Materi kuliah tentang analisa antikosidan.

1. ANALISIS
ANTIOKSIDAN

2. METODE ANALISIS ANTIOKSIDAN
Metode Kualitatif
 Uji Warna
 Spektrofotometri IR
Metode Kuantitatif
 DPPH (Diphenyl pycril Hidrazil)
 Metode ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity)
 Iodimetri dan iodometri
Metode In vivo  dengan hewan coba

3. UJI WARNA
 Merupakan suatu metode kualitatif untuk menentukan
keberadaan suatu antioksidan dengan mereaksikan
suatu sampel dengan reaktan tertentu sehingga
menunjukkan sifat fisik berupa perubahan warna tertentu
sebagai indikator.

4. UJI WARNA PADA ASAM ASKORBAT (VITAMIN
C)
 Asam Askorbat + Perak nitrat (amoniakal )  Hitam
 Asam Askorbat + Pereaksi Benedict  Merah

5.  Asam Askorbat + Larutan Iodium (coklat – ungu ) 
Warna Hilang (bening)

6. SPEKTROSKOPI IR (INFRA RED)
 Merupakan metode analisis suatu gugus fungsi dari suatu
senyawa berdasarkan serapannya terhadap sinar infra merah
yang diberikan.
 Cara kerja alat ini adalah dengan mengukur serapan infra
merah pada suatu gugus fungsi, dimana tiap gugus fungsi
mempunyai daerah serapan yang berbeda-beda.

7. DATA DAERAH RESAPAN IR

8.  Dari data tersebut kita dapat mengdentifikasi gugus
fungsi yang terdapat dalam suatu senyawa yang diuji.

9. STRUKTUR ANTIOKSIDAN

10. METODE ORAC
 Digunakan untuk menganalisis kandungan suatu
senyawa antioksidan dari suatu benda, misalnya
makanan.
 Pada metode ORAC, digunakan fluorescent sebagai
bahan uji selain sampel yang digunakan.
 Metode ini menggunakan mesin azo-intitiator, suatu alat
yang berfungsi untuk membuat radikal bebas, peroxyl.

11.  Fluorescent ditembakkan dengan peroxyl, lalu dihitung
intensitasnya selama selang waktu tertentu.
 Lalu dibuatlah kurva intensitas vs waktu ( baik ataupun
tanpa antioksidan), sehingga kita dapat menghitung
luasan daerah diatara kedua kurva tersebut.
 Kadar antioksidan ditentukan dengan standar TE, trolox
equivalent, dengan trolox sebagai standarnya.

12.  Perhitungan nilai ORAC dilakuakn dengan rumus
berikut:
 ORAC value (µM) = 20k (SSample - SBlank) / (STrolox - SBlank)
 Dimana S merupakan daerah dibawah kurva dan k
adalah konstanta peluruhan fluoescent.

14. KELEBIHAN ORAC DAN KEKURANGANNYA
 ORAC merupakan metode yang sangat akurat, karena
metode menggunakan pengukuran fluorescent, ehinga
ketelitian dari metode ini pn semakin baik
 Efisien
 Kekurangannya metode ini hanya menunjukkan aktivitas
teradap radikal bebas tertentu, seperti peroxyl, serta
metode ini tidak dapat mnentukan sampel yang teah
rusak, entah apapun sebabnya.

16. IODIMETRI
 Merupakan metode titrasi langsung
 Metode kuantitatif karena berdasarkan jumlah I2
yang dihasilkan antara sampel dengan ion iodida
 Perbedaan dengan iodometri
 Iodometri titrasi tidak langsung
 Iod yang dibebaskan dalam reaksi kimia

17. CONT`D
 Dalam proses analitik, iodium digunakan sebagai pereaksi
oksidasi (iodimetri) dan ion iodida digunakan sebagai pereaksi
reduksi (iodometri).
 Ada beberapa zat merupakan pereaksi reduksi yang cukup kuat
untuk dititrasi secara langsung dengan iodium. Maka jumlah
penentuan iodimetrik adalah sedikit. Akan tetapi banyak
pereaksi oksidasi cukup kuat untuk bereaksi sempurna dengan
ion iodida, dan ada banyak penggunaan proses iodometrik.

18. APLIKASI IODIMETRI
 Penetapan kadar vitamin C cara Iodimetri
 Dasar: Kadar vitamin C yang ditetapkan secara iodimetri
menggunakan iod sebagai penitar. Vitamin C bersifat reduktor
kuat akan dioksidasikan oleh I2 dalam suasana asam dan I2
tereduksi menjadi ion iodide. Indikator yang digunakan adalah
kanji dengan titik akhir biru.

19.  Reaksi :

20.  Alat : Bahan :
a. Erlenmeyer Asah 250 ml a. Contoh Iberet Folic-500
b. Gelas Ukur 100 ml b. H2SO4 10 %
c. Buret Scelbach 50 ml c. Larutan I2 0.05 M
d. Pipet Tetes d. Indikator Kanji
e. Statip e. Air Suling
f. Neraca Analitik

21.  Cara Kerja :
1) Ditimbang contoh sejumlah Y gram kedalam
Erlenmeyer asah.
2) Dilarutkan dengan air dan ditambahkan 25 ml
H2SO4 10 %.
3) Dititrasi dengan I2 0,05 M dengan indikator kanji
hingga titik akhir berwarna biru.

