2. THÔNG TIN VỀ TÁC GIẢ
PHẠM VI VÀ ĐỐI TƯỢNG SỬ DỤNG
CỦA GIÁO TRÌNH
1. THÔNG TIN VỀ TÁC GIẢ
Họ và tên: Đặng Thị Hoàng Oanh
Sinh năm:1969
Cơ quan công tác:
Bộ môn: Sinh học và Bệnh Thuỷ sản Khoa: Thuỷ sản
Trường: Đại học cần Thơ
Địa chỉ Email để liên hệ: dthoanh@ctu.edu.vn
2. PHẠM VI VÀ ĐỐI TƯỢNG SỬ DỤNG
Giáo trình có thể dùng tham khảo cho những ngành: Nuôi trồng thuỷ sản và bệnh học thuỷ sản
Có thể dùng cho các trường nào: các trường Cao đẳng và đại học
Các từ khóa: vi khuẩn, vi-rút, vi nấm, nguyên sinh động vật, PCR, kỹ thuật miễn dịch, bệnh
cá, bệnh tôm, chẩn đoán, thủy sản
Yêu cầu kiến thức trước khi học môn này: sinh học cơ bản, sinh hoá, sinh học phân tử
đại cương
Đã xuất bản in chưa, nếu có thì Nhà xuất bản nào: Giáo trình lưu hành nội bộ Đại Học Cần
Thơ. Chưa xuất bản chính thức ở nhà xuất bản
2
3. MỤC LỤC
THÔNG TIN VỀ TÁC GIẢ.....................................................................................................2
MỤC LỤC................................................................................................................................3
LỜI CẢM TẠ...........................................................................................................................8
GIỚI THIỆU ...........................................................................................................................9
CHƯƠNG I: NHỮNG KIẾN THỨC TỔNG QUÁT ...........................................................10
I.1. SỨC KHỎE VÀ ĐỘNG VẬT THỦY SẢN.............................................................10
I.2. NHỮNG VẤN ĐỀ CHUNG TRONG CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỦY SẢN........10
I.2.1. Sự đồng nhất trong thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu .....................................10
I.2.2. So sánh kết quả giữa các phòng thí nghiệm..........................................................10
I.2.2.1. Các dạng kết quả và ý nghĩa của chúng.........................................................10
I.2.2.2. Phương thức so sánh, ví dụ:...........................................................................11
I.2.3. Những vấn đề cần lưu ý........................................................................................11
I.2.3.1. Giá trị giới hạn cho những phép phân tích ....................................................11
I.2.3.2. Tính hiệu lực của phương pháp chẩn đoán....................................................11
I.2.3.3. Tính ổn định của phương pháp ......................................................................11
I.2.3.4. Đối chứng.......................................................................................................11
I.2.4. Phát hiện và chẩn đoán bệnh.................................................................................12
I.2.4.1. Chẩn đoán lâm sàng.......................................................................................12
I.2.4.2. Những biện pháp sàng lọc (screening) ..........................................................12
I.2.4.3. Phát hiện bệnh (detection) .............................................................................12
I.2.4.4. Chẩn đoán bệnh (diagnostic) .........................................................................12
I.2.4.5. Các con đường lây truyền bệnh (disease transmission).................................12
I.2.5. Vai trò của chẩn đoán trong quản lý dịch bệnh thủy sản......................................13
I.2.6. Các mức độ trong chẩn đoán bệnh thủy sản .........................................................13
I.2.6.1. Mức I:.............................................................................................................13
I.2.6.2. Mức 2:............................................................................................................14
I.2.6.3. Mức 3:............................................................................................................14
I.2.7. Phân nhóm kỹ thuật phát hiện/chẩn đoán bệnh ở thủy sản...................................14
I.2.8. Các kỹ thuật quan sát............................................................................................17
I.2.8.1. Những kỹ thuật quan sát ................................................................................17
I.2.8.2. Những kỹ thuật mô học đặc biệt....................................................................17
I.2.8.3. Kỹ thuật hiển vi điện tử .................................................................................17
I.2.8.4. Các kỹ thuật nuôi vi sinh vật .........................................................................17
I.2.9. Các kỹ thuật huyết thanh.......................................................................................17
I.2.10. Các kỹ thuật phân tử ...........................................................................................17
I.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG 1 ..................................................................18
CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT .............................................................19
II.1. QUAN SÁT DẤU HIỆU BỆNH, MẪU GIẢI PHẪU TƯƠI VÀ MÔ BỆNH
HỌC...................................................................................................................................19
II.1.1.Phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh ...................................................................19
II.1.1.1.Những vấn đề cần lưu ý khi quan sát bệnh lý thủy sản.................................19
3
4. II.1.1.2. Quan sát bệnh lý ở tôm.................................................................................20
II.1.1.3.Phương pháp quan sát bệnh lý ở cá...............................................................22
II.1.2. Phương pháp quan sát mẫu giải phẫu tươi ..........................................................25
II.1.3. Phương pháp mô học...........................................................................................26
II.1.3.1. Mục tiêu........................................................................................................27
II.1.3.2. Những điều cần lưu ý khi sử dụng phương pháp mô bệnh học:...................27
II.1.3.3. Phương pháp mô học bao gồm các bước:.....................................................27
II.2. KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH.....................................................................28
II.2.1. Nguyên tắc...........................................................................................................28
II.2.2. Ứng dụng .............................................................................................................28
II.2.3. Mẫu phân tích......................................................................................................29
II.2.4. Thao tác ...............................................................................................................29
II.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp...................................................................29
II.2.5.1. Ưu điểm:.......................................................................................................29
II.2.5.2. Nhược điểm: .................................................................................................30
II.3. KỸ THUẬT NUÔI VI SINH VẬT .........................................................................30
II.2.1. Nuôi vi khuẩn ......................................................................................................30
II.2.1.1. Ứng dụng......................................................................................................30
II.2.1.2. Phương pháp.................................................................................................30
II.2.1.3. Mẫu phân tích...............................................................................................31
II.2.1.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp............................................................31
II.2.2. Nuôi nguyên sinh động vật..................................................................................31
II.2.2.1. Ứng dụng......................................................................................................31
II.2.2.2. Phương pháp.................................................................................................31
II.2.2.3. Mẫu phân tích...............................................................................................31
II.2.2.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp............................................................31
II.2.3. Nuôi vi-rút ...........................................................................................................31
II.2.3.1. Ứng dụng......................................................................................................31
II.2.3.2. Phương pháp.................................................................................................32
II.2.3.3. Mẫu phân tích...............................................................................................32
II.2.3.4. Đọc kết quả...................................................................................................32
II.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG II................................................................33
CHƯƠNG III: CÁC KỸ THUẬT HUYẾT THANH............................................................34
III.1. PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA MIỄN DỊCH ..........................................................34
III.1.1. Nguyên lý ...........................................................................................................34
III.1.2. Ứng dụng............................................................................................................35
III.1.3. Mẫu phân tích.....................................................................................................35
III.1.4. Các dạng khuếch tán miễn dịch .........................................................................35
III.1.4.1. Kết tủa trong môi trường lỏng.....................................................................35
III.1.4.2. Tủa trong môi trường gel ............................................................................37
III.1.4.3. Miễn dịch khuếch tán điện ..........................................................................38
III.1.4.4. Miễn dịch khuếch tán: Điện di với miễn dịch khuếch tán in situ ...............38
III.1.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp .................................................................39
III.1.5.1. Ư u đi ểm:....................................................................................................39
III.1.5.2. Nhược điểm:................................................................................................39
4
5. III.2. PHƯƠNG PHÁP NGƯNG KẾT MIỄN DỊCH ...................................................39
III.2.1. Nguyên lý ...........................................................................................................39
III.2.2. Xếp loại các phản ứng ngưng kết.......................................................................40
III.2.2.1. Ngưng kết trực tiếp: ....................................................................................40
III.2.2.2. Ngưng kết gián tiếp:....................................................................................40
III.2.2.3. Ngưng kết nhân tạo:....................................................................................40
III.2.3. Ứng dụng............................................................................................................41
III.2.4. Mẫu phân tích.....................................................................................................41
III.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp .................................................................41
III.2.5.1. Ư u đi ểm:....................................................................................................41
III.2.5.2. Nhược điểm:................................................................................................41
III.3. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH HUỲNH QUANG......................................................41
III.3.1. Nguyên lý ...........................................................................................................41
III.3.2. Phương pháp.......................................................................................................42
III.3.2.1. Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang trực tiếp..................................................42
III.3.2.2. Kỹ thuật miễn dịch huỳng quang gián tiếp .................................................42
III.3.3. Ứng dụng............................................................................................................43
III.3.4. Mẫu phân tích.....................................................................................................43
III.3.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp .................................................................43
III.3.5.1. Ưu điểm:......................................................................................................43
III.3.5.2. Nhược điểm:................................................................................................43
III.4. KỸ THUẬT MIỄN DỊCH LIÊN KẾT ENZYM .................................................44
III.4.1. Nguyên lý ...........................................................................................................44
III.4.2. Ứng dụng............................................................................................................45
III.4.3. Mẫu phân tích.....................................................................................................45
III.4.4. Phương pháp.......................................................................................................45
III.4.4.1. Kỹ thuật ELISA gián tiếp............................................................................45
III.4.4.2. Kỹ thuật ELISA trực tiếp ............................................................................46
III.4.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp .................................................................47
III.4.5.1. Ưu điểm:......................................................................................................47
III.4.5.2. Nhược điểm:................................................................................................47
III.5. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG III.............................................................47
CHƯƠNG 4: CÁC KỸ THUẬT PHÂN TỬ..........................................................................48
IV.1. KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI TRÙNG HỢP...............................................48
IV.1.1. Nguyên tắc .........................................................................................................48
