Analisis Protein dan
Senyawa Bernitrogen
EVY ROSSI
JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN
FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS RIAU
S...
Analisis Protein dan Senyawa
Bernitrogen dapat dilakukan dengan
beberapa Methode
1.Secara kualitatif terdiri atas ;
a. rea...
Methode Kualitatif
1. Reaksi Xantoprotein

Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke
dalam larutan protein...
3. Reaksi Millon
Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat
dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditamba...
5.Reaksi Sakaguchi
Pereaksi yang digunakan ialah naftol dan
natriumhipobromit. Pada dasarnya reaksi ini
memberikan hasil p...
Methode Kjeldahl
• Metode Kjeldahl merupakan metode yang
sederhana untuk penetapan nitrogen total
pada asam amino, protein...
• Setelah pembebasan dengan alkali kuat, amonia yang
terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam
larutan penyerap d...
Prinsip
• Penetapan nilai protein kasar dilakukan
secara tidak langsung, karena analisis ini
didasarkan pada penentuan kad...
• Angka 6,25 berasal dari angka konversi
serum albumin yang biasanya mengandung
16% nitrogen.
• Untuk beras, kedelai, dan ...
Alat dan Bahan Sulfat pekat
Alat :
Asam
• Labu Kjeldahl 300 mL
• Satu set alat
destilasi
• Erlenmeyer 250 cc
• Buret 50 cc...
Prosedur Analisis
1. Destruksi
•

Timbang contoh sampel kering
oven sebanyak ± 1 gram ( catat

sebagai A gram).
• Masukan ...
2. Destilasi
• Siapkan alat destilasi

selengkapnya, pasang

• Basakan larutan bahan dari
destruksi dengan menambah

denga...
Titrasi
• Erlenmeyer berisi sulingan tadi
diambil (jangan lpa membilas
bagian yang terendam dalam air
sulingan)
• Kemudian...
• Akhir titrasi ditandai dengan tepat
perubahan warna larutan menjadi merah
muda dan tidak hilang selama 30 detik bila
men...
2. Metode Spektrofotometri Visible
(Biuret)
• Methode ini adalah salah satu cara terbaik untuk
menentukan kadar protein su...
Peralatan

• Spektofotometer

• Sentrifuse

•Waring Blender
Prosedure
Pembuatan reagen Biuret :
Larutkan 150 mg tembaga (II) sulfat (CuSO4. 5H2O) dan
kalium natrium tartrat (KNaC4H4O...
Pembuatan kurva Standar :
1. Masukkan ke dlm tabung reaksi 0 (blanko), 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8
dan 1 ml larutan protein st...
Cara mempersiapkan sampel

:

• Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal
albumin, endapkan dahulu dengan...
3. Methode Lowry
Prinsip
• Reaksi antara Cu 2+ dgn ikatan peptida dan reduksi asam
fosfo monolobdad dan asam fosfotungstat...
Prosedur :
Pembuatan reagen Lowry A :
Merupakan larutan asam fosfotungstat-asam
fosfomolibdat dengan perbandingan (1 : 1)
...
Prosedur
Pembuatan kurva Standar
Siapkan larutan bovin serum albumin dengan
konsentrasi 300 µg/ml (Li). Buat seri
konsentr...
Penyiapan Sampel
• Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang
terlarut misal albumin, endapkan dahulu dengan
penambahan a...
Upcoming SlideShare
Loading in …5
×

Analisis Protein dan Senyawa Bernitrogen

1,496 views

Published on

Mata Kuliah Analisis Hasil Pertanian dengan materi Analisis Protein dan Senyawa Bernitrogen

Published in: Education
0 Comments
1 Like
Statistics
Notes
  • Be the first to comment

No Downloads
Views
Total views
1,496
On SlideShare
0
From Embeds
0
Number of Embeds
23
Actions
Shares
0
Downloads
260
Comments
0
Likes
1
Embeds 0
No embeds

