1. Univerzitet u Tuzli
Prirodno-matematički fakultet
Primijenjena biologija
Seminarski rad iz predmeta Genetičko inženjerstvo i biotehnologija
Genska terapija kancera
Mentor: Dr.sc. Vesna Hadžiavdić, vanr.prof Student: Melisa Kadrić
Tuzla, 11.2017
Sadržaj
2. 1. UVOD.......................................................................................................................................................2
2. RAZRADA TEME.......................................................................................................................................3
2.1 Osnove genske terapije......................................................................................................................3
2.2 Funkcionisanje genske terapije..........................................................................................................5
2.3 Prve eksperimentalne genske terapije...............................................................................................6
2.4 Vektori na bazi RNK virusa...............................................................................................................10
2.4.1 Adenovirusi kao vektori............................................................................................................12
2.4.2 Neviralni vektori .......................................................................................................................14
2.5 Genska terapija kancera..................................................................................................................15
2.5.1 Kliničke studije danas................................................................................................................18
2.5.2 Genska terapija i leukemija.......................................................................................................20
2.5.4 Genska terapija u liječenju agresivnog ne-Hodkinovog limfoma..............................................21
2.5.5 Genska terapija raka prostate...................................................................................................21
2.6 Argumenti koji favoriziraju primjenu genske terapije......................................................................21
2.7 Problemi primjene genske terapije..................................................................................................22
3. SAŽETAK.................................................................................................................................................24
4. LITERATURA...........................................................................................................................................24
1. UVOD
U našem svakodnevnom okruženju, primjećujemo veliki broj ljudi sa različitim
karakteristikama. Sve individuelne karakteristike koje ovi ljudi nose su
determinirane njihovim genetičkim kodom. Prilikom začeća, svako od njih primi
3. 46 hromosoma (po 23 od oba roditelja) koji sadrže gene koji kodiraju za njihov
izgled, različite aspekte ličnosti te za njihovo buduće zdravlje. Geni su aranžirani
na nivou 46 hromosoma i locirani u svakoj ćeliji. Ćelija tako predstavlja osnovnu
jedinicu organizma, a geni se mogu smatrati biološkim programom života. Drugim
riječima, ako na individualnom genu postoji greška, ova greška može dovesti i do
razvoja bolesti. Pravu revoluciju u genetici napravili su svojevremeno Watson i
Crick koji su otkrili strukturu DNK. 1970 godine, istraživači su izolirali gene iz
DNK i tada je započeo razvoj «gen splicing» tehnologije. Geni pri tome imaju
ulogu “bluprinta” za sintezu specifičnih enzima i proteina. Svaki individualni gen
je sastavljen od DNK koja nosi sve nasljedne informacije za jednu individuu. Do
nedavno, ovakav genetički sadržaj je u potpunosti bio prirodno kontroliran. Brzi
razvoj molekularne te celularne biologije je ne samo doprinio našem razumijevanju
molekularne osnove oboljenja već je ukazao i na tehnologije koje se mogu koristiti
prilikom manipulacije gena in vivo. Imajući u vidu činjenicu da veliki broj
oboljenja kod ljudi bivaju izazvani nasljednim ili stečenim abnormalnostima u
ekspresiji i regulaciji ekspresije gena, kao posljednji izum naučnika, pojavila se
genska terapija. Želja naučnika je bila da se obrne patogeni proces na mjestu
njegovog nastanka,polazeći od pretpostavke da će funkcionalni geni, kada se ubace
u ćelije, biti u stanju pozitivno djelovati na ćelijsku funkciju i proizvesti željeni
genski produkt, na taj način kompenzirajući za genetičke nedostatke. Ovo će
predstavljati osnov za liječenje obolenja.U definicijskom smislu dakle, genska
terapija se odnosi na korekciju ili prevenciju oboljenja putem dodavanja ili
ekspresije genetičkog materijala koji koriguje za nedostajuće ili aberantne genetske
funkcije ili pak interferira sa procesom izazivanja oboljenja. Veliki broj naučnika
danas za ovu tehniku koristi termin transfer gena umjesto genska terapija, sa
jasnom željom da ukaže na činjenicu da transfer gena u principu ne mora da
implicira i terapeutske efekte.
Ranih osamdesetih godina ideja genske terapije je započela u svijetu medicine i
dovela je do naglih uspjeha na nivou genetičkih istraživanja. I upravo uspjeh
genske terapije na ovom polju je doveo do razmišljanja o potencijalu korištenja
ove tehnologije u tretmanu mnogih oboljenja poput kancera, recimo, za koji se
dugo znalo da se javlja zbog abnormalne ekspresije i regulacije gena. Potencijal
ove tehnologije je veliki jer kod korištenja hemoterapije dolazi do ispoljavanja
značajnih i po život ugrožavajućih nus efekata koje znatno ograničavaju
hemoterapeutske doze, pa prema tome, i postignute terapeutske efekte. Za razliku
od konvencionalnih tehnika, genska terapija kod kancera implicira ciljanje na
kancer ćelije, ima manje toksične efekte i znatno veći potencijal kod zaliječenja.
4. 2. RAZRADA TEME
2.1 Osnove genske terapije
U prvoj fazi ispitivanja nastanka jednog oboljenja, uvijek je potrebno detektovati
gene odgovorne za oboljenje ili karakteristike individue. Uz korištenje tehnike
genetičkog testiranja,danas je moguće detektovati da li jedna individua nosi
potencijal za razvojem određeno goboljenja u toku svog života te moguće je vezati
bolest za specifičan gen, za specifični hromosomi gen. To znači da se ovaj novi gen
tzv. transfer gen može ukloniti cijepanjem DNK na specifičnim lokacijama i to u
procesu koji se zove gene splicing. Ovaj gen se potom ubaci uretrovirus (oštećen u
smislu funkcije)- vektor koji je odabran zato što će inficirati ćelije koje
trebaizmijeniti i tako izmjeniti i genetički “make up” individue. Retrovirus inficira
ove ćelije iprocesuira stare gene ćelija, zajedno sa novim genima. Putem
integriranja, ova dva tipa gena moguće je da nova kopija gena preuzme prioritet u
odabranim ćelijama. Ove ćelije se potom selektiraju izvan tijela, dozvoli im se
multipliciranje i kao takve se ponovo ubacuju u tijelo pacijenta. Pretpostavka je da
ćelije sa novim oblikom gena preuzimaju organizam sve dok nepreostanu samo
ćelije sa izmijenjenim genima.Iako je to još uvijek spekulativno, ovaj se proces
roditelji mogu potencijano iskoristiti udetekciji genetičke budućnosti njihove
nerođene djece i nakon genetičkog “make up”-a nakonrođenja. Medicinska znanost
je uznapredovala do te mjere da roditelji mogu izabrati kakve karakteristike žele da
ima njihovo potomstvo, a isto tako i mogu izbjeći veliki broj oboljenja, kako
spostvenih, tako i kod djece.
5. Slika br.1 Mogućnost somatskog kloniranja
Čak će biti moguće izmjeniti i kozmetičke crte ljudi poput očiju, kose, boje kože
kao i građe. Nasljedna oboljenja se tako potencijalno mogu ukloniti iz cijele
familijarne loze samo jednim procesom genske terapije na nivou starije
generacije.Drugim riječima, to znači da se proces mora pažljivo posmatrati zato što
dozvoljava i otvara mogućnost genetičke proizvodnje te daje priliku kreiranja linija
individua bez oboljenja, bez neželjenih osobina i sa poželjnim izgledom. S tim u
vezi pojavljuje se veliki broj pravnih, etičkih i mnogih drugih pitanja na koja treba
dati adekvatne odgovore. Pri tome će genska terapija vjerovatno predstavljati
revolucionarni korak, zahvaljujući mogućnosti isporuke gena u ćelije pacijenta, što
potencijalno može izliječiti ili bar olakšati jedan veliki broj oboljenja, od kojih su
mnoga bila rezistentna na dosadašnje tretman. Ako je ovo u ovom trenutku
nepojmljivo, treba uzeti u obzir samo činjenicu da se svaka bolest javlja
djelomično i zbog toga što jedan ili više gena ne funkcionira na adekvatan način.
