Šta je to genotoksičnost/mutagenost? Koje su to supstance koje imaju ove osobine i od čega zavisi njihova pojava? Koji su njihovi štetni uticaji? Koje su metode njihove identifikacije?

1. TEMA:
„Genotoksičnost i mutagenost“
Denis Križić, MA prehrambene tehnologije
Zenica, mart 2019.

2. O čemu ćemo govoriti...
• šta je to genotoksičnost/mutagenost,
• koje su to supstance koje imaju ove osobine i
od čega zavisi njihova pojava,
• o njihovim štetnim uticajima, te
• o metodama njihove identifikacije.

3. Uvod
• Genotoksičnost je svaki štetni učinak hemijskih
tvari koji se odražava na genetski materijal.
• Te štetne tvari nazivaju se genotoksične
hemikalije koje nakon udisanja, gutanja ili
prolaskom kroz kožu mogu uzrokovati genetska
oštećenja ili značajno povećati pojave navedenih
oštečenja.
• Posljedice genotoksičnih učinaka hemijskih
komponenti u hrani se ne moraju pojaviti odmah,
već mogu nastupiti čak i nakon prestanka
izlaganja štetnoj tvari. Glavni razlog ovog
problema je akumulaciju nekih tvari u organizmu i
vrlo polagano ispoljavanje iz skladišnog prostora
tokom dugog vremena.

4. Genotoksikologija
Naučna oblast
koja se bavi
proučavanjem
štetnih djelovanja
raznih agenasa
na nasljedni
materijal.
Zadatak - otkrivanje
novih agenasa koji
posjeduju potencijal za
izazivanje nasljednih
promjena u
germinativnim i/ili
somatskim ćelijama
organizama,te procjena
stepena opasnosti
izlaganja ljudi tim
agensima.
Prema kriterijima koje je
definisao EMIC,
genotoksični efekti se
manifestuju kao efekti
na nukleinskim kiselinama,
kao genske mutacije, efekti
na hromosomima, citološki
efekti,mitotički ili mejotički e
fekti,mutacije biljnog
pigmenta, efekti na funkciju
plodnosti ili steriliteta, te
mješoviti efekti.

5. Mutageni
• Agens koji uzrokuje promjenu u genetskom
materijalu, koja može dovesti do pojave bolesti ili
zloćudnog tumora (raka).
• Djeluju i na somatske i na zametne ćelije.
• Mutacije nastale u somatskim ćelijama ne
prenose se na dalje generacije dok se mutacije
na zametnim ćelijama prenose i mogu dovesti do
smanjenja plodnosti, smrti, re različitih fenotipskih
promjena (urođene mane).
• Zbog toga i postoji potreba za klasifikacijom
mutagena zametnih stanica.

6. Klasifikacija mutagena prema GHS ( Globally Harmonised System)
Kategorija 1A Kategorija 1B Kategorija 2
Opis kategorije Tvari za koje se
zna da uzrokuju
nasljedne
mutacije
Tvari za koje se
smatra da
uzrokuju
nasljedne
mutacije
Tvari za koje je
moguće da
uzrokuju
nasljedne
mutacije
Kriterij
kalsifikacije
Mutacije su
dokazane
epidemiološkim
studijama na
ljudima
Mutacije su
dokazane testovima
in vivo na
nasljednim
zametnim ćelijama
ili testovima
mutagenosti
somatskih ćelija
sisavaca ili
dokazima
mutagenih učinaka
na zametne ćelije
bez dokaza
prijenosa na
potomstvo
Mutacije dokazane
testovima in vivo
mutagenosti na
somatskim ćelijama
ili testovima
genotoksičnosti na
somatskim ćelijama
sisavaca, a u
određenim
slučajevima i in
vitro istraživanjima.
Health Hazard
Simbol koji označava sve tri
kategorije.

7. Vrste mutagena
Fizički Hemijski i biološki
- tu spadaju
ekstremne
temperature,
ultraljubičasti zraci,
te jonizirajuće
zračenje.
- jonizirajući zraci
stvaraju
visokoreaktivne
jone u tkivima koji
utiču na udvajanje
molekula DNK
- organizmi složenije
građe imaju
najmanju otpornost
na zračenje.
- hemijske supstance sa
kojima je čovjek u
svakodnevnom kontaktu, a
nalaze se u vazduhu,
hrani, lijekovima i sl.
- mogu biti : dodaci hrani
(prehrambeni aditivi) ,
pesticidi (DDT, sevin,
kaptan), u vazduhu
(izduvni gasovi, SO2, Pb
itd...)
- biološki mutageni su
obično virusi i bakterije.