No notes for slide

Analisis Protein dan Senyawa Bernitrogen

  1. 1. Analisis Protein dan Senyawa Bernitrogen EVY ROSSI JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN FAKULTAS PERTANIAN UNIVERSITAS RIAU SEMESTER GANJIL 2010/2011
  2. 2. Analisis Protein dan Senyawa Bernitrogen dapat dilakukan dengan beberapa Methode 1.Secara kualitatif terdiri atas ; a. reaksi Xantoprotein b. reaksi Hopkins-Cole c. reaksi Millon d. reaksi Nitroprusida e. reaksi Sakaguchi 2.Secara kuantitatif terdiri dari ; • metode Kjeldahl • metode spektrofotometri visible (Biuret) • metode Lowry • metode titrasi formol • metode spektrofotometri UV.
  3. 3. Methode Kualitatif 1. Reaksi Xantoprotein Larutan asam nitrat pekat ditambahkan dengan hati-hati ke dalam larutan protein. Setelah dicampur terjadi endapan putih yang dapat berubah menjadi kuning apabila dipanaskan. Reaksi yang terjadi ialah nitrasi pada inti benzena yang terdapat pada molekul protein. Reaksi ini positif untuk protein yang mengandung tirosin, fenilalanin dan triptofan. 2. Reaksi Hopkins-Cole Larutan protein yang mengandung triptofan dapat direaksikan dengan pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air. Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole, asam sulfat dituangkan perlahan-lahan sehingga membentuk lapisan di bawah larutan protein. Beberapa saat kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas antara kedua lapisan tersebut.
  4. 4. 3. Reaksi Millon Pereaksi Millon adalah larutan merkuro dan merkuri nitrat dalam asam nitrat. Apabila pereaksi ini ditambahkan pada larutan protein, akan menghasilkan endapan putih yang dapat berubah menjadi merah oleh pemanasan. Pada dasarnya reaksi ini positif untuk fenol-fenol, karena terbentuknya senyawa merkuri dengan gugus hidroksifenil yang berwarna. 4. Reaksi Natriumnitroprusida Natriumnitroprusida dalam larutan amoniak akan menghasilkan warna merah dengan protein yang mempunyai gugus –SH bebas. Jadi protein yang mengandung sistein dapat memberikan hasil positif.
  5. 5. 5.Reaksi Sakaguchi Pereaksi yang digunakan ialah naftol dan natriumhipobromit. Pada dasarnya reaksi ini memberikan hasil positif apabila ada gugus guanidin. Jadi arginin atau protein yang mengandung arginin dapat menghasilkan warna merah. 6.Metode Biuret Larutan protein dibuat alkalis dengan NaOH kemudian ditambahkan larutan CuSO4 encer. Uji ini untuk menunjukkan adanya senyawasenyawa yang mengandung gugus amida asam yang berada bersama gugus amida yang lain. Uji ini memberikan reaksi positif yaitu ditandai dengan timbulnya warna merah violet atau biru violet.
  6. 6. Methode Kjeldahl • Metode Kjeldahl merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein dan senyawa yang mengandung nitrogen. • Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat.
  7. 7. • Setelah pembebasan dengan alkali kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi. • Metode ini telah banyak mengalami modifikasi. • Metode ini cocok digunakan secara semimikro, sebab hanya memerlukan jumlah sampel dan pereaksi yang sedikit dan waktu analisa yang pendek.
  8. 8. Prinsip • Penetapan nilai protein kasar dilakukan secara tidak langsung, karena analisis ini didasarkan pada penentuan kadar nitrogen yang terdapat dalam bahan. • Kandungan nitrogen yang diperoleh dikalikan dengan angka 6,25 sebagai angka konversi menjadi nilai protein. • Nilai 6,25 diperoleh dari asumsi bahwa protein mengandung 16% nitrogen (perbandingan protein : nitrogen =100 :16 = 6,25:1).
