1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 29717
(51) A61K 39/135 (2006.01)
C12N 7/00 (2006.01)
МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2014/0670.1
(22) 15.05.2014
(45) 15.04.2015, бюл. №4
(72) Абишов Абдикалык Абдижаппарович;
Хайруллаева Куралай Амангельдиевна
(73) Товарищество с ограниченной
ответственностью "Казахский научно-
исследовательский ветеринарный институт"
(56) Салажов Е.П. Ветеринарные препараты. М.:
Колос, 1981, с.66-73
(54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ
ИНАКТИВИРОВАННОЙ ТРЕХВАЛЕНТНОЙ
ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ЯЩУРА
(57) Изобретение относится к ветеринарной
вирусологии и биотехнологии в частности к способу
изготовления вакцинных препаратов и может найти
применение в ветеринарной практике для
профилактики ящура.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением, выражается использовании штаммов
вирусов, обладающих высокой иммуногенной
эффективностью, и применении технологий,
позволяющих получать биомассу штаммов
вакцинных вирусов с высоким титром.
Способ получения инактивированной
трехвалентной вакцины против ящура, включающий
использование штаммов выделенные на территории
Казахстана типа А, О, Азия-1, репродукцию
биомассы этих штаммов в суспензионной культуре
клеток ВНК-21 при температуре 37±1°С, очистку
вирусной суспензии от балластных примесей,
инактивацию, концентрирование полученной
суспензии и соединение концентрированного
вируса с масляным адъювантом, отличающийся тем,
что для получения высокоактивного вирусного
сырья в суспензионной культуре клеток ВНК-21 при
температуре 37±1°С используют штаммы «АК-2000-
12» «Д-05-12» «А-2003-12» типов А, О и
Азия-1, очистку вирусной суспензии от балластных
примесей методом сепарирования, инактивацию,
концентрирование полученного вируса ящура и
соединение концентрированного вируса с масляным
адъювантом один из марок монтанида ISA-70,
ISA-50 или ISA-206 производства фирмы «Seppic»
(Франция).
(19)KZ(13)A4(11)29717

2. 29717
2
Изобретение относится к ветеринарной
вирусологии и биотехнологии в частности к способу
изготовления вакцинных препаратов и может найти
применение в ветеринарной практике для
профилактики ящура.
Известен способ изготовления инактивированной
трехвалентной вакцины против ящура, включающий
репродукцию вируса ящура в организме
новорожденных крольчат, забивание больных
животных, измельчение, очистку от балластных
белков, инактивирование аминоэтиленимином,
фильтрование вирусной суспензии через
стерилизующие фильтры и добавление гидрата
окиси алюминия [Салажов Е.П. Ветеринарные
препараты, М. «Колос», 1981, с.66-73].
Недостатком способа изготовления вакцины
против ящура является низкая производительность
технологии получения биологической массы
возбудителя ящура и присутствие посторонних
балластных белков.
Задачей изобретения является повышение
иммунологической эффективности трехвалентной
инактивированной вакцины против ящура.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением, выражается использовании штаммов
вирусов, обладающих высокой иммуногенной
эффективностью, и применении технологий,
позволяющих получать биомассу штаммов
вакцинных вирусов с высоким титром.
Способ получения инактивированной
трехвалентной вакцины против ящура, включающий
использование штаммов выделенные на территории
Казахстана типа A AV-0265 «АК-2000-12», типа О
AV-0267«Д-05-12», типа Азия-1 AV-0266 «А-2003-
12», репродукцию биомассы этих штаммов в
суспензионной культуре клеток ВНК-21 при
температуре 37±1°С, очистку вирусной суспензии от
балластных примесей, инактивацию,
концентрирование полученной суспензии и
соединение концентрированного вируса с масляным
адъювантом.
Изобретение осуществляется следующим
образом.
Штаммы вируса ящура типа A AV- 0265 «АК-
2000-12»,типа О AV-0267«Д-05-12», типа Азия-1
AV-0266 «А-2003-12», используемые для получения
инактивированной трехвалентной вакцины против
ящура депонированы в лаборатории по изучению
генофонда микроорганизмов ТОО «КазНИВИ» и
обладают следующими свойствами.
