Presentazione a cura della dr.ssa Andrea Dardis, responsabile del Laboratorio del Centro di Coordinamento Regionale per le Malattie Rare FVG.

1. Andrea Dardis, PhD
Centro di Coordinamento Regionale per le Malattie Rare
University Hospital “Santa Maria della Misericordia”
Udine, Italy
andrea.dardis@asuiud.sanita.fvg.it
Dall'analisi molecolare ai quadri clinici
della Malattie Lisosomiali

2. Circa 60 disordini dovuti a un difetto a carico di specifici enzimi
lisosomiali o di proteine lisosomiali non enzimatiche transmembrana
che determinano un accumulo di metaboliti non degradati all’interno
dei lisosomi.
LE/Lysosomes
ER
enzima
Proteine di trasporto
Accumulo di macromolecole Danno cellulare????????????
Malattie da accumulo lisosomiale

3. L’accumulo si osserva in diversi tessuti e organi
Manifestazioni fenotipiche complesse caratterizzate da
associazione di sintomi viscerali, oculari, ematologiche, scheletriche
e neurologiche.
Forme infantili ed adulti
Malattie da accumulo lisosomiale

4.  Più di 60 disordini ereditari
 Prevalenza globale 1:8000 nati vivi
 Eredità autosomica recessiva, a eccezione delle
malattie di Fabry, di Hunter e di Danon (X linked)
 Vengono classificate in base al substrato accumulato
Malattie di accumulo lisosomiale

5. Mucopolisaccaridosi Sfingolipidosi Glicoproteinosi altro
MPS I (Hurler, Scheie) Fabry Fucosidosi Def Multiplo Sulfatasi
MPS II (Hunter) Farber a-mannosidosi Def. Lipasi acida
MPS III A (Sanfilippo A) Gangliosidosi GM1 b-mannosidosi Galattosialidosi
MPS III B (Sanfilippo B) Gangliosidosi GM2 (Tay
Sachs)
Schindler Glicogenosi II
MPS III C (Sanfilippo C) Gangliosidosi GM2
(Sandhoff)
Sialidosi Dannon
MPS III D (Sanfilippo D) Gangliosidosi GM2 (def
GM2A)
Mucolipidosi II
MPS IV A (Morquio A) Gaucher (def bglu) Mucolipidosi III
MPS IV B (Morquio B) Gaucher (def Sap C) Mucolipidosi IV
MPS VI (Maroteaux-
Lamy)
Krabbe Ceroidolipofuscinosi I
MPS VII (Sly) Leucodistrofia metacr.
(def ARSA)
Ceroidolipofuscinosi II
Leucodistrofia metacr
(def. SapD)
Ceroidolipofuscinosi 3
Niemann Pick A e B Ceroidolipofuscinosi 5
Niemann Pick C Ceroidolipofuscinosi 6
Ceroidolipofuscinosi 8
Deficit enzimatico Deficit di proteine non enzimatiche

6. Malattie di accumulo lisosomiale
Sospetto clinico
Ricerca di metaboliti Mucopolisaccaridi urinari (MPS)
Oligosaccaridi urinari (GSDII)
Test specifici enzimatici e/o molecolari
Chitotriosidasi plasmatica (Gaucher, NPA/B-C)Biomarkers
Non informativa in tutti i casi (mutazioni)
CCL18
Oxysterols (NPC-A/B, Wolman)

7. Deficit enzimatico
75%
Deficit di proteine non enzimatiche
25%
Malattie di accumulo lisosomiale
Dosaggio enzimatico Diagnosi molecolare

8. Diagnosi enzimatica
Nella maggior parte dei casi affidabile e rapida
Limiti
Non adatta alla prognosi e individuazione di portatori
Non sufficiente
3) Dosaggi di enzimi la cui funzione dipende di attivatori
2) In donne con sospetta malattia lisosomiale legata al X (Fabry)
1) Dosaggi di enzimi per cui sono state descritte pseudodeficienze enzimatiche

