1. РЕСПУБЛИКА КАЗАХСТАН
(19) KZ (13) A4 (11) 29970
(51) C12N 1/20 (2006.01)
C12R 1/225 (2006.01)
МИНИСТЕРСТВО ЮСТИЦИИ РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К ИННОВАЦИОННОМУ ПАТЕНТУ
(21) 2014/0708.1
(22) 23.05.2014
(45) 15.06.2015, бюл. №6
(72) Воробьев Александр Львович; Дудикова
Галина Николаевна; Чижаева Анна Викторовна;
Велямов Масимжан Турсунович
(73) Республиканское государственное казенное
предприятие на праве хозяйственного ведения
"Восточно-Казахстанский государственный
технический университет им. Д. Серикбаева"
Министерства образования и науки Республики
Казахстан"
(54) ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ
ВЫРАЩИВАНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКИХ
МИКРООРГАНИЗМОВ НА ОСНОВЕ
МОЛОЧНОЙ СЫВОРОТКИ И
РАСТИТЕЛЬНЫХ НАНОПОРОШКОВ
(57) Изобретение относится к культивированию
штаммов пробиотических микроорганизмов и может
быть использовано при производстве пищевых и
кормовых добавок, предназначенных для
профилактики и лечения желудочно-кишечных
заболеваний у человека, животных и птицы.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением, выражается в приготовлении
питательной среды для получения высоких титров
биомассы бактерий.
Питательная среда для выращивания
пробиотических микроорганизмов, содержащая
питательную основу, минеральные и органические
соли, питательной основой для среды служит
нанопорошок зерна пшеницы, а в качестве
стимулятора роста - хелатированная форма кремния
при следующем содержании ингредиентов, мас.%:
молочная сыворотка 89,95-94,8
нанопорошок пшеницы 5,0-10,0
хелатированная форма кремния 0,05-0,2
(19)KZ(13)A4(11)29970
2. 29970
2
Изобретение относится к культивированию
штаммов пробиотических микроорганизмов и может
быть использовано при производстве пищевых и
кормовых добавок, предназначенных для
профилактики и лечения желудочно-кишечных
заболеваний у человека, животных и птицы.
В настоящее время продукты и биологически
активные добавки с пробиотиками занимают
ведущее место в комплексе мер, направленных на
профилактику и коррекцию нарушений
микрофлоры. Значимость пробиотических
препаратов и продуктов диктует необходимость
разработки новых эффективных недорогих
производственных питательных сред для наработки
микробной массы. В производстве биологически
активных добавок с пробиотиками, а также лечебно-
профилактических продуктов и заквасок важной
является разработка питательной основы для
пробиотических микроорганизмов. Такая основа
должна включать все основные компоненты,
соответствующие потребностям бактерий.
Культивирование в такой среде должно
способствовать, как минимум, сохранению
пробиотических свойств микроорганизмов.
Производственная питательная среда должна
обеспечивать высокую скорость размножения,
высокую концентрацию жизнеспособных
микробных клеток в единице объема среды - не
менее 1·1010
КОЕ/мл и высокую сохранность
жизнеспособных микробных клеток.
Питательные потребности молочнокислых
бактерий весьма разнообразны и связаны с
биохимической активностью микроорганизмов. Все
питательные вещества в среде должны находиться в
легкоусвояемой форме, в частности, в форме
механохимически активированных растительных
нанопорошков.
При интенсивном механохимическом
воздействии реализуются большие скорости
изменения нагрузки на исходное растительное
сырьё. При этом способе нагружения возникают
явления, которые в корне отличаются от процессов
«мягкой» обработки. Структура и текстура
материала претерпевают радикальные изменения.
Происходит возрастание избыточной свободной
энергии системы, разрыв межмолекулярных связей,
стабилизирующих надмолекулярную структуру
природных органических полимеров, понижение
плотности, возрастание площади поверхности,
изменение валентных углов и межмолекулярных
расстояний полимерных цепей, ослабление
кристалличности. Все эти процессы объединяются
под названием механохимической дезагрегации
(Фомин, В.Н. К вопросу о критериях оптимизации
процессов переработки и получения полимерных
композиционных материалов / В.Н. Фомин //
Доклады Академии наук. 2004. Т.394, №6,
с.778-781).
При обработке методом механоактивации
происходит повышение сухого вещества, сырого
протеина, жира и энергетической ценности.