Штамм вируса ящура типа A AV-0265 КазНИВИ
«АК-2000-12»
Репродуктивные свойства. Штамм вируса ящура
типа A AV-0265 КазНИВИ «АК-2000-12»
репродуцируется и накапливается в перевиваемой
линии клеток ВНК-21/13 в титре 109,50
lg ТЦД50/см3.
В указанной перевиваемой культуре клеток штамм
AV-0265 КазНИВИ «А-2003-12» вируса ящура типа
А активно размножается и начало цитопатического
действия отмечается через 8-9 часов после
инфицирования, поражая к 20-30 часам около 80-
90% монослоя клеток.
Штамм вируса на уровне 5-7 пассажей в
культуре клеток ВНК-21/13 характеризуется
высокой репродуктивной активностью. Повышение
инфекционной и комплементсвязывающей
активности достигнуто в результате клонирования
исходного культурального штамма, путем
предельного разведения. Биологическая активность
клонированных вариантов штамма перевиваемой
линии клеток ВНК-21/13 достигает до 9,50 lg
ТЦД50/см
3
.
Антигенные свойства. Штамм вируса ящура типа
A AV-0265 КазНИВИ «АК-2000-12» в организме
зараженных животных (белые мыши, морские
свинки, кролики, крупный рогатый скот) вызывает
образование вируснейтрализующих,
комплементсвязывающих и прецепитирующих
антител.
Патогенные свойства. Штамм вируса ящура типа
A AV-0265 КазНИВИ «АК-2000-12» у
инфицированных мышат-сосунов и крольчат
вызывает развитие типичных клинических
признаков болезни ящура (парезы и параличи
конечностей, мышц туловищ и шеи),
заканчивающиеся гибелью животных в течение 20-
26 ч после заражения. В организме зараженных
лабораторных животных вирус накапливается в
титрах 108,5
-109,3
ЛД50/01мл (летальная мышиная доза,
вызывающих 50% гибель мышат- сосунов).
Иммуногенные свойства. Штамм вируса ящура
типа A AV-0265 КазНИВИ «АК-2000-12»
репродуцированный в культуре клеток ВНК-21/13,
инактивированный димером этиленимина и
добавленный масляного адъюванта при подкожном
введении крупному рогатому скоту в дозе 3 мл
стимулирует образования напряженного
противоящурного иммунитета. Все
иммунизированные животные при контрольном
заражении оставались клинически здоровыми в
течение 10 суток после их инфицирования
вирулентным вирусом ящура типа А.
Стабильность свойств при пассировании.
Основные биологические свойства штамма вируса
ящура типа A AV-0265 КазНИВИ «АК-2000-12»,
при культивировании в культуре клеток ВНК-21/13
сохраняются в течение 12 пассажей (срок
наблюдения).
Сохраняемость. Штамм вируса ящура типа A
AV-0265 КазНИВИ «АК-2000-12» в виде
культуральной суспензии не снижает
биологическую активность при температуре 4±1°С в
течение 40 сут, при минус 30°С-18 мес, а в виде
фарша из тушек крольчат с консервантом
(глицерин + физиологический раствор аа) при pH
7,5 в течение 6 месяцев при температуре 4±1°С,
36 мес - при минус 40°С.
Штамм вируса ящура типа Азия-1 AV-0266
КазНИВИ «А-2003-12»
Штамм AV-0266 вируса ящура типа Азия-1
получен путем клонирования исходного штамма
методом предельного разведения с последующей
репродукцией на перевиваемой линии клеток ВНК-
21/13 и обозначен как штамм AV-0266 вируса ящура
типа Азия -1 КазНИВИ «А-2003-12».

3. 29717
3
Полученный штамм характеризуется
следующими признаками.
Штамм AV-0266 вируса ящура типа Азия-1
КазНИВИ «А-2003-12» обладает высокой
репродуктивной активностью на культуре клеток
ВНК-21/13, антигенной и иммуногенной
активностью. Повышает эффективность
профилактических препаратов и диагностики ящура
животных. Штамм используют для изготовления
вакцинных и диагностических биопрепаратов.
