BREVE PREMESSA: Negli ultimi anni si sono sviluppate tecnologie altamente sofisticate che consentono di valutare il rischio per condizioni cromosomiche fetali. L'ampio ventaglio di opzioni oramai disponibili nell'ambito degli screening non invasivi pone numerosi quesiti su quale tecnologia utilizzare e le problematiche specifiche connesse alla tecnologia. Durante questa mezza giornata di aggiornamento verranno dunque presentate in modo semplificato le basi molecolari delle differenti tecnologie coi vantaggi e vantaggi correlati, quali test sono disponibili e il loro livello di certificazione in relazione alla normativa europea inerente alla marchiatura CE-IVD, quali sono le cause di risultati discordanti, dei ‘no results’ e la gestione dei casi con risultato ad alto rischio, no result e discordanze OBIETTIVI FORMATIVI: • Descrivere le differenti tecnologie disponibili coi relativi vantaggi e svantaggi; • Presentare le cause biologiche dei risultati discordanti mediante cfDNA test; • Illustrare le diverse cause di ‘no result’ e le implicazioni sulle performances del test; • Descrivere l’utilità delle certificazioni, validazioni dei cfDNA test e dei controlli esterni di qualità; • Discutere circa l’utilità clinica dei contenuti aggiuntivi oltre alle trisomie 21,18,13; • Discutere circa il follow-up e il management dei risultati ad alto rischio, dei no results e dei risultati discordanti.

1. Livia Marcato
TOMA Advanced Biomedical Assays, S.p.A.
lmarcato@tomalab.com
Cell-free DNA test: aspetti emergenti nella
pratica quotidiana
CAUSE DEI RISULTATI DISCORDANTI

2. TYPE OF
ANEUPLOIDY
STUDIES
TRISOMIC
cases
NON-TRISOMIC
cases
Singleton pregnancies: weighted pooled
DR FPR
n n n (95% CI) (95% CI)
T21 30 1963 223932
99.7% 0.04%
(99.1-99.9%) (0.02-0.07%)
T18 25 563 222013
97.9% 0.04%
(94.9-99.1%) (0.03-0.07%)
T13 23 119 212883
99.0% 0.04%
(65.8-100%) (0,02-0,07%)
45,X 11 36 7677
95.8% 0.14%
(70.3-99.5%) (0.05-0.38%)
other SCA 8 17 5403
100% 0.003%
(83.6-100%) (0-0.07%)
TYPE OF
ANEUPLOIDY
STUDIES
TRISOMIC
cases
NON-TRISOMIC
cases
Twin pregnancies: weighted pooled
DR FPR
n n n (95% CI) (95% CI)
T21 5 24 1111
100% 0%
(95.2-100%) (0-0.003%)
Eccellente test di screening ma non è diagnostico!!!
Possibili risultati FP e FN
Performance del cfDNA test: meta-analisi
Gil et al, Ultrasound Obstet Gynecol Sep 2017;50(3):302-314

3. Limiti – Risultati discordanti
Fetal side Maternal side
Bassa Frazione Fetale
Mosaicismi feto-placentari
Vanishing twin

4. Limiti – Risultati discordanti
Fetal side
Bassa Frazione Fetale
Mosaicismi feto-placentari
Vanishing twin
Elevato peso materno
Gravidanze IVF
Gravidanze gemellari
Combinazione di più fattori
Possibile aneuploidia fetale?
Bassa settimana di gestazione (<10 sdg)
Grati et al, Genet Med; Grati FR, Ultrasound Obstet Gynecol. 2016; Wang E et al, Prenat Diagn. 2013; Ashoor et
al, 2012; Turocy et al, 2015; Revello et al, Ultrasound Obstet Gynecol. 2016.
Fattori che
influenzano
la FRAZIONE
FETALE

5. Palomaki et al, Genet Med 2011; 13: 913–920; Canick, et al. Prenat Diagn 2013, 33, 1–8
Low Fetal fraction

6. Limiti – Risultati discordanti
Fetal side Maternal side
Bassa Frazione Fetale
Mosaicismi feto-placentari
Vanishing twin
Grati et al, Genet Med. 2014 Aug;16(8):620-4; Grati FR, Ultrasound Obstet Gynecol. 2016
May 31. doi: 10.1002/uog.15975

