Metode kolorimetri untuk mengukur kadar hemoglobin darah meliputi metode hematin asam, hematin alkali, cyanmethemoglobin, oksihemoglobin, dan SLS-hemoglobin. Metode-metode tersebut berbeda dalam prinsip reaksi pembentukan derivat hemoglobin yang berwarna untuk diukur absorbsinya.
1. TUTOR HEMATOLOGI
PENGUKURAN KADAR
HEMOGLOBIN DARAH dengan
METODE KOLORIMETRI
Yuni Setyowatiningsih / Yetti Hernaningsih
9 Desember 2010
2. DAFTAR ISI
1 PENDAHULUAN
2 HEMOGLOBINOMETRI DARAH
PEMERIKSAAN KADAR HB DI LAB P.K.
3
RSUD DR.SOETOMO
4 FAKTOR FISIOLOGIS YANG MEMPENGARUHI HB
3
5 NILAI RUJUKAN
2
3. HEMOGLOBIN
Merupakan protein utama dalam eritrosit
BM 68000
Menyusun 95% berat kering eritrosit
Hb terdiri dari 2 pasang rantai globin (tetramer
dua pasang rantai polipeptida) dan empat
kelompok heme, masing-masing heme
mengandung 1 atom besi (Fe)
Berfungsi mengangkut O2 ,CO2 ,dan NO
3
7. PENGUKURAN KADAR HEMOGLOBIN
Secara ideal untuk menilai anemia, seharusnya
yang diukur adalah kapasitas ikatan Hb
dengan oksigen, namun hal ini tidak praktis
dilakukan.
Pada metode kolorimetri, kadar Hb diukur
melalui pengubahan Hb menjadi senyawa
tertentu yang berwarna.
7
8. PENGUKURAN KADAR HEMOGLOBIN
A. DIRECT MATCHING
B. HEMATIN ASAM
METODE C. HEMATIN ALKALI
KOLORIMETRI
D. CYANMETHEMOGLOBIN
E. OKSIHEMOGLOBIN
F. SLS-Hb
8
9. Spesimen Pemeriksaan
Darah yang dipakai adalah darah vena
Sampel dengan antikoagulan
Darah
Darah kapiler dapat digunakan secara
langsung tanpa antikoagulan
Pemasangan tourniquet yang terlalu
lama, menyebabkan hemokonsentrasi
dan Hb meningkat
9
10. A. Direct Matching
Metode Tallqvist
1. Setetes darah diletakkan pada kertas absorban
putih dan dibiarkan kering selama beberapa
detik.
2. Warna darah kemudian dipadankan dengan
lembar skala warna merah serial (10 – 100 %).
3. Caranya ialah dengan menempatkan tetes
darah dibawah lobang yang ada ditengah-
tengah lembar warna.
10
13. Lanjutan DIRECT MATCHING...
• Sederhana, tidak membutuhkan alat
yang banyak
• Mudah dilakukan
• Kesalahan besar (20-50%) karena
variasi fisiologis mata mengidentifikasi
warna (Khususnya karena persentase
skala tidak akurat)
13
14. 14
B. Metode Hematin Asam (SAHLI) :
Prinsip :
Hb diubah menjadi hematin asam yang berwarna
coklat jernih dengan penambahan asam hidroklorida
(HCl).
→ warna yang terbentuk dipadankan dengan gelas
warna standar untuk mengukur kadarnya
Alat :
Hemoglobinometer Sahli
15. 15
Hemoglobinometer Sahli
Hb-meter Sahli terdiri dari :
1. Gelas standar berwarna coklat
2. Tabung Sahli berskala
3. Pipet Sahli (volume 20 μL)
4. Gelas pengaduk
5. Pipet Pasteur
6. Larutan HCl 0.1N
7. Aquadest
16. 16
Metode Hematin-Asam (Sahli) :
Prosedur :
Tabung Sahli diisi lar.HCl 0.1N sampai tanda 2 g%
Darah dihisap ke dalam pipet Sahli sampai tepat
tanda 20 μL
Bersihkan sisa darah pd bagian luar pipet Sahli
Tiup 20 μL darah dari pipet ke dalam tabung Sahli
hati2 sambil dibilas beberapa kali dengan lar.HCl 0.1N
Campur rata darah dan HCl 0.1N , tunggu 10 menit
17. 17
Lanjutan Hematin Asam...