IV.1.1.1. Giai đoạn biến tính (denaturation):.............................................................48
IV.1.1.2. Giai đoạn lai (hybridization):......................................................................48
IV.1.1.3. Giai đoạn tổng hợp (hay kéo dài) (extension): ...........................................48
IV.1.2. Ứng dụng............................................................................................................49
IV.1.3. Phương pháp ......................................................................................................50
IV.1.3.1. Ly trích DNA hay RNA từ vật chủ để sử dụng làm mạch khuôn...............50
IV.1.3.2. Chuẩn bị......................................................................................................50
IV.1.3.3. Đối chứng....................................................................................................51
IV.1.4. Các hạn chế của phương pháp PCR...................................................................52
IV.1.5. Các dạng PCR....................................................................................................52
5
6. IV.1.5.1. PCR truyền thống........................................................................................52
IV.1.5.2. PCR phiên mã ngược ..................................................................................53
IV.1.5.3. PCR thời gian thật.......................................................................................54
IV.2. KỸ THUẬT PHÂN TÍCH TÍNH ĐA DẠNG VỀ CHIỀU DÀI ĐOẠN GIỚI
HẠN...................................................................................................................................54
IV.2.1. Nguyên lý...........................................................................................................54
IV.2.2. Phương pháp ......................................................................................................54
IV.2.3. Hệ thống phi phóng xạ DIG...............................................................................55
IV.2.4. Ứng dụng của kỹ thuật lai Southern ..................................................................56
IV.2.5. Mẫu phân tích.....................................................................................................57
IV.2.6. Ưu và nhược điểm..............................................................................................57
IV.2.6.1. Ưu điểm: .....................................................................................................57
IV.2.6.2. Nhược điểm:................................................................................................57
IV.3. KỸ THUẬT LAI IN SITU ....................................................................................57
IV.3.1. Nguyên lý...........................................................................................................57
IV.3.2. Ứng dụng............................................................................................................57
IV.3.3. Mẫu phân tích.....................................................................................................57
IV.3.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp.................................................................58
IV.3.4.1. Ưu điểm: .....................................................................................................58
IV.3.4.2. Nhược điểm:................................................................................................58
IV.4. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG IV.............................................................58
CHƯƠNG V: MỘT SỐ QUI TRÌNH PHÁT HIỆN BỆNH Ở THỦY SẢN .......................59
V.1. PHÁT HIỆN VI-RÚT ĐỐM TRẮNG Ở TÔM BẰNG KỸ THUẬT PCR .........59
V.1.1. Ðối tượng và phạm vi áp dụng............................................................................59
V.1.2. Tài liệu tham khảo xây dựng tiêu chuẩn ngành ..................................................59
V.1.3. Giải thích thuật ngữ.............................................................................................59
V.1.4. Thiết bị, dụng cụ, mồi và hóa chất ......................................................................60
V.1.4.1. Thiết bị, dụng cụ...........................................................................................60
V.1.4.2. Mồi, hóa chất................................................................................................61
V.1.5. Chuẩn bị mẫu.......................................................................................................62
V.1.5.1. Số lượng mẫu ...............................................................................................62
V.1.5.2. Yêu cầu đối với mẫu để phân tích................................................................63
V.1.6. Phương pháp tiến hành........................................................................................63
V.1.6.1. Xử lý mẫu....................................................................................................63
V.1.6.2. Phản ứng khuếch đại PCR............................................................................63
V.1.6.3. Tiến hành điện di..........................................................................................64
V.1.7. Ðọc kết quả..........................................................................................................64
V.1.8. Quy định về đảm bảo an toàn..............................................................................65
V.2. PHÁT HIỆN YHV VÀ GAV BẰNG KIT IQ2000 YHV/GAV ............................65
V.2.1. Giới thiệu.............................................................................................................65
V.2.2. Thành phần..........................................................................................................65
V.2.3. Thiết bị và hóa chất .............................................................................................66
V.2.4. Giới hạn phát hiện và tính nhạy ..........................................................................67
V.2.5. Chuẩn bị mẫu và ly trích RNA............................................................................67
6
7. V.2.5.1 Thao tác ly trích RNA ...................................................................................67
V.2.5.2. Hoà tan RNA................................................................................................68
V.2.6. Qui trình khuếch đại............................................................................................68
V.2.6.1. Chuẩn bị hoá chất phản ứng.........................................................................68
V.2.6.2. Điều kiện phản ứng ......................................................................................68
V.2.6.3. Phương thức chuẩn bị phản ứng...................................................................69
V.2.7. Điện di .................................................................................................................70
V.2.7.1. Chuẩn bị bản thạch (gel) ..............................................................................70
V.2.7.2. Điện di..........................................................................................................70
V.2.7.3. Thuốc nhuộm gel và đọc kết quả .................................................................71
V.2.8. Đọc kết quả..........................................................................................................71
V.2.9. Khắc phục sự cố kỹ thuật ....................................................................................73
V.3. PHÁT HIỆN VI KHUẨN Ở CÁ BẰNG PHƯƠNG PHÁP RFLP ......................74
V.3.1 Phương pháp thu mẫu bệnh phẩm và phân lập vi khuẩn......................................74
V.3.2 Phương pháp RFLP ..............................................................................................74
V.3.2.1. Ly trích DNA................................................................................................74
V.3.2.2. Cắt DNA bằng enzym giới hạn....................................................................74
V.3.2.3. Quá trình khử puria, biến tính và thấm chuyển............................................75
V.3.2.4. Quá trình tiền lai và lai DNA trên màng......................................................75
V.3.2.5. Phát hiện các vạch DNA ..............................................................................75
V.3.3. Xử lý thống kê.....................................................................................................75
V.3.4. Đọc kết quả..........................................................................................................76
PHỤ LỤC 1: CÁC BƯỚC THU MẪU CHẨN ĐOÁN BỆNH............................................77
1. Phụ lục 1a. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ở cá................................................77
2. Phụ lục 1b. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ở tôm.............................................79
3. Phụ lục 1c. Các bước thu mẫu chẩn đoán bệnh ở nhuyễn thể.................................80
PHỤ LỤC 2: CÁC DẤU HIỆU BỆNH THƯỜNG GẶP Ở TÔM.......................................83
PHỤ LỤC 3: CÁC DẤU HIỆU BỆNH THƯỜNG GẶP Ở CÁ ..........................................87
PHỤ LỤC 4: PHƯƠNG PHÁP NHUỘM HEMATOXYLIN VÀ PHLOXINE/EOSIN....90
1. Công thức pha thuốc nhuộm Hematoxylin và Phloxine/Eosin (H&E) ...................90
2. Qui trình nhuộm Mayer-Bennett Hematoxylin và Phloxine/Eosin (H&E) ............90
PHỤ LỤC 5: CÔNG THỨC DUNG DỊCH DAVIDSON,S AFA CỦA HUMASON,1972)
................................................................................................................................................92
PHỤ LỤC 6: PHƯƠNG PHÁP NHUỘM NHANH PHÁT HIỆN MBV, YHV VÀ WSSV
................................................................................................................................................93
A. Phát hiện MBV bằng phương pháp nhuộm Malachite Green................................93
B. Phát hiện YHV bằng phương pháp nhuộm Wright - Giemsa.................................94
C. Phát hiện WSSV bằng phương pháp nhuộm Haematoxyline và Eosin .................95
7
8. LỜI CẢM TẠ
Tác giả chân thành cảm tạ Tiến sỹ Ngô Thị Thu Thảo và Thạc sỹ Trần Thị Tuyết
Hoa đã góp ý về mặt hình thức và nội dung cho giáo trình.
Xin cảm ơn sự giúp đở của Cô Phạm Trần Nguyên Thảo và hai em sinh viên Phạm
Thị Ngọc Yến và Hoàng Tuấn lớp bệnh học thủy sản khoá 29 trong quá trình chỉnh
sửa và chuẩn bị bản in giáo trình.
8
9. GIỚI THIỆU
Quá trình xét nghiệm bệnh phẩm thủy sản thường có nhiều khả năng người phân tích thu
được kết quả chẩn đoán là các tác nhân gây bệnh cơ hội hơn là tác nhân gây bệnh chủ yếu.
Kết quả chẩn đoán bệnh phụ thuộc rất lớn vào tính sẵn có của phương pháp chẩn đoán đang
được áp dụng ở phòng thí nghiệm, lãnh vực nghiên cứu của người thực hiện việc chẩn đoán
hoặc những phép chẩn đoán được phát triển trên cơ sở các loài địa phương. Nắm vững
nguyên tắc của các kỹ thuật đoán và cách đọc kết quả một cách chuẩn xác có ý nghĩa rất
quan trọng.
Môn học nguyên lý và kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản là môn học kỹ thuật chuyên ngành
bệnh học thủy sản cung cấp cho sinh viên những hiểu biết về nguyên lý và phương pháp
thực hiện các kỹ thuật chẩn đoán bệnh ở thủy sản. Đồng thời môn học cũng giới thiệu các
lãnh vực ứng dụng của các phương pháp trong chẩn đoán bệnh thủy sản. Một phương pháp
có thể được ứng dụng để phát hiện/chẩn đoán nhiều mầm bệnh.
Phần thực hành của môn học cung cấp những kiến thức và kỹ năng hỗ trợ cho phần lý thuyết và
cũng là cơ sở để sinh viên tiếp cận các phương pháp cơ bản trong chẩn đoán bệnh thủy sản.
Phần tài liệu tham khảo được sử dụng để xây dựng giáo trình được trình bày sau mỗi
chương. Sinh viên có thể tìm thấy các tài liệu này từ trung tâm học liệu Đại học Cần thơ, thư
viện Khoa Thủy sản hay tài liệu cá nhân của giảng viên.
9
10. CHƯƠNG I: NHỮNG KIẾN THỨC TỔNG QUÁT
I.1. SỨC KHỎE VÀ ĐỘNG VẬT THỦY SẢN
Khác với các vật nuôi ở trên cạn, động vật thủy sản thường đòi hỏi sự theo dõi nhiều hơn về
môi trường và sức khỏe của chúng. Do sống ở dưới nước nên hoạt động của động vật thủy
sản thường rất khó quan sát trừ khi chúng được bắt ra khỏi mặt nước hoặc khi bị bệnh.
Động vật thủy sản lại sống trong môi trường sinh thái phức tạp và thường xuyên biến động.
Thêm vào đó, thức ăn thừa, thủy sản chết và nhiều thứ khác luôn ẩn ở dưới đáy ao. Các đối
tượng nuôi thủy sản rất đa dạng về loài, về môi trường sống, mức độ thâm canh của kỹ thuật
nuôi và hệ thống nuôi được áp dụng. Các dạng bệnh ở động vật thủy sản cũng đa dạng và có
nhiều biến đổi, trong đó có một số bệnh chưa xác định được vật chủ và có nhiều bệnh không
có dấu hiệu lâm sàng riêng biệt.
Bệnh trong nuôi thủy sản thường không do một nguyên nhân riêng lẻ mà là kết quả của một
loại các sự kiện/nguyên nhân có liên quan với nhau trong đó có cả sự tương tác giữa vật chủ
(bao gồm các điều kiện về sinh lý, sinh sản và giai đoạn phát triển), môi trường và sự hiện
diện của mầm bệnh. Sự hiện diện của một mầm bệnh trong mô tôm/cá không có nghĩa mầm
bệnh đó là nguyên nhân chính gây ra bệnh. Phần lớn nguyên nhân đầu tiên gây bệnh là do
những biến đổi xấu về môi trường gây tổn thương đến cơ thể hoặc làm giảm đi khả năng
kháng bệnh của tôm/cá. Trong lúc đó mầm bệnh sẵn có trong môi trường sẽ nhân cơ hội này
xâm nhập vào cơ thể chúng. Do vậy cần phải xem xét cả vật chủ, mầm bệnh và môi trường
để xác định nguyên nhân gây bệnh nhằm có biện pháp phòng ngừa và xử lý thích hợp.
I.2. NHỮNG VẤN ĐỀ CHUNG TRONG CHUẨN ĐOÁN BỆNH THỦY SẢN
I.2.1. Sự đồng nhất trong thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu
Thao tác thu, xử lý và phân tích mẫu là một trong những yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng
đến kết quả của các phép chẩn đoán bệnh. Thời gian thu mẫu, khoảng cách giữa các lần thu
mẫu, phương pháp cố định mẫu, nhiệt độ bảo quản mẫu, chất lượng của môi trường phân
lập, thời gian sử dụng của các dung dịch hoá chất sau khi chuẩn bị, vv, đều là những vấn đề
cần được cân nhắc trong quá trình phân tích mẫu. Số lần mẫu được đông lạnh rồi rả đông
cũng ảnh hưởng đến kết quả phân tích. Giữa các phòng thí nghiệm và các phép phân tích
được sử dụng phải đồng nhất thì kết quả đạt được mới có ý nghĩa về mặt so sánh.
I.2.2. So sánh kết quả giữa các phòng thí nghiệm
Để so sánh kết quả phân tích hay kết quả chẩn đoán từ các phòng thí nghiệm chẩn đoán
bệnh thủy sản, các yếu tố sau đây cần phải được xem xét:
I.2.2.1. Các dạng kết quả và ý nghĩa của chúng
10
11. I.2.2.2. Phương thức so sánh, ví dụ:
- Mật số vi-rút so với hàm lượng kháng thể
- Giới hạn xác định kết quả dương và âm tính
- Độ nhạy của phương pháp (ví dụ như % kết quả dương tính thật trên số kết quả
dương tính)
- Tính chuyên biệt (ví dụ như % kết quả âm tính thật trên số kết quả âm tính)
- Các tính toán và đọc kết quả
- Các đối chứng
I.2.3. Những vấn đề cần lưu ý
I.2.3.1. Giá trị giới hạn cho những phép phân tích
Cần phải thiết lập những giá trị giới hạn cho những phép phân tích mà kết quả thu được có
tính định lượng để xác định kết quả âm tính và dương tính.