Defektivni gen uzrokuju čine da ćelije sintetiziraju pogrešne količine proteina ili
njihove aberantne forme.
Gen terapija se može koristiti i kod ljudi koji imaju oboljenja: bilo ona koja su
izazvana defektom na razini samo jednog gena i to tako što se zamijeni defektivni
6. gen sa normalnim genom ili kada su u pitanju kompleksnija oboljenja, poput
različitih vrsta kancera . U ovom slučaju, u proces kancerogeneze uključeno je više
gena i faktori ambijenta. Preko 4000 stanja, poput SCID i cistične fibroze, izazvani
su urođenim oštećenjem na nivou jednog gena Veliki broj drugih, poput kancera,
srčanih obolenja, AIDS-a, atritisa i senilnosti, javljaju se, na izvjestan način, uslijed
pogreški na nivou jednog ili više gena koji su ključeni u odbrambeni odgovor
organizma. Ovakav odbrambeni odgovor, koji zahtijeva genetički specificirane
proteine uključuje, ne samo imuni sistem, već i mehanizme za održanje
organizama. Ćelije jetre tako produciraju proteine koji pomažu u pročišćavanju
holesterola iz krvi. Ako imperfekcije na nivou ovog gena za proteine vode
redukciji gustine ili efikasnosti tog proteina, rezultat u tom slučaju mogu biti
visoke koncentracije holesterola, ateroskleroza te nastanak srčanih oboljenja. Naše
današnje razumijevanje mehanizma nastanka velikog broja oboljenja je još uvijek
dosta spekulativno, ali će vremenom ta znanja porasti do ogromnih srazmjera. Ovo
posebno argumentira činjenica da je ljudski genom projekt rezultirao otkrićem
hromosomskih lokacija i dijelova DNK koda kod 99 % aktivnih gena. Danas se
uveliko radi na otkrivanju funkcije svakog gena i taj proces će ići jako brzo, a sa
njim i mogućnost identifikacije gena koji ne funkcioniraju dobro u okviru
«normalnosti» kod različitih oboljenja.
2.2 Funkcionisanje genske terapije
Vektori služe za isporuku terapeutskih gena u ćelije pacijenta. Onog trena kada se
nađu u stanici, moraju korektno funkcionirati. Organizam pacijenata može odbiti
tretman, a postoji elementarna potreba za reguliranjem genske ekspresije. Pokazalo
se da korištenje virusa prestavlja efikasan način inkapsuliranja i isporuke njihovih
gena humanim ćelijama na patogeni način. Naučnici tako manipuliraju njihovim
genomom. Da bi se korektni geni isporučili ćelijama, istraživači su razvili više
metoda za transport genetičkog materijala. Najefektivnija tehnika koristi
modificirane viruse kao takve prenosioce. Virusi su djelomično dobri i s toga što su
u stanju da prirodno penetriraju u ćelije i tako ubace genetički materijal koji sadrže
u ćelije domaćina. No, prije nego li se oni iskoriste u terapiji, geni koji kodiraju
sintezu proteina koje virusi koriste u reprodukciji i koji izazivaju bolest se moraju
ukloniti. Kada se oni zamijene korektivnim genima, dobije se sistem isporuke koji
je identičan originalnom vanjskom virusu i koji može transportirati korisne gene u
stanice, ali ne može izazvati obolenje. Ljekari mogu aplicirati gensku terapiju na
više načina. Oni mogu ubaciti zdravu kopiju gena u ćelije pacijenta(u svrhe
kompenziranja za defektan gen).Geni pri tome ne moraju uvijek fitovati u
hromosome pacijenta da bi bili od pomoći, jednostavno moraju opstati i dovesti do
pojave terapeutskog nivoa specificiranog proteina. Oni također mogu ubaciti
djelomično izmijenjen gen da bi dali ćelijama nove osobine te konačno mogu i
7. isporučiti gen da bi prevenirali određena medicinska stanja. Umjesto da čekaju da
se kod žene koja je podložna razvoju kancera dojke razvije tumor i da oboli, ljekari
je mogu zaštititi od obolijevanja apliciranjem tzv. protektivnih gena.
2.3 Prve eksperimentalne genske terapije
Genska tearpija predstavlja ubacivanje (inserciju) genetičkog materijala u stanice u
smislu prevencije odnosno liječenja oboljenja. Nasljedna oboljenja, uključujući
cističnu fibrozu, hemofiliju, srpastu anemiju ili i Fanconi anemiju, hronično
granulomatozno obolenje, Gausherovu kombibiranu imunodeficitarnost te veliki
broj drugih oboljenja su ciljevi za tretman na nivou genske terapije. Hronična
infektivna oboljenja, kancer, dijabetes, te autoimuna oboljenja, mogu biti
kontrolirana ili barem djelomično kompenzirana putem genske terapije. Istraživači
sa US Nacionalnog instituta zdravlja su 1990. obavili prvu aplikativnu proceduru
genske terapije na djevojčici staroj 4 godine. Djevojčica je rođen sa ozbiljnom
urođenom manom (SCID). Nedostajao joj je zdravi imunološki sistem i bila je
podložan djelovanju svake žive bakterije. Djeca sa ovim oboljenjem često su
podložna infekcijama i rijetko preživljavaju do zrelih godina. Za njih su čak i
dječije bolesti, poput boginja, ugrožavajuće po život. Ona se pokušavala boriti sa
ovom bolešću, izbjegavajući kontakt sa ljudima izvan svoje porodice, ostajući u
sterilnom ambijentu svog doma i prevenirajući često obolijevanje masivnom
dozom antibiotika. U postupku provođenja procedure genske terapije, ljekari su
uzeli leukocite iz organizma djeteta, kultivirali stanice u laboratoriji i u njih
inkorporirali gen koji nedostaje modificirane krvne stanice unijeli u krvotok
pacijenta. Laboratorijski rezultati su pokazali da je ova vrsta terapije pojačala
imunološki sistem; djevojčica više nije imala stalne prehlade, bilo joj je dozvoljeno
da ide u školu i čak je i imunizirana protiv kašlja. Ova procedura nije klasičan
tretman, jer tretirani leukociti genetski funkcioniraju tako samo par mjeseci i ovaj
proces injiciranja se mora ponavljati u tom intervalu. Iako opis ovog slučaja ima
sretan kraj, on predstavlja malo više od optimističkog poglavlja u ovoj dužoj priči.
Naime, biologija humane genske terapije je veoma kompleksna i postoji veliki broj
tehnika koje se moraju razviti, te a liječena oboljenja treba razumjeti da bi se
mogla znatno efikasnije koristiti genska terapija. U vezi s tim se nameću i neki
etički, pravni i drugi problemi. Ovdje treba postaviti jasnu razliku između terapije
na nivou somatskih (nereproduktivnih stanica) i reproduktivnih stanica individue.
Samo germinativne stanice nose gene koji će se proslijediti na buduće generacije.
Mnogi kritičari protokola genske terapije bune se protiv genetičkih manipulacija,
bez obzira koja je pozadina iza toga. Veliki broj drugih su saglasni sa primjenom
terapije somatskih ćelija, ali se ne usuđuju predložiti ili, pak, raditi na
germinacijskoj linijskoj terapiji iako je ona znatno teža za genske manipulacje.