9. Non sufficiente
1-dosaggi di enzimi per cui sono state descritte pseudodeficienze
enzimatiche
Condizione presente nella popolazione generale determinata da polimorfismi
ATTIVITA ENZIMATICA MOLTO BASSA NON ASSOCIATA A MALATTIA
Arilsulfatasi A
b-esosaminidasi
a-iduronidasi
a-glucosidasi
a-galattosidasi
a-fucosidasi
b-glicuronidasi
Possibili errori nella
diagnosi e consulenza
genetica
Diagnosi enzimatica

10. In donne con sospetta malattia lisosomiale legata al X (Fabry)
Diagnosi enzimatica
Non sufficiente
XY Maschi emizigoti presentano un’attività della alfa
galattosidasi A chiaramente patologica
XX Donne portatrici in eterozigosi, come conseguenza
dell’inattivazione casuale del X, possono essere
asintomatiche o sviluppare sintomi. L’attività
enzimatica può risultare alterata o nella norma.

11. GM1
GM2
GM3
Ceramide
Globotriosylceramide
Glucosylceramide
Lactosylceramide
galactosylceramideSfingomielina
HexA GM2
attivatore
Sialidasi a-Galactosidasi A
b-Galactosidase
Glucosilceramidasi
b-Galattosilceramidasi
Sulfatide
ARSA
SAP C
SAP B
SAP A
GM2 gangliosidosi
Leucodistrofia
metacromatica
Krabbe
Gaucher
•Difetto enzimatico
•Difetto di attivatore (rare)
Attività enzimatica NORMALE
Non sufficiente
Dosaggi di enzimi la cui funzione dipende di attivatori
Diagnosi enzimatica

12. Diagnosi molecolare
Unico strumento diagnostico nel 25% dei disordini
In casi di pseudodeficienze enzimatiche
In dosaggi di enzimi la cui funzione dipende
da attivatori
Donne con sospetta malattia lisosomiale
legata al X (Fabry)
Prognosi della malattia (attività enzimatica
non sempre correla con severità)
Determinazione dei portatori
Approfondimento della diagnosi
Certezza diagnostica
Consulenza genetica
Complementare la diagnosi enzimatica

13. Diagnosi molecolare
Assenza di mutazioni frequenti (mutazioni descritte:
Fabry circa 600, Gaucher circa 300, NPC1 circa 400,
ecc) la maggior parte “private”
Mutazioni puntiformi
Sequenziamento dell’intera zona codificante dei geni
Primo approccio

14. Geni da 5 a 30 esoni
Diagnosi molecolare
Ricerca di mutazioni puntiformi mediante sequenziamento
5’ 3’
1. PCR specifica degli esoni e zone introniche fiancheggianti
2. Sequenziamento automatico (Genetic Analyzer 3500XL, 24 capillari)

15. Diagnosi molecolare
c.1064T>C (p.L355P) c.2188 G>T (p.E730X)
Paziente con diagnosi enzimatica di glicogenosi 2.
Autosomica recessiva - Gene GAA
Non riportata

16. Diagnosi molecolare
Le criticità
Mutazioni nuove : patogenetiche o polimorfismi (>1% nella popolazione normale)?
Ricerca nei database
Studio di 100 alleli
Saggi funzionali in vitro
Alleli complessi (2/+ mutazioni sullo stesso allele)
Conferma nei genitori
Clonaggio
Tutte le mutazioni devono essere confermate in una seconda PCR

17. Espressione in vitro delle muove mutazioni
missenso e alleli complessi
Enzymatic activity
Western blot
pcDNA3
GAA cDNA WT
pcDNA3
GAA cDNA mutant
site directed mutagenesis

18. 0
20
40
60
80
100
120
WT c.399C>A c.670C>T c.1064T>C c.2104C>T c.2188G>T
%residualGAAactivity
76
110
95
70
WT ALDP
Expression of new missense mutations
in COS-1 cells
c.1064T>C c.2104C>TGAA wt

