HPLC

1. Một số phương pháp tách
trong kiểm nghiệm
2

2. Vai trò của các kỹ thuật tách trong KN
(Paracetamol + Codein
+ tá dược v.v.)
Kỹ thuật tách
Paracetamol Codein Tá dược
KT phân tích
Chiết
Sắc ký
Điện di
Phổ - quang
Điện hóa
Giai đoạn trung gian
thiết yếu trong phân
tích mẫu có thành
phần phức tạp
Kết quả KN (định tính, định
lượng, tinh khiết…)

3. Kỹ thuật sắc ký
 Có hiệu lực tách cao, phù hợp cho việc tách
mọi đối tượng quan tâm trong KN thuốc
 Có thể kết nối trực tiếp với hầu hết kỹ thuật
phân tích thông dụng và tiên tiến nhất trong
KN (detector), cho phép thực hiện đồng thời
tách và phân tích liên tục
 Thiết bị thương mại hóa phổ biến, đa dạng,
dễ tìm giải pháp kỹ thuật phù hợp cho yêu
cầu KN cụ thể

4. Các kỹ thuật sắc ký phổ biến trong KN thuốc
(đã có trong Phụ lục trong DĐVN IV)
Sắc ký lớp mỏng (PL 5.4)
Sắc ký lỏng (PL 5.3)
Sắc ký khí (PL 5.2)
Sắc ký giấy (PL 5.1)
Sắc ký rây phân tử (PL 5.5)

5. SẮC KÝ LỎNG
Một số khái niệm cơ bản
Thiết bị
Kỹ thuật phân tích
Yêu cầu về thiết bị
Ứng dụng trong KN

6. Một số khái niệm cơ bản
Hệ số dung lượng k’
0
0
R
0
'
R
m
s
m
s
t
t
t
t
t
Q
Q
V
V
K
k'





Cần lựa chọn điều kiện sắc ký để 1  k’  8
Hệ số chọn lọc 
A
B
R
R
'
A
'
B
t
t
k
k
α 

Cần lựa chọn điều kiện sắc ký để 1,05    2,0

7. Hệ số đối xứng của pic
2a
W
F 0,05

Số đĩa lý thuyết N
Một số khái niệm cơ bản
2
1/2
2
R
2
2
R
W
t
5,54
W
t
16
N 

Cần lựa chọn điều kiện sắc ký F càng gần 1 càng tốt

8. Độ phân giải
tR1
tR2
t0
   
A
1/2
B
1/2
'
B
R
R
A
B
R
R
S
W
W
k
t
t
1,18
W
W
t
t
2
R A
B
A
B






Rs cần  1,5

13. Kỹ thuật phân tích
1 Sắc ký phân bố
2 Sắc ký hấp phụ
3 Sắc ký trao đổi ion
4 Sắc ký loại cỡ
5 Sắc ký ái lực
6 Sắc ký các đồng phân quang học

14. SẮC KÝ PHA THUẬN VÀ PHA ĐẢO
Phụ thuộc vào độ phân cực tương đối của
pha động và pha tĩnh
A
Thêi gian
B
C
Thêi gian
A B C
Thêi gian
A
B
C
Thêi gian
A B C
Sắc ký pha thuận
(Pha tĩnh phân cực hơn pha động)
Sắc ký pha đảo
(Pha động phân cực hơn pha tĩnh)
Pha động ít phân cực Pha động phân cực mạnh
Pha động phân cực trung bình Pha động phân cực trung bình

15. CHỌN PHA TĨNH VÀ PHA ĐỘNG
ChÊt tan
Pha ®éng
Pha tÜnh
Độ phân cực của các thành phần là chỉ tiêu mô
tả định tính lực tương tác
Với pha tĩnh: Dựa vào nhóm thế R của dẫn chất siloxan
Với pha động: Dựa vào trị số P’
Với chêt phân tích: Dựa vào nhóm chức
Chất tan
Pha tĩnh Pha động

16. CHỌN PHA TĨNH VÀ PHA ĐỘNG
Để tách sắc ký chọn 1 trong 2 nguyên tắc sau:
1 Độ phân cực của chất phân tích hợp với
độ phân cực của pha tĩnh và khác xa độ
phân cực của pha động.
2 Độ phân cực của chất phân tích hợp với
độ phân cực của pha động và khác xa độ
phân cực của pha tĩnh.
Nguyên tắc 1 có xác suất thành công cao hơn.