Genska terapija se,teorijski, može raditi ciljano na somatskim i spolnim stanicama.
8. Slika br.2 Transfer gena in vivo i ex vivo
Kod somatske genske terapije, genom recipijenta je izmijenjen, ali se izvršene
promjene ne prenose na slijedeće generacije. Drugim riječima, na ovu vrstu
terapije se gleda dijametralno suprotno u odnosu na ovu drugu, čiji je cilj
prenošenje promjena na potomstvo. U principu, postoje tri kategorije genske
terapije somatskim ćelijama. Najpoznatija tehnika je poznata pod imenom «ex
vivo» tehnika. Zasniva se na uklanjanju stanica sa defektivnim genima kod
pacijenata koji se podvrgavaju terapiji i davanju normalnih kopija aficirane DNK .
Ova terapija je najčešće ciljana na eritrocite jer veliki broj genetičkih oštećenja
dovodi do promjene funkcije jednog ili drugog tipa ovih stanica. Eritrociti su
također jako pogodni zato što ih je najlakše ukloniti, ali također i vratiti u
organizam. Eritrociti imaju ograničeno vrijeme poluraspada.Drugim riječima, to
znači da korigirane stanice nestaju polagano tako da su pacijentima potrebni
periodični tretmani. Primjena genske terapije u budućnosti će vjerovatno biti
vezana za stanice koštane srži. U ove svrhe potrebno je imati dotok nezrelih stanica
iz kojih će se razvit širok dijapazon krvih stanica i koje će po potrebi biti u stanju
zamijeniti aficirane krvne stanice. Stem stanice su idealne za gensku terapiju jer su
praktično besmrtne; opstaju onoliko dugo koliko pacijent živi. Drugim riječima,
prema tome znači da one, predstavljaju permanentan rezervoar za insertirani gen.
9. Iako su naučnici bili u stanju dobiti stem stanice iz ljudske koštane srži, imaju
problema sa ubacivanjem ovih gena u eluzivne stanice kao i sa njihovom
indukcijom u cilju produkcije velikog broja krvnih stanica u organizmu. No,
pomaci su ipak evidentni. Nedavno, je tim naučnika, predvođen Donald B.Kohnom
iz LA, objavio da su tri novorođenčeta oboljela od SCID kojima su bili ubačeni
geni u njihove stem stanice sada djeca koja dobro napreduju. Njihovi eritrociti
produciraju kritični enzim koji im je nedostajao prilikom rođenja. Uslijed činjenice
da oni brzo rastu, zaključuje se da su njihove stem stanice veoma aktivne. Kod
starijih ljudi, stem stanice produciraju nove stanice znatno sporije. No, problem se
riješava činjenicom da se sada mogu izolirati takvi spojevi koje organizam sam po
sebi može koristiti za izazivanje ćelijske diobe. Za očekivati je da će se za par
godina ovaj problem sa stem ćelijama riješiti. Druga relativno dobro razvijena
tehnika somatske genske terapije je tehnika in situ. Kod ove tehnike, nosači
korektivnog gena se ubacuju direktno u tkivo gdje se geni pidiraju. Ova procedura
ima smisla kada je stanje lokalizirano, ali ne može korigirati sistemske poremećaje.
In situ tretman se razmatra za veći broj oboljenja. Primjeri ovakvog pristupa su
infuzija adenoviralnih vektora u traheje i bronhije kod pacijenata sa cističnom
fibrozom, injiciranje vektora koji nosi gen za citokin ili toksin u tumorsku masu ili,
pak, injiciranje vektora koji sadrži distrofin gen direktno u mišić pacijenta sa
mišićnom distrofijom. In situ terapija je još uvijek problematična uslijed
nedostatnih pravih i efektivnih puteva implantacije korigovanih gena u različite
organe. Čak što više i ono što je karakteristično za ex vivo terapiju , geni u svim
situacijama ne kodiraju dobru sintezu proteina. Također, izmijenjene stanice su
rijetko besmrtne, tako da korisni geni nestaju kada stanice u kojih su oni ugrađeni
umru. I konačno i kod terapije in vivo kao i kod in situ terapije, jednom kada geni
dospiju u stanice, oni se mogu ubaciti slučajnim odabirom u DNK i hromosome.
Takva insercija može biti potpuno bezazlena, no ponekad može imati i ozbiljne
posljedice. Ako korektivni geni djeluju na disrupciju tumor supresor gena, koji
normalno štite organizam od kancera, onda može doći i do razvoja kancera. Treća
vrsta tretmana poznata kao in «vivo tretman» ili tretman u živom organizmu još
uvijek ne postoji, ali zasigurno će biti terapija budućnosti. Kod njene primjene,
vektor bi se morao injicirati direktno u krvotok na sličan način kako se danas daje
veliki broj lijekova. Kada jednom dospiju u organizam, ovi nosači će biti u stanju
pronaći svoje ciljane stanice, a (ignorirat će druge tipove) i tako će doći do
efikasnog i sigurnog prebacivanja genetičkih informacija. Ne postoji klinički
primjeri za ovu treću kategoriju, ali ako se od ove tehnike želi da postane važna
terapeutska opcija, onda će se morati razmišljati o razvoju in vivo injektabilnih
vektora. Germinacijska linijska terapija tehnički se teže izvodi i postavlja veliki
broj etičkih izazova. Dva osnovna pristupa dominiraju kod apliciranja ove vrste
genske terapije i to: 1) tretman preembrija nosi značajan enzimatski defekt prije
10. implantacije u majku ( ovo se radi uz korištenje tehnika in vitro fertilizacije) ili pak
tretman ćelija sperme ili jajnih ćelija afektiranih odraslih osoba tako da njihovi
genetički defekti se ne prebacuju na potomstvo. Ovaj pristup zahtjeva tehničku
ekspertizu u cilju delecije defektnog gena ili ubacivanja odgovarajuće genske
zamjene. Pri tome se ne smije zabuniti i povezati kloniranje sa genskom terapijom.
Kloniranje znači stvaranje drugog biološkog sistema sa esencijalno istim
genetskim make –upom.
Slika br.3 Germline genska terapija
11. Slika br.4 Somatska genska terapija
2.4 Vektori na bazi RNK virusa
Retrovirusi su inicijalno bili odabrani kao gen transfer vehikule koje najviše
obećavaju. Danas oko 60 % odobrenih protokola je zasnovano na primjeni
retroviralnih vektora. Ovi RNK virusi mogu doprinijeti efikasnom transferu gena u
veliki broj stanica i mogu se stabilno integrirati u ćelijski genom domaćina,
obezbjeđujući mogućnost dugotrajnije ekspresije. Posjeduju minimalan rizik jer
retrovirusi su se razvili u relativno nepatogene parazite postoje izuzeci poput HIV
virusa i humanih T limfotropnih virusa (HTLV). Vrlo često se murin leukemija
virus koristi kao vektor, u protokolima genske terapije, a razvijen je veliki broj
sistema pakiranja koji zatvaraju vektorski genom u sklopu virusnih čestica. Vektori
sami po sebi imaju uklonjene viralne gene, potpuno su replikacijski defektni i
mogu akceptirati do 8 kilobaza egzogene DNK. Problemi sa kojima se istraživači
suočavaju kod razvoja djelotvornih retroviralnih vektora u tretmanu bolesti mogu
se grupirati u četiri osnovna tipa: realizacija efikasnog transfera, transdukcija
stanica koje se ne razmnožavaju , održavanje dugotrajne genske ekspresije te
razvoj efektivnih puteva proizvodnje jeftinih vektora. Klinički protokoli sa
retroviralnim vektorima uglavnom koriste ex vivo pristup. Ćelije koje su
transducirane putem retroviralnih vektora posjeduju visok stupanj prirodnih MuLv
(amfotropnih) receptora, a koji se dijele u vrijeme izlaganja vektoru. Najveći broj
stanica koje rastu in vitro mogu biti transducirane, iako par ćelijskih tipova ne
podliježe ovom procesu. Važna ciljana ćelija je primitivna hematopoetska stem
12. ćelija, jer genski transfer u ove ćelije rezultira pojavom genetski inženjeriranih
ćelija u toku životnog vijeka recipienta. HCS imaju nizak nivo amfotropnog
receptora i odlikuju se lošom transdukcijom. Veliki broj tipova ćelija koje
posjeduju amfotropni receptor, poznat pod imenom fosfatni simport, ograničava
ciljanu specifičnu koristi prilikom korištenja ovih vektora u tretmanu in vivo.
