Phân tích vi sinh

1. TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG THƯƠNG
TP HCM
PHÂN TÍCH VI SINH THỰC PHẨM
ĐỀ TÀI :ĐỊNH LƯỢNG BACILLUS CEREUS BẰNG PHƯƠNG
PHÁP ĐẾM KHUẨN LẠC
GVHD: ĐINH THỊ HẢI THUẬN
1

2. NHÓM 12
Huỳnh Gia Phát – 2022210138
Huỳnh Phùng Thanh Vũ – 2022210070
Huỳnh Khả Duy – 2022210038
Lê Vỹ Khang - 2022218236
Võ Hoàng Nguyên-2005217994
2

3. I.Tổng quan về Bacillus cereus
3

4. Liều lượng gây ngộ độc 106-108 tế bào/g
Bacillus cereus
Kỵ khí tùy ý
Bắt màu gram dương
Dễ tạo bào tử
Trực khuẩn
Dễ sinh độc tố
4

5. II. Phân Tích Bacillus cereus
7

6. Nguồn nhiễm
Thịt sống và thịt gia cầm Ngũ cốc
Rau củ Môi trường đất
5

7. Diarrhoeal toxin Emetic toxin
Độc tố chủ yếu
Gây tiêu chảy, sốt
Không bền
nhiệt
Thời gian ủ bệnh từ 8-16 giờ
Gây buồn nôn, đau bụng
Bền nhiệt
Thời gian ủ bệnh từ 1-5 giờ
6

8. Phạm vi áp dụng
• Phương pháp được tham chiếu theo TCVN 4992:2005 ( ISO 7932:2004)
• Phương pháp này áp dụng cho các sản phẩm dùng cho người, thức ăn chăn nuôi,
các mẫu môi trường trong khu vực sản xuất và xử lý thực phẩm.
• Cấy một lượng mẫu qui định lên bề mặt môi trường nuôi cấy đặc đựng trong các đĩa petri
• Pha loãng theo tỉ lệ 1:9 ( 1 mẫu - 9 SPW )
• Ủ trong điều kiện hiếu khí 30oC/18-48h
• Tính số lượng B.Cereus trong 1ml hoặc 1g mẫu
Nguyên tắc
8

9. Thiết bị và dụng cụ thủy tinh
• Thiết bị để khử trùng khô (lò sấy) hoặc để khử trùng ướt (nồi hấp áp lực)
• Tủ ấm
• Nồi cách thủy
• pH mét
• Đĩa Petri
• Pipet chia vạch
• Dụng cụ dàn mẫu
9

10. Môi trường và hóa chất
Môi trường và hóa chất Mục đích
SPW ( Saline PeptoneWater ) Pha loãng mẫu
MYP agar base ( Mannitol- EggYolk- Polymixin )
Nuôi cấy B. cereus
Polymixin B
EggYolk
Blood agar base
Khẳng định B. cereus giả định
Sheep blood
HCL và NaOH 10% Chỉnh pH
10

11. Thành Phần Hàm Lượng Vai trò
Mannitol 10 g/l Phân biệt Bacillus cereus dựa trên khả năng
phân giải mannitol
Peptone 10 g/l Cung cấp nguồn nitơ và cacbon cho vi
sinh vật.
Sodium chloride 5 g/l Điều hòa áp suất thẩm thấu của môi
trường.
Agar 15 g/l Tạo thành dạng rắn cho môi trường
Egg yolk emulsion 100 ml/l Là một nguồn dinh dưỡng và chất béo
cho vi sinh vật.
Polymyxin B sulphate 0.3 mg/l Ức chế sự phát triển của các vi khuẩn
Gram âm
MôiTrường MYP
11

12. Quy trình phân tích
Dàn đều dịch lỏng lên khắp bề mặt đĩa thạch bằng que dàn mẫu vô trùng cho đến khi khô bề mặt
thạch.
Ủ 30oC/24h
Đồng nhất mẫu bằng máy Stomacher trong 60s
Dịch mẫu [10-1] Dịch mẫu [10-2]
MYP MYP MYP MYP
Cân 10g hoặc 10ml + 90ml SPW
Khẳng định B. cereus giả định trên MT thạch máu cừu bằng phản ứng Haemolysin
Ủ 30oC/24h
Tính và biểu thị kết quả
Đếm khuẩn lạc
Pha Loãng
12