Giá trị giới hạn này sẽ ảnh hưởng đến kết quả âm tính và dương tính giả cũng như kết quả
âm và dương tính thật.
I.2.3.2. Tính hiệu lực của phương pháp chẩn đoán
Một phương pháp phân tích mẫu hay thử nghiệm có tính hiệu lực là phương pháp có thể cho
ra kết quả phân biệt rõ ràng giữa kết quả dương tính và âm tính hoặc giữa cá thể bị nhiễm
bệnh và không bị nhiễm bệnh.
Tính hiệu lực của phương pháp biểu hiệu qua hai đặc điểm là tính nhạy (khả năng xác định
chính xác mẫu có nhiễm hay không) và tính chuyên biệt (khả năng phát hiện mẫu không có
nhiễm bệnh).
Tính hiệu lực của phương pháp được xác định bằng cách so sánh các cá thể cùng loài trong
cùng một mẫu. Trong trường hợp khác kết quả phải được kiểm định bằng các kỹ thuật mô học.
I.2.3.3. Tính ổn định của phương pháp
Một phương pháp được gọi là ổn định khi phương pháp đó cho ra kết quả tin cậy và giống
nhau sau nhiều lần lập lại. Hai yếu tố quyết định cho tính ổn định của phương pháp là: biến
động giữa các cá thể phân tích và biến động giữa các lần đọc kết quả.
I.2.3.4. Đối chứng
Đối chứng phải được bố trí trong tất cả các phân tích, gồm có đối chứng dương và đối chứng
âm. Lý tưởng nhất là đối chứng chuyên biệt cho loài cho tất cả các phân tích. Các xét nghiệm
phân tử như trường hợp của phản ứng chuỗi trùng hợp (polymerase chain reaction-PCR) phải
11
12. có đối chứng DNA để theo dõi khả năng tạp nhiễm giữa các mẫu trong quá trình ly trích, đối
chứng là DNA của vật chủ để kiểm soát khả năng khuếch đại DNA của mẫu và đối chứng
PCR để kiểm soát sự tạp nhiễm trong quá trình thực hiện phản ứng.
I.2.4. Phát hiện và chẩn đoán bệnh
I.2.4.1. Chẩn đoán lâm sàng
Qua chẩn đoán lâm sàng những ảnh hưởng của bệnh được ghi nhận và mô tả, từ việc quan
sát tổng quát, những thay đổi về tập tính hay hoạt động, những vết lở loét hay những vùng
bị tổn thương khác ở bên ngoài cho đến những quan sát, ghi nhận và mô tả ở mức hiển vi
bệnh lý của các nội quan.
I.2.4.2. Những biện pháp sàng lọc (screening)
Những biện pháp sàng lọc bao gồm tất cả những phương pháp xét nghiệm được áp dụng
trên cơ thể sinh vật khoẻ nhằm để kiểm tra xem chúng có bị nhiễm những mầm bệnh truyền
mhiễm có khả năng gây bệnh về sau hay không.
I.2.4.3. Phát hiện bệnh (detection)
- Xác định sự hiện diện của nhóm hay loại mầm bệnh nào đó
- Xác định mức độ cảm nhiễm (tự nhiên hoặc nhân tạo) của mầm bệnh trong mẫu phân tích
I.2.4.4. Chẩn đoán bệnh (diagnostic)
- Xác định sự hiện diện của mầm bệnh chuyên biệt ở mức loài, chủng hay các dạng
biến hoá của mầm bệnh đó
- Mức độ cảm nhiễm dù ít hay nhiều của mầm bệnh qua chẩn đoán có ý nghĩa là vật
chủ đang bị nguy hiểm
• Chẩn đoán sơ bộ (Presumptive Diagnosis) – các chẩn đoán bước đầu dựa trên
những quan sát tổng quan và những chứng cứ gián tiếp. Qua chẩn đoán sơ bộ
thường thấy có nhiều tác nhân gây bệnh.
• Chần đoán xác định (Confirmatory Diagnosis) – kết quả xét nghiệm dương tính
thật của mầm bệnh với độ tin cậy của phương thức xét nghiệm cao.
I.2.4.5. Các con đường lây truyền bệnh (disease transmission)
Trong chẩn đoán và xác định nguyên nhân gây bệnh thì các con đường lây truyền bệnh
thường được biết đến như là dịch tể (epidemiology hoặc epizootiology) của bệnh đó. Những
hình thức lây truyền của bệnh và các yếu tố tác động đến quá trình lây truyền bệnh (môi
trường, thao tác, giai đoạn phát triển, ổ bệnh, vv.) thường phải được tìm hiểu, ghi nhận trong
quá trình khảo sát, điều tra, theo dõi và nghiên cứu về bệnh.
12
13. I.2.5. Vai trò của chẩn đoán trong quản lý dịch bệnh thủy sản
Chẩn đoán có hai vai trò quan trọng trong quản lý và khống chế bệnh thủy sản. Trước hết,
các kỹ thuật chẩn đoán bệnh thủy sản được ứng dụng rất hiệu quả để sàng lọc những cá thể
mang những mầm bệnh nguy hiểm nhất là trong chọn giống thủy sản hoặc chọn những
cá thể khỏe mạnh để vận chuyển từ nơi này đến nơi khác. Việc sàng lọc bệnh có hai lợi
ích: (a) làm giảm rủi ro bộc phát bệnh do những cá thể mang mầm bệnh gây nên do sốc,
thao tác hay do môi trường thay đổi trong quá trình vận chuyển và (b) làm giảm rủi ro lây
bệnh của những cá thể mang mầm bệnh nhưng kháng được bệnh. Vai trò thứ hai của chẩn
đoán bệnh là giúp xác định nguyên nhân gây nên tình trạng sức khỏe kém hoặc những
biểu hiện bất thường về sinh sản, tăng trưởng hay hoạt động để có thể đề xuất những bước
tiếp theo trong quá trình tìm ra nguyên nhân gây bệnh và đề xuất giải pháp khống chế hoặc
xử lý bệnh tùy theo từng điều kiện cụ thể. Đây là vai trò trực tiếp và rõ ràng nhất của việc
chẩn đoán bệnh thủy sản.
Chẩn đoán chính xác một bệnh thường được xem xét một cách không đúng là do quá phức
tạp và tốn kém. Điều này có thể chỉ đúng trong trường hợp phải đối phó với những bệnh khó
chẩn đoán hoặc với những bệnh mới xuất hiện. Chẩn đoán bệnh không chỉ đơn thuần là
thực hiện các xét nghiệm trong phòng thí nghiệm. Kết quả xét nghiệm giúp xác định sự
hiện diện của một mầm bệnh nào đó, hoặc có thể loại trừ sự có mặt của mầm bệnh tùy vào
mức độ phát hiện của phương pháp được sử dụng. Chẩn đoán sai dẫn đến phòng và trị bệnh
không hiệu quả và thậm chí là rất tốn kém. Ví dụ như có một tác nhân gây bệnh mới xuất
hiện ở một vùng nuôi thủy sản trọng điểm nào đó hay đối tượng thủy sản được thả nuôi chết
hàng loại trong quá trình vận chuyển hay thao tác trong trại như chuyển ao, đóng túi để vận
chuyển, vv. Việc chẩn đoán phải được thực hiện bằng những quan sát, theo dõi liên tục bắt
đầu từ trại sản xuất, thật ra đây là việc cần làm trước khi bệnh xảy ra.
I.2.6. Các mức độ trong chẩn đoán bệnh thủy sản
Theo tài liệu hướng dẫn chẩn đoán bệnh ở thủy sản nuôi ở Châu Á (Asia Diagnostic guide
for aquatic animal disease. FAO fisheries technical paper 402/2) thì chẩn đoán bệnh thủy
sản được chia thành ba mức độ (xem chi tiết ở bảng 1) với những bước thực hiện và yêu cầu
tùy theo mỗi mức độ chẩn đoán. Các mức độ chẩn đoán không có ý nghĩa từng mức độ
riêng lẻ mà mang tính liên hoàn bổ sung dữ liệu và thông tin cho nhau để đạt được một chẩn
đoán hoàn hảo. Mức độ 1 cung cấp những thông tin căn bản làm cơ sở cho chẩn đoán mức 2
và 3 do việc chẩn đoán ở các mức độ cao hơn chỉ có thể được xác định chính xác khi có sự
liên kết với những quan sát và kết quả thu được ở những mức độ chẩn đoán thấp hơn.
I.2.6.1. Mức I:
Gồm những quan sát về trại nuôi, thông tin về sản xuất, những ghi nhận trong quá trình nuôi
và việc quản lý sức khỏe. Những thông tin này cho biết về các nhân tố kích thích sự bộc
phát bệnh để làm cơ sở cho mức độ chẩn đoán 2 và 3.
13
14. 14
I.2.6.2. Mức 2:
Gồm những xét nghiệm chuyên biệt về ký sinh trùng, mô bệnh học, vi khuẩn hay nấm.
Những xét nghiệm này có những yêu cầu nhất định về kinh phí cho dụng cụ, thiết bị và hoá
chất cũng như đào tạo cán bộ chuyên môn. Nhìn chung chẩn đoán mức hai không thể thực
hiện ở trại nuôi.
I.2.6.3. Mức 3:
Gồm những dạng chẩn đoán có tính chuyên biệt cao yêu cầu có sự đầu tư thích đáng về kinh
phí cho dụng cụ, thiết bị và hoá chất cũng như đào tạo cán bộ chuyên môn. Chẩn đoán mức
3 bao gồm những kỹ thuật phân tử và kỹ thuật miễn dịch. Mặc dù hiện tại có một vài bộ kít
được phát triển cho việc chẩn đoán nhanh tại các trại nuôi (mức 1) hay sử dụng trong các
phòng thí nghiệm vi sinh vật và mô học (mức 2).
Một trong số các vấn đề quan trọng để đạt hiệu quả chẩn đoán cao nhất ở cả ba mức độ chẩn
đoán bệnh là phải đảm bảo rằng những người làm công việc chẩn đoán ở mức 1 phải có liên
lạc và biết cách liên lạc với các phòng thí nghiệm thực hiện chẩn đoán mức 2 và 3 và ngược
lại các phòng thí nghiệm mức 2 và 3 cũng phải có mối liên lạc với những người thực hiện
chẩn đoán mức 1. Chẩn đoán mức 3 thường cung cấp những thông tin thuần túy về mặt xét
nghiệm trong phòng thí nghiệm nên cần phải có những thông tin về các điều kiện thực tế ở
trại nuôi thì việc chẩn đoán mới thật sự mang lại hiệu quả thực tế.
Như vậy, chẩn đoán mức 1 là nhằm mục đích chẩn đoán bước đầu về bệnh và được xem
như là cái mốc của quá trình chẩn đoán. Các chẩn đoán xác định (mức 2 và 3) chỉ có thể
được thực hiện khi mà khả năng chẩn đoán bước 1 đã được thiết lập. Việc thành lập các
phòng thí nghiệm cho chẩn đoán mức 2 và 3 thường là tùy thuộc vào tình hình và mức độ
nghiêm trọng của dịch bệnh mà những người thực hiện việc chẩn đoán mức 1 phải đối phó
và giải quyết.