Ovdje se do sada uglavnom radilo na pokušajima konstruiranja prirodnih
retroviralnih omotača proteina. Ovi proteini imaju dvije funkcije:
(1) Vežu se za receptor i to na površini ciljane stanice, tako da se SU/TM kompleks
podvrgava konformacijskim promjenama koje dozvoljavaju fuziju viralnih i
staničnih membrana, nakon koje slijedi
(2) ulazak u viralni omotač koji nosi specifičnu genetičku informaciju virusa u
citoplazmu ciljane ćelije. Ipak, činjenica je genski transfer ovim putem nije dao
očekivane rezultate.
Razlog za to leži u strukturi retroviralnog omotača proteina koji je po svojoj
strukturi trimer sa vrlo kompleksnom kvaternarnom strukturom. Kada se ovaj
prirodni receptor vezujući domen zamijeni sa stranom sekvencom, mijenja se
kompletna struktura proteinskog omotača. Rezultat je da se prirodna
konformacijska promjena koja dovodi do fuzije virusa sa staničnom membranom u
stvari ne događa. Bez fuzije, genski transfer postaje neefikasan.
Slika br.5 Mogući vektori u genskoj terapiji
13. 2.4.1 Adenovirusi kao vektori
Adenovirusi predstavljaju velike strukture bez omotača, koje su domaćini
dvolančane DNK. Njihov genom je znatno veći (oko 35 kB) i znatno kompleksniji
nego onaj od retrovirusa. U najvećem broju slučajeva, samo mali njegov dio se
odstranjuje prilikom konstruiranja adenovirus asociranih vektora. Nakon
inficiranja ćelije, adenoviralna DNK postaje lokalizirana u nukleusu i ne integrira
se u DNK domaćina. Obično injiciranje putem adenovirusa «divljeg» tipa se
asocira sa blagim kliničkim simptomima kod ljudi. Kao potencijalni vektori koji se
koriste u genskoj terapiji, adenovirusi pokazuju i dobre i loše strane. Tako imaju
sposobnost da efikasno inficiraju ćelije koje se ne dijele te pokazuju ekspresiju
velikih količina željenih genskih produkata. No, činjenica da nisu u stanju da se
integriraju u domaćina, općenito znači da je njihovo preživljenje, a samim tim i
trajanje genske ekspresije dosta ograničeno. Takvi vektori koji nose različite
marker gene (geni čiji produkt ekspresije se lako detektuje) su injicirani
životinjama. Ekspresija ovih gena je detektovana na nivou raznih tkiva ,
uključujući srce, jetru, mišiće, koštanu srž, CNS, endotelne ćelije. Trajanje
ekspresije ovih gena je bilo od par nedjelja do nekoliko mjeseci. I dok takva
kratkotrajna ekspresija gena može biti prikladna za neke protokole koji se koriste u
genskoj terapiji, manje se može koristiti u terapiji genetskih obolenja gdje je
potrebno imati dugotrajnu ekspresiju. Ovo bi se u teoriji moglo postići
ponovljenim davanjem adenoviralnih vektora. Adenovirusi izazivaju jaki imuni
odgovor koji limitira efikasnost ponovljenog administriranja.
Slika br.6 Adenovirus vektor
Druge vrste vektora koji se mogu svrstati u kategoriju viralnih vektora su
adenoasocirani virusi i herpes virus. Adenoasocirani virus je veoma mali ,
14. jednolančani virus čiji genom se sastoji iz samo dva gena. Ne može se replicirati
autosomno ili ,pak, to može činiti ali samo u prisustvu koinficirajućeg adenovirusa.
(ili nekog drugog odabranog virusa). Iako se pronalazi u ljudskoj populaciji, ne
asocira se ni sa jednim poznatim oboljenjem. Dakle, samo mali geni se mogu
ubaciti u adenoasocirane viralne vektor sisteme. Ti sistemi omogućavaju transfer u
nedijeleće ćelije. Također olakšavaju dugotrajnu ekspesiju transferiranog
genetskog materijala. Kod transfera posredovanih adeno asociranim virusima,
nukleinske kiseline su integrirane u genom ćelije recipijenta.
Herpes simplex virus predstavlja drugi potencijalni vektor sistem koji ima sve veći
značaj. HSV je neurotropni virus, i kao takav može biti jako koristan prilikom
isporuke gena u periferni i centralni nervni sistem. Nakon infekcije, HSV ostaje
latentan u nedjelećim neuronima sa svojim genomom koji ostaje u neintegriranoj
formi. Do sada je bilo nemoguće generirati replikacijski nekompetentnu, ali još
uvijek viabilnu herpes simplex česticu. No, neki od replikacijski nekompetentnih
virusa će ipak zadržati sposobnost da oštete tj. unište ćelije koje inficiraju. I dok
herpes simplex virusi se mogu pokazati korisnim u genskoj terapiji kad tad,
odgovarajuće i sigurne varijante HSV se moraju prije toga kreirati i testirati. U
upotrebi je i sindbis virus, koji pripada alfavirus familiji. Radi se o jednolančanom
RNK virusu koji može inficirati veliki broj insekata i vertebrata. Zrele virion
čestice su sastavljene od RNK genoma koji je kompleksiran sa kapsidnim
proteinom C. Ovaj je okružen lipidnim dvoslojem u koji su uronjena dodatna dva
viralna proteina E1 i E2. E2 polipeptid pomaže u viralnom vezivanju na površinske
receptore podložnih ćelija (osnovni površinski receptor na koji se cilja je visoko
konzerviran, široko distribuirani laminin receptor). Sindbis virus je u stanju da
inficira nedjeleće ćelije i općenito podržava visok nivo ekspresije gena. Također
pokazuje i visok raspon prepoznavanja različitih domaćina i prema tome nedostaje
mu nasljedna ciljana specifičnost koja je karakteristika idealiziranog viralnog
vektora. U upotrebi je također i rekombinantni sindbis virus koji se dobio
insercijom nukleotidne sekvencije koja kodira za IgG vezujući domen
Staphyloccocus aureus u E2 viralni gen. Oštećivanje E2 gena dovodi do toga da
njegovi proteinski produkti nisu u stanju da vezuju laminin. Ali protein A domen
dozvoljava himeričkom produktu E2 da vezuje monoklonalna antitijela. Ovaj virus
potencijalno može postati nulti vektor koji je potencijalno sposoban da cilja na bilo
koji tip ćelija. Rezultati studija koje koriste ovaj sistem su ohrabrujući, no
izmijenjeni virus (bez asociranih monoklonalnih antitijela) nije inficirao veći broj
ćelijskih linija. Putem inicijelne inkubacije sa monikolonalnim antitijelom
odgovarajuće specifičnosti, virusne čestice su bile u stanju da efikasno
transduciraju ćelije sa izraženom ekspresijom površinskih receptora poput CD4,
CD 33 te humanog leukocitnog antigena.(HLA). Pojava lentiviralnih vektora koji
15. se uglavnom izvode iz HIV tip I virusa, koncem devedesetih je otvorila mogućnost
manipulacije ćelija koje se nisu smatrale klasičnim ciljanim ćelijama za
retroviralnu gensku transfer tehnologiju. No, posljednjih godina ovi vektori
poprimaju sve veći značaj. Lentiviralni vektori postaju tako interesantni u tretmanu
nekih patologija koje je bilo nemoguće tretirati prije korištenjem adenoviralnih
vektora ili AAV izvedenih vektora. Primjer za to je lentiviralni transfer gena u
nervne ćelije in vivo koji je objavljen u izučavanju tretmana oboljenja CNS-a, sa
transferom Huntington proteina za produkciju modela Huntington oboljenja ili
lentiviralni transfer GDNF za tretman Parkinson oboljenja. Osnovna ograničenja
strategije sa lentiviralnim vektorima su široka produkcija i klinički razvoj. No, bez
obzira na izražene tehnološke probleme, neki od ćelijskih tipova poput
proliferirajućih T limfocita se mogu sa efikasnošću transducirati i odabrati uz
korištenje lentiviralnih ili MLV vektora. Prvi klinički pokus sa ovim tipom vektora
je 2001. godine objavilo savjetodavno tijelo za rekombinacije SAD-a.