Перераспределяется состав протеинов и углеводов,
разрушаются антипитательные вещества, что
способствует созданию условий максимального
ферментативного гидролиза питательных веществ
(Касимова А.Ш., Шакиров Ш.К., Шайдуллин Р.Ф.
Влияние механоактивации на кормовую ценность
отходов перерабатывающей промышленности/Мат.
Всероссийской научно-практ. конф. молодых
ученых.- Казань, 2010. с.387).
Кремнийсодержащую стимулирующую добавку
получают из рисовой шелухи и хелатирующего
вещества катехинового типа (зеленый чай),
подвергнутые механохимической активации.
В результате проведенной механохимической
активации компонентов предлагаемая добавка из
растительного сырья содержит растворимый
кремнезем и катехины зеленого чая. Особым
преимуществом технологии с использованием
механохимической активации является образование
растворимых мономолекулярных хелатированных
форм кремния.
Кремний является своего рода катализатором
усвоения 74 химических элементов (кальций,
магний, фтор, натрий, сера, алюминий, йод, фосфор,
цинк, железо и др.), образования отдельных
ферментов, аминокислот, гормонов. Катализатором
являются и катехины зеленого чая. Кремний также
способствует активному синтезу молекулы,
обеспечивающей энергией все биохимические
процессы, протекающие в клетках (АТФ). Зеленый
чай, являясь эффективным профилактическим
средством, обладает способностью нейтрализовать
токсины, уничтожать болезнетворные бактерии, при
этом стимулируя рост полезных (Патент РФ
№2473244, опубл. 27.01.2013).
Для наращивания биомассы используют
питательные среды различного состава.
Известна питательная среда для выращивания
биомассы бифидобактерий и лактобактерий на
основе гидролизата гороха (Патент РФ №2061037,
опубл. 27.05.96 г.).
Недостатком питательной среды является низкое
содержание низкомолекулярных пептидов и
аминокислот, что не обеспечивает наработку
биомассы высокой концентрации. При этом время
наращивания микробной массы (не менее 24 часов),
титруемая кислотность и сроки сохранности не
соответствуют предъявляемым требованиям.
Известна молочная питательная среда,
содержащая цистеин солянокислый, лактозу,
гидролизат молочных белков, аутолизат дрожжей и
натрий хлористый (Патент РФ №2169763, опубл.
27.06.2001 г.).
Недостаток указанной питательной среды
заключается в том, что панкреатический гидролизат
белков молока содержит, наряду с
высокомолекулярными и низкомолекулярными
пептидами, частично гидролизованный казеин и
другие компоненты, которые плохо усваиваются
бактериями, а ферментативный аутолизат дрожжей
наряду с витаминами и стимулирующими
факторами роста бактерий содержит токсические
вещества - продукты ферментативного автолиза,
вследствие чего снижаются сроки и титр биомассы
бифидо- и лактобактерий в процессе хранения.
3. 29970
3
Наиболее близкой по технической сущности,
достигаемому положительному эффекту и принятая
за прототип является питательная среда для
культивирования лактобактерий, состоящая из
разбавленной молочной сыворотки, картофельного
экстракта, минеральных и органических солей
(Патент РФ №2080795, опубл. 10.06.1997 г.).
Недостатками известного способа являются
сложность приготовления и многокомпонентность
питательной среды, необходимость коррекции pH и
недостаточно высокое содержание микроорганизмов
в получаемой закваске.
Задачей изобретения является разработка
питательной среды на основе молочной сыворотки и
нанопорошков зерновых культур с добавлением
хелатированной формы кремния в качестве
стимулятора роста.
Технический результат, обеспечиваемый
изобретением, выражается в приготовлении
питательной среды для получения высоких титров
биомассы бактерий.
Технический результат достигается с помощью
питательной среды для культивирования
лактобактерий, содержащей молочную сыворотку и
нанопорошок зерновых культур, а в качестве
стимулятора роста - хелатированная форма кремния
при следующем содержании ингредиентов, мас.%:
молочная сыворотка 89,95-94,8
нанопорошок пшеницы 5,0-10,0
хелатированная форма кремния 0,05-0,2
Используемые в исследованиях консорциумы
молочнокислых бактерий депонированы в
коллекцию промышленных микроорганизмов
Казахского НИИ перерабатывающей и пищевой
промышленности (КазНИИППП).