Masukkan aquadest setetes demi setetes sampai
warnanya sama dengan warna kaca standar Sahli
→ baca angka pada skala tepat setinggi meniskus
larutan hematin asam
19. Lanjutan Hematin Asam...
• Murah
• Sederhana
• Reaksi lambat
• Zat non Hb (protein dan lipid) dalam
plasma dan stroma eritrosit mempengaruhi
warna hematin asam
• Hematin asam bersifat tidak stabil
• Warna standar akan semakin memudar
19
20. C. Metode Hematin Alkali
Prinsip:
Hb diubah menjadi hematin alkali
oleh NaOH, lalu absorbannya dibaca
pada λ 540 nm dengan fotometer
20
21. Lanjutan Hematin Alkali...
A B
Metode Metode Alkali
Baku Asam
• 0,05 ml darah + 4 ml
• 0,05 ml darah + 4,95 ml HCl 0,1 N dicampur
NaOH 0,1 N, panaskan segera
4 menit tepat • Biarkan 20-30 menit,
• Segera dinginkan • Tambahkan 0,95 ml
sampel dengan air NaOH 1 N, balik-balik
dingin tabung beberapa kali
• Baca dengan fotometer • 2 menit kemudian baca
sampel pada λ 540 nm
21
24. Lanjutan Hematin Alkali...
Standar dari Metode Hematin Alkali
( Gibson and Harrison) :
Campuran Chromium Potassium Sulfat, Cobaltous
Sulphate, dan Potassium Dichromate dalam aqua
Larutan ini setara dengan pengenceran 1:100
darah dengan kadar Hb 16 g %
Standar ini harus dipanaskan, supaya garam yang
terkandung di dalamnya berubah menjadi bentuk
ion dan bisa mengabsorbsi cahaya warna hijau
24
25. Lanjutan Hematin Alkali...
NO KEUNTUNGAN KERUGIAN
1 Bebas CN HbF dan Hb Bart’s
resisten terhadap
denaturasi alkali
2 Larutan alkali kuat akan Lebih rumit dan kurang
menghasilkan campuran akurat
lipid dan protein yang
lebih homogen dari
metode hematin asam
3 Derivat Hb inaktif
(HbCO, Hi, dan SHb)
turut berubah menjadi
hematin
25
26. 26
D. Metode Cyanmethemoglobin :
Prinsip :
Hb + K3Fe(CN)6 → MetHb atau Hi
Hi + KCN → HiCN
Prosedur :
1. Masukkan 20 μl darah kedalam tabung berisi
5 ml lar.Drabkin ( dilusi 1:250 )
2. Campur dan biarkan 10 menit
3. Baca absorbans pd spektrofotometer
( λ = 540 nm ) dgn lar. Drabkin sbg blanko .
28. 28
Lanjutan Cyanmethemoglobin...
4. Baca absorbans lar.standar HiCN (yg telah
diketahui kadarnya ) pada λ = 540 nm .
Kalkulasi :
Abs sampel
C Hb (g/dl) = x C stdr HiCN
Abs standar
Atau dari beberapa kadar lar.Standar HiCN
(Standar HiCN pd berbagai pengenceran)
dibuat Kurva-Standar Hb ( kurva kalibrasi )
29. 29
Lanjutan Cyanmethemoglobin...
Metode cyanmethemoglobin adalah metode
yang dianjurkan oleh International Commitee
for Standardization in Hematology (ICSH)
sebab selain mudah dilakukan juga
mempunyai larutan standar yang stabil dan
hampir semua hemoglobin dapat terukur,
kecuali sulfhemoglobin.
30. 30
Lanjutan Cyanmethemoglobin...
Faktor-faktor yang mempengaruhi pengukuran Hb :
Adanya SHb tidak termasuk dalam total Hb
HbCO mengabsorbsi lebih banyak cahaya pada
540 nm dibanding HiCN. Waktu yang tidak cukup
untuk konversi lengkap HbCO ke HiCN akan
meningkatkan Hb (false high)
Kekeruhan akibat leukositosis, hiperlipidemia,
proteinemia atau ketika sel darah merah gagal lisis
akan memberikan hasil Hb yang meningkat palsu
31. Lanjutan Cyanmethemoglobin...
Sel darah putih dapat diangkat dengan men-sentrifus
pengenceran Hb sebelum pembacaan
Dengan hiperlipidemia, sampel disentrifus dan plasma
lipemik diganti dengan volum larutan garam yang sama.
