X. laevis è un importante organismo modello in biologia evolutiva dello sviluppo, tossicologia, etologia, neurobiologia, endocrinologia e biologia dei tumori; grazie alle recenti tecniche di Genome editing, ha acquisito una posizione rilevante anche nel campo della Genetica.
I progressi tecnologici raggiunti nel campo delle strategie di sequenziamento degli acidi nucleici ("Next Generation Sequencing", NGS) permettono oramai di ottenere con facilità le informazioni contenute all’interno dell’intero genoma umano. Ma solo una piccola percentuale (stimata a 1,6%) del genoma umano viene tradotto nelle proteine che fanno funzionare il corpo umano. Il sequenziamento esomico ("Whole exome sequencing") si concentra proprio sulle parti del genoma che codificano le proteine ("i geni") perché la ricerca di varianti in tali regioni permette di trovare le modificazioni funzionali delle proteine che sono associate a malattie. Dovendo sequenziare solo circa 1/60 dell’intero genoma si ha la possibilità di avere una migliore accuratezza e di ridurre tempi e costi del sequenziamento. Per questo motivo il sequenziamento esomico è diventato uno dei metodi di diagnosi genetica più utilizzato dai medici (sopratutto nel caso in cui non ci siano ipotesi sui geni coinvolti nella malattia).
Presentazione della mia tesi magistrale in Biotecnologie per l'Alimentazione incentrata sullo studio del potenziale alterante su prodotti lattiero caserari del batterio Pseudomonas fluorescens.
2. Xenopus Laevis & Xenopus tropicalis
Ordine: Anura
Famiglia: Pipidae
Cibo: predatori carnivori e cannibali
Condizioni di Vita: totalmente acquatici
Pelle: permeabile e mucosa. I pigmenti della pelle
sono sotto controllo ormonale
Vita media: 15 anni in condizioni selvatiche e 25-30
in cattività
Dimorfismo sessuale: dimensione
Numero uova: centinaia; i girini completano lo
sviluppo in 6 settimane.
3. Necessità dello Xenopus come organismo
modello nella drug descovery
CASO DELLA PERSYNTHAMIDE:
Zebra fish mutanti recessivi per il ciclo cellulare
“crash and burn” (crb). La mutazione crb colpisce il
gene mybl2 e causa un incremento del numero di
cellule mitotiche nell’embrione
Persynthamide unica molecola per recuperare il
fenotipo mitotico nei mutanti omozigoti (vitali) crb.
Effetti sulla regolazione cellulare sono zebra fish –
specifici e non possono essere generalizzati alle
cellule cancerose mammifere.
4. Storia Xenopus laevis
X. laevis è stato utilizzato per uno dei primi test di gravidanza, attualmente obsoleto:
la gonadotropina corionica (HCG) contenuta nell‘urina delle donne incinte è infatti in grado di
indurre la deposizione di uova nella femmina adulta di X. laevis. Oggigiorno tale proprietà viene
utilizzata a fini di ricerca, per stimolare l'accoppiamento negli animali da laboratorio
X. laevis è un importante organismo modello in biologia evolutiva dello sviluppo, tossicologia,
etologia, neurobiologia, endocrinologia e biologia dei tumori [‘’Establishing and Maintaining a
Xenopus Laesvis Colony for Research Laboratories’’- P.Koustubhan, D.Sorocco, M. Levin]
È stato uno dei primi vertebrati ad essere clonato, nel 1958 da John Bertrand Gurdon (premio Nobel
per la Medicina e la Fisiologia nel 2012 insieme al giapponese Shinya Yamanaka) [’’Sexually
Mature Individuals of Xenopus laevis from the Transplantation of Single Somatic Nuclei ’’- J. B.
Gurdon, T. R. Elsdale, M. Fischberg]
5. Colture tissutali (es. cellule muscolari e neuronali per lo studio di induzione
sinaptica)
Interazione cellula-matrice extracellulare
Analisi di signaling cellulare
Studio del citoscheletro e organizzazione spaziale delle macromolecole
[“Xenopus laevis: Practical Uses in Cell and Molecular Biology”-
Volume 36, Pages ii-xxii, 3-718 (1991) Edited by Brian K. Kay and H.
Benjamin Peng]
Studio origine e sviluppo tumori
Studio meccanismi apoptotici
[“www.xenbase.org”]
Xenopus e ricerca
6. VANTAGGI SVANTAGGI
Similarità genoma con l’uomo
Tetrapode
Polmoni
Facilità di allevamento
Uova trasparenti
Sviluppo esterno in soluzione
salina
Ogni stadio di sviluppo è
accessibile alla
sperimentazione
Embrioni relativamente grandi
(microchirurgia, trapianto
tissutale)
Pelle permeabile
Paleopoliploide
Perdita di geni (50-60%) o
silenziamento a causa della
ridondanza funzionale
Diploidizzazione del genoma
2n=36
9. GLI XENOPUS E L’UOMO
Modello per malattie similarità in organizzazione
e struttura degli organi + omologia stretta con
genoma umano
Drug descovery
10. XENBASE
2010: pubblicata la sequenza genomica di X.
tropicalis.
genoma ad alto grado di conservazione: sintenico
come quello umano, con le regioni di sintenia che
spesso si estendono per centinaia di geni.