I.2.7. Phân nhóm kỹ thuật phát hiện/chẩn đoán bệnh ở thủy sản
Các kỹ thuật phát hiện/chẩn đoán bệnh ở thủy sản có thể được phân nhóm theo nhiều cách
dựa vào dạng mầm bệnh (ví dụ: kỹ thuật vi khuẩn, kỹ thuật vi-rút…) hoặc dựa vào phương
pháp được sử dụng (ví dụ: kỹ thuật hiển vi điển tử, kỹ thuật miễn dịch…). Trong giáo trình
này các kỹ thuật chẩn đoán bệnh thuỷ sản được chia thành 3 dạng chính dựa theo tài liệu của
IAAAM (International Association of Aquatic Animal medicine, http://www.iaaam.org): (1)
các kỹ thuật quan sát bằng mắt thường và bằng kính hiển vi; (2) các kỹ thuật huyết thanh và
(3) các kỹ thuật phân tử.
15. Bảng 1. Các mức độ chẩn đoán bệnh và các điều kiện liên quan
Mức
độ
Những việc
cần làm
Kiến thức cần phải có Người thực hiện Yêu cầu về mặt kỹ thuật
I Quan sát vật
nuôi và môi
trường
Xét nghiệm
lâm sàng tổng
quát
Hiểu biết về phương thức cho ăn, quan
sát hoạt động và sự tăng trưởng của thủy
sản nuôi
Thường xuyên theo dõi ao nuôi
Thường xuyên ghi nhận thông tin về môi
trường và những diễn biến của ao nuôi để
hỗ trợ cho các chẩn đoán ở mức 2 và 3
Hiểu biết các bước cần thực hiện để liên
lạc và gởi mẫu xét nghiệm mức 2 và 3 ở
các PTN bệnh thủy sản.
Người nuôi thủy
sản/quản đốc trại nuôi
Cán bộ khuyến ngư
Cán bộ hỗ trợ về
ngư y
Cán bộ phụ trách kỹ
thuật nuôi thủy sản
Những hiểu biết về chính về quan sát thực địa
Mẫu theo dõi các thông tin về trại nuôi
Các dụng cụ cần thiết
Mẫu quan sát lâm sàng
Mẫu theo dõi ao nuôi
Lưu trữ mẫu/vận chuyển mẫu đến phòng thí
nghiệm phân tích mức 2
Các bước quan sát, theo dõi phát hiện bệnh.
Tài liệu hướng dẫn chẩn đoán bệnh thủy sản
II Ký sinh trùng
Vi khuẩn
Nấm
Mô bệnh học
PTN được trang bị cơ bản về thiết bị và
dụng cụ phục vụ cho việc phát hiện/chẩn
đoán mầm bệnh cũng như cán bô có trình
độ chuyên môn về bệnh thủy sản.
Lưu giữ, ghi nhân đầy đủ và duy trì bài
bản và chính xác kết quả chẩn đoán.
Có khả năng lưu giữ và duy trì nguồn mẫu
Cán bộ chuyên môn
về sinh học thủy sản
Cán bộ chuyên môn
về bệnh
Cán bộ chuyên môn
về ký sinh trùng
Cán bộ chuyên môn
Hệ thống lưu trữ mẫu
Lưu trữ mẫu/vận chuyển mẫu đến phòng thí
nghiệm phân tích mức 3
Thiết bị và hoá chất cho xét nghiệm mức 2
Qui trình xét nghiệm và cán bộ có trình độ xét
nghiệm ở mức 2
16. 16
đạt tiêu chuẩn cho chẩn đoán mức 3.
Hiểu biết sự cần thiết khi phải chẩn đoán
mức 3 và cách liên lạc, chuẩn bị mẫu và
chuyển mẫu để chẩn đoán mức 3
về nấm
Cán bộ chuyên môn
về vi khuẩn
Cán bộ chuyên môn
về mô bệnh học
Các tài liệu hướng dẫn chẩn đoán bệnh thủy
sản
III Vi-rút
Hiển vi điện
tử
Sinh học
phân tử
Miễn dịch
Đòi hỏi PTN có trang bị thiết bị và dụng
cụ hiện đại cũng như cán bộ kỹ thuật
phải có trình độ chuyên môn cao.
Lưu giữ, ghi nhân đầy đủ và duy trì bài
bản và chính xác kết quả chẩn đoán.
Có khả năng lưu giữ và duy trì nguồn
mẫu đạt tiêu chuẩn cho các mục đích
nghiên cứu
Duy trì sự liên hệ với những người có
trách nhiệm và các cơ quan chức năng
gởi mẫu xét nghiệm.
Cán bộ chuyên môn
về vi-rút
Cán bộ chuyên môn
về mô bệnh học
Chuyên gia và kỹ
thuật viên về sinh
học phân tử
Thiết bị và hoá chất cho xét nghiệm mức 3
Qui trình xét nghiệm và cán bộ có trình độ xét
nghiệm ở mức 3
Qui trình lưu giữ mẫu và các thao tác chuẩn
hoá/đồng nhất phương pháp với các phòng thí
nghiệm khác
Các tài liệu hướng dẫn chẩn đoán bệnh thủy sản
Tài liệu chẩn đoán bệnh bằng phương pháp
phân tử
17. I.2.8. Các kỹ thuật quan sát
I.2.8.1. Những kỹ thuật quan sát
Gồm những kỹ thuật quan sát mẫu bệnh phẩm bằng mắt thường, quan sát tiêu bản tươi
bằng kính hiển vi giải phẫu. Qua những thủ thuật quan sát này người chẩn đoán có thể
ghi nhận những thông tin ban đầu về bệnh như các dấu hiệu lâm sàng, ký sinh trùng và
tình trạng các mô của cơ thể trước và sau khi tử vong.
Mẫu cũng có thể được cố định bằng những dung dịch cố định thích hợp để quan sát bằng
kỹ thuật mô bệnh học.
I.2.8.2. Những kỹ thuật mô học đặc biệt
Một số kỹ thuật mô học đặc biệt như kỹ thuật hóa mô miễn dịch hay hóa huỳnh quang
miễn dịch, sử dụng các kỹ thuật miễn dịch trực tiếp trên tiêu bản mô bệnh, được sử dụng
trong chẩn đoán mức 2 và 3.
I.2.8.3. Kỹ thuật hiển vi điện tử
Kính hiển vi điện tử được sử dụng ở những phòng thí nghiệm mức 3 để quan sát vi sinh
vật. Qua kính hiển vi điện tử người ta có thể quan sát cấu tạo bề mặt của các vi sinh vật,
hình thái bên ngoài của chúng, hoặc cấu tạo bên trong ở mức độ mô và vi mô.
I.2.8.4. Các kỹ thuật nuôi vi sinh vật
Các kỹ thuật nuôi vi sinh vật (như vi khuẩn, vi-rút, ký sinh trùng và nấm) bằng các môi
trường chọn lọc chuyên cho một số mầm bệnh cũng được mộ số phòng thí nghiệm dùng
trong chẩn đoán.
I.2.9. Các kỹ thuật huyết thanh
Gồm có những xét nghiệm sử dụng kháng thể hoặc sử dụng kháng nguyên. Những xét
nghiệm sử dụng kháng thể giúp xác định đáp ứng của kháng thể vật chủ với kháng
nguyên. Tuy nhiên những xét nghiệm này không có tính xác định tình trạng nhiễm bệnh.
Trong khi đó những xét nghiệm sử dụng kháng nguyên giúp phát hiện những phân tử
kháng nguyên bề mặt của vi sinh vật nên có vai trò trong chẩn đoán xác định.
I.2.10. Các kỹ thuật phân tử
Những kỹ thuật phân tử giúp xác định sự hiện diện của tác nhân gây bệnh bằng cách phát
hiện DNA hay RNA của mầm bệnh. Các kỹ thuật này cho phép phát hiện mầm bệnh trên
cả mẫu bệnh phẩm còn sống lẫn mẫu đã chết.
18. I.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG 1
1. Austin, B., and Austin, D. A. (999). Bacterial fish Pathogens: Disease of farmed
and wild fish 3rd Edition.
2. Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa. (2005). Giáo
trình bệnh học thủy sản.
3. Ellis, A. E. (1985). Fish and Shellfish Pathology.
4. FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease. fisheries technical paper
402/2.
5. Lightner, D. V. (1996). A Handbook of shrimp Pathology and Diagnostic
Procedures for Deseases of Culutred Penaeid Shrimp.
6. Noga, E. J. (1999). Fish Disease: Diagnosis and Treatment.
7. OIE (2006). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals.
8. Post, G. (1983). Textbook of Fish health.
9. Roberts, R. J. (1985). Fish pathology.
18
19. CHƯƠNG II: CÁC PHƯƠNG PHÁP QUAN SÁT
II.1. QUAN SÁT DẤU HIỆU BỆNH, MẪU GIẢI PHẪU TƯƠI VÀ MÔ BỆNH HỌC
II.1.1.Phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh
II.1.1.1.Những vấn đề cần lưu ý khi quan sát bệnh lý thủy sản
Thông tin về dấu hiệu bệnh, mô học và tế bào học của mẫu bệnh phẩm thực hiện khi giải
phẫu là phần rất quan trọng cho các chẩn đoán có liên quan nhằm cung cấp thông tin cho
một chẩn đoán đầy đủ. Trong đa số các trường hợp, kết quả chẩn đoán đòi hỏi phải có
những bằng chứng cho thấy sự liên quan giữa mầm bệnh và những tổn thương của cơ thể
do mầm bệnh đó gây nên. Ngoài vai trò xác định tương quan giữa mầm bệnh và vật chủ,
những thông tin từ kết quả quan sát còn giúp xác định/phân biệt những yếu tố tham gia
gây bệnh khác.
Những biến đổi về hình thái của mô và tế bào phải được xác định và phân ra thành các
nhóm ví dụ như những biểu hiện của vật chủ với sự tấn công của mầm bệnh nhằm có
những biện pháp chẩn đoán khác nhau để có kết quả xác định do cơ thể có rất nhiều loại
mô và chúng có những biểu hiện khác nhau về mặt bệnh lý.
Để có thể lựa chọn phương pháp chẩn đoán hợp lý, người làm công tác chẩn đoán phải
thu thập, ghi nhận hoặc phải đuợc cung cấp những thông tin sau:
1. Vị trí xuất hiện của những dấu hiệu bệnh lý trên cơ thể, các nội quan và mô cũng
như những những thay đổi trong thời gian gần nhất được phán đoán thông qua: (i)
quá trình diễn biến bệnh (Đã chết hay đang bị bệnh nặng; Tình trạng bệnh: số còn
sống, số khỏe, số bệnh và số đã chết) ; (ii) báo cáo chi tiết về quan sát lâm sàng;
(iii) mẫu mô bệnh và (iv) kết quả xét nghiệm mô bệnh học trên nhiều tiêu bản mô.
2. Kết quả chẩn đoán lâm sàng trước và sau khi tử vong
3. Những thông tin liên quan đến khả năng bị nhiễm độc tố
4. Chấn thương hoặc những thông tin liên quan đến tình trạng kiệt sức
5. Các điều kiện về dinh dưỡng, sinh sản, mật độ và môi trường nuôi.
6. Thông tin về biện pháp phòng bệnh được áp dụng như loại thuốc hay vắc xin được
sử dụng, thời gian và phương thức sử dụng.
7. Thông tin về kết quả các chẩn đoán trước đây (nếu có).
Những xáo trộn về mặt sinh lý hay trao đổi chất của cơ thể thường không thấy được
qua phân tích mô bệnh học mà chỉ có thể bằng các quan sát những tổn thương hay
những thay đổi về mặt hình thể do những xáo trộn có liên quan gây ra.
Mẫu được thu để phục vụ cho việc chẩn đoán để định dạng mầm bệnh, xác định tác
nhân gây bệnh hay cung cấp thông tin cho việc xác định nguyên nhân gây bệnh tùy
19
20. thuộc vào việc chọn lựa phương pháp chẩn đoán như đã nêu ở trên. Chi tiết các bước
thu mẫu được trình bày ở phụ lục 1.