  9. 9. • Angka 6,25 berasal dari angka konversi serum albumin yang biasanya mengandung 16% nitrogen. • Untuk beras, kedelai, dan gandum angka konversi berturut-turut sebagai berikut: 5,95, 5,71, dan 5,83.
  10. 10. Alat dan Bahan Sulfat pekat Alat : Asam • Labu Kjeldahl 300 mL • Satu set alat destilasi • Erlenmeyer 250 cc • Buret 50 cc skala 0,1 mL • Timbangan analitik • Asam Chorida ( yang sudah diketahui normalitasnya) • Natrium Hydroxsida 40% • Katalis campuran (yang dibuat dari CuSO4.5H2O dan K2SO4 dengan perbandingan 1:5 • Asam borax 5% • Indikator Bahan ( zat kimia) : • campuran ( brom cresolgreen : Methyl merah = 4 : 5. sebanyak 0,9 gram campuran dilarutkan dalam alkohol 100 mL)
  11. 11. Prosedur Analisis 1. Destruksi • Timbang contoh sampel kering oven sebanyak ± 1 gram ( catat sebagai A gram). • Masukan ke dalam labu kjeldhal dengan hati-hati, dan tambahkan 6 gram katalis campuran. • Tambah 20 mL Asam Sulfat pekat. • Panaskan dalam nyala api kecil di lemari asam. Bila sudah tidak berbuih lagi destruksi diteruskan dengan nyala api yang besar. • Destruksi sudah di anggap selesai bila larutan sudah berwarna hijau jernih, setelah itu dinginkan
  12. 12. 2. Destilasi • Siapkan alat destilasi selengkapnya, pasang • Basakan larutan bahan dari destruksi dengan menambah dengan hati-hati jangan 40-60 mL NaOH 40% melalui lupa batu didih, vaselin corong samping. Tutup kran dan tali pengaman • Pindahkan larutan hasil corong segera setelah larutan didih, kemudian bilas tersebut masuk ke labu didih • Nyalakan pemanas bonsen dan dengan aquades sebanyak alirkan air ke dalam kran destruksi ke dalam labu lebih kurang 50 mL. • Pasangkan erlenmeyer yang telah diisi asam borax 5% sebanyak 5 mL untuk menangkap gas amonia, dan telah diberi indikator campuran sebanyak 2 tetes. pendingin tegak. • Lakukan destilasi sampai semua N dalam larutan dianggap telah tertangkap oleh asam borax yang ditandai dengan menyusutnya larutan dalam labu didih sebanyak 2/3 bagian (atau sekurang-kurangnya sudah tertampung dalam erlenmeyer sebanyak 15 mL
  13. 13. Titrasi • Erlenmeyer berisi sulingan tadi diambil (jangan lpa membilas bagian yang terendam dalam air sulingan) • Kemudian titrasi dengan HCl yang sudah diketahui normalitasnya catat sebagai B, titik titrasi dicapai dengan ditandai perubahan warna hijau ke abu-abu. Catat jumlah larutan HCl yang terpakai sebagai C mL
  14. 14. • Akhir titrasi ditandai dengan tepat perubahan warna larutan menjadi merah muda dan tidak hilang selama 30 detik bila menggunakan indikator PP. % N = ml HCl (sampel-blanko) x B Berat sampel (g) x 1000 B = Normalitas HCl x 14.008 x 100% % protein = % N x faktor protein (6,25)
  15. 15. 2. Metode Spektrofotometri Visible (Biuret) • Methode ini adalah salah satu cara terbaik untuk menentukan kadar protein suatu larutan. • Methode ini memerlukan 1-10 mg protein per ml • Dalam kondisi zat alkali (Cu 2+) yang membentuk kompleks dengan ikatan peptida yang menghasilkan warna ungu dengan absorban pada 540 nm. • Hanya sedikit senyawa-senyawa lain yg mengganggu reaksi misalnya: urea yang mengandung gugus CO dan NH dan gula pereduksi yang mengandung ion Cu 2+ • Pereaksi : Larutan Biuret dan larutan protein standar berupa larutan bovine serum albumin dlm air
  16. 16. Peralatan • Spektofotometer • Sentrifuse •Waring Blender