19. Assenza di mutazioni in uno o entrambi gli alleli
dopo sequenziamento della zona codificante
(circa 20% dei casi)
Mutazioni introniche profondeDelezioni parziali o totali di uno degli alleli

20. Delezioni parziali o totali di uno degli alleli
Multiplex ligation-dependent probe
amplification (MLPA)
1 2 3 4 5
1 2 3 5

21. Mutazione intronica profonda
2547 Kb1
1-25 1-23
DNA
mRNA
24-25
RT-PCR
Sequenziamento
352nt
473 nt
121 nt del introne 23
rimangono ritenuti nel mRNA

22. Diagnosi molecolare
Campione DNA (cellule nucleate)
PCR di ogni esone
Sequenziamento automatico
mutazioni
Conferma nei genitori
Una o nessuna mutazione
Mutazione intronica?? Delezione ???
Coltura di fibroblasti
Analisi del mRNA per mutazioni di slpicing
descritta
nuova
Patogenetica ???
MLPA

23. Diagnosi prenatale
E’ possibile quando c’è un paziente diagnosticato in famiglia
Malattie autosomiche recessive: I genitori, entrambi
portatori, hanno una probabilità ¼di avere un figlio affetto
Mamma (portatrice) Papà (portatore)
sano malatoportatore

24. Diagnosi prenatale
Malattie X linked: le donne portatrici hanno una probabilità ½
di trasmettere il gene mutato alla prole
50% dei maschi affetti 50% delle femmine portatrici
Diagnosi prenatale solo nei maschi

25. Campione: Villo coriale (10-12^sett.) o amniociti (16^sett)
Diagnosi biochimica: Analisi dell’ attività enzimatica
Diagnosi molecolare: Analisi delle mutazioni del gene presenti nella famiglia.
Solo utile in famiglie in cui le mutazioni sono state caratterizzate.
Esclusione della contaminazione con DNA materno
Diagnosi prenatale

26. Esclusione della contaminazione con DNA materno
Analisi di microsateliti (STR)
Il numero di ripetizioni varia frequentemente tra gli alleli
portando ad un alto grado di polimorfismo
piccoli blocchi di ripetizioni in tandem,da 15-50
volte,semplici nella sequenza (1-6bp)e dispersi nel genoma
Sono numerosi

27. Analisi di microsateliti
Multiplex PCR
Amplificazione di diversi (15) STR in
contemporaneo utilizzando primers
fluorescenti
Elettroforesi capillare (Genetic
Analyzer 3500XL)

28. 4000
3200
2400
1600
800
-
-
-
-
-
130 170 210 250 290 330 370
-
-
-
-
-
-
-
250 290
4000
3200
2400
1600
800
-
-
-
-
-
130 170 210 330 370
-
-
-
-
-
-
-
Madre
Villo
Madre
Allele 1 Allele 2
128 140
162 162
220 234
298 302
Villo
Allele 1 Allele 2
128 132
162 166
220 220
298 302

29. Next generation sequencing
Consente il sequenziamento simultaneo di un
enorme numero di frammenti di DNA in tempi
più rapidi e a costi più bassi
Targeted resequencing of genes involved in metabolic diseases
In particular lysosomal diseases with similar phenotypes

30. Step 1 : DNA bank generation
Fragmentation
Genomic
DNA
Ligation of
adaptor and
index
Step 1
DNA library
generation
Step 2
Clonal
amplification
Step 3
Sequencing
Genomic libray
Next generation sequencing
3 steps
A B

31. 2-Amplificazione clonale
Next generation sequencing (NGS)
Support =FlowCell

32. Next generation sequencing (NGS)
3-sequencing by stnthesis (SBS)

33. Next generation sequencing (NGS)
4-Analisi
Immagini di fluorescenza Sequenze nucleotidiche (reads)
“quality score”
Allineamento con la sequenza di riferimenti “Variant call “
L’accuratezza viene assicurata dalla lettura ripetuta e massiva di ogni frammento
deep coverage