II.1.1.2. Quan sát bệnh lý ở tôm
Việc phát hiện ra bệnh ở tôm rất khó khăn, trừ khi có hiện tượng tôm chết hàng loạt. Dấu
hiệu bệnh thường xuất hiện ở một số ít cá thể trong ao nuôi do vậy cần phải quan sát tôm
nuôi thường xuyên nhằm xác định được bệnh ở giai đoạn sớm nhất. Trong hầu hết các
trường hợp, biểu hiện bên ngoài thường giống nhau mặc dù tác nhân gây bệnh khác nhau.
Nếu phiêu sinh vật phát triển, chất lượng nước và tôm đều ở trong điều kiện tốt thì kể từ
tuần lễ nuôi thứ ba sẽ không thể nhìn thấy tôm nữa. Khi tôm bị những tác động do môi
trường xấu hoặc bị bệnh chúng thường nổi lên mặt nước hoặc tập trung ven bờ. Khi thấy
tôm xuất hiện ở ven bờ hay trên mặt ao thì đó là dấu hiệu nghiêm trọng. Vì thế cần phát
hiện sớm những dấu hiệu khác thường qua sàn ăn hoặc chài. Tôm thường thích lên mặt
ao hay ven bờ vì nước ở đó có hàm lượng oxy cao. Trong nhiều trường hợp cũng có thể
là để tránh hàm lượng chất độc cao ở đáy ao. Kiểm tra các ao nuôi vào ban đêm và lúc
sáng sớm là rất quan trọng vì tôm bệnh sẽ nổi lên mặt nước hoặc ven bờ rất nhiều vào
những lúc này. Khi thấy tôm tập trung ven bờ thì nên kiểm tra đáy ao để biết số tôm chết,
nhất là ở khu vực đặt máy sục khí, ở giữa ao nơi tích cặn bã và quanh cống thoát.
Trong hầu hết các trường hợp, không thể xác định bệnh trong ao nuôi qua một lần thu mẫu
cho dù có phân tích nhiều chỉ tiêu đi nữa thì ý nghĩa của nó rất nhỏ. Điều cần thiết ở đây là
cần theo dõi đàn tôm trong suốt quá trình nuôi. Phát hiện được bệnh ở giai đoạn sớm
thường dựa vào những dấu hiệu xuất hiện trên tôm, chất lượng nước và những ghi nhận
trong sản xuất bao gồm thức ăn tôm sử dụng và quá trình sinh trưởng. Điều này chỉ có thể
thực hiện được ở những trại có các số liệu theo dõi đầy đủ về xu hướng phát triển, tỉ lệ
sống, tình trạng sức khỏe, sinh khối và tỉ lệ chuyển hóa thức ăn ở mỗi thời điểm thu mẫu.
Mật độ thả nuôi ảnh hưởng rất lớn đến quá trình phát triển của tôm trong ao. Mật độ thả
quá dày chắc chắn sẽ gặp trở ngại, vì tôm sẽ cạnh tranh nhau về thức ăn và môi trường
sống. Mật độ thả phù hợp cho từng ao tùy thuộc vào nhiều yếu tố như: điều kiện về thổ
nhưỡng, chất lượng nước, khí hậu ở vùng nuôi; kiểu thiết kế và cấu trúc ao nuôi; trang
thiết bị; cỡ tôm thu hoạch dự kiến và kinh nghiệm của người quản lý.
Thiết kế ao tốt có thể bù đắp cho một số trở ngại về môi trường và cỡ tôm thu hoạch có
thể bị giới hạn bởi môi trường xấu. Khi chất lượng nước tại chỗ xấu hoặc quá thay đổi thì
thả tôm với mật độ cao thường không có hiệu quả. Những thay đổi về thời tiết và chất
lượng nước theo mùa có ảnh hưởng đến tôm nuôi. Thời gian chuẩn bị ao và thả giống
phù hợp cho việc nuôi tôm cũng phải được xem xét.
Các thông tin về môi trường và quản lý ao nuôi cần lưu ý bao gồm: chất lượng nước đặc
biệt là hàm lượng oxy hòa tan, pH và nhiệt độ; những biến động về thời tiết như mưa lớn;
tình trạng đáy ao; sự phát triển của tảo và hình thức quản lý nước.
Sự xấu đi của nền đáy ao có thể dẫn đến chất lượng nước kém và gây bệnh cho tôm, tuy
nhiên nó cũng gây ra các ảnh hưởng trực tiếp. Chế độ sục khí trong ao ảnh hưởng đến sự
tích tụ chất thải ở đáy ao. Nếu như phần diện tích sạch ở đáy ao giảm sẽ làm tăng số
lượng tôm đến sàn ăn và tôm ăn hết thức ăn nhanh hơn. Cũng có thể có trường hợp ngược
lại, nếu các sàn ăn đặt ở nơi dơ bẩn trong ao thì số tôm đến sàn ăn cũng sẽ giảm. Thường
20
21. có nhiều dấu hiệu khác xuất hiện trên tôm cũng cho biết chất lượng nước xấu như màu
sắc bất thường ở mang, vỏ bẩn, phồng đuôi, ăn lẫn nhau và phụ bộ bị thương. Nếu có
nghi ngờ về sự xấu đi của nền đáy ao thì nên lội khắp ao để xem lượng chất thải tích tụ và
sự phân bổ của chúng ra sao.
Mặc dù tảo phát triển tốt thường có lợi cho ao nuôi, nhưng trong ao nuôi thay nước ít có
thể gặp rắc rối do tảo phát triển quá mức vì các chất dinh dưỡng tích lũy trong ao.
Phương thức quản lý và xử lý nước cần phải được lưu tâm đặc biệt. Mục đích của giai
đoạn lấy nước, xử lý nước và bón phân là để thúc đẩy phiêu sinh vật phát triển tốt và
ngăn ngừa các sinh vật khác vào ao nuôi, trong đó có các sinh vật gây bệnh và sinh vật
mang mầm bệnh. Các sinh vật này bao gồm các loài cá, giáp xác và các động vật không
xương sống khác. Các sinh vật này có thể cạnh tranh hoặc giết hại tôm và chúng có thể
mang mầm bệnh vào ao nuôi như các mầm bệnh vi-rut rất nguy hiểm.
Những dấu hiệu bệnh lý bên ngoài cơ thể tôm nuôi thường không cung cấp những thông
tin nhất định nào về tác nhân gây bệnh. Phức tạp hơn là dấu hiệu bệnh lý do nhiều tác
nhân cùng gây ra cộng với những biến đổi bất lợi về các yếu tố môi trường. Việc chẩn
đoán bệnh nếu chỉ đơn thuần dựa vào dấu hiệu bên ngoài sẽ không chính xác mà cần phải
được thực hiện cùng với phương pháp phân tích mô bệnh học hay các phương pháp chẩn
đoán khác. Dấu hiệu bệnh được tiến hành qua các bước như sau:
1. Quan sát hoạt động của tôm
2. Quan sát màu sắc cơ thể như:
- Hiện tượng đỏ thân hay đỏ phụ bộ
- Sự xuất hiện những đốm trắng trên vỏ
- Hiện tượng vỏ tôm có màu xanh
- Hiện tượng đầu vàng
- Thịt tôm có màu trắng đục
3. Quan sát màu sắc mang như:
- Hiện tượng mang tôm có màu hơi nâu hay đen
- Hiện tượng mang tôm có màu xanh
4. Phụ bộ
5. Lớp biểu bì
6. Cơ
7. Túi tinh
8. Tăng trưởng chậm hay tôm bị còi
21
22. 9. Dị dạng
10.Mềm vỏ
11.Màu sắc và độ đầy của ruột
12.Màu sắc của phân
Thông tin chi tiết về phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh trên cơ thể tôm được trình bày
trong phần bệnh tôm, giáo trình bệnh học thủy sản (Khoa Thủy sản, 2005). Các dấu hiệu
bệnh thường gặp ở tôm được trình bày ở phụ lục 2.
II.1.1.3.Phương pháp quan sát bệnh lý ở cá
II.1.1.3.1. Quan sát hoạt động của cá
Hoạt động của cá phải được quan sát thường xuyên mới có thể phát hiện sớm những biểu
hiện bất thường. Bầt kỳ một dấu hiệu hoạt động bất thường của cá cũng cần phải được
ghi nhận và tìm hiểu nguyên nhân. Trước khi có dấu hiệu bệnh lý rõ ràng, cá thường ăn
nhiều hơn bình thường và sau đó ngừng ăn, hoặc có một số cá tách đàn khi bắt mồi. Sự
ghi nhận thường xuyên những thông tin về hệ số chuyển hóa thức ăn, tỉ số chiều dài/trọng
lượng cơ thể hoặc những dấu hiệu về hình dạng cơ thể sẽ giúp dự đoán/phát hiện bệnh
sắp xảy ra.
Những biểu hiện bất thường của cá như bơi gần mặt nước, chìm xuống đáy ao, mất thăng
bằng hoặc thiếu oxy hay có bất kỳ những dấu hiệu hoạt động bất thường nào. Sự xuất
hiện đột ngột của những hoạt động bất thường của cá thường liên quan đến tình trạng hôn
mê của cơ thể cá. Những thay đổi về hoạt động của cá thường xảy ra khi cá bị sốc. Thiếu
oxy làm cá bị ngạt thở, lờ đờ, phình bụng hay bơi lắc lư mất hăng bằng và thậm chí làm
ảnh hưởng xấu đến mang và máu. Những hoạt động lạ thường còn có thể do những rối
loạn về thần kinh liên quan đến bệnh (bệnh do vi-rút gây viêm não và võng mạc).
Phải theo dõi xem cá chết dưới hình thức nào và mức độ ra sao. Nếu cá cứ tiếp tục chết
dai dẳng thì phải thu mẫu gởi đến phòng thí nghiệm để thực hiện các chẩn đoán ở mức 2
và 3. Nếu cá chết đồng loạt hoặc chết theo vùng ngẫu nhiên thì phải xem xét ngay lập tức
và các chỉ tiêu về môi trường trước và sau khi cá chết cần phải được ghi nhận và xem xét.
Cá chết lan từ vùng này sang vùng khác có thể là do tác nhân gây bệnh truyền nhiễm và
phải thu mẫu định dạng mầm bệnh ngay lập tức. Việc làm tức thời (nếu có thể) là cách ly
cá bị bệnh và cá khỏe trong thời gian xác địng nguyên nhân gây tử vong.
Tăng trưởng hàng ngày của cá cần phải được ghi nhận càng đầy đủ càng tốt. Tốt nhất là
thu mẫu định kỳ hoặc ước lượng khi cho cá ăn mỗi ngày. Bên cạnh thông tin về tăng
trưởng của cá thông tin về hoạt động bắt mồi và cá chết (nếu có) cũng cần được ghi nhận
đầy đủ. Thời gian thay bể hay thay nước, vệ sinh dụng cụ/ống dẫn nước hay khử trùng
trại cũng càn được ghi chép lại. Trong nhiều trường hợp, những thông tin trên rất hữu ích
để tìm ra nguyên hay xuất hiện bệnh trong trại nuôi cá.