2.4.2 Neviralni vektori
Najvažniji i najkorišteniji takav sistem je onaj koji koristi lipozom vezane
komplekse. Liposomi koji nastaju iz mješavine neutralnih i katjonskih lipida
(lipopleksi) mogu stvoriti stabilne vektore koji predstavljaju luku za DNK. Ova
DNK ulazi u interakciju sa katjonskim lipidima u unutarnjem dijelu lipofleksa što
za posljedicu ima stabilizirajući efekat po cijeli kompleks. Katjonski lipidi na
vanjskoj površini lipofleksa također stimuliraju interakcije lipozoma sa ciljanim
ćelijama. Iako lipozomi mogu tranficirati u kultivirane ćelije, efikasnost ovih
poduhvata je nekoliko puta manja od one koja se postiže od strane retroviralnih
vektora. Ekspresija gena koji se unesu na ovaj način je tranzitorna i isporučena
DNK normalno nije integrirana u ćelijski genom domaćina. Liposomi se sa druge
strane lako proizvedu, netoksični su, imaju nisku imunogeničnost. Ova
karakteristika ih čini osobito privlačnim vektorima koji se mogu koristiti kod
ponovljenih administriranja pacijentima. Altternativni neviralni put isporuke
podrazumijeva stvaranje kompleksa koji se sastoje od nukleinskih kiselina i
nelipidnih molekula. Sintetički polilizin zasnovani polipeptidi stvaraju stabilne
komplekse sa DNK i takvi kompleksi su u stanju da uđu u ćelije procesom
endocitoze. Inkluzija dodatnih biomolekula u ovim kompleksima može pomoći u
procesu ciljanja na površini specifičnih ćelija. Činjenica je također da ćelije mogu
biti u stanju da preuzmu i izvrše ekspresiju tzv. ogoljene DNK. Eksperimenti
vezani za načine direktne isporuke ćelijama će se nastaviti i dalje u budućnosti.
16. Slika br.7 Konstrukcija lipopleksa
2.5 Genska terapija kancera
Do danas većina pokušaja primjene genske terapije ne vezuje se za urođena
genetička oboljenja već za kancer. Godišnje se samo u SAD pojavi 1,4 milion
slučajeva kancera. Preživljavanje pacijenata nakon primjene nekih od standardnih
protokola u tretmanu (hirurški zahvati, kemoterapija) je na razini od oko 50%.
Gubitak kontrole rasta i pojava metastaza predstavljaju dvije osnovne
karakteristike malignih tumora. I dok se primarni tumori daju lako odstraniti
hirurškim zahvatom, tumori sa metastazama se teško tretiraju i predstavljaju
osnovni uzrok smrtnosti. Teorijski je dovoljno da postoji samo jedna kancer ćelija
da bi se pojavio tumor. S toga, sposobnost terapeutske strategije da cilja na tumor
sa metastazama te da eliminira 100% kancer ćelija bi trebala da predstavlja cilj
terapeutske strategije za kancer.
Početni pokusi u korištenju genske terapije u tretmanu odnosno liječenju kancera
su započeli 1991. godine. Većina tada primjenjivih pristupa se zasnivala na nekom
od slijedećih protokola:
* modifikacija limfocita da bi se stimulirala antitumorska aktivnost,
17. * modifikacija tumorskih ćelija u svrhe podsticanja imunogeničnosti,
* insercija tumor supresor gena u tumorske ćelije,
* insercija toksin gena u tumorske ćelije da bi se stimulirala destrukcija
tumorskih ćelija,
* ubacivanje gena samoubica u tumorske ćelije,
* ubacivanje gena rezistencije na lijekove u stem ćelije u svrhe zaštite istih od
šteta nastalih kao posljedica hemoterapije,
* ubacivanje antisense gena u tumorske ćelije čime se kontrira ekspresija
onkogena u istim i pored toga, mora se konstatirati da nema baš nekog
velikog napretka u genskoj terapiji uslijed više razloga i to: potrebno je
pronaći bolje ciljano specifične vektor sisteme, potrebno je bolje spoznati
kako kancer ćelije injiciraju nomalan imuni odgovor. Uslijed etičkih razloga,
najveći procenat tretiranih pacijenataje imao terminalni kancer (bez nade za
uspjeh prilikom korištenja konvencionalnih terapija).
Slika br.8 Vektori u genskoj terapiji kancera
Pretpostavka je da se kancer otkriven u ranijoj fazi lakše može trerirati na ovaj
18. način. Jedan od najstarijih pokusa prilikom primjene genske terapije u tretmanu
kancera je uključio ubacivanje TNF gena u tumor infiltrirajuće limfocite.
Pretpostavljalo se da TIL ćelije kada se ubace u tijelo mogu infiltrirati tumor. U
tom slučaju, TNF sinteza bi se javila na mjestu tumora, gdje je i potrebno da se
javi. Ovaj prisup je kasnije nešto proširen korištenjem gena koji kodiraju citokine
(IL2., IL-4., IFN-gama., GM-CSF) u TIL. Dakle, na ovaj način se ubace geni
citokina direktno u tumorske ćelije.
Pretpostavlja se da se na ovaj način može dobiti dobar i kvalitetan imuni odgovor,
postići ubijanje tumorskih ćelija kao i vakcinacija pacijenta protiv novih epizoda
bolesti. Do danas se ovi efekti uglavnom postižu putem uklanjanja ciljanih ćelija iz
tijela , njihovim kultiviranjem in vitro, ubacivanje željenog gena (uz korištenje
retroviralnih vektora), nakon koje slijedi ponovno ubacivanje, ali sada
izmijenjenog gena u tijelo. Alternativna antikancer strategija podrazumijeva
inserciju kopije tumor supresor gena u kancer ćelije. Nedostatak jednog takvog
genskog produkta P 53 je direktno impliciran kod različitih kancera kod ljudi. In
vitro eksperimenti su pokazali da insercija p 53 deficitarnih tumorskih ćelija
inducira smrt takvih ćelija. Loša strana ovakvog pristupa pristupa je da 100%
transformiranih ćelija trba uspješno tretirati da bi se kancer potpuno zaliječio.
