Biokimia mikroba

1. Jillian Marc, David Feria-Gervasio, Jean-Roch
Mouret,Stéphane E Guillouet

2. Optimasi dari industri biomassa diarahkan untuk proses yang memberikan
hasil biomassa yang tinggi. Namun, beberapa ragi seperti Saccharomyces
cerevisiae dapat mengalami efek Crabtree di bawah kelebihan glukosa.
Hal ini dapat terjadi pada tangki skala besar dimana terdapat
heterogenitas dalam konsentrasi glukosa. Oleh karena itu kelebihan
glukosa dapat menyebabkan terjadinya produksi etanol yang dapat
menghambat pembentukan biomassa. Penelitian sebelumnya menunjukkan
bahwa asam oleat sebagai co-substrat dalam chemostat terbatas glukosa
dapat menunda dan memodulasi efek "jangka pendek" efek Crabtree pada
Saccharomyces cerevisiae. Disini akan diteliti lebih lanjut mengenai
pengaruh dari asam oleat sebagai modulator dari efek Crabtree.

3. oStrain Saccharomyces cerevisiae
CEN.PK 113-7D dan CA10/pCD63
oMedia YPD (10 g L-1 ekstrak ragi,
20 g L-1 bactopeptone, 20 g L-1
glukosa, 15 g L-1 agar)

4. o Kultur chemostat dengan S. cerevisiae
CA10/pCD63
o Kultur accelerostat dengan S. cerevisiae CEN.PK
113-7D
o Kultur batch dengan S. cerevisiae CEN.PK 113-
7D
o Kultur VHEP fed-batch dengan S. cerevisiae
CEN.PK 113-7D

5. Komposisi gas inlet dan outlet dianalisis
dengan spektrometri massa. Untuk
chemostats dan A-stat, analisis dilakukan
setiap 5 menit selama steady state, setiap
45 s selama akselerasi A-stat dan setiap
5 s selama pulse dinamis dengan PRIMA
600s (gas VG, Manchester, Inggris).
Untuk batch dan fed-batch, analisis
dilakukan setiap 5 menit dengan Proline
Dycor (Instrument Proses Ametek,
Berwyn, USA). Aerasi dimulai 1 jam
setelah inokulasi.

6. Pengukuran spektrofotometri pada 620 nm dilakukan
dengan spektrofotometer Hitachi U-1100 atau Libra
S4. Untuk penentuan berat kering sel, medium kultur
dipanen dan disaring pada membran poliamid dengan
ukuran pori 0,45 pM, yang kemudian dikeringkan
sampai berat konstan pada 60°C dibawah tekanan
parsial (200 mmHg, yaitu kira-kira 26,7 kPa). 500 μl
medium kultur dicampur dengan 500 μl iso-propanol
untuk menghilangkan asam oleat. Campuran divortex
selama 1 menit dan disentrifugasi selama 3 menit pada
12.000×g. Butiran diresuspensi dalam 500 μl air untuk
pengukuran spektrofotometri. Untuk penentuan berat
kering sel, membran dicuci setelah penyaringan dengan
heksana dan air untuk menghilangkan asam oleat.

7. Pewarnaan sel dengan metode metilen
biru digunakan untuk menjelaskan
penentuan viabilitas sel Dengan
adanya oleat, suspensi sel disiapkan
seperti suspensi sel untuk menjelaskan
prosedur sebelum pewarnaan.

8. Sampling untuk analisis metabolit dilakukan dengan
sampling kaldu langsung dari bioreaktor melalui membran
poliamid steril dengan ukuran pori 0,45 pM. Permeat
dapat dianalisis langsung (chemostats dan A-stat) atau
dibekukan pada -20 ° C untuk analisis lebih lebih lanjut
(batch dan fed-batch).
Konsentrasi glukosa dianalisa dengan metode enzimatik
dengan YSI Model analyzer 27 A (YSI Life Science,
Yellow Springs, USA). Penentuan akurat glukosa,
etanol, gliserol dan asam organik dari permeat
dilakukan dengan kromatografi cair kinerja tinggi
(HPLC). Untuk chemostats dan A-stat, konsentrasi
etanol dan asam asetat ditentukan dengan kromatografi
gas.
Penentuan konsentrasi asam oleat dilakukan dengan dua
metode pada penyaringan supernatan yang diperoleh
setelah iso-propanol dicuci dan disentrifugasi.

16. Penggunaan asam oleat oleh industri dalam proses
tersebut dapat menyebabkan pengelolaan yang
lebih baik dalam masalah heterogenitas ketika
terjadi efek Crabtree yang tidak diinginkan.
Selain itu, kami menunjukkan bahwa dampak oleat
tidak tergantung strain tetapi reversibel. Oleh
karena itu, persiapan starter ragi dengan oleat
sebagai co-substrat glukosa dapat digunakan
dalam berbagai aplikasi, menerapkan efek
Crabtree atau tidak.

19. Tingkat pengenceran yang ditetapkan sebesar 0,18h-1 untuk
S. cerevisiae CA10/pCD63 untuk menjaga sel-sel di bawah
metabolisme oksidatif murni. Bioreaktor diberi tambahan
media mineral dengan glukosa pada 38 g L-1 untuk
chemostat glukosa dan 39 g L-1 untuk chemostat oleat-
glukosa. Chemostat oleat-glukosa ini juga ditambah dengan
720 g L-1 larutan asam oleat pada tingkat pengenceran
0,0041h-1.
Setelah pembentukan steady state, enam sampel independen
diambil selama periode 40 jam untuk karakterisasinya.
Kemudian pulse glukosa dilakukan dengan menyuntikkan
larutan glukosa yang volumenya diketahui 600 g L-1 untuk
mendapatkan konsentrasi dalam reaktor 10 g L-1. Pompa
influen dan efluen berjalan terus menerus selama
percobaan. Percobaan ini dilakukan dua kali untuk setiap
kondisi dalam dua chemostat independen.

20. Kultur accelerostat dilakukan dengan
strain CEN.PK 113-7D dalam kondisi
yang sama seperti untuk kultur
chemostat, dengan konsentrasi glukosa
37 g L-1 untuk A-stat glukosa dan 38
g L-1 untuk A-stat oleat-glukosa.

21. Kultur batch dilakukan dalam 5 L bioreaktor B DCU B.Braun
dengan volume kerja 3 L, dikelola dengan software
MFCS/win 2.0. Suhu diatur pada 30°C dan pH pada 5.0
dengan penambahan 1 M NaOH. Aliran udara dan laju
pengadukan disesuaikan untuk menjaga kondisi sepenuhnya
aerobik. Inokulasi dilakukan dengan S. cerevisiae CEN.PK
113-7D sel dipanen pada steady state dalam chemostat
terbatas glukosa pada D=0,16h-1 untuk BGCG, atau dalam
chemostat terbatas glukosa pada D=0,16h-1 dengan oleat
sebagai co-substrat pada D=0,0073h-1 untuk BGCGO dan
BGOCGO

22. Kultur fed-batch dilakukan dalam 5 L
bioreaktor B DCU B.Braun dengan
volume kerja 3 L, dikelola dengan
software MFCS/win 2.0. Suhu diatur
pada 30°C dan pH pada 4.0 dengan
penambahan 14% (v/v) larutan NH3.
Inokulasi dilakukan pada piring YPD
dari S. cerevisiae CEN.PK 113-7D.