17. Sắc ký các đồng phân quang học

18. SẮC KÝ LỚP MỎNG (TLC)
NGUYÊN TẮC
Pha tĩnh: gồm một lớp
mỏng các hạt kích thước
đồng nhất
Pha động: hệ dung môi
đơn hay đa thành phần
Hệ số lưu giữ Rf
a
b
d
d
R
M
R
f 


19. Hệ số lưu giữ Rf

20. Ứng dụng HPLC trong KN
Định tính
- So sánh tR pic trên sắc ký đồ mẫu thử và mẫu
chuẩn đối chiếu
- Dựa vào thông tin đặc hiệu với đối tượng phân
tích do detector cung cấp (phổ hấp thụ UV-Vis,
phổ huỳnh quang quét được tại vị trí pic sắc ký,
sự xuất hiện của mảnh phổ khối đặc trưng…)
- Mức độ chọn lọc của thông tin định tính phụ
thuộc vào bản chất detector sử dụng

21. So sánh thời gian
lưu pic chất cần
phân tích trên SKĐ
mẫu chuẩn và mẫu
thử.
Định tính hoạt chất
So sánh đáp ứng
đặc hiệu của
detector giữa mẫu
chuẩn và mẫu thử.
SKĐ chuẩn
SKĐ thử

22. VD:
DĐVN IV, chuyên luận “Nang amoxicilin”
Định tính:
«B. Thời gian lưu của pic chính trên sắc ký đồ
của dung dịch thử trong phần định lượng
phải tương ứng với thời gian lưu của pic
amoxicilin trên sắc ký đồ của dung dịch
chuẩn.»

23. Định lượng
- Là ứng dụng quan trọng nhất của SKL trong
kiểm nghiệm
- Có 5 phương pháp định lượng HPLC:
 Ppháp chuẩn ngoại (External Standard)
 Ppháp chuẩn nội (Internal Standard)
 Ppháp thêm chuẩn (Standard addition)
 Ppháp chuẩn hoá diện tích(Area
Normalization)
 Kỹ thuật thêm đường chuẩn
(Xem SGK)

24. Định lượng
- Quá trình định lượng bằng HPLC có thể chia
thành 4 bước:
 Lấy mẫu thử
 Tiến hành sắc ký
 Đo tín hiệu detector
 Phương pháp định lượng

25. Lấy mẫu
- Cần tôn trọng triệt để các nguyên tắc được quy
định với từng loại mẫu để lấy được mẫu mang
tính đại diện
- Chú ý khâu bảo quản mẫu và xử lý mẫu để giảm
thiểu sai số
- Có thể tiến hành các phản ứng hoá học trên
mẫu thử để tạo dẫn chất có độ nhạy cao hơn để
có thể đo được bằng detetor của máy.

26. Tiến hành chạy sắc ký
- Chuẩn bị mẫu thử:
 Chú ý dung môi sử dụng, lý tưởng nhất là
dùng pha động
 Dung môi pha mẫu cần có độ tinh khiết phù
hợp, đồng tan với pha động, cho đáp ứng
nhỏ với detector
- Chú ý:
 Khả năng chất thử bị phân hủy khi tách SK
 Trên sắc đồ có thể xuất hiện pic lạ do tạp
chất trong dung môi hòa tan mẫu