8. Vrste mutagena
Dok fizikalni agensi
uzrokuju promjenu
genetskog materijala
gotovo u svim stanicama,
hemijski agensi su s jedne
strane jaki mutageni u
određenoj vrsti stanica
(organizma), a s druge
strane, na druge stanice
(organizme) slabo ili
uopće ne djeluju.
Do koje će mjere na genetski
materijal nekog organizma
djelovati određeni fizikalni
ili hemijski agensi određuju i
drugi brojni faktorikao što su
hemijska struktura spojeva,
način pristizanja agensa u
organizam, dužina trajanja
izlaganja, doza, apsorpcija,
izlučivanje, raspodjela
agensa u organizmu i sl.

9. Genotoksične i mutagene komponente u hrani
• Obradom hrane pri visokim temperaturama dolazi do nastajanja različitih genotoksičnih supstanci.
• Najčešći kontaminent koji nastaje obradom hrane pri visokim temperaturama je akrilamid
(potencijalno kancerogen za ljude - grupa 2A).
• Relativno visoke koncentracije akrilamida pronađene u hrani bogatoj ugljikohidratima kao što su
čips, pomfrit, pečeni krompiri i tostirani hljeb. Paralelna ispitivanja su pokazala da pržena
svinjetina, piletina, govedina, bakalar, kobasice, hamburger sadrže vrlo male količine akrilamida u
usporedbi s hranom bogatom ugljikohidratima. Hljeb odnosno kora hljeba, žitarice i kafa sadrže
značajne koncentracije akrilamida.
• Do sada nije prikupljeno dovoljno podataka da bi se dokazala kancerogenost ili genotoksičnost
kod ljudi preko količina akrilamida sadržanih u uobičajenoj prehrani (Bala, 2012).
Akrilamid i hlorpropanoli
Hlorpropanoli : najznačajniji spojevi su 3 -
monohlorpropandiol i 1,3 – dihlor – 2 –
propanol.
3 – monohlorpropandiol se može pronaći
u hrani kao što je prženi sir ili pržene
žitarice, tostiranom hljebu ili u ječmu
namjenjenog za proizvodnju slada,
umacima od soje, biskvitima , kuhanoj
usoljenoj ribi ili mesu itd...

10. Aflatoksin
• Kao idealan model u istraživanju
genotoksičnosti poslužile su primarne
kulture hepatocita štakora i miša u kojima
je promatran popravak DNA nakon
izlaganja stanica pojedinim aflatoksinskim
prekursorima.
• Pri tome je u kulturi hepatocita štakora
dokazano da sterigmatocistin ima 100
puta jači genotoksični učinak od AFB1,
dok O-metilsterigmatocistin ima 30 puta
slabije djelovanje od AFB1 . Također je
zabilježeno da verzikolorin A ima 10 puta
jači učinak od O-metilsterigmatocistina,
dok verzikolorin B ima sličan genotoksični
potencijal kao i verzikolorin A.

11. • Dim koji nastaje za vrijeme pečenja hrane (posebno
mesa i ribe) može biti karcinogen odnosno sadržavati
karcinogene tvari.
• Slično kao i u slučaju nastajanja PAH-ova i nastajanje
heterocikličkih amina je povezano s načinom pripreme
hrane. Prilikom prženja mesa i ribe na tavi ili roštilju
nastaju velike količine heterocikličnih amina, kuhanjem
hrane gotovo da ne nastaju heterociklički amini, dok
prženjem na ulju i pečenjem u pećnici nastaju varijabilne
količine heterocikličnih amina.
Heterociklični amini

12. Policiklički aromatski
ugljikovodici (PAH-ovi)
• U većem broju studija se pokazala koncerogenost PAH-ova koji su
dodavani na mjestima primjene dermalno, subkutikularno,
inhalacijom ili oralno. Međutim, ne samo da su se tumori javljali na
mjestima primjene ( na koži kod dermalne ili želudcu nakon oralne
primjene) već je moguća i pojava na jetri, bubrezima i plućima. Brzo
se distribuiraju po organizmu, oštećuju DNA i izazivaju mutacije.