13. Các bước tiến hành
Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu
Bước 2. Pha loãng mẫu
Bước 3. Cấy và ủ mẫu
Bước 4. Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định
Bước 5. Đọc kết quả
13

14. BƯỚC 1. CHUẨN BỊ
MẪU VÀ HUYỀN
PHÙ BAN ĐẦU
Căn chính xác 10g đối với mẫu rắn
Đong mẫu với thể tích 10ml đối với mẫu lòng của phần mẫu
thử đại diện, cho vào túi nhựa vô trùng (bình tam giác).
Cho dung dịch pha loãng SPW 90ml (sai số cho phép + 5% )
vô trùng vào túi nhựa (bình tam giác) chứa mẫu.
Đồng nhất mẫu và dịch pha loãng SPW trong máy dập mẫu
trong 1 phút hoặc lắc đều bình tam giác trong 2 – 3 phút
14

15. Để vi sinh vật không bị
tổn thương do thay đổi
nhiệt , thì nhiệt độ của
dịch pha loãng trong
suốt quá trình thao tác
luôn phải giữ xấp xỉ
bằng nhiệt độ phòng
Do các bào tử lắng xuống nhanh trong pipet, nên để
pipet ở tư thế nằm ngang (không để đứng) khi được
làm đầy với một thể tích của huyền phù hoặc dung
dịch pha loãng thích hợp.
Lắc huyền phù ban đầu và các dung dịch pha loãng
bằng máy vortex để tránh các phần tử có vi sinh vật
lắng xuống.
Bước 1. Chuẩn bị mẫu và huyền phù ban đầu
15

16. Bước 2. Pha loãng mẫu
Dùng pipet vô trùng lấy 1ml huyền
phù ban đầu với sai số +5% cho vào
một ống nghiệm chứa 9 ml dịch pha
loãng SPW vô trùng ở nhiệt độ thích
hợp.
Trộn kỹ bằng máy vortex trong 5 - 10 giây để
thu được dung dịch pha loãng 10-2(đối với các
loại mẫu làm từ nguyên chất thì thu được
dung dịch pha loãng là 10-1). Nếu cần, lặp lại
thao tác trên để có được dung dịch pha loãng
10-3, 10-4, 10-5....cho đến khi thu được lượng
vi khuẩn thích hợp.
16

17. • Dùng pipet vô trùng chuyển 0,1ml mẫu thử cho vào giữa đĩa petri. Lặp lại qui
trình với các dung dịch pha loãng thập phân tiếp theo. Sử dụng 2 nồng độ
pha loãng liên tiếp, mỗi nồng độ 2 đĩa petri.
• Dùng que cấy trái trái đều dịch mẫu lên khắp bề mặt đĩa petri, sử dụng một
que trãi vô trùng cho mỗi đĩa. Để các đĩa khoảng 15 phút ở nhiệt độ phòng
để chất cây bám vào thạch. Lật úp đĩa và ủ 30°C/24 giờ.
Bước 3. Cấy và ủ mẫu
17

18. Bước 4. Đếm và chọn các khuẩn lạc để
khẳng định
• Đếm các đĩa có số khuẩn lạc dưới
150 sau 24 giờ nuôi cấy. Khuẩn lạc
B.cereus giả định là các khuẩn lạc
lớn, màu hồng, được bao quanh
bởi một vòng kết tủa. Đếm các
khuẩn lạc B. cereus giả định trên
những đĩa có số đếm phù hợp.
• Lấy 5 khuẩn lạc giả định, nếu
trên đĩa có ít hơn 5 khuẩn lạc
thì lấy tất cả các khuẩn lạc giả
định có mặt. Cấy ria, cấy đâm
sâu hoặc chấm các khuẩn lạc đã
chọn lên mặt thạch máu cừu, ủ
ở 30°C trong 24 giờ. Đọc kết
quả.
18