Drugi pristup koji se pokazao i pokazuje uspješnim je ubacivanje tyv gena
osjetljivosti u tumorske ćelije. Ovaj genski produkt bi trebao dovesti do
ispoljavanja sposobnosti da se konvertira netoksični prolijek u toksičnu substancu
u samim čelijama uzrokujući njihovo uništenje.Ovaj se pristup koristi kod gena za
timidin kinazu kod herpes simplex virusa. Jedan od mogućih pristupa
podrazumijeva i ubacivanje gena u hematopoetske stem ćelije u svrhe zaštite ćelija
od toksičnih efekata hemoterapije. Najveći procenat lijekova za kancer pokazuje
toksične nusefekte, što često definira dozu. Zajednički efekat je razaranje stem
ćelija. Ako bi se ove ćelije zaštitile ili načinile rezistentnim na hemoterapeutski
agens, mogle bi se pacijentu dati i veće doze lijeka. Ovaj zaštitni efekat bi se
mogao postići korištenjem genskog produkta koji kodira višekratnu rezistenciju na
lijekove. Kancer ćelije postaju rezistentne na hemoterapiju. Funkcija ovog gena je
da ispumpava veliki broj kemoterapeutskih agensa (daunorubicin, taksol,
vinblastin, vinkristin) izvan ćelija. I zaista se pokazalo da ubacivanje MDR- 1 gena
u stem ćelije štiti iste od djelovanja velikih doza taksola. Ovaj pristup se upravo
sada koristi kod pacijenata koji primaju visoke doze hemotearpeutskih agensa za
veliki opseg kancer tipova, uključujući kancer dojke, ovarijalni kancer, te tumore
mozga.
19. Tumori koji se danas tretiraju u kliničkim pokusima genske terapije su različiti
tipovi kancera poput melanoma, neuroblastoma, kancer mozga, glave, vrata, pluća.
jetre, dojke, crijeva, prostate, mezoteliuma, leukemija, limfoma, multipl mijeloma.
Slika br.9 Funkcioniranje genske terapije kancera
2.5.1 Kliničke studije danas
Od velikog broja korištenih protokola, može se reći da samo jedan protokol se
nalazi u fazi III kliničkih istraživanja, a svi ostali su u fazi I i II. Kompanija
Genetic Therapy Inc/ Novartis vrši kliničke pokuse. Ciljano oboljenje je
glioblastoma multiforma, maligni tumor mozga. Riješenje je u ubacivanju gena
koji je sposoban da direktno ubija ćelije i to direktno u tumor dok su normalne
ćelije mozga zaštićene. Retroviralni vektor (G1TkSvNa) sadrži neomycin
rezistentni gen kao selektivni marker i herpes simplex gen za timidin kinazu.
Materijal koji se injicira u tumorsku masu je ćelijska kultura PA 317 koja generira
retroviralne čestice koje nose G1TkSvNa vektor. Jedine rastuće ćelije u sklopu
rastućeg tumora su tumorske ćelije i ćelije vaskulature (koje opskrbljuju tumor sa
krvlju). Pošto retroviralni vektori vrše transdukciju dijelećih ćelija, jedine ćelije
koje primaju vektor bi trebalo da budu tumorske ćelije i krvni sudovi. Viralni
HSTK može dodati fosfatnu grupu na nefosforilirani nukleozid, dok endogena
humana timidin kinaza to ne može. Kada se abnormalni nukleozid poput lijeka
ganciklovira da pacijentu, samo ćelije koje vrše ekspresiju HSTK gena će
20. fosforilirati lijek, inkorporirati ga u njihov sintetsku mehanizam za DNK i kao
takve biti ubijene,(uništene). U sadašnjoj fazi, mišje ćelije koje produciraju čestice
vektora koje nose HSTK gen bivaju inokulirane u reziduelni tumor i peritumorske
zone nakon resekcije tumora. Nakon toga, pacijent se tretira sa ganciklovirom.
Teoretski gledano, tumorske ćelije koje su transducirane sa vektorom koji sadrži
HSTK gen će fosforilirati ganciklovir, ganciklovir trifosfat potom blokira DNK
sintetsku mašineriju i ćelije bivaju uništene. Smatra se da su četiri mehanizma
odgovorna za smrt tumorskih ćelija. Prvi predstavlja direktni efekt fosforiliranog
ganciklovira na transducirane tumorske ćelije, drugi efekat je onaj u kojem toksični
agens (ganciklovir trifosfat) ulazi u susjedne ćelije, treći je lokalni inflamatorni
efekat izazvan injiciranjem mišjih ćelija, a četvrti je sistemski imuni odgovor.
Nekoliko pokusa u fazi II testiraju vektore genske terapije poput vakcina protiv
kancera ili AIDS-a. Prvi su pokusi za metastatske maligne melanome a drugi se
vezuju za skvamozni ćelijski karcinom glave i vrata. Ovdje se injicira HLA gen
poput B7 koji tumor ne ekspresira se injicira u tumorsku masu i ekspresija ovog
stranog antigena bi trebalo da stimulira imunološki sistem da reagira protiv
kancera. Dosadašnji rezultati pokazuju da imunološki sistem ne samo da razvija
odgovor protiv B7 antigena, već i protiv drugih ant na tumorskim ćelijama, što ima
za posljedicu imunološki napad na netransducirane tumorske ćelije. Kompanija
Viagen/Chiron radila je sa retroviralnim vektorom koji kodira za env i rev genske
segmente HIV-I IIIb); ovaj vektor se injicira intramuskularno u svrhe indukcije
cititoksičnog odgovora T ćelija. Činjenica je da je ključ uspjeha uspješne genske
terapije odgovarajući transfer terapeutskih gena u ćelije. Visoka efikasnost
transfekcije kao i selektivno i specifično ciljanje na kancer pod in vivo uslovima su
najvažniji tehnički zadaci koji se u ovom domenu moraju uspješno zadovoljiti.
Tehnologije kojima se raspolaže danas ne vode ka 100% efikasnosti transfekcije za
kancer ćelije pod in vivo uvjetima. Strategije koje su orijentirane prema supresiji
tumorskog fenotipa mogu se iskoristiti prilikom redukcije tumorskog opterećenja,
čak i kada se dobije 100% efikasnost prilikom transfekcije. Ex vivo transfer gena i
lokalna intratumorska injekcija mogu efektivno transferirati gen u specifičnu grupu
ćelija. No, sistemsko tumorski specifično ciljanje, od kojeg kod metastatskih
kancera direktno ovisi, treba nešto drugačiji pristup. Aktualnoi su pokušaji ciljanja
tumorskih ćelija preko tumor specifičnih ligand-ćelijska površina u receptor
interakciji i putem kontrole transgenske ekspresije u tumorskom tkivu od strane
tumor specifičnih promotera. U odnosu na druge strategije, imunomodulatorni
pristup koji dovodi do sistemskih antitumor efekata ima dobru stranu da cilja
tumor sa metastazama. I što na kraju reći o ovoj vrsti terapije? Zasigurno je da ona
ima čitav niz dobrih strana u odnosu na konvencionalnu kancer terapiju, posebno u
sferi efikasnosti i toksičnosti. No također, zasigurno na ovom polju postoje vrlo
21. izražena ograničenja, kao i kod najvećeg broja terapija za kancer. Ovaj se problem
i dodatno komplikuje jer malignitet sam po sebi je visoko kompleksan oblik
oboljenja, specijalno u slučaju najuznapredovalijih tumora i postaje jasno da
najveći broj kancera neće biti moguće tretirati uključujući jedinstven terapijski
pristup.
2.5.2 Genska terapija i leukemija
Naučnici su zabilježili prvi uspjeh novog pristupa u liječenju leukemije uz pomoć
genske terapije, koji podstiče pretvaranje krvnih zrnaca pacijenta u ulogu "ubice"
koje love i uništavaju ćelije kancera. Terapija je do sada isprobana tek na troje
pacijenata, ali rezultati su impresivni: kod dvoje pacijenata nema kancerogenih
ćelija, a od tretmana je prošlo godinu dana, dok je stanje trećeg pacijenta znatno
bolje, ali još ima kancerogenih ćelija. Naučnici se sada pripremaju da tehniku
genske terapije primjene i u liječenju drugih vrsta raka.
