tạo Kit Chẩn Đoán Nhanh Streptococcus Suis Type 2 Lợn.doc

Similar to Nghiên Cứu Chế Tạo Kit Chẩn Đoán Nhanh Streptococcus Suis Type 2 Lợn.doc (20)

More from Dịch vụ viết thuê Luận Văn - ZALO 0932091562

More from Dịch vụ viết thuê Luận Văn - ZALO 0932091562 (20)

Recently uploaded

Recently uploaded (19)

Nghiên Cứu Chế Tạo Kit Chẩn Đoán Nhanh Streptococcus Suis Type 2 Lợn.doc