27. Tiến hành chạy sắc ký
- Dung môi phải đáp ứng các yêu cầu sau:
 Độ tinh khiết cao để không có pic lạ
(PA,HPLC)
 Có thể hoà lẫn được với dung môi rửa giải
 Cho đáp ứng rất nhỏ với detector
 Dung môi và dung dịch thử phải lọc qua
màng lọc 0,45 μm
- Tiêm mẫu: có 2 cách
 Dùng bơm tiêm (± 1-2%)
 Van tiêm mẫu thể tích xác định (±1%)

28. Đo tín hiệu detector
- Detector sử dụng đáp ứng yêu cầu sau:
 Hoạt động được ở vùng tuyến tính của nó
 Có độ hấp thụ nhỏ đối với dung môi
 Tránh lọt không khí vào cột và detector
 Giữ sạch cell và làm sạch nó thường xuyên
- Tín hiệu detector: đo được khi chất ra khỏi cột
sắc ký được máy ghi lại dưới dạng pic
- Detector được dùng phổ biến nhất trong HPLC
là detector UV-VIS

29. Dữ liệu dùng trong định lượng là chiều cao
pic và diện tích pic.
Phương pháp chuẩn ngoại – External Standard
Đường chuẩn và thêm đường chuẩn
Phương pháp chuẩn nội – Internal Standard:
tỷ số=Smau/Sch/noi
Phương pháp chuẩn hoá diện tích – Area
Normalization: tỷ số Spic của chất đó và tổng
Spic có mặt trong mẫu (thường áp dụng với
sắc ký khí).
Phương pháp định lượng

31. Phương pháp chuẩn ngoại
Chuẩn hoá 1 điểm (so
sánh)
X
X C
S
S
C = C
S
x x
c c
C S
=
C S
SX
SC
Phương pháp định lượng

32. S1 S
2
S
5
S
3
S
4
Chuẩn hoá nhiều điểm (đường
chuẩn)
- Pha một dẫy dung dịch chuẩn có nồng
độ tăng dần từ C1-C5.
- Tiến hành chạy sắc ký cùng điều kiện.
Phương pháp định lượng

33. S
SX
CX
Y=aX+b
Phương pháp chuẩn ngoại
Phương
trình hồi quy
tuyến tính
C
Phương pháp định lượng

34. Phương pháp chuẩn nội
Chất chuẩn nội - IS:
Là chất được thêm vào tất cả mẫu thử và mẫu chuẩn với
lượng như nhau.
Yêu cầu của chất IS:
- Có đặc tính p/tích và lý hóa tương tự như chất p/tích,
- Đạt về độ tinh khiết, dễ kiếm.
- Ổn định trong điều kiện chuẩn bị mẫu và p/tích.
- Ko tương tác với bất cứ cấu tử có trong hỗn hợp mẫu
-Ko bay hơi để có thể cất trữ dd chuẩn trong một thời gian
nhất định.
- Ko tồn tại trong mẫu từ nguồn.
-Có nồng độ gần với cấu tử p/tích.

36. Phương pháp chuẩn nội
Phương pháp chuẩn hoá 1 điểm
- Chuẩn nội được thêm vào một lượng
như nhau ở cả mẫu chuẩn ngoại và mẫu
thử
X
X S
S
R
C =C
R
ES
S
IS
S
R =
S
X
X
IS
S
R =
S
Mẫu
Chuẩn
nội
Chuẩn
ngoại
Mẫu thử
Chất
thử
Chuẩn
nội

37. Phương pháp chuẩn nội
R
RX
CX
0 1 2 3 4 5 6
RX
C
Chuẩn hoá nhiều điểm (đường
chuẩn)

38. Chất chuẩn nội - IS:
Yêu cầu của pic chất IS:
-Pic của IS phải tách khỏi pic của thành phần khác
(Rs>1,25)
-Pic của IS phải gần với pic của chất phân tích.
Sai số do tiêm mẫu được loại bỏ, sai số cực tiểu
0,5-1,0%.
Phương pháp định lượng