U istraživanje su bila uključena trojica muškaraca sa veoma uznapredovalim
slučajevima hronične limfocitne leukemije (HLL). Jedini tretman za takve
pacijente do sada je bilo liječenje presađivanjem koštane srži ili tretman matičnim
ćelijama, ali te metode liječenja ne uspevaju uvijek i nose veoma veliki rizik.
Naučnici su godinama pokušavali da pronađu način da poboljšaju "odgovor"
imunog sistema i podstaknu organizam da se efikasnije bori protiv raka. Dr Džun i
njegovi saradnici izmijenili su proceduru, unoseći izmjene na nivou gena koje su
dovele do toga da se T-ćelije pretvore u pravu "vojsku" koja je ubijala kancerogene
ćelije, pri tome se uspješno i razmnožavajući. Nove, tako dobijene T-ćelije
prepoznaju kancerogene ćelije, uništavaju ih i nastavljaju da uočavaju nove
kancerogene ćelije koje se pojave i bore se protiv njih. Do sada je bilo poznato da
T-ćelije napadaju viruse na ovaj način, ali ovo je prvi put da se to primenjuje kod
pacijenata koji imaju rak. Naučnici sada žele da istraže da li se metoda genske
terapije može primjeniti i na druge vrste kancera kao što su na primjer rak jajnika,
prostate i mozga.
2.5.3 Genska terapija u liječenju tumora mozga
Novi oblik genske terapije (Toca 511 & Toca FC) pokazuje obećavajuće rezultate u
borbi protiv rekurentnog karcinoma mozga, glioma, ukazuje nova studija. Naime,
tri godine nakon genske terapije, više od četvrtine pacijenata s gliomom bilo je još
živo. Srednje preživljavanje iznosilo je 14,4 mjeseca, što je značajno više od
prosječnog preživljavanja za gliom koje iznosi 8 mjeseci. Obzirom na smrtonosnu
prirodu ove bolesti, trogodišnje preživljavanje se rijetko bilježi kod rekurentnog
glioma.Također, treba istaknuti da je ova poboljšana stopa preživljavanja vidljiva
kod čitavog niza pacijenata, a ne samo u pacijenata sa specifičnim genskim
22. mutacijama. Smatra se da ovi rezultati ukazuju da mnogi pacijenti mogu imati
koristi od genske terapije. Gliom je vrsta tumora koja se javlja u mozgu i leđnoj
moždini. U gliome spadaju astrocitomi, oligodendrogliomi, meduloblastomi i
ependimomi. Mnogi gliomi infiltriraju moždano tkivo difuzno i nepravilno. Gliom
se javlja u 5 do 7 ljudi od 100.000.
2.5.4 Genska terapija u liječenju agresivnog ne-Hodkinovog limfoma
Izgleda da eksperimentalna genska terapija znana kao CAR-T stanična terapija,
može pomoći u liječenju agresivnog ne-Hodgkinovog limfoma, ukazuje nova
studija. Naime, pokazalo se da je genska terapija pomogla u liječenju jedne trećine
slučajeva limfoma za koje se smatralo da su neizlječivi. Jednako tako, u četiri od
pet pacijenata s agresivnim ne-Hodgkinovim limfomom uočeno je poboljšanje
stanja bolesti. Prema mišljenju stručnjaka, navedeni rezultati su izvanredni i vrlo
ohrabrujući. Što se ipak tiče nuspojava genske terapije, one su sveukupno gledajući
bile podnošljive. Inače, limfom je opći pojam za rak koji se razvija u limfnom
sustavu. Limfni sustav je dio imunološkog sustava, koji pomaže tijelu u borbi
protiv bolesti. Spomenuta genska terapija se bazira na promjeni T-stanica
imunološkog sustava. Naime, nakon modifikacije T-stanica, T-stanice sadrže gene
koji su učinkoviti u borbi protiv raka. T-limfociti se vraćaju pacijentu intravenozno,
te se zatim u njegovom tijelu umnožavaju.
2.5.5 Genska terapija raka prostate
Alternativni tretmani za rak prostate, jedan od najčešćih oblika raka kod
muškaraca, stalno se istražuje i razvija. Dok neke od tih novih pristupa ,
uključujući genske terapije, mogu imati budućnost, kao i sada, niko od njih nije se
pokazao potpuno sigurno i učinkovito. Rak prostate je vodeći raka među
muškarcima .
Prvi uspješni klinički test genske terapije, također pod nadimkom samoubojstvo
terapija , predvodio je dr. Peter T. Scardino u 1990 na Baylor College of Medicine
u Houstonu. Danas , samo nekoliko sveučilišnih laboratorija provodi to liječenje.
Stanice prostate su postale kancerogene zbog promjene gena unutar stanice. U
vrijeme genske terapije, virus se injektira u stanice raka, ostavljajući iza naziva gen
timidin kinaze, ili TK. Injektirani virusi neće putovati u druge dijelove tijela. On
neće zaraziti normalne stanice prostate, niti će zaraziti spermu.
2.6 Argumenti koji favoriziraju primjenu genske terapije
Svrha genske terapije je izmjena ekspresije nekih gena u pokušaju da se liječi,
tretira i eventulano prevenira oboljenje. Kod somatske terapije, genom recipijenta
je izmijenjen, ali se ova promjena ne prebacije na slijedeće generacije. Ranih
23. osamdesetih godina, fokus genske terapije se svodio na tretiranje obolenja koja su
izazvana defektima na nivou jednog gena (hemofilija, mišićna distrofija, srpasta
anemija). Ranih devedesetih, koncept genske terapije sveo se na tretman
određenog broja stečenih obolenja. No, ubrzo se spoznalo da vektori ne vrše
transfer gena dovoljno efikasno tako da ekspresija i korištenje terapeutskih gena
nije trajala jako dugo. O genskoj terapiji se na svu sreću ne smije razmišljati samo
u svrhe tretmana genetičkih oboljenja već i kao o alternativnom putu isporuke
proteina. Već danas terapeutika sa proteinima ima svoje važno mjesto; posebno ako
se radi o insulinu, hormonu rasta te eritropoetinu, svaki od kojih se mora često
injicirati u pacijenta. Sadašnji pristup genskoj terapiji želi da izbjegne ponavljanje
injekcije koje mogu biti i bolne, nepraktične i skupe. Jedna takva metoda koristi
novi adeno asocirani virus, organizam koji ne izaziva neko poznato oboljenje i ne
izaziva imuni odgovor kod pacijenta. Vektor se stacionirau ćelijama koje zatim
vrše ekspresiju korigiranog gena za proizvodnju proteina. Kod tretmana hemofilije,
vektor koji nosi gen treba biti injiciran u mišić, na taj način uzrokujući sintezu
faktora IX te tako prevenira krvarenje. U genskoj terapiji poput ove, ubačeni gen je
uvijek prisutan, tako da dolazi do stalne ekspresije proteina, posebno u slučajevima
gdje on nije prisutan. Wilson je opisao novu permutaciju u kojoj vektor sadrži
protein producirajući gen i predstavlja jednu vrstu molekularnog reostata koji će
reagirati na pilulu za regulaciju genske ekspresije.