Штаммы консорциума Lactobacillus casei Lц 114
(КазНИИППП, №В-311) и Lactobacillus fermentum
Ls 129 (КазНИИППП, №В-302), выделены из
зерновых субстратов и депонированы в коллекцию
микроорганизмов КазНИИППП. В результате
экспериментов по конструированию
комбинированного пробиотика создали консорциум,
обладающий пробиотическим действием и
депонировали в коллекцию микроорганизмов за
№В-485.
Штаммы консорциума Lactobacillus acidophilus
4Ш1 (КазНИИППП, №В-400), Lactobacillus
fermentum 3Ш1 (КазНИИППП, №В-404) и
Lactobacillus pontis 9К3 (КазНИИППП, №В-426),
выделены из кумыса и шубата и депонированы в
коллекцию микроорганизмов КазНИИППП. В
результате экспериментов по конструированию
комбинированного пробиотика был создан
консорциум, обладающий пробиотическим
действием и депонирован в коллекцию
микроорганизмов №В-486.
Адаптацию к росту на заявляемой питательной
среде (опытная питательная среда - ОПС)
консорциумов молочнокислых бактерий проводили
в два этапа. На первом этапе, после
культивирования на стандартной питательной среде
МРС (Мозера-Рогоза-Шарпа), исследовали характер
взаимоотношений молочнокислых бактерий в
консорциуме при выращивании на заявляемой
среде. Консорциум вносили в среду в концентрации
5%. Как показали результаты экспериментов, на
заявляемой среде возрастает активность культур
консорциумов: повышается антагонистическая
активность (до 26-33 мм подавление зоны роста),
несколько возрастает кислотообразующая
способность, увеличивается титр клеток. Заметных
различий между активностью двух консорциумов не
наблюдалось. Однако, КОЕ у консорциума Lb.
acidophilus 4Ш1+ Lb. fermentum 3Ш1+ Lb. pontis
9K3, состоящего из культур, выделенных из кумыса
и шубата, была на порядок выше, чем у
консорциума, выделенных из зерновых субстратов
(табл. 1).
Для определения оптимального количества
посевного материала, проводили пассажи на
заявляемой питательной среде в течение месяца.
Количество вносимого посевного материала
составляло 1% (5 пассажей) и 5% (4 пассажа).
Пассажи консорциумов в количестве 1% в
заявляемой среде показали нестабильность таких
свойств культур микроорганизмов, как
кислотообразующая и антагонистическая
активность. Показатели общего количества клеток
(КОЕ) были стабильны, однако при внесении 1%
закваски при пассажах происходит изменение
соотношения культур молочнокислых бактерий в
консорциумах, что и проявляется нестабильностью
их пробиотических свойств (табл. 2).
В ходе пассажей консорциумов в заявляемой
питательной среде в количестве 5% наблюдается
стабильность всех свойств (табл. 3).
Таблица 1
Физиологическая активность консорциумов при росте на различных средах
pH Молочная кислота,% Антагонистическая
активность,
диаметр зон, мм
КОЕ/млВариант (среда,
консорциум)
24 ч 48 ч 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч
МРС
Консорциум 1(Lц
114+ Ls 129)
4,64±0,1 4,59±0,1 0,216±0,006 0,228±0,006 23±0,9 23±0,8 - -
МРС
Консорциум 2
(3Ш1+4Ш1+9К3)
4,88±0,1 4,78±0,2 0,160±0,005 0,18±0,007 17±0,5 18±0,6 - -
ОПС 4,58±0,2 4,74±0,1 0,236±0,009 0,267±0,008 26±0,8 33±0,9 3,6х1011
3,4х1011
4. 29970
4
pH Молочная кислота,% Антагонистическая
активность,
диаметр зон, мм
КОЕ/млВариант (среда,
консорциум)
24 ч 48 ч 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч
Консорциум 1(Lц
114+ Ls 129)
ОПС
Консорциум 2
(3Ш1+4Ш1+9К3)
4,68±0,1 4,73±0,1 0,228±0,007 0,258±00,6 26±0,7 32±0,9 2,3х1012