7. Mosaicismo Confinato alla Placenta:
tipo 1 and 3 (CPM 1 & 3)
FALSI POSITIVI
cfDNA con
aneuploidia
nel circolo
materno
Citotrofoblasto
con
aneuploidia
True fetal mosaicism type 5 (TFM 5)
FALSI NEGATIVI
cfDNA
NORMALE
nel circolo
materno
Feto con
aneuploidia
Citotrofoblasto
normale
Mosaicismi feto-placentari: citotrofoblasto non
sempre coincide con cariotipo fetale
Grati et al, Genet Med. 2014 Aug;16(8):620-4; Grati FR, Ultrasound Obstet Gynecol. 2016
May 31. doi: 10.1002/uog.15975
FPR: 1 in 800
(T21,18,13,MX)
FNR: 1 in 70
(T21,18,13,MX)
Feto
normale

8. Grati FR et al, Prenat Diagn. 2015 Oct;35(10):994-8.
FALSO POSITIVO (CPM 1/3)
Data la possibilità di avere CPM 1/3 è raccomandata diagnosi
prenatale invasiva dopo un risultato di ALTO RISCHIO all’NIPT
Limiti – Risultati discordanti
cfDNA con
aneuploidia
nel circolo
materno
Citotrofoblasto
con
aneuploidia
Feto
normale

9. Limiti – Risultati discordanti
Grati FR et al, Prenat Diagn. 2015 Oct;35(10):994-8; Dar et al, Am J Obstet Gynecol. 2014
Nov;211(5):527.e1-527.e17

10. CVS or amnio after a positive cfDNA testing result?
Probabilita’ cromosoma-specifica di riscontrare mosaicismo nel
campione di CVS eseguito a seguito di
ALTO RISCHIO al cfDNA test?
T21/18 risk of mosaic in CVS is equal or slightly higher than that of the general
population of women performing a CVS
 May be reasonable to perform CVS
T13 frequency of mosaicism relatively high
 Reasonable offering an amniocentesis, specially if the sonogram is normal
 It makes sense to do a CVS if sonogram is abnormal
Trisomy 21 Trisomy 18 Trisomy 13
2 4 22
(58 (27-91)) (25(15-41)) (5(3-6))
% (1/ (95% CI)
Grati FR et al, Prenat Diagn. 2015 Oct;35(10):994-8; Nicolaides KH, Fetal Diagn Ther.
2011;29(3):183-96.

11. Limiti – Risultati discordanti
Fetal side Maternal side
Bassa Frazione Fetale
Mosaicismi feto-placentari
Vanishing twin
Grati et al, Genet Med. 2014 Aug;16(8):620-4; Grati FR, Ultrasound Obstet Gynecol. 2016
May 31. doi: 10.1002/uog.15975

12. Vanishing Twin (gemello riassorbito)
Thurik et al, Prenat Diagn. 2015 Aug;35(8):754-60.
Chimerismo confinato alla placenta dovuto a Vanishing Twin
Cellule rimanenti del trofoblasto del gemello riassorbito:
gradualmente possono fondersi con le cellule della
placenta del feto in vita …o
possono rimanere nei pressi delle arterie spiraliformi e
rilasciare cfDNA nel circolo materno

13. Chauhan et al, Am J Obstet Gynecol. 2010 Oct;203(4):305-15; Curnow et al, Am J Obstet Gynecol. 2015
Jan;212(1):79.e1-9; Thurik et al, Prenat Diagn. 2015 Aug;35(8):754-60.
Dati sui Vanishing Twin:
 Gravidanze IVF: ~20%
 Gravidanze spontanee: difficile da stabilire
(dipende a che settimana viene eseguita la prima
ecografia)
• recente stima (studi su casi NIPT): 0.2 - 0.6%
Vanishing Twin (gemello riassorbito)