Состав среды и условия культивирования: Среда
Игла-МЕМ, содержащий 5% сыворотки крови
крупного рогатого скота.
Морфологические признаки. Вирус ящура типа
Азия-1 относится к мелким вирусам парнокопытных
животных. Размер вириона 22-25 нм, имеет
сферическую (икосаэдрический) форму, состоит из
одноцепочечной линейной молекулы РНК,
заключенную в белковую оболочку, состоящей
главным образом из четырех структурных белков
VP1, VP2, VP3; VP4. Вирус содержит 31,5% РНК и
68,5% протеинов. Молекула белка состоит из
5 полипептидных цепей, который содержит 18
аминокислот.
Штамм AV-0266 КазНИВИ «А-2003-12» вируса
ящура типа Азия-1 обладает морфологическими
признаками, свойственными для возбудителя ящура
рода афтовирусов семейства пикорновирусов.
Культуральные свойства. Штамм AV-0266
КазНИВИ «А-2003-12» вируса ящура типа Азия-1
репродуцируется и накапливается в перевиваемой
линии клеток ВНК-21/13 в титре 109,25
lg ТЦД50/см3.
В указанной перевиваемой культуре клеток штамм
AV-0266 КазНИВИ «А-2003-12» вируса ящура типа
Азия-1 активно размножается и начало
цитопатического действия отмечается через
7-9 часов после инфицирования, поражая к 25-32
часам около 80-90% монослоя клеток.
Штамм вируса на уровне 7-8 пассажей в
культуре клеток ВНК-21/13 характеризуется
высокой репродуктивной активностью. Повышение
инфекционной и комплементсвязывающей
активности достигнуто в результате клонирования
исходного культурального штамма, путем
предельного разведения. Биологическая активность
клонированных вариантов штамма 9,25 lg ТЦД50/см3
.
Антигенные свойства. Штамм AV-0266
КазНИВИ «А-2003-12» вируса ящура типа Азия-1 в
организме зараженных животных (белые мыши,
морские свинки, кролики, крупный рогатый скот)
вызывает образование вируснейтрализующих,
комплементсвязывающих и прецепитирующих
антител.
Патогенные свойства. Штамм AV-0266
КазНИВИ «А-2003-12» вируса ящура типа Азия-1 у
инфицированных мышат-сосунов и крольчат
вызывает развитие типичных клинических
признаков болезни ящура (парезы и параличи
конечностей, мышц туловищ и шеи),
заканчивающиеся гибелью животных в течение 18-
24 ч после заражения. В организме зараженных
лабораторных животных вирус накапливается в
титрах 108,5
-109,3
ЛД50/0,1мл (летальная мышиная доза,
вызывающих 50% гибель мышат- сосунов).
Иммуногенные свойства. Штамм AV-0266
КазНИВИ «А-2003-12» вируса ящура типа Азия-1
репродуцированный в культуре клеток ВНК-21/13,
инактивированный димером этиленимина и
добавленный масляного адъюванта при подкожном
введении крупному рогатому скоту в дозе 3 мл
стимулирует образования напряженного
противоящурного иммунитета. Все
иммунизированные животные при контрольном
заражении оставались клинически здоровыми в
течение 7 суток после их инфицирования
вирулентным вирусом ящура типа Азия-1.
Стабильность свойств при пассировании.
Основные биологические свойства штамма AV-0266
КазНИВИ «А-2003-12» вируса ящура типа Азия-1,
при культивировании в культуре клеток ВНК-21/13
сохраняются в течение 15 пассажей (срок
наблюдения).
Сохраняемость. Штамм AV-0266 КазНИВИ «А-
2003-12» вируса ящура типа Азия-1 в виде
культуральной суспензии не снижает
биологическую активность при температуре 4±1°С в
течение 40 сут, при минус 30°С-18 мес, а в виде
фарша из тушек крольчат с консервантом (глицерин
+ физиологический раствор аа) при pH 7,5 в течение
6 месяцев при температуре 4±1°С, 36 мес - при
минус 40°С.