19. Bước 5. Đọc Kết Quả
Khuẩn lạc của B. cereus môi trường thạch MYP
Dẹt, đường kính 2–3 mm, bờ hình răng cưa, màu đỏ hồng, xung quanh có vùng đục; tan máu β.
19

21. Tính kết quả
B.Cereus giả định trong 1g/1ml mẫu (X) được tính theo công thức:
(CFU/g hay CFU/ml)
Trong đó:
C: Tổng số các khuẩn lạc nấm men, nấm mốc đếm được trên 4 đĩa của hai độ pha loãng liên tiếp nhau
V: Thể tích dịch được cấy trên mỗi đĩa (ml)
n1 : Số đĩa ở độ pha loãng thứ nhất được giữ lại
n2 : Số đĩa ở độ pha loãng thứ hai được giữ lại
d: Độ pha loãng đầu tiên được giữ lại
𝑿 =
𝚺𝑪
𝑽 × (𝒏𝟏 + 𝟎, 𝟏 × 𝒏𝟐) × 𝒅
21

22. Ví dụ giả định
Độ pha loãng 𝟏𝟎−𝟏 𝟏𝟎−𝟐
Số Khuẩn Lạc
52 15
48 26
Dựa vào bảng kết quả phía trên ta có
𝑋 =
52+48+15+26
0,1×(2+0,1x2)×10−1 =6409 = 6.4.103
𝑋 =
𝛴𝐶
𝑉 × (𝑛1 + 0,1 × 𝑛2) × 𝑑
22

23. Ví dụ giả định
Lô hàng không đạt yêu cầu
Sản phẩm Loại vi khuẩn Giới hạn Vi Sinh Vật
(Trong 1g hoặc 1 ml
sản phẩm)
Sữa dạng bột B.Cereus 10²
Sản phẩm Loại vi khuẩn Giới hạn Vi Sinh Vật
(Trong 1g hoặc 1 ml sản
phẩm)
Sữa dạng bột B.Cereus 6,4x103 CFU/g có trong
mẫu kiểm nghiệm
(*)Theo quyết định số 46/2007/QĐ-BYT
23

24. A. PCA
B. MYP
C.SPW
D. DRBC
Câu hỏi: Môi trường muối cấy của Bacillus cereus?
Đáp án: B
Câu hỏi ôn tập

25. Câu hỏi: Các bước tiến hành nuôi cấy Bacillus cereus?
A. Pha loãng mẫu – Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu – Cấy và ủ
mẫu – Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định – Đọc kết quả
B. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu – Cấy và ủ mẫu – Pha loãng mẫu
– Đọc kết quả – Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định
C. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu – Pha loãng mẫu – Cấy và ủ
mẫu – Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định – Đọc kết quả
D. Chuẩn bị mẫu thử và huyền phù ban đầu – Cấy và ủ mẫu – Pha loãng
mẫu – Đếm và chọn các khuẩn lạc để khẳng định – Đọc kết quả
Đáp án: C

26. Câu hỏi: Quá trình ủ mẫu của B.cereus ở điều kiện nhiệt độ là bao nhiêu?
A. 30°C
B. 40°C
C. 10°C
D. 15°C
Đáp án:A

27. Câu hỏi: Phương pháp đếm khuẩn lạc được sử dụng để định
lượng Bacillus cereus bằng cách nào?
A. Đếm số lượng khuẩn trên một bề mặt cấy sau khi chúng đã phân
tán đều.
B. Sử dụng phép đo hấp thụ ánh sáng để xác định nồng độ vi khuẩn.
C. Quan sát vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử.
D. Xác định sự thay đổi màu sắc khi vi khuẩn phát triển trên môi
trường agar.
Đáp án:A

28. Câu hỏi: Bacillus cereus là một loại vi khuẩn gram dương, có khả
năng gây ra nhiều bệnh trên con người. Chọn câu trả lời đúng liên
quan đến tính chất của Bacillus cereus?
A. Bacillus cereus là vi khuẩn gram âm.
B. Bacillus cereus có khả năng tạo nên bào tử chịu nhiệt độ cao.
C. Bacillus cereus là vi khuẩn chủ yếu gây nhiễm trùng ruột.
D. Bacillus cereus không thể tồn tại trong môi trường oxh.
Đáp án: B