13. Genotoksičnost pojedinih teških metala
Arsen (As) Olovo (Pb) Nikl (Ni) Hrom (Cr)
IARC označava arsen
i njegova jedinjenja
kao grupu 1
kancerogena.
Duže izlaganje arsenu
može da izazove
dijabetes, oksidativni
stres koji može uticati
na strukturu i
funkciju
kardiovaskularnog
sistema.
Oralno izlaganje
arsena (anorgaski
oblik) dovodi do
posljedice pojave
kancera mokraće,
bešike, pluća i kože.
Olovo i anorganski
spojevi klasifikovani
kao kancerogeni za
ljude, dok organska
jedninjenja olova se ne
klasificiraju kao
mogući ljudski
kancerogeni.
Prema Anttila et al.
(1995) , izloženost
20700 radnika ka
olovu i ispušnim
gasovima, je imalo
direktan uticaj na
povećanja pojave
kancera.
Njegova organska
jedninjenja su
toksičnija od
anorganskih. Najveći
rizici od raka pluća i
nosa su kod radnika
koji su jako izloženi
niklu. Nikl je
kancerogen
respiratornog trakta
kod radnika koji rade
u nikl rafinerijama.
Nikl sulfat u
kombinaciji nikl
sulfidom i oksidom
koji se susreću u
procesima rafiniranja
nikla smatraju se
uzročnicima raka kod
čovjeka prema
podacima IARC-a.
Prema IARC pofesionalna
izloženost
heksovalentnom hromu u
proizvodnji hroma i
industriji pigmenata je
povezana sa kancerom
pluća i spojevi koji sadrže
heksavalentni hrom se
smatraju ljudskim
kancerogenima.
Prema istaraživanjima De
Flora (2000) u pregledu
preko 700 kompleta
kratkoročnih tesktova na
genotoksičnost je
rezultiralo da u 32 krom
spoja je otrkiveno 88%
spojeva koji sadrže
heksovalentni krom su
bili pozitini u ovisnosti od
njihove topivosti i
bioraspoloživosti u
ciljaniim stanicama.

14. Metode testiranja genotoksičnosti
AMESOV TEST
MLA TEST (Mouse lymphoma assay)
In Vitro Micronucleus test

15. Amesov test
• Dokazuje potencijal ispitivane tvari za nastanak mutacije u genomu
bakterije Salmonella typhimurium, odnosno, određuje se rizik
kancerogenosti hemijskog spoja.
• Mutacije se odvijaju u genima za sintezu histidina, odnosno,
konstruisane su tako da trebaju histidin za rast.
• Bakerije se uzgajaju na agaru s malom količinom histidina
dovoljnom da bakterije rastu neko vrijeme i imaju priliku mutirati
nakon dodavanja hemijskog spoja koji se ispituje. Kada se histidin
potroši, samo bakterije koje su mutirale mogu proizvoditi vlastiti
histidin i na taj način dalje živjeti.
Inkubacija obično traje 48 sati, te so ovim testom mogu
detektovati relevantni ljudski mutageni i glodarski
karcinogeni. Iako pozitivan rezultat Amesovog testa jeste
potvrda genotoksičnog učinka jedinjenja, negativan rezultat
ne znači da to jedinjenje nije genotoksično za ćelije sisara.

16. The mouse lymphoma assay (MLA test)
• Kod MLA testa koriste se ćelije limfoma timusa miševa
koje su heterozigotne za lokus L5178Y koji kodira enzim
timidin kinazu (TK).
• Veličina i broj kolonija pruža informaciju o mutagenom
dejstvu. Ovaj test detektuje mutacije i hromozomske
promjene.
• Mutagene supstance se dodaju u kulturu ćelija i izazivaju
mutaciju u TK+/- ćelijama koje postaju TK-/- što rezultira
gubitkom TK aktivnosti i sticanjem TFT rezistencije, pa
nakon presijavanja ćelija u podlogu sa toksičnim
analozima timidina mutantne ćelije stvaraju kolonije dok
one koje su ostale wild type TK+/- ne uspjevaju u
prisustvu TFT.

17. In Vitro Micronucleus test
• In Vitro Micronucleus testom se dokazuju genotoksični karcinogeni.
• Mikronukleus (MN) se formira tokom metafaze / anafaze mitoze i može
poteći od cijelog hromosoma (aneugeni događaj - gubitak hromosoma) ili
dijela prekinutog hromosoma (klastogeni događaj) koji se nisu integrisali u
jedro ćerki ćelija.
• MN se detektuje fluorescentnom bojenom High Content Screening (HCS)
tehnikom.
• Moguće je upotrijebiti S9 frakciju jetre za ispitivanje genotoksičnog
karcinogenog efekta metabolita.

18. Vrsta testa Primjer
Test mutacije gena prokariota
Ames test
E.coli lacI test
Testovi u eukariota ne-sisavaca
Reverzija auksotrofa kvasaca
Test aneupolidije kod kvasaca
Test konverzije gena kvasaca
Tradescantia test
Test gubitka spolnog kromosoma kod Drosophila
Analize popravaka i oštećenja DNA
Komet test
Test detekcije hemijskih adukta
Test indukcije SOS popravka E.coli
Test neplaniranog popravka hepatocita štakora
Testovi mutacije gena sisavaca
Test mutacije TK stanice limfoma miša
In vivo spot test na mišu
- In vitro testovi karakteristični za studije mutagenosti i karcinogenosti -
Metode testiranja genotoksičnosti