Штамм вируса ящура типа О AV-0267 КазНИВИ
«Д-05-12»
Штамм вируса ящура типа О AV-0267 КазНИВИ
«Д-05-12» получен путем клонирования исходного
штамма методом предельного разведения с
последующей репродукцией на перевиваемой линии
клеток ВНК-21/13 и обозначен как штамм вируса
ящура типа О AV-0267 КазНИВИ «Д-05-12».
Полученный штамм характеризуется
следующими признаками.
Штамм вируса ящура типа О AV-0267 КазНИВИ
«Д-05-12» обладает высокой репродуктивной
активностью на культуре клеток ВНК-21/13,
антигенной и иммуногенной активностью.
Повышает эффективность профилактических
препаратов и диагностики ящура животных. Штамм
используют для изготовления вакцинных и
диагностических биопрепаратов.
Состав среды и условия культивирования: Среда
Игла-МЕМ, содержащий 5% сыворотки крови
крупного рогатого скота.
Морфологические признаки. Вирус ящура типа О
относится к мелким вирусам парнокопытных
животных. Размер вириона 22-25 нм, имеет
сферическую (икосаэдрический) форму, состоит из
одноцепочечной линейной молекулы РНК,
заключенную в белковую оболочку, состоящей
главным образом из четырех структурных белков
VP1,VP2, VP3, VP4 Вирус содержит 31,5% РНК и
68,5% протеинов. Молекула белка состоит из 5
полипептидных цепей, который содержит 18
аминокислот.
Штамм «Д-05-12» вируса ящура типа О обладает
морфологическими признаками, свойственными для

4. 29717
4
возбудителя ящура рода афтовирусов семейства
пикорновирусов.
Культуральные свойства. Штамм вируса ящура
типа О AV-0267 КазНИВИ «Д-05-12»
репродуцируется и накапливается в перевиваемой
линии клеток ВНК-21/13 в титре 109,00
lg ТЦД50/см3.
В указанной перевиваемой культуре клеток штамм
«Д-05-12» вируса ящура типа О активно
размножается и начало цитопатических изменений
отмечается через 8-10 часов после инфицирования,
поражая к 32-36 часам около 70-80% клеток
монослоя.
Штамм вируса на уровне 10-12 пассажей в
культуре клеток ВНК-21/13 характеризуется
высокой репродуктивной активностью. Повышение
инфекционной и комплементсвязывающей
активности достигнуто в результате клонирования
исходного культурального штамма, путем
предельного разведения. Биологическая активность
клонированных вариантов штамма на культуре
клеток ВНК-21/13 9,00 lg ТЦД50/см3.
Антигенные свойства. Штамм вируса ящура типа
О AV-0267 КазНИВИ «Д-05-12» в организме
зараженных животных (белые мыши, морские
свинки, кролики, крупный рогатый скот) вызывает
образование вируснейтрализующих,
комплементсвязывающих и прецепитирующих
антител.
Патогенные свойства. Штамм вируса ящура типа
О AV-0267 КазНИВИ «Д-05-12» у инфицированных
мышат-сосунов и крольчат вызывает развитие
клинических признаков ящура (парезы и параличи
конечностей, мышц туловищ и шеи),
заканчивающиеся гибелью животных в течение 20-
26 ч после заражения. В организме зараженных
лабораторных животных вирус накапливается в
титрах 108,0
-109,00
ЛД50/0,1мл (летальная мышиная
доза, вызывающих 50% гибель мышат-сосунов).
Иммуногенные свойства. Штамм вируса ящура
типа О AV-0267 КазНИВИ «Д-05-12»
репродуцированный в культуре клеток ВНК-21/13,
инактивированный димером этиленимина и
добавленный масляного адъюванта при подкожном
введении крупному рогатому скоту в дозе 3 мл
стимулирует образования напряженного
иммунитета против возбудителя ящура. Все
иммунизированные животные при контрольном
заражении оставались клинически здоровыми в
течение 12 суток после их инфицирования
вирулентным вирусом ящура типа О.
Стабильность свойств при пассировании.
Основные биологические свойства штамма вируса
ящура типа О AV-0267 КазНИВИ «Д-05-12», при
культивировании в культуре клеток ВНК-21/13
сохраняются в течение 17 пассажей (срок
наблюдения).