40. Phương pháp thêm chuẩn
Phương pháp thêm 1 điểm:
- Chuẩn bị 2 mẫu thử như nhau.
- Thêm vào mẫu thử thứ 2 một lượng chính
xác chất chuẩn.
- Tiến hành xử lý 2 mẫu và chạy sắc ký
trong cùng điều kiện.
X X
ΔC
C =S
ΔS

41. Phương pháp thêm chuẩn
Phương pháp thêm đường
chuẩn:
- Pha một dẫy dung dịch chuẩn có nồng
độ tăng dần từ C1, C2…C5 .
- Thêm từng dd chuẩn trên vào nền mẫu
thử.
- Xử lý mẫu rồi chạy sắc ký.
- Xây dựng đường chuẩn mối tương
quan giữa diện tích pic (thử + chuẩn)
với nồng độ của dung dịch chuẩn (C).

42. Phương pháp thêm đường chuẩn
Cx
x
A
A
Nång ®é chuÈn thªm vµo
Dung dÞch thö thªm chuÈn
Nång ®é
dd thö
0
Giao điểm của đường chuẩn với trục hoành
là nồng độ của dung dịch thử.
Sx
S
Nồng độ
dd thử
Nồng độ chuẩn thêm vào
Dung dịch thử thêm chuẩn

43. Phương pháp chuẩn hóa diện tích
* Nguyên tắc:
+ Hàm lượng phần trăm của một chất/ hỗn
hợp bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic
của chất đó so với tổng diện tích pic của
tất cả các pic xuất hiện trên sắc ký đồ.
A A
n
1 2 n
i
i = 1
S S
% A = ×100% = x100%
S + S +...+ S
S


44. Phương pháp chuẩn hóa diện tích
• Yêu cầu:
+ Tất cả các thành phần được rửa giải.
+ Tất cả các thành phần được phát hiện
detector như nhau.
 Trong HPLC đáp ứng của Detector với
các chất phân tích không giống nhau.

45. Phương pháp chuẩn hóa diện tích
• TH đáp ứng của detector vơi từng thành
phần khác nhau thì sử dụng hệ số đáp ứng fi
• Chạy sắc ký một dd chuẩn có nồng độ đã
biết (CC) và đo diện tích của nó (SC):
A A
1 1 2 2 n n
S .f
% A = .100%
S f + S f +...+ S f
C
i
C
C
f =
S

46. Dựa vào chỉ số Rf của mẫu thử và mẫu chuẩn
chạy sắc ký trong cùng điều kiện
Hệ số lưu giữ tương đối Rr.
dR,x: Đường đi của chất phân tích (cm)
dR,c: Đường đi của chất chuẩn (cm)
Rr càng gần 1 chất phân tích và chất chuẩn
càng đồng nhất
c
R,
x
R,
r
d
d
R 
Ứng dụng TLC trong KN
Định tính

47. Mức độ tinh khiết thể hiện ở các vết lạ trên sắc ký đồ.
Dược điển qui định kiểm tra tạp chất bằng TLC
Thử tinh khiết

48. Có 2 cách:
Tách chiết chất phân tích trong vết sắc ký
bằng dung môi thích hợp.
Sau đó định lượng chất phân tích bằng một
kỹ thuật phù hợp.
Định lượng trực tiếp trên bản mỏng: đo diện
tích hay cường độ màu của vết sắc ký.
Định lượng

49. ĐÁNH GIÁ CHUNG VỀ TLC
Ưu điểm
Nhược điểm
Thiết bị đơn giản, chi phí thấp, thực hiện nhanh.
Phát hiện được tất cả các chất.
Tách được các mẫu có nhiều thành phần, so sánh
trực tiếp mẫu thử và chuẩn.
Độ lặp lại thấp của trị số Rf do thành phần pha động
thay đổi.
Tăng giãn rộng pic do khuếch tán vì tốc độ dòng pha
động thấp.