1. UUNNIIVVEERRSSIITTÀÀ DDEEGGLLII SSTTUUDDII DDII TTOORRIINNOO
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BBIIOOTTEECCNNOOLLOOGGIIEE MMEEDDIICCHHEE
EFFETTI MORFOFUNZIONALI DELLA
MANIPOLAZIONE MOLECOLARE
DELLA SINAPSINA
Il candidato Il relatore
Andrea Cerase Prof. P.G. Montarolo
AANNNNOO AACCCCAADDEEMMIICCOO 22001111--22001122

2. Abstract
Le sinapsine appartengono ad una famiglia di proteine neuronali fosforilabili associate alle vescicole sinaptiche ed evolutivamente conservate negli organismi invertebrati e vertebrati. Da analisi genetiche su diversi organismi si ipotizza che questa famiglia abbia avuto origine da un gene ancestrale che subì eventi di duplicazione genica quando i vertebrati si separarono dagli invertebrati.
Nei mammiferi, sono state identificate le diverse isoforme generate grazie ad uno splicing alternativo dell’mRNA trascritto da tre diversi geni: SYN I, SYN II e SYN III. Nell’uomo e nel topo, questi geni sono presenti sul cromosoma X (Xp 11), sul cromosoma 3 (3p25) e sul cromosoma 22 (22q12.3). In organismi invertebrati invece, come Aplysia e nella chiocciola terrestre Helix, vi è la presenza di unico gene codificante per la sinapsina (apSyn ed helSyn, rispettivamente).
A livello amminoacidico, le sinapsine presentano un’alta omologia nella regione
N-terminale, costituita da tre domini funzionali chiamati A, B e C, ed una variabilità notevole in quella C-terminale. Inoltre, i domini A e B presentano siti di fosforilazione per diverse chinasi ben conservati nei diversi organismi. Tali fosforilazioni sono in grado di modificare le proprietà funzionali della sinapsina regolando la sua capacità di legare le vescicole sinaptiche o di permettere la polimerizzazione dei filamenti di actina, andando in ultima analisi e regolare fenomeni come la crescita neuritica, la formazione di strutture
pre-sinaptiche funzionali ed il rilascio del neurotrasmettitore.
Studi su topi in cui i singoli geni della sinapsina sono stati deleti hanno dato spesso risultati contrastanti, e questo è dovuto in parte alla presenza di tre geni codificanti queste proteine che determinano l’insorgere di fenomeni di ridondanza funzionale. Inoltre, è noto come in topi transgenici possano instaurarsi fenomeni di compensazione in seguito ad una deplezione gene specifica.
In questo lavoro abbiamo cercato di sviluppare un modello in vitro in cui specifiche cellule neuronali non presentino al loro interno la sinapsina endogena grazie all’utilizzo di un RNA antisenso per helSyn (helSyn_AS). A tal fine, ci siamo serviti dei neuroni di Helix, un organismo molto utile per lo studio degli effetti derivanti da una down-regolazione della sinapsina perchè privo di fenomeni di ridondanza. Inoltre, tale gasteropode presenta un sistema nervoso semplice costituito da neuroni identificabili, di notevoli dimensioni (raggiungendo fino a 200 μm di diametro), la cui posizione anatomica e le connessioni sono

3. ben note. Tali caratteristiche permettono di isolare determinate cellule neuronali da porre in coltura.
In seguito al clonaggio di helSyn_AS nel vettore pNEX3, i successivi esperimenti di microiniezione atti a valutare l’efficienza del costrutto nell’inibire l’espressione di helSyn hanno dimostrato come ci sia una significativa riduzione dei livelli di sinapsina nelle strutture pre-sinaptiche (varicosità). Al fine di valutare l’accumulo specifico di helSyn nelle varicosità è stato definito un parametro di localizzazione, il “targeting factor”, che tiene conto di segnali aspecifici dovuti al valore non trascurabile delle varicosità stesse (0,1-25 μm2 di area). Analizzando gli effetti morfologici indotti dall’inibizione di helSyn su neuroni C1 di Helix siamo riusciti a dimostrare che helSyn_AS è effettivamente in grado di ridurre sia la crescita neuritica sia la formazione di strutture varicose, confermando precedenti studi condotti in vitro su altri modelli animali.
Recenti studi hanno dimostrato come diverse mutazioni “non-senso” nei geni umani SYN I e SYN II siano associate ad autismo e fenotipi epilettici. Lo sviluppo di un modello in cui cellule poste in coltura non presentino la sinapsina endogena, e dove non vi siano fenomeni di ridondanza da parte di altre isoforme proteiche, potrebbe quindi essere di notevole aiuto per la caratterizzazione delle disfunzioni relative alle mutazioni della sinapsina. Studi futuri prevedono l’applicazione di questo modello al fine di
co-overesprimere forme mutanti della sinapsina per analizzare modificazioni nei parametri biofisici delle cellule, come il potenziale di riposo, il potenziale di soglia o eventuali modifiche a livello delle cinetiche di rilascio delle vescicole sinaptiche e sulle caratteristiche dei diversi pools.
Inoltre, l’utilizzo di questo modello potrebbe essere molto promettente per lo sviluppo di nuovi farmaci con azione anti-epilettica, permettendo l’evolversi di nuove terapie da impiegare su pazienti che presentano questo fenotipo.