14. Impatto clinico sconosciuto sui risultati NIPT
Persistenza del cfDNA rilasciato dalle cellule del trofoblasto del
gemello riassorbito?
Fino a che settimana di gestazione il cfDNA del gemello
riassorbito può influenzare il risultato del test?
CfDNA rilevato fino a 8 settimane
Curnow et al, Am J Obstet Gynecol. 2015 Jan;212(1):79.e1-9
Vanishing twin (gemello riassorbito)

15. Limiti – Risultati discordanti
Fetal side Maternal side
Grati et al, Genet Med. 2014 Aug;16(8):620-4; Grati FR, Ultrasound Obstet Gynecol. 2016 May 31. doi:
10.1002/uog.15975

16. Maternal side
Bianchi, Genet Med. 2017 Dec 7. doi: 10.1038/gim.2017.219. [Epub ahead of print]
• Deficit Vit B12
• Malattie autoimmuni
• Colestasi intraepatica
•Tumori materni
(MALIGNI E BENIGNI)
• Anomalie cromosomi
sessuali materni
(costituzionali e a mosaico)
• Trasfusioni e trapianti
• Copy Number Variants e
mosaicismi degli autosomi
materni

17. Limiti - Risultati discordanti
Vit B12 Def:
- 38 years old woman
- 12wg
- Positive NIPT for T21 (and cahotic pattern
with monosomies and trisomies)
-Amnio 46,XY
Pernicious Anemia
FALSE
POSITIVE
result
Bianchi, Genet Med. 2017 Dec 7. doi: 10.1038/gim.2017.219. [Epub ahead of print]

18. Limiti – Risultati discordanti
Fetal side Maternal side
Grati et al, Genet Med. 2014 Aug;16(8):620-4; Grati FR, Ultrasound Obstet Gynecol. 2016 May 31. doi:
10.1002/uog.15975;
Condizioni /trattamenti materni
Tumori materni
Anomalie cromosomi sessuali
materni (costituzionali o a mosaico)
Trasfusioni e trapianti
CNV e mosaicismi autosomi materni
Bianchi, Genet Med. 2017 Dec 7. doi: 10.1038/gim.2017.219. [Epub ahead of print]

19. Limiti – Risultati discordanti
Maternal side
Tumori materni
Diaz & Bardelli, J Clin Oncol. 2014 Feb 20; 32(6): 579–586; Bianchi et al, Prenatal
Diagnosis 2016, 36, 203–209

20. Maternal tumors
BENIGN e MALIGNANT
Diaz & Bardelli, J Clin Oncol. 2014 Feb 20; 32(6): 579–586; Bianchi et al, Prenatal Diagnosis 2016, 36, 203–20;
Bianchi, Genet Med. 2017 Dec 7. doi: 10.1038/gim.2017.219. [Epub ahead of print]
Uterine leiomyoma
Maternal side

21. Overall prevalence of leiomyomas: 10.7% (as detected by first trimester
endovaginal sonography)
African-American women are much more commonly affected, with a
prevalence among them of 18%
Not all uterine leiomyomas, because many are small with limited blood supply,
and the most common cytogenetic changes are balanced translocations.
Maternal side
Benign gynecological condition: Uterine leiomyoma
Bianchi, Genet Med. 2017 Dec 7. doi: 10.1038/gim.2017.219. [Epub ahead of print]

22. http://atlasgeneticsoncology.org//Tumors/leiomyomID5031.html
Benign gynecological condition: Uterine leiomyoma
http://atlasgeneticsoncology.org//Tumors/leiomyomID5031.html
 ~40% of cytogenetically investigated cases show
abnormal karyotypes, usually with single or few changes
 Rarely, they may show complex karyotypes
 Common cytogenetic rearrangements include a translocation between
chromosomes 12 and 14, trisomy 12, deletions of portions of the long arms of
chromosomes 3 or 7 and the short arm of chromosome 1, rearrangements of the
short arm of chromosome 6 and rearrangements of chromosomes 1, 3, 10, 13 and X
 Correlations:
- Myoma location /incidence of abnormal karyotype: intramural - 35%; subserosal -
29%; submucosal – 12%
- Type of chromosome abnormality/tumor mean size: normal karyotype - 5.4 cm; with
del(7q) - 5cm; with t(12; 14) rearrangements - 8.5 cm
Uterine leiomyoma
3/44 casi
NO RESULT