22. Perhitungan :
Kadar Vit. C = Vp x Mp x BE Vit. C x 100
x Bobot rata –rata x 100%

23. PENENTUAN
AKTIVITAS
ANTIOKSIDAN
METODA DPPH

24. • DPPH (1,1-Difenil-Pikril-2-Hidrazil), merupakan
radikal bebas yang dapat bereaksi dengan senyawa
yang dapat mendonorkan atom hidrogen, dapat
berguna untuk pengujian aktivitas antioksidan
komponen tertentu dalam suatu ekstrak.
• Adanya elektron yang tidak berpasangan, DPPH
memberikan serapan kuat pada 517 nm. Ketika
elektronnya menjadi berpasangan oleh
keberadaan penangkap radikal bebas, maka
absorbansinya menurun secara stokiometri sesuai
jumlah elektron yang diambil.

25. Keberadaan senyawa antioksidan dapat
mengubah warna larutan DPPH dari ungu
menjadi kuning

26. • Metode DPPH merupakan metode yang mudah,
cepat, dan sensitif untuk pengujian aktivitas
antioksidan senyawa tertentu atau ekstrak
tanaman
Hasil uji pendahuluan aktivitas antioksidan (A = kontrol
negatif, B = kontrol positif [rutin], dan C = larutan uji
[fraksi air ekstrak etanolik daun selasih])

27. DPPH berperan sebagai radikal bebas yang
diredam oleh antioksidan dari bahan uji, dimana
DPPH akan bereaksi dengan antioksidan tersebut
membentuk 1,1-difenil-2-pikrilhidrazyl. Reaksi ini
menyebabkan perubahan warna dari ungu pekat
menjadi kuning atau kuning gelap yang dapat
diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada
gelombang 517 nm, sehingga aktivitas peredaman
radikal bebas oleh sampel dapat ditentukan.
Pengujian DPPH dapat untuk mengetahui
parameter konsentrasi yang ekuivalen
memberikan 50% efek aktivitas antioksidan (IC50).

28. •• IC50 adalah konsentrasi suatu zat antioksidan
yang dibutuhkan untuk menghambat 50% radikal
bebas DPPH. Zat antioksidan yang mempunyai
aktivitas antioksidan tinggi akan mempunyai nilai
IC50 yang rendah
• Aktivitas antioksidan dinyatakan dalam persen
penghambatan, yang dihitung dengan rumus:
Persen penghambatan = Aktifitas antioksidan :
A blanko – A sampel x 100%
A blanko
A blanko = serapan radikal DPPH 1mM
A sampel = serapan radikal DPPH 1mM

29. Selanjutnya dibuat grafik antara konsentrasi
sampel (x) dengan persen penghambatan (y).
Nilai IC50 dihitung berdasarkan rumus persamaan
regresi.
Secara spesifik, suatu senyawa dikatakan
sebagai antioksidan jika nilai IC50 kurang dari 200
ppm
 Jika nilai IC50 yang diperoleh berkisar antara
200-1000 ppm, maka zat tersebut kurang aktif
namun masih berpotensi sebagai zat antioksidan
(Molyneux, 2004).

30. Grafik antara konsentrasi sampel (x) dengan aktivitas
antioksidan (y).

31. ORAC
(OXYGEN RADICAL
ABSORBANCE CAPACITY )
KAPASITAS OKSIGEN RADIKAL ABSORBANSI

32. APAKAH ORAC ITU?
 Sebuah metode skoring yang dikembangkan dan
digunakan oleh USDA (Departemen Pertanian
Amerika) di Tufts University
 untuk mengukur kekuatan antioksidan total
makanan dan minuman. Dengan kata lain, ORAC
data menyediakan ukuran kemampuan antioksidan
untuk mengikat radikal bebas.
 Uji ORAC mengukur aktivitas antioksidan
sebenarnya dari produk makanan, bahan makanan,
produk pertanian, dan produk farmasi.
 Tubuh manusia membutuhkan rata-rata ORAC
1500 Antioksidan setiap hari untuk bisa bekerja
melawan oksidasi yang terjadi dalam sel.

33.  Bahaya dari radikal bebas memberikan kontribusi besar
terhadap proses penuaan dan penyakit dan masalah
kesehatan lainnya.
 Studi menunjukkan bahwa makanan dengan nilai ORAC
yang lebih tinggi dapat membantu dalam melindungi
tubuh kita dari penuaan dini dan penyakit.
 Bukti menunjukkan bahwa asupan antioksidan harian
ditingkatkan menjadi antara 3.000 sampai 5.000 unit
ORAC atau lebih untuk memiliki dampak yang
menguntungkan signifikan pada darah dan jaringan lain.
 Pola makan kaya antioksidan membantu menetralkan
radikal bebas dalam tubuh, menjaga sistem kekebalan
tubuh yang kuat sementara memerangi segala sesuatu
dari keriput pada penyakit jantung dan kanker.