II.1.1.3.2. Thông tin về sản xuất, môi trường và quản lý ao
Chất lượng nước và những điều kiện môi trường biến động cũng có những ảnh hưởng
đáng kể đến sức khỏe của cá có thể là ảnh hưởng trực tiếp (trong giới hạn chịu đựng về
22
23. mặt sinh lý) hay gián tiếp (làm tăng sự mẫn cảm của cá với mầm bệnh). Nhiệt độ, độ
mặn, độ đục, vi khuẩn gây bẩn và sự phát triển của tảo đều là những yếu tố môi trường
quan trọng. Mật độ nuôi cao trong các hệ thống nuôi thâm canh làm cho các bị sốc và gây
nên những thay đổi về môi trường tạo điều kiện cho bệnh bộc phát. Sự tích tụ chất thải
từ thức ăn thừa do cho ăn quá mức hay do cá giảm ăn đều sinh ra độc tố khi phân hủy
làm ảnh hưởng trực tiếp đến cá và tạo điều kiện môi trường thuận lợi cho vi sinh vật phát
triển. Các mầm bệnh này thường là các tác nhân gây bệnh thứ cấp. Ngoài ra các chất gây
ô nhiễm khác cũng có thể ảnh hưởng đáng kể đến sức khỏe của cá.
Thông tin vế môi trường nuôi đặc biệt là ở những hệ thống nuôi hở, ao, bè hay lồng rất
quan trọng khi xác định nguyên nhân gây bệnh. Các thông tin cần phải ghi nhận càng
thường xuyên càng tốt là: những thay đổi về thời tiết, nhiệt độ nước, hàm lượng oxy, pH,
độ mặn, độ trong và sự phát triển của tảo và hoạt động của con người.
II.1.1.3.3.Quan sát bề mặt cơ thể cá
Những quan sát bề mặt cơ thể cá nói chung không cung cấp nhiều thông tin liên quan đến
một sự cố về bệnh riêng lẻ nhưng những quan sát về dấu hiệu lâm sàng ở bề mặt cơ thể
cùng với những biện pháp hợp lý như loại bỏ hoặc cách ly cá bệnh với cá khỏe, thu mẫu
xét nghiệm có thể giảm đáng kể thất thoát do bệnh.
II.1.1.3.4.Quan sát trên da và vây cá
Những tổn thương trên da và vây thường là do bệnh truyền nhiễm, ví dụ như bệnh đỏ da
ở cá chép. Tuy nhiên, những vết thương trước đó do những nguyên nhân cơ học (cá cọ
vào thành bể hay do những sinh vật khác như cá dữ, chim) hay tổn thương hóa học tấn
công sẽ tạo điều kiện cho các mầm bệnh sơ cấp hay thứ cấp (ví dụ như trường hợp nhiễm
vi khuẩn Aeromonas) tấn công làm xấu thêm tình trạng sức khỏe của cá.
Những thay đổi ở da liên quan đến bệnh, ví dụ như bệnh đốm đỏ dù là nhỏ hay to thường
đòi hỏi phải có những động tác tích cực để xử lý. Những dấu hiệu bệnh thường xuất hiện
xung quanh các tia vi, nắp mang, hậu môn và vùng đuôi, cũng có khi dấu hiệu bệnh lan
khắp toàn thân. Những dấu hiệu như xuất huyết hoặc mất cân bằng thẩm thấu sẽ làm cho
da cá sậm màu đi. Những vết thương bị xuất huyết trên da dễ dẫn đến tình trạng lở loét
làm ảnh hưởng đến việc điều hòa áp suất thẩm thấu và khả năng đề kháng của cơ thể với
các mầm bệnh thứ cấp. Hiện tượng lở loét thường gặp ở phần da vùng lưng và đầu và có
thể do bệnh gây nên. Ở một số loài cá, những chỗ da bị sưng lên là dấu hiệu của sự mất
vẩy hoặc sự tích tụ chất nhày.
Ngoại ký sinh trùng hay giun dẹp cũng cần phải được lưu ý. Khi những loài ký sinh trùng
này xuất hiện trên da cá nhiều hơn mức bình thường sẽ làm cho cá bị nhiễm những mầm
bệnh thứ cấp, là dấu hiệu của sự phát bệnh hay bị sốc. Ký sinh trùng có thể bám trên bề
mặt da cá hoặc ở giai đoạn ấu trùng sống trong bào nang/bào xác dưới da hay vi cá.
Những dạng bào xác ấu trùng như ấu trùng sán lá song chủ metacercariae có thể phát
hiện nhờ những đốm trắng hay đen dưới da (hoặc sâu trong mô).
Mắt của cá cũng là nơi cần được quan sát cẩn thận để phát hiện bệnh. Hình dạng, màu
sắc, tình trạng đục vẩn, bọt khí và những đốm đỏ nhỏ lấm tấm do xuất huyết đều là
những dấu hiệu cho thấy cá sắp bị bệnh hoặc đang ở trong tình trạng nhiễm bệnh. Ví dụ
23
24. như trường hợp mắt cá bị to và trương phồng lên còn được gọi là cá bị lồi mắt thường
liên quan đến nhiều trường hợp bệnh ở cá.
II.1.1.3.5. Quan sát mang
Mang cá là một trong số các mô dễ quan sát những thay đổi khi cá bị bệnh như mang
nhợt nhạt hay bị lở loét. Những thay đổi ở mang cá thường là có liên quan đến bệnh và
cần phải lưu tâm đặc biệt khi thấy những biểu hiện bất thường xuất hiện ở mang. Những
đốm đỏ trên mang là dấu hiệu của sự xuất huyết đã làm giảm di khả năng thực hiện các
chức năng của mang. Mang bị sinh vật gây bẩn bám, tích tụ nhiều chất nhày hay ký sinh
trùng (tiêm mao trùng, sán lá đơn chủ, giáp xác chân chèo, nấm, v.v.) đều có thể làm hạn
chế bề mặt tiếp xúc của mang và là dấu hiệu ảnh hưởng xấu đến sức khỏe của cá. Những
ảnh hưởng xấu ở mang có thể làm ảnh hưởng trực tiếp đến cá hoặc làm cho cá dễ mẫn
cảm với các mầm bệnh thứ cấp khác.
II.1.1.3.6. Quan sát trên cơ thể
Bất kỳ một thay đổi khác thường nào về mặt hình dạng của cá đều là dấu hiệu không tốt
về mặt sức khỏe. Những thay đổi về hình dạng thường gặp là “đầu nhọn” hay xảy ra ở cá
con là dấu hiệu của sự phát triển không bình thường; hiện tượng ưỡn hay vẹo cột sống là
dấu hiệu không tốt về dinh dưỡng hay môi trường. Phù cơ thể là một hiện tượng xuất
hiện khá phổ biến và dễ nhận thấy nhất về mặt thay đổi hình dạng cơ thể của cá. Phù cơ
thể là sự căng phồng phần bụng làm cho bụng cá trương to. Đây là dấu hiệu bệnh cho
thấy có sự sưng lên của các nội quan cá như gan, tụy hay thận, sự tích tụ dịch cơ thể do
ký sinh trùng hoặc do những nguyên nhân khác chưa rõ. Phù cơ thể là một trong những
nhân tố của khá nhiều bệnh nguy hiểm ở cá liên quan đến sự ngưng trệ hệ thống điều hòa
thẩm thấu do có nhiều tế bào máu của thận bị phá hủy.
II.1.1.3.7. Quan sát bên trong cơ thể cá
Quan sát bên trong cơ thể cá là bước tiếp sau việc quan sát những thay đổi về hoạt
động/tập tính sống của cá. Mẫu cá bệnh phải được giải phẫu dọc theo phần bụng từ họng
đến hậu môn để quan sát các nội quan và xoang cơ thể. Nên giải phẫu mẫu cá khỏe để so
sánh những sai khác của nội quan cá khoẻ và cá bệnh.
Nếu như cá khỏe mạnh và các mô cơ thể bình thường thì sẽ không thấy dịch cơ thể trong
khoang bụng cá, cơ rắn chắc, có thể thấy những lớp mỡ có màu trắng kem xung quanh
ruột và dạ dày. Thận có màu đỏ sẫm nằm sát phần tận cùng phía trên của khoang cơ thể
giữa tuỷ sống và bóng hơi, gan có màu đỏ, tụy và lách cũng có màu đỏ.
II.1.1.3.8. Quan sát khoang bụng và các mô
Những dấu hiệu bệnh thường thấy nhất trong khoang cơ thể là sự xuất huyết và sự tích tụ
dịch cơ thể. Những đốm máu có thể xuất hiện trong cơ vách của khoang cơ thể.Vách của
khoang cơ thể mềm nhũn, rã ra khi giải phẫu là dấu hiệu cho biết cá đã chết lâu và sẽ
không còn thích hợp cho việc chẩn đoán chính xác do sự xâm nhập rất nhanh của các vi
sinh vật hoại sinh là mầm bệnh cơ hội khi sau khi cá chết.
Hiện tượng hoại cơ còn có thể do cơ bị nhiễm trùng ví dụ như ký sinh trùng nhóm thích
bào tử trùng (myxosporean). Có thể quan sát sự nhiễm trùng này bằng cách ép một mảnh
24
25. nhỏ mẫu mô bị nhiễm lên lam kính và quan sát bằng kính hiển vi giải phẫu để quan sát
những thể vùi dạng bào tử. Một số loài ký sinh trùng nhóm vi bào tử trùng
(microsporidian) và thích bào tử trùng có thể hình thành bào xác trong cơ của cá, mô liên
kết các nội quan và khoảng cơ thể, và những cơ quan khác. Những dạng bào xác này tập
trung thành từng cụm có hình cầu trắng và đòi hỏi thao tác định danh để xác định ký sinh
trùng thuộc nhóm nào.
Giun sán cũng có thể xuất hiện trong khoang bụng, nhóm này thường nằm cuộn lại xung
quanh các nội quan và các mô màng bụng. Sự hiện của chúng thường không gây nguy
hiểm cho cá tuy nhiên nếu chúng có quá nhiều trong khoang bụng sẽ gây chèn ép hay
chiếm chỗ các nội quan của cá.
II.1.1.3.9. Quan sát các nội quan
Bất cứ những đốm trắng xám nào xuất hiện trên một trong những cơ nội quan của cá như
gan, thận, tụy hay lách đều do bệnh vì những đốm trắng xám này là dấu hiệu của sự hoại
tử hoặc tổn thương ở mô. Ở thận hoặc lách thì đây là dấu hiệu của sự ngưng sản xuất tế
bào máu. Những vết loét trên thận còn có thể là do ảnh hưởng trực tiếp của sự điều hoà
áp suất thẩm thấu. Những vết loét trên gan thì có thể do ảnh hưởng của cơ chế kháng
khuẩn và kháng độc tố. Bất kỳ một nội quan nào của cá bị sưng lên đều là dấu hiệu của
bệnh cần được chẩn đoán càng sớm càng tốt. Khi ruột cá bị sưng thì phải kiểm tra xem là
do thức ăn hay do sự tích tụ dịch nhày. Sự tích tụ dịch nhày là dấu hiệu của ngưng tiêu
hóa thức ăn, loại bỏ chất thải cũng như sự kích động ruột thường có liên quan đến những
bệnh nguy hiểm. Đây cũng có thể do sự xâm nhập cơ hội của những đoạn ruột đã bị kích
động do sự thay đổi quá nhanh về thức ăn ví dụ như do trùng roi Hexamita salmonis.
Ruột có đầy dịch nhày có thể nhận ra qua phân kết cụm, phân kéo dài hay có dịch nhày.
Thông tin về phương pháp quan sát dấu hiệu bệnh trên cơ thể cá cũng được trình bày
trong phần bệnh cá, giáo trình bệnh học thủy sản (Khoa Thủy sản, 2005). Các dấu hiệu
bệnh thường gặp ở cá được trình bày ở phụ lục 3.