1,94x1012
Таблица 2
Адаптация молочнокислых бактерий к росту на молочной сыворотке (1% засева)
pH
Кислотность,
°Н
Антагонистическая
активность диаметр
зон,мм
КОЕ/мл
1пассаж
2пассаж
3пассаж
4пассаж
5пассаж
1пассаж
2пассаж
3пассаж
4пассаж
5пассаж
1пассаж
2пассаж
3пассаж
4пассаж
5пассаж
1пассаж
2пассаж
3пассаж
4пассаж
5пассаж
Вариант
(среда,
консорциум)
72 ч 24ч 48 ч 72 ч 24ч 48 ч 72 ч 24 ч48 ч 72 ч 24 ч 48 ч
ОПС, 1%
засева
Консорциум
1(Lц 114+Ls
129)
4,55 4,72 4,57 4,774,76 4,8 40,6 33,2 42,0 30,6 35,6 39,4 33 - 35 36 - 35 1012
- 1012
1012
- 1012
ОПС, 1%
засева
Консорциум 2
(3Ш1+4Ш1+9
К3)
4,61 4,85 4,57 4,834,81 4,85 40,2 33,0 40,2 32,8 32,4 38,6 35 - 34 29 - 31 1010
- 1011
1011
1011
Таблица 3
Адаптация молочнокислых бактерий к росту на молочной сыворотке (5% засева)
pH Кислотность, °Н Антагонистическая
активность, диаметр
зон, мм
КОЕ/млВариант среда,
консорциум)
1пассаж
2пассаж
3пассаж
4пассаж
1пассаж
2пассаж
3пассаж
4пассаж
1пассаж
2пассаж
3пассаж
4пассаж
1пассаж
2пассаж
3пассаж
4пассаж
ОПС, 5% засева
Консорциум 1(Lц
114+ Ls 129)
4,58 4,74 4,70 4,72 31,4 35,6 33,0 39,6 26 33 32 33 1011
1011
1011
1011
ОПС, 5% засева
Консорциум 2
(3Ш1+4Ш1+9К3)
4,68 4,73 4,69 4,74 30,4 34,4 39,4 36,2 26 32 33 32 1012
1012
1012
1012
Способ осуществляют следующим образом.
Свежую молочную сыворотку фильтруют через 3-4
слоя марли и вносят 5-10% растительного
компонента (нанопорошок пшеницы), который
получают путем измельчения зерна вместе с
оболочками на вибромельнице ВМ-30 в течение 10
мин, при этом содержание наночастиц размером 20-
500 нм составляет не менее 50% (фиг.1) и
стимулятор роста - хелатированную форму
аморфного кремния (0,05-0,2 г/л питательной
среды). Среду не автоклавируют, а подвергают
кипячению - 5 мин.
Консорциумы молочнокислых бактерий
добавляют в питательную среду в количестве 5%,
культивируют при температуре 35±2°С в течение
24-48 часов. В процессе культивирования проводят
оценку кислотообразующей активности,
антагонизма к В. subtilis, pH культуральной
жидкости и титр бактериальных клеток.
Ниже приведены примеры составов заявляемой
питательной среды.
Пример 1. Минимальное содержание
нанопорошка пшеницы (мас.%):
молочная сыворотка 94,95
нанопорошок пшеницы 5,0
хелатированная форма кремния 0,05
Пример 2. Среднее содержание нанопорошка
пшеницы (мас.%):
молочная сыворотка 92,95
нанопорошок пшеницы 7,0
хелатированная форма кремния 0,05
5. 29970
5
Пример 3. Максимальное содержание
нанопорошка пшеницы (мас.%):
молочная сыворотка 89,95
нанопорошок пшеницы 10,0
хелатированная форма кремния 0,05-0,2
Ниже приведены данные (табл. 4, 5, 6) по
культивированию консорциумов лактобактерий с
использованием заявляемой питательной среды. Из
указанных таблиц видно, что питательные среды с
различными концентрациями растительного
нанопорошка (5, 7, 10%) позволяют повысить
антагонистическую активность и титр клеток при
культивировании на них обоих консорциумов в
сравнении с контролем. Наиболее эффективной
является питательная среда, содержащая 10%
нанопорошка. Однако отличие, по основным
показателям, от сред, в состав которых входят 5 и
7% нанопорошка, - незначительно.
При росте на молочной сыворотке консорциум
на основе культур, выделенных из молочных
субстратов, более активно проявляет
антагонистичесие свойства и способность к
размножению - титр клеток на порядок выше, чем у
консорциума лактобактерий, выделенных из муки.