34. METODE ORAC
 Pada metode ORAC, digunakan fluorescent sebagai
bahan uji selain sampel yang digunakan.
 Metode ini menggunakan mesin azo-intitiator, suatu alat
yang berfungsi untuk membuat radikal bebas, peroxyl.
BMG LABTECH’s FLUOstar OPTIMA

35.  Fluorescent ditembakkan dengan peroxyl, lalu dihitung
intensitasnya selama selang waktu tertentu.
 Lalu dibuatlah kurva intensitas vs waktu ( baik ataupun
tanpa antioksidan), sehingga kita dapat menghitung
luasan daerah diatara kedua kurva tersebut.
 Kadar antioksidan ditentukan dengan standar TE, trolox
equivalent, dengan trolox sebagai standarnya.

36.  Perhitungan nilai ORAC dilakukan dengan rumus berikut:
 ORAC value (µM) = 20k (SSample - SBlank) / (STrolox - SBlank)
 Dimana S merupakan daerah dibawah kurva dan k adalah
konstanta peluruhan fluoescent.

37. KELEBIHAN ORAC DAN KEKURANGANNYA
 ORAC merupakan metode yang sangat akurat, karena
metode menggunakan pengukuran fluorescent, ehinga
ketelitian dari metode ini pn semakin baik
 Efisien
 Kekurangannya metode ini hanya menunjukkan aktivitas
teradap radikal bebas tertentu, seperti peroxyl, serta
metode ini tidak dapat mnentukan sampel yang teah
rusak, entah apapun sebabnya.

38. TENTANG NILAI KANDUNGAN ANTIOKSIDAN OLEH
ORAC
 Kekuatan antioksidan pada makanan
selalu disamakan dengan nilai ORAC,
sebuah analisis uji coba yang
mengukur Oxygen Radical
Absorbance Capacity (ORAC).
 Bagaimanapun juga yang penting
untuk dipahami adalah kandungan
antioksidan dalam sebuah makanan
tidak sepenuhnya terhitung oleh
ORAC, dan ini tidak mencerminkan
kemampuannya mengubah status
antioksidan dalam manusia.

39.  Ketika tes ORAC menghitung aktivitas perubahan radikal
bebas melawan salah satu jenis radikal bebas – radikal
peroxyl – terdapat beberapa jenis radikal bebas dan
sejumlah pengujian kadar logam yang mengukur
aktivitas melawan radikal bebas.

43. Dengan sendirinya, nilai
ORAC hanya sebagian
gambaran dari
kandungan anti-
oksidan dan bukan
indikasi dari jaminan
kesehatan.
 Apalagi, yang terpenting dari antioksidan yaitu antioksidan adalah
bioavailable, atau dapat diambil dan digunakan tubuh. Fitonutrien
memiliki beberapa tingkatan bioavailability setelah dikonsumsi
dan kemungkinan pengaruh biologis yang berbeda saat diserap
tubuh.

44.  Bahaya dari radikal bebas memberikan kontribusi
besar terhadap proses penuaan dan penyakit dan
masalah kesehatan lainnya.
 Studi menunjukkan bahwa makanan dengan nilai
ORAC yang lebih tinggi dapat membantu dalam
melindungi tubuh kita dari penuaan dini dan
penyakit.
 Bukti menunjukkan bahwa asupan antioksidan
harian ditingkatkan menjadi antara 3.000 sampai
5.000 unit ORAC atau lebih untuk memiliki dampak
yang menguntungkan signifikan pada darah dan
jaringan lain.

47. METODA IN VIVO
 Tikus Wistar dibagi 4 kelompok :
 K0 = Kelompok kontrol Negatif = Normal
 K 1 = Kelompok Kontrol Positif
 KP1 = Kelompok Perlakuan Dosis 1
 KP2 = Kelompok Perlakuan Dosis 2
 Selama 14 hari setiap kelompok kecuali kontrol negatif
tikus diberi minyak jelantah 0,42 ml/200 gram BB,
kandung peroksida = 118 mek / kg.
 Minyak jelantah diberikan peroral sekali sehari pada
siang hari menggunakan sonde l pada siang hari
 Sampel (ekstrak) diberikan juga setiap hari pada
KP1,KP2 dan K obat pada pagi hari

48.  Akan terjadi ROS pada hati tkus akibat pemberian
minyak jelantah yg tinggi peroksida/radikal bebas
 Sampel berupa ekstrak herbal (antioksidan)
sebagai perlakuan  bgmn pengaruhnya ?? Dg
melihat kadar MDA, SOD serum darah tikus
setelah perlakuan selama 14 hari atau 28 hari
 Pengujian Pre n Post Test dengan mengambil
darah pada sinus orbital (mata) atau ekor tikus
 Utuk mengukur stress oksidatif tubuh dapat
ditentukan dengan malondialdehid (MDA). Semakin
tinggi kadar MDA plasma maka semakin tinggi
stress oksidatif yang terjadi dalam sel-sel tubuh