Spesimen kemudian dicampur ulang sebelum
diencerkan untuk menentukan Hb
31
33. Lanjutan Cyanmethemoglobin...
NO KEUNTUNGAN KERUGIAN
1 Akurasi cukup baik Pengenceran yang tinggi (1:251)
mempengaruhi presisi
2 Hb, Hi, HbCO, dan HbO2 Hiperprotenemia, leukosit yang
terukur, kecuali SHb gagal lisis menyebabkan turbiditas
sehingga hasilnya tinggi palsu
3 Sampel dapat langsung Mengandung CN
dibandingkan dengan HiCN
standar
4 Pembacaan absorben tidak Reaksi relatif lama, terutama untuk
harus dilakukan segera setelah mengubah HbCO menjadi HiCN
pengenceran karena HiCN stabil
33
34. E. METODE OKSIHEMOGLOBIN
PRINSIP :
Hb diubah menjadi HbO2 oleh NH4OH
METODE:
• 4 ml NH4OH 0,007 N + 0,02 ml darah
• Tutup dan campur dengan baik untuk
menjamin oksigenasi Hb yang sempurna
• Baca dengan fotometer
• Larutan NH4OH 0,007 N digunakan sebagai
blanko
34
35. Lanjutan Oksihemoglobin...
Alat Hematologi:
1. Sysmex Semi automated Hematology Analyzer Tipe
PL-100, CC-108, MH-301 (Reagen RHEMOX-HB)
2. Sysmex Fully automated Hematology Analyzer Tipe
CC-710 (Reagen RHEMOX-HB)
35
36. Lanjutan Oksihemoglobin...
NO KEUNTUNGAN KERUGIAN
1 Reaksi cepat dan Larutan HbO2 cenderung
sederhana memudar (tidak stabil)
2 Bebas CN Pipet harus dibilas 3 kali
dengan aquadem atau
aquades bebas tembaga
karena oksihemoglobin
dirubah menjadi
methemoglobin hasil
rendah palsu
3 Akurat Hi tidak turut terukur karena
tidak dapat dirubah menjadi
HbO2
36
37. F. Sodium Lauril Sulfat (SLS)
Prinsip:
Sodium lauril sulfat (SLS) adalah surfaktan
anionik banyak dipakai pada produk kosmetik dan
pasta gigi, bersifat stabil, dan dapat menghasilkan
SLS-Hi tanpa agen pengoksidasi.
Sifatnya mirip dengan HiCN namun tidak toksik.
37
38. Tahap Reaksi Metode SLS-Hb:
1 2
3
Lisis sel darah Perubahan
merah. Absorbsi formasi di Akibat dari
SLS di membran molekul globin perubahan pada
sel darah merah molekul globin
dikarenakan 4 tersebut yang
adanya kombinasi memancing
ionik dan hidrofob Ikatan kelompok
hidrofil SLS konversi
dengan solubilisasi hemoglobin dari
membran fosfatid dengan Fe3+
untuk ferro (Fe2+)
dan pengubahan
struktur protein membentuk SLS- teroksidasi ke
Hb yang stabil keadaan ferri(Fe3+)
(derivat
hemikrom).