II.1.2. Phương pháp quan sát mẫu giải phẫu tươi
Quan sát mẫu giải phẫu tươi có thể được thực hiện ngay tại trại nuôi hay chỉ cần có kính
hiển vi và các dụng cụ tiểu phẫu đơn giản là có thể thực hiện được nhằm giúp đánh giá
tình trạng sức khỏe tôm/cá nuôi và phán đoán những nguyên nhân có thể gây bùng phát
bệnh. Những phương pháp trình bày dưới đây thường được sử dụng trong chẩn đoán
bệnh tôm. Ở cá, các kỹ thuật này cũng được áp dụng khá tương tự. Thông tin chi tiết về
các phương pháp cơ bản trong chẩn đoán bệnh cá có thể tham khão thêm trong tài liệu
hướng dẫn chẩn đoán bệnh thủy sản (Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease,
FAO fisheries technical paper 402/2) hoặc trong giáo trình bệnh học thủy sản (Khoa
Thủy sản, 2005).
Kính phết huyết tương
Để kiểm tra hình thái của hồng cầu và sự hiện diện của vi trùng và ký sinh trùng trong
máu. Những biến đổi như nhân bị co lại thường có liên quan đến bệnh Vibrio hoặc bệnh
đầu vàng. Nhân bị vỡ và có nhiều thể vùi trong tế bào chất là biểu hiện đặc trưng của sự
25
26. nhiễm vi-rút gây bệnh đầu vàng (YHV). Vi khuẩn Vibrio thường phổ biến trong các
trường hợp nhiễm khuẩn. Vi bào tử trùng (Microsporidium) cũng thường được tìm thấy
trong máu. Có thể nhuộm mẫu huyết tương bằng phương pháp nhuộm Gram hay nhuộm
Heamatocyline & Eosin (H&E) (xem phụ lục 4).
Kính phết mẫu gan tụy, cơ và cơ quan sinh dục đặt lên lam cho vào một giọt dung dịch cố
định Davidson, phết đều, để khô và nhuộm bằng thuốc nhuộm H&E. Phương pháp này có
thể phát hiện các thể ẩn của vi-rút trong trường hợp tôm bị nhiễm nặng. Ngoài ra cũng có
thể phát hiện nhóm Vibrio và vi bào tử trùng.
Cố định mang tôm bằng dung dịch HCl Davidson và nhuộm bằng thuốc nhuộm H&E có thể
phát hiện vi-rút gây bệnh đốm trắng (WSSV), YHV và vi-rút gây hoại tử cơ quan tạo máu và
cơ quan lập biểu mô (IHHNV). Vi khuẩn gây bệnh đóng rong, nguyên sinh động vật, nấm
mycosis và hiện tượng tiết hắc tố cũng được phát hiện bằng cách này (xem phụ lục 5).
Quan sát tiêu bản tươi bằng cách lấy mẫu của mang, phụ bộ, cơ quan gan tụy, cơ, cơ quan
sinh dục và ruột giữa cho vào một giọt dung dịch 2.8 % NaCl hoặc nước biển vô trùng,
đậy bằng lam và quan sát dưới kính hiển vi để phát hiện vi khuẩn dạng sợi, nguyên sinh
động vật, vi khuẩn hình que có khả năng di động (thường là nhóm Vibrio), nấm mycosis,
tảo khuê, tảo lục và cả mùn bã hữu cơ. Ở những chỗ bị đen dưới vỏ hoặc trong cơ có thể
dùng dao tiểu phẫu để cắt mẫu và đặt mẫu lên phiến kính với một giọt dung dịch 2.8 %
NaCl và quan sát dưới kính hiển vi để phát hiện vi khuẩn gây bẩn, nguyên sinh động vật
và nấm Furasium.
Một số phương pháp nhuộm nhanh hiện đang được sử dụng để phát hiện vi-rút baculo ở
tôm sú (Monodon baculovirus-MBV), YHV và WSSV (xem phụ lục 6).
II.1.3. Phương pháp mô học
Mô bệnh học là phương pháp xác định các tổn thương ở các mô tế bào dựa trên các thủ
thuật nhuộm tế bào và quan sát bằng kính hiển vi. Phương pháp này cho phép người phân
tích kết luận tính chất của các vùng tổn thương.
So sánh và đối chiếu với các kết quả quan sát bên ngoài là công việc rất cần thiết để có được
một chẩn đoán đúng. Nếu chỉ dựa vào những hình thái tổn thương bên ngoài mà không có các
dữ kiện khác có liên quan đến cá tôm bệnh thì thường có những kết luận sai lầm vì những hình
thái tổn thương của vài bệnh có thể giống nhau và gây nhầm lẫn trong chẩn đoán.
Phương pháp mô học nghiên cứu cấu trúc mô ở mức độ hiển vi và mô bệnh học là một
chuyên môn hẹp của phương thức mô học đề cập tới quá trình phát triển bệnh. Mô bệnh
học là một kỹ thuật rất quan trọng trong nghiên cứu bệnh tôm và nhiều trường hợp bệnh
chỉ có thể chẩn đoán được bằng phương pháp này. Tuy nhiên, nó có những hạn chế nhất
định, chẳng hạn, thao tác tương đối chậm và trong nhiều trường hợp bệnh tôm phải được
xử lý ngay trước khi có được kết quả xét nghiệm mô học. Phương pháp mô học chỉ nên
sử dụng kết hợp với tất cả các dữ liệu về môi trường và sức khỏe tôm để xác định tác
nhân gây bệnh
26
27. Trước khi quan sát dưới kính hiển vi, mẫu phải được cố định để tránh bị hư thối, loại bỏ
thức ăn và đúc khối sáp. Cắt mẫu thành từng lát mỏng khoảng 5 micromet, rồi đặt lên lam,
nhuộm màu và đậy bằng lam kính. Thịt tôm bị phân hủy cực kỳ nhanh sau khi tôm chết, vì
thế cần phải cố định chúng. Tôm chết dù được giữ trong nước đá hay đông lạnh cũng đều
vô ích đối với phương pháp mô học do những biến đổi xảy ra trong cơ. Dung dịch cố định
tôm tốt nhất là dung dịch Davidson’s và formaline đệm trung tính (phụ lục 5).
II.1.3.1. Mục tiêu
- Nghiên cứu các tổn thương ở các mô và tế bào (vi thể)
- So sánh đối chiếu các tổn thương với những biểu hiện lâm sàng của vật chủ để
tìm hiểu mối quan hệ mật thiết giữa biến đổi hình thái và các rối loạn chức năng
làm cơ sở cho việc chẩn đoán.
II.1.3.2. Những điều cần lưu ý khi sử dụng phương pháp mô bệnh học:
1. Kết quả phân tích mô học có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán bệnh hiển thị
quan hệ trực tiếp giữa tác nhân gây bệnh và vật chủ
2. Khi thực hiện các phân tích mô học cần phải ghi nhận và phân loại những biến đổi
về hình thái và cấu tạo ở mức tế bào. Mỗi loại mô, tế bào có những biểu hiện khác
nhau với tác nhân gây bệnh.
II.1.3.3. Phương pháp mô học bao gồm các bước:
1. Các giai đoạn tạo lát cắt tế bào (tiêu bản mô học)
- Thu mẫu (theo phương pháp của Lightner, 1996)
- Cố định mẫu (dung dịch Davidson’s). Sau đó trữ trong dung dịch 50-70 % alcohol.
- Cắt mẫu
- Tách nước
- Đúc parafin
- Cắt mẫu bằng microtom
- Dùng xylen để loại parafin ra khỏi lát cắt.
2. Nhuộm lát cắt bằng phương pháp nhuộm H&E
3. Quan sát tiêu bản dưới kính hiển vi và nhận định kết quả
27
28. II.2. KỸ THUẬT HÓA MÔ MIỄN DỊCH
II.2.1. Nguyên tắc
Kỹ thuật hoá mô miễn dịch (Immunohistochemistry-IHC) cho phép phát hiện kháng
nguyên trên tiêu bản mô bằng cách sử dụng kháng thể có tính đặc hiệu với kháng nguyên
qua phản ứng kháng nguyên-kháng thể. Kháng thể dùng cho phản ứng có thể được đánh
dấu bằng thuốc nhuộm phát huỳnh quang (kỹ thuật IFC), enzym, chất phóng xạ… để có
thể nhận biết khi quan sát dưới kính hiển vi điện, kính hiển vi huỳnh quang hay những
loại kính hiển vi khác (hình 2.1).
II.2.2. Ứng dụng
- Xác định tác nhân gây bệnh một cách chuyên biệt dựa trên tính nhạy và tính
chuyên biệt của phản ứng kết hợp kháng nguyên-kháng thể.
- Do khả năng phát hiện kháng nguyên trong tiêu bản mô hay tế bào nên phương
pháp này cho phép tìm hiểu khả năng gây bệnh của tác nhân gây bệnh .
- Quan sát bằng kính hiển vi điện hay kính hiển vi huỳnh quang, một vài phương
pháp đặc biệt được sử dụng để quan sát dưới kính hiển vi điện tử.
Hình 2.1. Nguyên lý kỹ thuật IHC (KT: kháng thể; KN: kháng nguyên)
28
29. II.2.3. Mẫu phân tích
Mẫu sử dụng là mô hay dịch cơ thể còn tươi: thời gian chuẩn bị mẫu thường là khoảng 24
giờ. Sau đó mẫu được xử lý bằng một trong các phương pháp sau:
Vết bôi/kính phết: vết bôi dùng cho xét nghiệm IHC phải được gởi đến phòng thí nghiệm
trong vòng 48 giờ sau khi chuẩn bị tiêu bản. Trường hợp lâu hơn 48 giờ thì mẫu phải
được giữ trong tủ lạnh và tránh ánh sáng để kháng nguyên không bị hư. Thông tin chi tiết
về việc chuẩn bị tiêu bản phải được sự hướng dẫn của phòng thí nghiêm nhận mẫu.
Formalin: cố định mẫu (dày khoảng <1 cm) trong dung dịch đệm trung tính (10%
formalin) và đúc khối bằng paraffin trong vòng < 1 tuần. Hoặc cố định 48 giờ trong
formalin, sau đó bảo quản trong ethanol để có thể bảo quản mẫu cho việc phát hiện bằng
phương pháp mô học hoặc phương pháp miễn dịch.
Đông lạnh: ưu điểm của mẫu đông lạnh là tách được trường hợp liên kết chéo của một số
kháng nguyên với formalin làm ảnh hưởng đến sự liên kết kháng nguyên-kháng thể. Tuy
nhiên phương pháp đông lạnh làm giảm đi chi tiết về hình thái của mô và tế bào, đòi hỏi
phải có phương pháp trữ đông đặc biệt cho IHC, giới hạn việc xác định tình trạng bệnh
trước khi mô được trữ đông và thao tác thực hiện tiêu bản khó hơn so với tiêu bản bằng
cách đúc khuôn parafin như trong phương pháp mô bệnh học. Phương thức trữ đông tốt
nhất là sử dụng môi trường trữ mô chuyên biệt, để trong isopentane và đông lạnh bằng
nitơ lỏng hay ở –70°C.
II.2.4. Thao tác
Có nhiều phương pháp IHC được sử dụng tuỳ theo mục đích phát hiện kháng nguyên chủ
yếu dựa trên loại mẫu (vết bôi, đúc parafin hay đông lạnh), dạng mẫu vật để phát hiện
bệnh và độ nhạy cần đạt được.
Những thông tin cần có khi thực hiện IHC là: (i) cách cố định mẫu; (ii) thời gian cố định;
(iii) những miêu tả đặc trưng về mẫu và (vi) loài.
II.2.5. Ưu và nhược điểm của phương pháp
II.2.5.1. Ưu điểm:
- Nhận dạng những mầm bệnh khó có thể phát hiện bằng phương pháp mô học hay
nhuộm truyền thống.
- Xác định chính xác tác nhân gây bệnh dựa vào tính chuyên biệt của kháng thể đối với
kháng nguyên.