2.7 Problemi primjene genske terapije
Protokoli za somatsku gensku terapiju se moraju potvrditi ,a tehnike koje se koriste
kod svakog protokola variraju. Slične tehnike se koriste i kod jednog i kod drugog
pristupa iako je ova druga vrsta znatno teže izvodiva. Prva takva terapija
somatskim ćelijama je koristila ubacivanje normalnog gena u DNK ćelija da bi se
iskompenziralo nefunkcioniranje defektnih gena. Ova tehnika uključuje dobivanje
zdravih eritrocita od osobe koja je aficirana genetičkim oboljenjem genopatijom i
potom ubacivanje normalnog gena u defektnu stanicu. Normalni gen se unosi uz
korištenje domesticiranog retrovirusa koji inficira stanice, te ubrizgavanjem sasvim
funkcionog gena. Retrovirusi mogu inficirati veliki broj tipova ćelija tako da je
važno razviti tehnike transfera gena koji dozvoljavaju samo retrovirusima da
transferiraju gene u stanice i da kao takvi ostanu u njima. Čak što više, novi gen ne
može dospjeti na pogrešno mjesto u genomu stanice. Kod cistične fibroze, kao
vektor se koristi nova vrsta virusa pod nazivom adenovirus. Kod drugih
proučavanja, nova DNK se ubrizgava direktno u stanice kože ili čak i u tumorske
stanice. Dobar progres je napravljen u pravcu potvrde da vektori mogu biti
domaćini za specifične tipove ćelija. No, istraživači su manje uspješni kada
kreiraju sisteme isporuke koji mogu efikasno unijeti njihov genski teret u ciljane
ćelije ili stimulacije imunološkog sistema te drugih odbrambenih mehanizama
24. pacijenta, koja treba da traje dovoljno dugo da bi oni stigli do svojih «destinacija».
Stalno prisutane pojave u vezi sa segmentima slučajno insertirane DNK je takoder
je problem sam po sebi. No, kao što je poznato već 2000. godine su počeli prvi
eksperimenti sa injicirajućim vektorima koji ciljaju na specifične ćelije. Ipak, bez
obzira na tehničke poteškoće koje se moraju prebroditi prije nego li genska terapija
u bilo kojem obliku postane rutina, uvijek su prisutni i finansijski problemi.
Slijedećih nekoliko godina, početni pokusi će biti izuzetno skupi i moći će se
izvoditi samo u velikim i bogatim centrima. Ali za razliku od nekih tehnika
(transplantacija gena), genska terapija će vremenom postati jednostavnija i manje
će koštati. Prvi klinički protokol vezan za korištenje genske terapije je bio opisan
1990 godine. Za samo 7,5 godina, više od 300 protokola je odobreno širom svijeta
i preko 3000 pacijenata u svom tijelu nose genetički modificirane ćelije. Zaključci
primjene ovolikog broja protokola se svode na nalaze da ova tehnika ima veliki
potencijal u tretmanu velikog broja ljudskih oboljenja te da procedura sama po sebi
nosi veoma nizak rizik za popratne reakcije. Međutim, efikasnost ekspresije
transferiranih gena je izuzetno niska. Drugim riječima, ne postoje evidencije da su
protokoli genske terapije uspješni u tretmanu humanih oboljenja. Zašto je to tako?
Odgovori na ovo pitanje leže u činjenici da postoje različiti oblici somatske genske
terapije koji se međusobno razlikuju po načinu nošenja gena u aficirano tkivo.
Imperativ ne treba razviti takvu tehniku koja će predstavljati efikasan i siguran put
unošenja « zdravih gena». No, čini se da je ovaj cilj znatno teže postići u kontekstu
očekivanja koja su naučnici imali prije pet godina. Čini se da se ljudska vrsta
milionima godina adaptirala u zaštiti od ambijentalnih faktora, uključujući i
inkorporiranje strane DNK u svoj genom. Virusi su djelomično uspješni u
prevazilaženju ovog problema. Najveći problem za ostvarivanje punog potencijala
razvoja genske terapije je siguran i efektivan način za ugradnju terapeutskog
agensa u unutrašnjost stanice. Najčešći pristup genskoj terapiji je vezan za
korištenje genetski konstruiranih virusa. Ovi viralni vektori mogu imati svoju
ekspresiju u ćelijama koje inficiraju. Nedavni sigurnosni problemi su ponovo
ukazali na problem nevirusnog pristupa genskoj terapiji. Neviralna metoda
uključuje umotavanje genetičkog materijala u liposome i generiranje DNK-protein
konjugata. Liposomi mogu inkorporirati velike molekule DNK, nisu infektivni i
lako se sa njima manipulira. Također nemaju sposobnost da ciljaju na specifične
tipove ćelija, tako da su medijatori transfera gena u samom mjestu isporuke i
najčešće dovode do relativno kratke ekspresije. Virusi sa druge strane su prirodno
podešeni za isporuku genetskog materijala ćelijama. Svaki viralni vektor ima i
svoje dobre i svoje loše strane, uzevši u obzir prijemćivost domaćina za virus,
tipove tkiva u koje može ući, veličinu DNK koju može nositi , stanje ćelija koje su
potrebne za ulazak virusa, veličinu strane DNK koju može unijeti, stanje ćelija
potrebnih za ulaz virusa i njegovu replikaciju, njegovu sposobnost da se integrira u
25. hromosom domaćina u kojem će dovesti do imunog odgovora i sl.
3. SAŽETAK
Genska terapija kancera uključuje mnoštvo različitih pristupa. Za razliku od genske
terapije nasljednih poremećaja, koja nije imala bogatija iskustva, ovaj terapijski
pristup u tretmanu kancera se sve češće primjenjuje, ali još uvijek najčešće na
nivou eksperimentalnog liječenja. Najčešći primjeri kancera koji se tretiraju
genskom terapijom su tumori mozga, rak dojke, debelog crijeva,
maligni melanomi, mijelogenska leukemija, neuroblastomi, mikrocelularni i
nemikrocelularni rak pluća, rak jajnika te razni čvrsti tumori.
Činjenica je da je genska terapija frekventnija u tretmanu kancera, nego nekih
drugih oboljenja istovremeno svjedoči o njihovoj letalnosti i ogromnim
investicijama u ovo područje. Tome se pridružuje i relativno jednostaviji pristup u
uništavanju ciljanih malignih stanica, vještački ili osposobljavanjem imunog
sistema za samoodbranu organizma. U nekoliko najpoznatijih slučajeva primjene
genske terapije ciljani su pojedinačni geni, kao što su (npr.) TP53 augmentacijska
terapija i aktivacija antisens KRAS gena u nekim slučajevima mikrocelularnog
kancera pluća. No, u najvećem broju slučajeva, pristupa se ciljanom uništavanju
ćelija raka, bez prethodnog poznavanja njegove molekularne etiologije.
Strategija genske terapije raka se, u principu, paralelno razvija u dva glavna
pravca.
Strategija redukcije tumora je motivirana činjenicom da brojni oblici genske, kao
ni bilo koje druge terapije raka, ne rezultiraju potpunim uništenjem ciljanih
tumorskih ćelija, diferencirajući ih od zdravog tkiva. Naprimjer,
genska terapija direktnog genskog transfera u tumorske stanice ne osigurava
potpunu (100%) uspješnost kao ni bilo koji drugi vid transformacije ćelija. Zbog
toga je ovaj pristup, u suštini, rafiniranje klasičnog tretmana u liječenju raka
(konvencionalne terapije i hirurškog uklanjanja), a ne novi, zasebni oblik liječenja.
Strategija eliminacije tumora teži ka potpunom uništavanju ćelija raka. Ako se, na
primjer, imuno–ćelije uspiju stimulirati na specifični imuni odgovor, onda je
moguće govoriti o potpunom izliječenju. Bez obzira na primijenjenu terapiju,
potpuna eliminacija ćelija raka je prava rijetkost, jer njegove ćelije rapidno
proliferiraju, uz selektivno preživljavanje onih najotpornijih. One se kasnije dijele i
postaju potpuno rezistentne na propisanu terapiju.
4. LITERATURA