  17. 17. Prosedure Pembuatan reagen Biuret : Larutkan 150 mg tembaga (II) sulfat (CuSO4. 5H2O) dan kalium natrium tartrat (KNaC4H4O6. 4H2O) dalam 50 ml aquades dalam labu takar 100 ml. Kemudian tambahkan 30 ml natrium hidroksida 10% sambil dikocok-kocok, selanjutnya tambahkan aquades sampai garis tanda. Pembuatan larutan induk bovin serum albumin (BSA): Ditimbang 500 mg bovin serum albumin dilarutkan dalam aquades sampai 10,0 ml sehingga kadar larutan induk 5,0% (Li). Penetapan kadar (Metode Biuret) :
  18. 18. Pembuatan kurva Standar : 1. Masukkan ke dlm tabung reaksi 0 (blanko), 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 dan 1 ml larutan protein standar. Tambahkan air sampai volume totalnya masing-masing 4 ml. 2. Tambahkan 6 ml pereaksi Biuret ke dlm masing2 tabung reaksi dan homogenkan. 3. Simpan tabung reaksi pada suhu 37oC selama 10 min. atau pd suhu kamar selama 30 min. Kemudian ukur absorbannya pada 520 nm.
  19. 19. Cara mempersiapkan sampel : • Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal albumin, endapkan dahulu dengan penambahan amonium sulfat kristal (jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu Sampai mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam larutan). • Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm selama 10 menit, pisahkan supernatannya. • Presipitat yang merupakan proteinnya kemudian dilarutkan kembali dengan dapar asam asetat pH 5 misal sampai 10,0 ml. • Ambil sejumlah µL larutan tersebut secara kuantitatif kemudian tambahkan reagen Biuret dan jika perlu tambah dengan dapar asetat pH 5 untuk pengukuran kuantitatif. • Setelah 10 menit dari penambahan reagen Biuret, baca absorbansinya pada panjang gelombang 550 nm terhadap blanko yang berisi reagen Biuret dan dapar asetat pH 5. Perhatikan adanya faktor pengenceran dan absorban sampel sedapat mungkin harus masuk dalam kisaran absorban kurva standar.
  20. 20. 3. Methode Lowry Prinsip • Reaksi antara Cu 2+ dgn ikatan peptida dan reduksi asam fosfo monolobdad dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan triptofan yang akan menghasilkan warna biru. • Warna yang terbentuk tergantung pada kadar tirosin dan triptofan • Lebih sensitif (100x) dari methode Biuret.
  21. 21. Prosedur : Pembuatan reagen Lowry A : Merupakan larutan asam fosfotungstat-asam fosfomolibdat dengan perbandingan (1 : 1) Pembuatan reagen Lowry B : Campurkan 2% natrium karbonat dalam 100 ml natrium hidroksida 0,1N. Tambahkan ke dalam larutan tersebut 1 ml tembaga (II) sulfat 1% dan 1 ml kalium natrium tartrat 2%
  22. 22. Prosedur Pembuatan kurva Standar Siapkan larutan bovin serum albumin dengan konsentrasi 300 µg/ml (Li). Buat seri konsentrasi dalam tabung reaksi, misal dengan komposisi berikut : Tambahkan ke dalam masing-masing tabung 8 ml reagen Lowry B dan biarkan selama 10 menit, kemudian tambahkan 1 ml reagen Lowry A. Kocok dan biarkan selama 20 menit. Baca absorbansinya pada panjang gelombang 600 nm tehadap blanko. (Sebagai blanko adalah tabung reaksi no.1 pada tabel di atas)
  23. 23. Penyiapan Sampel • Ambil sejumlah tertentu sampel protein yang terlarut misal albumin, endapkan dahulu dengan penambahan amonium sulfat kristal (jumlahnya tergantung dari jenis proteinnya, kalau perlu sampai mendekati kejenuhan amonium sulfat dalam larutan). • Pisahkan protein yang mengendap dengan sentrifus 11.000 rpm selama 10 menit, pisahkan supernatannya. • Presipitat yang merupakan proteinnya kemudian dilarutkan kembali dengan dapar asam asetat pH 5 misal sampai 10,0 ml. • Ambil volume tertentu dan lakukan penetapan selanjutnya seperti pada kurva standar mulai dari penambahan 8 ml reagen Lowry A sampai seterusnya.

×