38
39. Lanjutan SLS-Hb...
NO KEUNTUNGAN KERUGIAN
1 Bebas CN (tidak SHb tidak terukur
beracun)
2 Reaksinya sangat SLS-Hi hanya stabil
cepat (10 detik), untuk beberapa jam
menguntungkan
untuk otomatisasi Bisa bertahan sampai
3 Cocok untuk 3 minggu pada 4oC
pemeriksaan manual,
fotometrik, dan
otomatisasi
39
45. PEMERIKSAAN Hb di Lab. P.K. RSU Dr.Soetomo
2. Cell Dyn Ruby/3200
Prinsip : Cyanide-free hemoglobin
Metode :
a. 1,7 mL Diluen + 12 µL darah
b. Ditambah 0,9 mL Pelisis
c. Darah, Pelisis, dan diluen diputar dalam Hb flow
cell. Pengenceran 1 : 218
d. Reagen pelisis Hb melisiskan eritrosit, merubah Hb
yang dibebaskan melalui proses kimia bebas
sianida
e. Absorben diukur pada λ 555 nm. Absorben
berbanding lurus dengan konsentrasi sampel
45
47. Faktor fisiologis yang mempengaruhi Hb
Umur,
jenis
kelamin
Altitude
Posisi
tubuh Faktor
Fisiologis
Variasi
diurnal
Kehamilan
47
48. Nilai Rujukan Hb (Dacie Lewis,2006)
Kategori Kadar Hb (g/l)* ± 2 SD
Bayi aterm 180 ± 40
Usia 3 hari 180 ± 30
Usia 7 hari 175 ± 4
Usia 14 hari 165 ± 4
Usia 1 bulan 140 ± 25
Usia 2 bulan 112 ± 18
Usia 3-6 bulan 126 ± 15
Usia 1 tahun 126 ± 15
Usia 2-6 tahun 125 ± 15
Usia 6-12 tahun 135 ± 20
Pria dewasa 150 ± 20
Wanita dewasa 135 ± 15 48
49.
50. Sampel dengan TG 294 Sampel dengan leukositosis
Disentrifus plasma (> 400.000/µL)
diganti dengan PZ dengan Setelah dicampur dgn
volume sama Lar.Drabkin disentrifus
endapan leukosit
50
.
51. INTERFERENS
SYSMEX XE 2100 CELL DYN 3200
Lipemia Elevated WBC count
Abnormal proteins in Increased plasma
blood plasma substances (trigliserides,
Severe leukocytosis(> bilirubin, in vitro
100.000/µL). hemolysis)
The effect of abnormal lytic-resistant RBCs
proteins and lipemia may be
removed by plasma
replacement or plasma
blank procedures.
51
52. Kurva Kalibrasi Pengukuran Kadar Hemoglobin
Untuk membuat kurva kalibrasi, kita memerlukan larutan
standar Hb.
Larutan standar Hb internasional menggunakan HiCN karena
sifatnya yang stabil.
Larutan standar ini dijual dalam bentuk ampul 10 ml,
mengandung 550-850 mg Hb per liter (kadar yang tepat
tertulis pada label).
Dalam praktiknya, larutan standar ini dianggap sebagai suatu
pengenceran dalam darah utuh.
Nilai Hb sesungguhnya yang diwakilinya diperoleh dengan
mengalikan kadar Hb pada label dengan faktor pengenceran
sampel darah.
Sebagai contoh, bila kadar Hb pada label 600 mg/l, berarti
larutan standar tersebut densitas optik sama seperti darah
yang mengandung Hb 150 g/l dengan pengenceran 1:250. 52
53. Larutan standar yang telah dibuka harus disimpan dalam gelap dan
sisanya harus dibuang pada hari yang sama untuk mencegah
kontaminasi. Pengukuran absorbans dari sampel harus dilakukan
dalam 6 jam setelah dilarutkan.
Prosedur
Hitung harga Hb larutan standar : Hb (g/l) = x 251
Siapkan 4 tabung untuk seri pengenceran larutan standar:
Tabung I : 5 ml larutan standar (tanpa pengenceran)
Kadar Hb = 100% Hb standar
Tabung II : 4 ml larutan standar + 1 ml larutan Drabkin
Kadar Hb = 80% Hb standar
Tabung III : 3 ml larutan standar + 2 ml larutan Drabkin
Kadar Hb = 60% Hb standar
Tabung IV : 2 ml larutan standar + 3 ml larutan Drabkin
Kadar Hb = 40% Hb standar 53
54. Campur dan biarkan selama 10 menit
Baca absorbans masing-masing tabung pada λ 540 nm
dengan menggunakan larutan Drabkin sebagai blangko
Tabulasikan kadar Hb masing-masing pengenceran
standar berikut nilai absorbansnya
Buatlah kurva kalibrasi kadar Hb, dengan kadar Hb pada
absis dan nilai absorbans pada ordinat. Untuk
memudahkan pembacaan, kita dapat membuat tabel
kadar Hb (20-180 g/l) dari kurva kalibrasi tersebut.
54