Создание питательной среды на основе
молочной сыворотки с добавлением растительных
компонентов (нанопорошков) позволила повысить
титр клеток, антагонистическую и
кислотообразующую активность консорциумов
лактобактерий. При этом зерновые компоненты
среды выполняют буферную роль, не позволяя
сильно понижаться pH.
Одним из важных свойств пробиотических
культур микроорганизмов является высокая
скорость размножения, выражаемая через титр КОЕ.
Таблица 4
Пример 4. Параметры глубинного культивирования консорциумов молочнокислых бактерий (засев 5%) в
питательных средах на основе молочной сыворотки и растительного сырья (нанопорошок)
pH Кислотность, °Н Антагонистическая
активность, диаметр зоны,
мм
КОЕ/млВариант
(среда+консорциум )
24 ч 48 ч 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч
Сыворотка
(контроль)
Lц 114+ Ls 129
4,12 4,03 11,8±0,4 12,1±0,3 28±1,04 29±1,2 1011
1012
Сыворотка
(контроль)
3Ш1+4Ш1+9К3
4,07 4,05 11,6±0,3 13,2±0,3 28±1,1 26±1,4 1011
1012
Сыворотка
+стимулятор
Lц 114+ Ls 129
4,21 4,17 11,2±0,3 14,5±0,3 24±0,9 22±1,3 1012
1012
Сыворотка
+стимулятор
3Ш1+4Ш1+9К3
4,25 4,18 12,8±0,3 13,9±0,2 29±0,9 18±0,8 1012
1013
Сыворотка
+пшеница+
стимулятор
Lц 114+ Ls 129
4,14 3,87 19,7±0,4 21,7±0,4 33±0,9 29±1,1 1014
1014
Сыворотка +
пшеница+
стимулятор
3Ш1+4Ш1+9К3
4,06 4,02 16,8±0,3 22,4±0,5 32±1,2 23±0,8 1014
1014
Сыворотка + ацетат
Na + сульфат Mg
(контроль)
Lц 114+Ls 129
4,54 4,41 11,8±0,2 13,6±0,2 23±0,5 30±0,6 1012
1012
Сыворотка + ацетат
Na + сульфат Mg
(контроль)
3Ш1+4Ш1+9К3
4,55 4,42 12,0±0,3 13,8±0,3 27±0,9 30±0,7 1011
1012
7. 29970
7
pH Кислотность, °Н Антагонистическая
активность, диаметр зоны,
мм
КОЕ/млВариант
(среда+консорциум )
24 ч 48 ч 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч 24 ч 48 ч
Сыворотка +
пшеница+
стимулятор
3Ш1+4Ш1+9К3
4,12 4,04 16,7±0,2 21,7±0,4 34±1,1 29±0,6 1014
1015
Сыворотка+ацетат Na
+сульфат Mg
(контроль)
Lц 114+ Ls 129
4,54 4,41 11,8±0,2 13,6±0,2 23±0,5 30±0,6 1012
1012
Сыворотка +ацетат
Na+сульфат Mg
(контроль)
3Ш1+4Ш1+9К3
4,55 4,42 12,0±0,3 13,8±0,3 27±0,9 30±0,7 1011
1012
Культивирование консорциумов на питательных
средах с растительным нанопорошком и
стимулятором роста позволяет значительно
повысить титр клеток - на 2-3 порядка. Через 24 часа
культивирования - 1014
КОЕ/мл, а к 48 - 1015
КОЕ/мл. При этом антагонистическая активность
консорциумов довольно высокая - 31-33 мм
(диаметр зоны задержки роста В. subtilis). При росте
консорциумов на других питательных средах - МРС,
ОПС с молочной сывороткой, просто молочной
сыворотке, при добавлении в сыворотку
стимулятора роста, ацетата Na и сульфата Mg, титр
клеток пробиотических микроорганизмов не
превышал значения 1012
КОЕ/мл.
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
Питательная среда для выращивания
пробиотических микроорганизмов на основе
молочной сыворотки и растительных
нанопорошков, содержащая питательную основу,
минеральные и органические соли, отличающаяся
тем, что питательной основой для среды служит
нанопорошок зерна пшеницы, а в качестве
стимулятора роста - хелатированная форма кремния
при следующем содержании ингредиентов, мас.%:
молочная сыворотка 89,45-94,8
нанопорошок пшеницы 5,0-10,0
хелатированная форма кремния 0,05-0,2.
Верстка Н.Киселева
Корректор К.Нгметжанова