23. Bianchi et al, Prenatal Diagnosis 2016, 36, 203–209; Pavlidis NA. Coexistence of pregnancy and malignancy.
Oncologist 2002;7:279–287; Bianchi, Genet Med. 2017 Dec 7. doi: 10.1038/gim.2017.219. [Epub ahead of print]
• Breast c.
• Ovarian c.
• Cervical c.
• Colorectal c.
• Lymphomas (H/NH)
• Malignant Melanomal
• Leukemia
Maternal side
Maternal tumors
BENIGN e MALIGNANT

24. Limiti – Risultati discordanti
Fetal side Maternal side
Grati et al, Genet Med. 2014 Aug;16(8):620-4; Grati FR, Ultrasound Obstet Gynecol. 2016 May 31. doi:
10.1002/uog.15975;
Condizioni /trattamenti materni
Tumori materni
Anomalie cromosomi sessuali
materni (costituzionali o a mosaico)
Trasfusioni e trapianti
CNV e mosaicismi autosomi materni
Bianchi, Genet Med. 2017 Dec 7. doi: 10.1038/gim.2017.219. [Epub ahead of print]

25. Perdita spontanea del cromosoma X (età-correlata)
Anomalie cromosomiche
(microscopiche/submicroscopiche) materne
Guttenbach et al, AJHG 1995; Russell LM, et al. Cytogenet Genome, 2007

26. Guttenbach et al, AJHG 1995; Russell LM, et al. Cytogenet Genome, 2007
Perdita spontanea del cromosoma X (età-correlata)
Anomalie cromosomiche
(microscopiche/submicroscopiche) materne

27. Management dei casi con risultato discordante
per aneuploidie dei cromosomi sessuali
Wang et al, Clin Chem. 2014 Jan;60(1):251-9
Risultato NIPT  Alto rischio per aneuploidie cromosomi sessuali
Diagnosi prenatale  cariotipo fetale normale
Cariotipo materno?

28. Limiti – Risultati discordanti
Fetal side Maternal side
Grati et al, Genet Med. 2014 Aug;16(8):620-4; Grati FR, Ultrasound Obstet Gynecol. 2016 May 31. doi:
10.1002/uog.15975;
Condizioni /trattamenti materni
Tumori materni
Anomalie cromosomi sessuali
materni (costituzionali o a mosaico)
Trasfusioni e trapianti
CNV e mosaicismi autosomi materni
Bianchi, Genet Med. 2017 Dec 7. doi: 10.1038/gim.2017.219. [Epub ahead of print]
Discordanza di
sesso fetale

29. Suggested clinical
management for
discordant cases
between cfDNA testing
results and echographic
sex
Bianchi et al, Obstet Gynecol 2015;125:375382

30. Bianchi et al, Obstet Gynecol 2015;125:375382
Suggested clinical management for discordant cases
between cfDNA testing results and echographic sex

31. Bianchi et al, Obstet Gynecol 2015;125:375382
Suggested clinical management for discordant cases
between cfDNA testing results and echographic sex

32. Suggested clinical management for discordant
cases between cfDNA testing results and
echographic sex
Grati, Ultrasound Obstet Gynecol 2016; 48: 415–423

33. Limiti – Risultati discordanti
Fetal side Maternal side
Grati et al, Genet Med. 2014 Aug;16(8):620-4; Grati FR, Ultrasound Obstet Gynecol. 2016 May 31. doi:
10.1002/uog.15975; Bianchi, Genet Med. 2017 Dec 7. doi: 10.1038/gim.2017.219. [Epub ahead of print]
Condizioni/trattamenti materni
Tumori materni
Anomalie cromosomi sessuali materni
(costituzionali o a mosaico)
Trasfusioni e trapianti
Copy Number Variations e mosaicismi
autosomi materni
Es.
Duplicazione
crom.18
materna
ALTO
RISCHIO
T18

34. Risultati discordanti

35. Livia Marcato
TOMA Advanced Biomedical Assays, S.p.A.
lmarcato@tomalab.com
Grazie per
l’attenzione