La sequenza nucleotidica parziale del genoma di X.
laevis è stata rilasciata su Xenbase (the Xenopus
model organism database)
13. MORPHOLINO
•Efficienza
•Specificità
•Resistenza alle nucleasi
•Buona solubilità in soluzioni acquose
•Bassa tossicità
•Bassi costi di produzione
Il meccanismo di azione si MOs si basa
sulla stabilità del duplex formato sull’RNA
target che provoca ingombro sterico.
La progettazione di MOs non richiede la
conoscenza della sequenza genomica, ma
non vi è trasmissione alla generazione
successiva
14. • L’oocita possiede gli mRNA materni e le proteine
che sono codificate nel genoma materno.
• Poiché la trascrizione dei geni zigotici è
inizialmente inattiva nelle prime fasi embrionali,
questi fattori materni adempiono ad importanti
funzioni
• La funzione degli mRNA materni può essere
facilmente studiata tramite iniezione di Mos che
ne blocchino la traduzione nelle uova fertilizzate
Studio di mRNA materni tramite MOs
19. Una sequenza codificante per una Cas9 di
S.pyogenes ottimizzata per codoni con un NLS è
stata clonata a valle del promotore per l’RNA pol
del batteriofago T7 in pCDG1.
Il plasmide risultante pCasX, permette la sintesi
di 50-capped 5.5 kb hCas9 RNA contenente le
sequenze della β globina 30 e 50 di Xenopus per
incrementare la traducibilità e l’introne SV40 e
un segnale di polyA per una maggiore stabilità
dell’RNA. Il tutto è stato processato in embrioni
di Xenopus in seguito a microiniezione.
20. E’ stato concluso che il sistema CRISPR/Cas ha targettato efficientemente il gene tyr in X.Tropicalis,
con un’apparente mutazione in entrambi gli alleli, specialmente negli albini più marcati.
Valutazione dell’albinismo
Tutti i 72 embrioni mostravano una riduzione
dei melanociti e della pigmentazione
dell’epitelio retinale in grado diverso, da
appena accennata a una perdita completa.
Queste osservazioni suggeriscono che un
largo numero di cellule aveva una perdita
biallelica della funzione del gene tyr. Le
mutazioni erano incentrate a valle e in
prossimità del sito PAM
Screening Embrioni fase 41-42 dello sviluppo
139 campioni iniettati,40 anormali
Rimanenti 99:27 fenotipicamente
anormali,72 normalmente sviluppati
Microiniezione
Una sequenza per un oligonucleotide ds contenete
il target per tyrA è stata clonata nel plasmide
DR274 per permettere la sintesi in vitro della
sgRNA per tyr di 100nt.
L’mRNA per hCas9 e la sgRNA per tyr sono
state coiniettate negli embrioni in fase di 1 o
2 cellule e incubati a 24-26°C per
permetterne lo sviluppo in girini.
Per creare una guida tyr-targeting di RNA è
stato studiato la sequenza codificante di tyr
alla ricerca di potenziali siti della forma
(GGN)18NGG.
E’ stato trovato un sito al 5’ dell’ORF
all’interno della sequenza codificante per 22
aa (nella porzione N-term) del peptide
responsabile dell’indirizzamento della
tirosinasi nelle membrane dei melanosomi (a
cui è legata).
Quindi è stato ipotizzato che la
modificazione di questa sequenza, anche solo
per una delezione in-frame di un singolo
codone, avrebbe portato alla perdita della
funzione segnale di questo peptide e ad una
disomogeneità della sintesi di melanina.
21.
22. PHENOTIPIC DRUG DISCOVERY
• In vivo
• Screening di cellule intatte/interi organismi con
library chimiche per identificare sostanze con
effetto terapeutico.
• Combina lo screening e il test sugli animali in
un unico step
23. Esempio dell’ heterotaxin
L’eccessiva espressione dei componenti del
segnale di TGF-β interferisce con la simmetria
destra-sinista di posizione degli organi negli
embrioni di Xenopus (heterotaxia)
E’ stata identificata una classe di piridine con un
effetto inibitorio sull’attività di TGF-β.
•Su una library di 133 regioisomeri, 44 sono stati
esaminati per la loro attività di induzione di
heterotaxia.
Un regioisomero induceva chiaramente il 100% di
heterotaxia ed è stato chiamato “heterotaxin”.
L’heterotaxin provoca inibizione dei segnali
intacellullari dipendenti da TGF-β.
•L’heterotaxin può essere utilizzato come agente
terapeutico (processi fibrotici e cancri metastatici)