Сохраняемость. Штамм вируса ящура типа О
AV-0267 КазНИВИ «Д-05-12» виде культуральной
суспензии не снижает биологическую активность
при температуре 4±1°С в течение 40 сут, при минус
30°С-20 мес, а в виде фарша из тушек крольчат с
консервантом (глицерин + физиологический раствор
аа) при pH 7,5 в течение 6 месяцев при температуре
4±1°С, 36 мес - при минус 40°С.
Пример 1.
Наработку вирусной массы типа А проводят с
использованием штамма «АК-2000-12», который
репродуцируют в суспензии перевиваемой линии
культур клеток ВНК-21/13 при температуре 37°С.
Через каждые 3 часа после начало культивирования
осуществляют забор проб вирусной суспензии,
клетки окрашивают метиленовой синью для
определения и подсчета живых клеток и клеток с
цитопатическим эффектом. При поражении более
90% клеток суспензии забор проб прекращают, а
процесс культивирования вируса продолжает в
течении 3-4 часов.
После окончания процесса культивирования в
ферментер добавляют хлороформ до конечной
концентрации 1,0%, эмульгирование биологической
массы проводят при постоянном перемешивании
вирусной суспензии, после окончании которого
суспензию подвергают сепарированию для удаления
балластных белков.
Инактивацию вируса проводят добавлением в
суспензию бинарного этиленимина в конечной
концентрации 0,03% и при температуре 27°С в
течении 30 часов. После окончания срока
инактивации в суспензию добавляют 50%
тиосульфат натрия для нейтрализации остаточного
инактиванта и 10% тиомерсал 0,002 мл для
консервации.
Содержание 146S компонентов в прививной дозе
вакцины получают путем концентрирования
антигена проточной ультрафильтрацией или на геле
гидроокиси алюминия. Конечная концентрация
146S компонентов вируса ящура должна быть не
менее 0,7 мкг/мл при изготовлении моновалентной
вакцины. В полученную вирусную суспензию
согласно инструкции по применению добавляют
один из марок монтанида ISA-70, ISA-50 или
ISA-206 производства фирмы «Seppic» (Франция).
Полученную вакцину расфасовывают и
проверяют на стерильность, авирулентность,
безвредность и иммуногенную активность.
Пример 2
Наработку вирусной массы типа О проводят с
использованием штамма «Д-05-12», который
репродуцируют в суспензии перевиваемой линии
культур клеток ВНК-21/13 при температуре 37°С.
Через каждые 3 часа после начало культивирования
осуществляют забор проб вирусной суспензии,
клетки окрашивают метиленовой синью для
определения и подсчета живых клеток и клеток с
цитопатическим эффектом. При поражении более
90% клеток суспензии забор проб прекращают, а
процесс культивирования вируса продолжает в
течении 6-8 часов.
После окончания процесса культивирования в
ферментер добавляют хлороформ до конечной
концентрации 1,0%, эмульгирование биологической
массы проводят при постоянном перемешивании
вирусной суспензии, после окончании которого
суспензию подвергают сепарированию для удаления
балластных белков.

5. 29717
5
Инактивацию вируса проводят добавлением в
суспензию бинарного этиленимина в конечной
концентрации 0,03% и при температуре 27°С в
течении 30 часов.
Содержание 146S компонента в прививной дозе
вакцины получают путем концентрирования
антигена проточной ультрафильтрацией или на геле
гидроокиси алюминия. Конечная концентрация
146S компонента вируса ящура должна быть не
менее 1,5 мкг/мл при изготовлении моновалентной
вакцины. В полученную вирусную суспензию
согласно инструкции по применению добавляют
один из марок монтанида ISA-70, ISA-50 или
ISA-206 производства фирмы «Seppic» (Франция).
Полученную вакцину расфасовывают и
проверяют на стерильность, авирулентность,
безвредность и иммуногенную активность.
Пример 3
Наработку вирусной массы типа Азия-1 проводят
с использованием штамма «А-2003-12», который
репродуцируют в суспензии перевиваемой линии
культур клеток ВНК-21/13 при температуре 37°С.