- Có thể giúp xác định một cách trực tiếp khả năng gây bệnh của mầm bệnh qua sự
tương tác ở mức tế bào về mặt hình thái hoặc cấu tạo.
29
30. II.2.5.2. Nhược điểm:
- Thời gian giữ mẫu trong formalin càng lâu sẽ càng dễ gây ra hiện tượng liên kết giữa
các kháng nguyên tạo kết quả dương tính giả.
- Đòi hỏi quá trình tạo ra kháng thể chuyên biệt, kiểm tra tính ổn định của phản ứng
giữa kháng thể và kháng nguyên.
- Một số kháng thể chỉ có thể cho phản ứng có hiệu quả với mẫu đông lạnh.
- Kết quả âm tính hay dương tính giả phụ thuộc rất nhiều vào chất lượng của mô được
sử dụng, phương pháp và thời gian cố định, kinh nghiệm làm việc với kháng thể của
người phân tích.
II.3. KỸ THUẬT NUÔI VI SINH VẬT
Những kỹ thuật nuôi vi sinh vật giúp cho việc chẩn đoán sơ bộ mầm bệnh vi sinh vật ở
mức họ hoặc có khi đến mức giống. Trong trường hợp đòi hỏi phải có chẩn đoán xác
định thì phải sử dụng những phương pháp định danh chuyên biệt tùy theo loài hoặc týp.
Tuy nhiên hạn chế của phương pháp nuôi vi sinh vật trong chẩn đoán bệnh là thường dễ
gặp trường hợp âm tính giả đối với một số mầm bệnh vi sinh đòi hỏi điều kiện nuôi cấy
đặc biệt. Mặt khác vấn đề tạp nhiễm trong quá trình nuôi cấy rất dễ gây nên hiện tượng
dương tính giả trong chẩn đoán.
II.2.1. Nuôi vi khuẩn
II.2.1.1. Ứng dụng
Đánh giá tình trạng nhiễm khuẩn của loài vi khuẩn phân lập được trên mẫu bệnh phẩm
II.2.1.2. Phương pháp
Phân lập và nuôi vi khuẩn bằng môi trường chọn lọc tùy theo dạng vi khuẩn được nuôi.
Vi khuẩn thường được nuôi trong môi trường có chứa kháng sinh mà chúng kháng. Cách
làm này vừa có thể giúp kiểm soát sự phát triển của chúng, theo dõi sự thay đổi khả năng
kháng thuốc trong cùng một quần thể cũng như giúp xác định loại kháng sinh có hiệu lực
với loài vi khuẩn đó. Một số môi trường chọn lọc thường được sử dụng nuôi mầm bệnh
vi khuẩn ở thủy sản như:
- Vibrio sp: TCBS
- Aeromonas sp: aeromonas agar + ampicillin, rimler short agar, ampicillin-dextrin
agar
- Flexibacter sp: Cytophaga
- Edwardsiella ictaluri: Edwardsiella ictaluri agar
30
31. II.2.1.3. Mẫu phân tích
Cơ, gan, thận hay máu của sinh vật bị bệnh. Trong một số trường hợp bệnh phẩm thủy
sản lở loét mẫu có thể được thu bằng cách dùnh gạc bông gòn lấy mẫu tại vết thương.
Mẫu cũng có thể được thu từ dịch cơ thể của bệnh phẩm.
II.2.1.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp
Ưu điểm: phát hiện được sự hiện diện của mầm bệnh.
Nhược điểm: thao tác phân lập và nuôi cấy rất tốn thời gian và dễ bị tạp nhiễm với các
mầm bệnh cơ hội
II.2.2. Nuôi nguyên sinh động vật
II.2.2.1. Ứng dụng
Giúp đánh giá tình trạng nhiễm nguyên sinh động vật trên mẫu bệnh phẩm
II.2.2.2. Phương pháp
Nguyên sinh động vật được nuôi trên các dòng tế bào đặc biệt có bổ sung fetal bovine
serum và kháng sinh như penicillin, streptomycin để tránh nhiễm khuẩn.
II.2.2.3. Mẫu phân tích
Mẫu ruột, phân, máu hay các mô cơ thể. Cách tốt nhất là rửa mẫu bằng dung dịch nước
muối sinh lý có chứa kháng sinh để tránh nhiễm khuẩn, sau đó giữ trong tủ lạnh trước khi
chuyển mẫu đến phòng thí nghiệm trong vòng 24 giờ.
II.2.2.4. Ưu và nhược điểm của phương pháp
Ưu điểm: phát hiện được sự hiện diện của mầm bệnh.
Nhược điểm: thao tác phân lập và nuôi cấy rất tốn thời gian và sau khi thu mẫu phải được
xử lý trong vòng 24 giờ
II.2.3. Nuôi vi-rút
II.2.3.1. Ứng dụng
Việc nuôi vi-rút thường được sử dụng nhằm hỗ trợ cho các phép chẩn đoán nhiễm vi-rút.
Việc phân lập vi-rút thường gắn với các xét nghiệm phân tử như PCR nên phương pháp
thu mẫu cũng phải được thực hiện tùy theo vi-rút là DNA hay RNA vi-rút.
31
32. II.2.3.2. Phương pháp
Vi-rút là sinh vật sống ký sinh bắt buộc nên việc nuôi vi-rút thường được thực hiện trên
tế bào sống hoặc trong cơ thể sinh vật sống. Tế bào sống thường được nuôi trong đĩa petri
hoặc trong lọ tiệt trùng. Mẫu được nghiền và sau đó cho vào môi trường nuôi cấy và
nhiệt độ thích hợp để vi-rút phát triển.
II.2.3.3. Mẫu phân tích
Mẫu phải được thu vào thời điểm có bệnh bộc phát vì vi-rút có thể không còn hiện diện
trên cơ thể vật chủ khoảng 2 ngày sau khi có thấy dấu hiệu bệnh lý. Tùy theo điều kiện
thực tế mà mẫu có thể được vận chuyển sống, ướp nước đá, nước đá khô hoặc nitơ lỏng
để chuyển về phòng thí nghiệm.
Mẫu gởi đến phòng thí nghiệm phải kèm theo các thông tin về loại mẫu, loại vi-rút tình
nghi bị nhiễm và thời gian quan sát thấy dấu hiệu bệnh lý liên quan đến vi-rút đó. Mẫu
được thu có thể là mẫu mô hoặc dung dịch trích từ mô trong điều kiện vô trùng, mẫu máu
được thu với dung dịch chống đông.
Điều kiện vận chuyển và lưu trữ mẫu tùy theo loại vi-rút và sẽ tùy theo phòng thí nghiệm
phân tích hướng dẫn. Một số phòng thí nghiệm đòi hỏi mẫu phải được giữ trong môi
trường có bổ sung protein và kháng sinh khi vận chuyển, mẫu phải được vận chuyển
trong nước đá trong vòng 24 giờ, hoặc phải giữ lạnh ở 4°C nếu vận chuyển trong vòng 5
ngày. Trường hợp lâu hơn 5 ngày phải giữ mẫu ở -70°C, v.v….
II.2.3.4. Đọc kết quả
Nhìn chung, việc phân lập vi-rút từ mô hay máu của vật chủ bị bệnh là đầy đủ làm chứng
cứ cho sự nhiễm vi-rút. Tuy nhiên, vi-rút có thể tham gia như là mầm bệnh thứ cấp chứ
không phải là tác nhân gây bệnh chủ yếu. Điều cần thiết trong quá trình chẩn đoán là phải
có cơ sở cho thấy vi-rút có liên quan đến sự tổn thương của cơ thể vật chủ hoặc vi-rút là
tác nhân gây bệnh chủ yếu. Việc này đòi hỏi những kỹ thuật có thể xác định vai trò gây
bệnh của vi-rút như tế bào học hoặc mô bệnh học đi kèm theo bằng những phương pháp
như IHC hay hiển vi điện tử. Cần phải ghi nhận rằng hiện tại qui trình PCR đã được phát
triển đối với hầu hết vi-rút gây bệnh ở thủy sản giúp cho việc sàng lọc và xác định vi-rút
mới khá hiệu quả. Tuy nhiên việc sử dụng PCR thuần túy để chẩn đoán bệnh cần phải
được thận trọng khi xác nhận quan hệ giữa vi-rút và dấu hiệu bệnh lý.
32
33. II.3. TÀI LIỆU THAM KHẢO CHƯƠNG II
1. Alday de Graindorge, V. and Flegel, T.W. (1999). Diagnosis of shrimp diseases with
emphasis on black tiger prawn, Penaeus monodon.
2. Austin, B., and Austin, D. A. (999). Bacterial fish Pathogens: Disease of farmed and
wild fish 3rd Edition
3. FAO Asia Diagnostic guide for aquatic animal disease. Fisheries technical paper
402/2.
4. Forbes, B. A., Sahm, D. F., and Weissfeld, A. S. (2002). Laboratory methods in basic
virology In: Diagnostic Microbiology. 11th edition.
5. Hirsh, D. C., MacLachlan, N. J., and Walker, R. L. (2004). Laboratory Diagnosis. In:
Veterinary Microbiology 2nd edition.
6. Lightner, D. V. (1996). A Handbook of shrimp Pathology and Diagnostic Procedures
for Deseases of Culutred Penaeid Shrimp.
7. Noga, E. J. (1999). Fish Disease: Diagnosis and Treatment.
8. OIE (2006). Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals.
9. Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thanh Phương, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Ngọc
Hải. (2002). Quản lý sức khỏe tôm trong ao nuôi.
10.Tonguthai, K., Chinabut, S., Somsiri,T., Chanratchakool, P., and Kanchanakhan, S.
(1999). Diagnostic Procedures for Finfish Diseases
11.Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh và Trần Thị Tuyết Hoa. (2005). Giáo trình
bệnh học thủy sản.
33
34. CHƯƠNG III: CÁC KỸ THUẬT HUYẾT THANH
Các kỹ thuật huyết thanh là kỹ thuật sử dụng kháng thể để phát hiện protein kháng
nguyên của vi-rút, vi khuẩn hoặc những đáp ứng của vật chủ với vi-rút, vi khuẩn hay ký
sinh trùng trong mẫu huyết thanh. Trọng tâm của các kỹ thuật huyết thanh là xác định sự
tiếp xúc của vật chủ với mầm bệnh, tuy nhiên, các kỹ thuật này cung cấp ít thông tin về
tình trạng nhiễm bệnh của vật chủ hoặc của cả đàn thủy sản nuôi.
III.1. PHƯƠNG PHÁP KẾT TỦA MIỄN DỊCH
III.1.1. Nguyên lý
Khi cho kháng thể đặc hiệu phản ứng với kháng nguyên hòa tan ở liều lượng chuẩn sẽ
xuất hiện được kết tủa nhìn thấy được bằng mắt thường. Phản ứng này được dùng phổ
biến để phát hiện kháng nguyên khi đã có sẵn kháng thể đặc hiệu hoặc để phát hiện
kháng thể khi có kháng nguyên hòa tan đặc hiệu. Phản ứng kết tủa bị ức chế khi có quá
thừa kháng nguyên hoặc kháng thể. Sự kết tủa tối ưu khi có nồng độ kháng nguyên phù
hợp với kháng thể.
Nguyên lý chung: kết tủa miễn dịch chỉ có thể sử dụng được khi cho kháng nguyên hòa
tan phản ứng với kháng thể cũng hòa tan. Hiện tượng kết tủa miễn dịch xảy ra in vitro.
Hiện tượng tủa những phức hợp phân tử do liên kết kháng nguyên-kháng thể là do hình
thành một mạng lưới ba chiều các phân tử kháng nguyên nối lại với nhau bởi các kháng
thể (Marrack, 1934) (hình 3.1).
34