Через каждые 3 часа после начало культивирования
осуществляют забор проб вирусной суспензии,
клетки окрашивают метиленовой синью для
определения и подсчета живых клеток и клеток с
цитопатическим эффектом. При поражении более
90% клеток суспензии забор проб прекращают, а
процесс культивирования вируса продолжает в
течении 7-8 часов.
После окончания процесса культивирования в
ферментер добавляют хлороформ до конечной
концентрации 1,0%, эмульгирование биологической
массы проводят при постоянном перемешивании
вирусной суспензии, после окончании которого
суспензию подвергают сепарированию для удаления
балластных белков.
Инактивацию вируса проводят добавлением в
суспензию бинарного этиленимина в конечной
концентрации 0,03% при температуре 27°С в
течении 30 часов.
Содержание 146S компонента в прививной дозе
вакцины получают путем концентрирования
антигена проточной ультрафильтрацией или на геле
гидроокиси алюминия. Конечная концентрация
146S компонента вируса ящура должна быть не
менее 1,5 мкг/мл при изготовлении моновалентной
вакцины. В полученную вирусную суспензию
согласно инструкции по применению добавляют
один из марок монтанида ISA-70, ISA-50 или
ISA-206 производства фирмы «Seppic» (Франция).
Полученную вакцину расфасовывают и
проверяют на стерильность, авирулентность,
безвредность и иммуногенную активность.
Пример 4
Формирование поливалентной вакцины.
При изготовлении трехвалентной вакцины после
наработки биологической массы типов А, О и
Азия-1 и проведении всех технологических
операций аналогично примерам 1-3 их смешивают с
расчетом в конечном прививном дозе вакцины
должна быть:
- авирулентный и очищенный вирус типа А, не
менее 2,0 мкг 146S- компонента;
- авирулентный и очищенный вирус типа О, не
менее 4,0 мкг 146S- компонента;
- авирулентный и очищенный вирус типа Азия-1,
не менее 3,0 мкг 146S- компонента;
- тиомерсал (10% раствор) - 0,002 мл;
-тиосульфат натрия (50% раствор) - 0,55 мл в
литре антигена;
-монтанид ISA-70, ISA-50 или ISA-206 «Seppic»
(Франция) - в соотношениях от 3:7 до 1:1 в
зависимости от вида вакцинируемого животного;
- поддерживающая среда - до 2 мл.
Инактивированная трехвалентная вакцина
против ящура типов А, О и Азия-1 изготовленная
согласно предлагаемого способа прошла успешное
испытание по стерильности, авирулентности,
безвредности и иммуногенной активности, что
указывает на соответствие требованиям
Международного Эпизоотического бюро (МЭБ),
предъявляемым к профилактическим препаратам
против ящура.
Таким образом, заявляемый способ изготовления
вакцины против ящура позволяет увеличить
количество вирусного, основного иммуногенного
компонента 146S в прививном дозе препарата,
способ также обеспечивает безвредность,
авирулентность и высокую иммуногенную
активность вакцины.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Способ изготовления инактивированной
трехвалентной вакцины против ящура, включающий
репродукцию вируса ящура в организме
новорожденных крольчат, измельчение, очистку от
балластных белков, инактивирование
аминоэтиленимином, фильтрование вирусной
суспензии через стерилизующие фильтры и
добавление гидрата окиси алюминия,
отличающийся тем, что для получения
высокоактивного вирусного сырья в суспензионной
культуре клеток ВНК-21 при температуре 37±1°С,
используют штаммы Picornavirus aphtae AV-0265
типа А «АК-2000-12», Picornavirus aphtae типа
Азия-1 AV-0266 «А-2003-12», Picornavirus aphtae
типа О AV-0267 «Д-05-12», затем проводят очистку
вирусной суспензии от балластных примесей
сепарированием, после чего проводят инактивацию
при температуре 27°С, концентрирование
полученной вирусной суспензии ящура и соединяют
с масляным адъювантом ISA-70, и получают
целевой продукт.
Верстка Ж. Жомартбек
Корректор К. Нгметжанова